CN108714235A - 一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜及其制备方法 - Google Patents

一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰糖医用薄膜，首先以高碘酸钠为选择性氧化剂对普鲁兰实施开环氧化，制备得到氧化普鲁兰，再向氧化普鲁兰溶液加入低免疫原性胶原蛋白，待溶液搅拌均匀后，随后加入交联剂，如先加入4‑吗啉乙磺酸（MES）进行活化，随后加入1‑乙基‑碳二亚胺盐酸盐（EDC）与N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）反应或加入一定量戊二醛，最后将其干燥成膜，制备得到了一种具有高生物活性的低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰复合医用薄膜，该医用薄膜材料具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物安全性，又具有较好的力学强度，保湿性能，可用作止血材料、组织工程支架、高级敷料、药物载体材料、美容材料等。

Description

一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用 薄膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及了一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜及其制备方法。
背景技术
普鲁兰多糖是由α-1，4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1，6糖苷键聚合而成的直链状多糖。普鲁兰无色无味，易溶于水，粘度较低，无毒副作用具有优异的生物相容性，易成模。但成膜缺乏力学强度限制了其在生物医药领域的应用。
天然高分子中的胶原类薄膜由于其优异的生物相容性，生物活性等，已在功能型薄膜领域得到了广泛应用。目前已有大量的研究人员利用胶原复合材料开发出各类术中止血材料及术后创口护理材料，因此被广泛应用于创伤敷料、生物胶黏剂、组织工程支架材料、给药载体材料等医用领域。凭借优良的生物活性、诱导组织再生能力、生物可降解性等，胶原类薄膜已成为目前的研究热点。然而，动物源胶原被发现存在病毒隐患、免疫排异性等缺点，影响了其的生物医学应用。近年来，利用基因重组技术制备低免疫原性胶原蛋白，解决了传统动物源胶原存在的生物安全性问题，能够成为动物源胶原的替代材料，目前已被应用于止血材料、组织工程材料、高级敷料等生物医用材料研发中。在实际应用中发现胶原类薄膜仍存在力学强度差、成膜性差、保湿性能弱等的先天缺陷，极大地限制了其的医学应用，因此，亟需开发一类具有高强度、保湿性能优异的胶原类薄膜。
综上所述，本发明为了解决目前生物薄膜类材料存在生物活性差，力学强度弱，降解速率快等缺点。采用以普鲁兰为原料，通过氧化开环，与低免疫原性胶原蛋白交联。从根源上保证了材料的生物安全性；同时，为解决目前薄膜类材料存在的力学强度差、保湿性能弱等的缺陷，以氧化普鲁兰为生物型交联剂，并以EDC或戊二醛为二次交联，制备得到了一种基于低免疫原性胶原蛋白/氧化透明酸的高强度，生物性能及保湿性能优异的致密医用薄膜，该薄膜材料具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物安全性等优良性能，又兼具较好的力学强度，保湿性能，可用作止血材料、组织工程支架、高级敷料、药物载体材料等。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜。该薄膜具有良好的生物相容性、可生物降解性等优良性能，又兼具较好的力学强度，生物活性及保湿性能能显著促进组织创面愈合和修复，可用作高级敷料、组织工程支架、止血材料、美容材料等生物医用材料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，首先以高碘酸钠为选择性氧化剂对普鲁兰实施开环氧化，制备得到氧化普鲁兰，再向氧化普鲁兰溶液加低免疫原性胶原蛋白，之后再加入4-吗啉乙磺酸MES, 1-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC及N-羟基琥珀酰亚胺NHS或戊二醛进行二次交联随后干燥成膜，制备得到了一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜，具体步骤包括：
（1）氧化普鲁兰的制备：取1质量份普鲁兰加入到50～200体积pH为7.4的磷酸缓冲液或蒸馏水中，22~80℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；将0.5～1.5质量份高碘酸钠同样溶解到50～100体积pH为7.4的磷酸缓冲液或蒸馏水中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；将1份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，4～25℃下避光搅拌反应48～96h，待反应结束后，加入4～20体积聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度、生物活性及保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得氧化普鲁兰溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白用量为氧化普鲁兰质量的:0.5:1~1.5:1：，22～40℃下缓慢搅拌0.5～24h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，再加入2~6体积的MES，活化0.5~2h后，加入NHS与EDC其摩尔质量比为1:2.5，反应24~48h后将所制备混合溶液称取30~80质量均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于37~40℃干燥24~72h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
所述的低免疫原性胶原蛋白（重均分子量为3万~6万）；普鲁兰（重均分子量为2万~100万）；制得的基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的力学强度、生物降解性及保湿性能可通过调整生物交联剂的用量及改性条件来有效控制。
本技术与现有技术相比，具有如下优点：
（1）与传统动物源胶原蛋白不同，本发明以低免疫原性胶原蛋白为原料，从根源上保证了材料的生物安全性，同时，低免疫原性胶原蛋白同样具有优异的生物活性，能够赋予普鲁兰薄膜优异的生物活性；
（2）本发明制备的氧化普鲁兰具有很高的化学反应活性、水溶性好等特点，能够与低免疫原性胶原蛋白形成席夫碱共价键结合，结合强度高，在实际应用中低免疫原性胶原蛋白不会被轻易释放，保证了薄膜材料优异的生物活性，同时还发现氧化普鲁兰能够促进低免疫原性胶原蛋白的分子自组装行为，加速成膜；并且使用EDC、NHS进行二次交联，使其结构致密，不仅提升其力学性能，对其保湿性能、保护创伤内环境也有极大益处。
（3）本发明采用以分子自组装、两次交联法构建薄膜，能够特性设计薄膜中低免疫原性胶原蛋白的微观形貌与三维结构，使其更仿生胞外基质。
具体实施方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
实施例1
