CN107441549A - 一种胶原蛋白‑硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胶原蛋白‑硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、制备胶原溶液；2)、将胶原溶液离心、脱泡，冷冻干燥得到胶原海绵；3)、110～125℃真空热交联48～72h；4)、EDC/NHS交联液中加入硫酸乙酰肝素二次交联12～36h；5)、清洗；6)、二次冻干；7)、干燥；8)灭菌。本发明将硫酸乙酰肝素与胶原的复合交联，保证了硫酸乙酰肝素的有效浓度和有效固定，二者联合作用，可主动诱导细胞的生长、增殖，促进伤口愈合；(2)采用冻干～交联～二次交联～二次冻干的方式，使得产品的液体吸收性大于自身重量的25倍和透气性大于5000g/m2.24h，舒适性好，同时使得产品具备了均一的三维结构，能更好的引导并加速组织的修复。

Description

一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法
技术领域
本发明涉及一种敷料，具体为一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法。
背景技术
创伤修复是一个复杂而渐进的过程，包括受损组织的清除、细胞的聚集、组织的再生、瘢痕形成和创面封闭等过程。创面修复是机体应答皮肤损伤所表现的一个复杂的生物学过程，主要包括局部炎症反应阶段、细胞增殖分化阶段和组织重建阶段。局部微环境的变化，包括创伤局部各种细胞、细胞外基质及生长因子等的相互作用，对创面愈合有极大影响。
越来越多的基础研究和临床研究均表明，湿性伤口敷料能够加速创面愈合。现已证明，湿性敷料能使伤口再上皮化能力显著提高，使创面以更快的速度愈合，覆盖急性浅层创面的愈合速度比传统敷料平均快3～4d。湿性敷料促进创面愈合的主要机制是：促进多种生长因子释放，加快创面愈合速度；保持创面低氧张力，刺激毛细血管增生，利于创面成纤维细胞或表皮细胞生长，并可刺激巨噬细胞释放多种生长因子；有利于坏死组织与纤维蛋白溶解；有助于宿主巨噬细胞等在创面的聚集，增强局部抗致病微生物的防御，有利于控制感染、抑制入侵致病菌生长和降低感染发病率。目前临床上应用的具有促进伤口愈合的湿性敷料主要包括薄膜类敷料、藻酸盐敷料、水凝胶敷料、水胶体敷料等。在实际应用中，常根据伤口情况选择合适的敷料。通常，一期愈合的伤口宜选用纱布、薄膜类敷料；浅层伤口宜选用薄膜类；干性坏死的伤口宜选用水凝胶、水胶体类敷料；少到中度渗液的伤口选用水凝胶类；中度到重度渗液的伤口宜选用藻酸盐类、泡沫海绵类。
胶原蛋白是结缔组织普遍存在的成分，是体内重要的结构蛋白之一，是器官和组织必不可少的构造骨架。按材料结构与组成分，以胶原为原料制成的创伤修复材料目前是国际市场的主流产品之一，作为细胞外基质的重要组成部分，其在烧创伤和组织修复领域展现了较大的优势，具有巨大的应用价值。胶原作为敷料应用于创伤修复通常具有以下特点：(1)低抗原性、生物相容性好，不会引起异物、炎症和排斥反应，可较长时间地用于创面覆盖；(2)具有类似真皮的形态结构，透水透气性好，粘附性好；(3)具有网状的三维空间结构，为创面愈合提供良好的愈合环境，有利于细胞的增生与修复，加速创面愈合；(4)降解产物安全，为组织的生长提供丰富的营养物质；(5)改善愈合质量，抑制过度的成纤维细胞生长，并能减少创面收缩。
但是现有的胶原为原料制成的创伤修复材料机械性能和抗降解性能较差，通气性较差，严重影响敷料的快速推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的胶原为原料制成的创伤修复材料机械性能和抗降解性能较差，通气性较差，严重影响敷料的快速推广的缺陷，提供一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备6～18mg/mL的胶原溶液，连续搅拌12h以上；
2)、将搅拌均匀的胶原溶液装入离心杯中，离心，脱泡，然后灌注到模盒中，并冷冻干燥，得到胶原海绵；
3)、将冷冻干燥后的胶原海绵于110～125℃真空热交联48～72h；
4)、配置0.5～10mM的EDC/NHS交联液，并添加胶原海绵质量的10～20％的硫酸乙酰肝素，搅拌溶解，放入胶原海绵二次交联12～36h；
5)、弃交联液，将胶原海绵先用注射水冲洗2～3遍，再置于注射水中清洗，每100片需15L～25L注射水，每隔3～4h更换一次注射用水，更换6～8次；
6)、将清洗完毕后的胶原海绵置于模盒中，铺平整，并注入20～35mL注射水，使注射水浸润海绵上表面，放入冻干机中，二次冻干；
7)、将二次冻干的海绵放入真空干燥箱内进行干燥；
8)、将冻干后胶原海绵装入灭菌复合袋中，依次排列于压制机板层中，压制 5～10min后，即可制得胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料，装入灭菌复合袋中，辐照灭菌。
进一步的，所述步骤1)中胶原溶液的制备方法采用专利法为 ZL201110361034X的制备方法，具体如下：
(1)取新鲜组织(猪皮、牛皮、牛跟腱等)，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将组织破碎成小颗粒状，按照固液比1:30～1:40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时，过滤，备用；
(2)在上述预处理后的组织中加入质量为组织质量6～8倍的无水乙醚或者丙酮，于35～40℃回流5～8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；
(3)将上述组织浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25～30小时；
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理30 分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声处理 1小时；
(5)加入2～3％的H2O2溶液，混合静置2～4小时，调节pH至5.0，离心；
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20～30小时，离心，沉淀物加入0.6～ 0.7moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌20～ 30小时，离心；
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6～0.7moL/L冰醋酸，先以0.6～ 0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5～7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体。
进一步的，步骤2)中灌注到