（1）氧化普鲁兰的制备：取1g普鲁兰加入到50ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，22℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；将0.5g高碘酸钠同样溶解到50ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；将1份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，4℃下避光搅拌反应48h，待反应结束后，加入4ml聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得氧化普鲁兰溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰的质量比为0.5:1，22～40℃下缓慢搅拌0.5h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入2ml的MES活化0.5h，再加入0.5g的EDC及一定质量的NHS，使得NHS与EDC添加量的物质的量之比为1：2.5，反应24h，将所制备混合溶液称取30g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于37~40℃干燥24h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例2
（1）氧化普鲁兰的制备：取1g普鲁兰加入到200ml蒸馏水中， 80℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；将1.5g高碘酸钠同样溶解到100ml蒸馏水中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；将1份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，10℃下避光搅拌反应96h，待反应结束后，加入20ml聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得氧化普鲁兰溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰的质量为 1.5:1，在40℃下缓慢搅拌24h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入4ml的MES活化0.5h，再加入1g的EDC及一定质量的NHS，使得NHS添加量与EDC添加量的摩尔比为1:2.5，反应24h，将所制备混合溶液称取80g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于40℃干燥72h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例3
（1）氧化普鲁兰的制备：取1g普鲁兰加入到150ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，60℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；将1.0g高碘酸钠同样溶解到50ml蒸馏水中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；将1份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，8℃下避光搅拌反应72h，待反应结束后，加入10ml聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度医用薄膜的制备：向步骤（1）所得氧化普鲁兰溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰的质量比为1:1，37℃下缓慢搅拌6h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入5ml 的MES活化0.5h，再加入2g的EDC及一定质量的NHS，使得NHS添加量与EDC添加量的摩尔比为1:2.5，反应24h，将所制备低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰溶液称取50g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于40℃干燥48h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例4
（1）氧化普鲁兰的制备：取1g普鲁兰加入到50ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，22℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；将0.5g高碘酸钠同样溶解到50ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；将1份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，4℃下避光搅拌反应48h，待反应结束后，加入4ml聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜的制备：向步骤（1）所得氧化普鲁兰溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰的质量比为0.5:1，22～40℃下缓慢搅拌0.5h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入2ml 50%戊二醛，反应24h，将所制备混合溶液称取30g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于37~40℃干燥24h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。
实施例5
（1）氧化普鲁兰的制备：取1g普鲁兰加入到150ml pH为7.4的磷酸缓冲液中，60℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；将1.0g高碘酸钠同样溶解到50ml蒸馏水中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；将1份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，8℃下避光搅拌反应72h，待反应结束后，加入10ml聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰。
（2）基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度医用薄膜的制备：向步骤（1）所得氧化普鲁兰溶液中加入低免疫原性胶原蛋白，控制低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰的质量比为1:1，37℃下缓慢搅拌6h，搅拌至清澈透明，冷却至室温后，加入5ml 的50%戊二醛，反应24h，将所制备低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰溶液称取50g均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于40℃干燥48h。最后将其所成薄膜置于0~4℃下备用。制备得到基于低免疫原性胶原蛋白/氧化普鲁兰的高强度，生物活性且保湿性能优异的致密医用薄膜。

Claims (7)

1.一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将低免疫原性胶原蛋白溶液与氧化普鲁兰相混合，控制低免疫原性胶原蛋白用量为氧化普鲁兰质量的50%~150%，22～40℃下充分反应；至清澈透明后，加入交联剂进行二次交联；取充分反应的溶液制膜，得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜。
2.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，其特征在于，所述氧化普鲁兰由包括以下步骤的方法制得：
取1质量份普鲁兰加入到50～200体积pH为7.4的磷酸缓冲液中，22~80℃下搅拌至溶液完全澄清，配制成1份普鲁兰水溶液；以及，
将0.5～1.5质量份高碘酸钠同样溶解到50～100体积pH为7.4的磷酸缓冲液中，室温下搅拌至完全溶解，配制成1份高碘酸钠溶液；以及，
将0.5～1.5份高碘酸钠溶液缓慢加入到1份普鲁兰溶液中，4～10℃下避光搅拌反应48～96h，待反应结束后，加入4～20体积聚乙二醇终止反应，室温下搅拌30min后，使用截留量为300～500Da的透析袋在去离子水中透析3～5天，最后冷冻干燥制备得到氧化普鲁兰；
上述步骤中，质量与体积的对应关系为1质量份：1体积=1g：1ml。
3.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，其特征在于：所述交联剂为MES、EDC、与NHS的组合或戊二醛中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）将0.5～3.0质量份的氧化普鲁兰溶解到50～300体积pH为7.4的磷酸缓冲液或蒸馏水中，50℃~80℃室温下搅拌至完全溶解，配制成1份氧化普鲁兰溶液；
2）将低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰按质量比0.5:1~1.5:1，将低免疫原性胶原蛋白加入到1份氧化普鲁兰溶液中，22~40℃下磁力搅拌反应0.5~24h，搅拌至清澈透明；冷却至室温后，加入0.5~6体积的MES乙醇水溶液，搅拌均匀；加入EDC和NHS，使得EDC的添加量为0.5~2质量份、并使EDC与NHS摩尔比为1:2.5，反应24~48小时；移取基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰混合溶液均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于20~40℃干燥24~72h，制备得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜；
上述步骤中，质量与体积的对应关系为1质量份：1体积=1g：1ml。
5.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
1）将0.5～3.0质量份的氧化普鲁兰溶解到50～300体积pH为7.4的磷酸缓冲液或蒸馏水中，50℃~80℃室温下搅拌至完全溶解，配制成1份氧化普鲁兰溶液；
2）将低免疫原性胶原蛋白与氧化普鲁兰按质量比0.5:1~1.5:1，将低免疫原性胶原蛋白加入到1份氧化普鲁兰溶液中，22~40℃下磁力搅拌反应0.5~24h，搅拌至清澈透明；冷却至室温后，加入0.5~2质量份戊二醛；移取基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰混合溶液均匀铺展在聚四氟乙烯板中，置于烘箱中，于20~40℃干燥24~72h，制备得到基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜；
上述步骤中，质量与体积的对应关系为1质量份：1体积=1g：1ml。
6.如权利要求1所述的一种基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜的制备方法，其特征在于，所述的氧化普鲁兰的氧化度为35%～50%。
7.权利要求1~6任一项所述方法制备的基于低免疫原性胶原蛋白修饰的高生物活性普鲁兰医用薄膜。
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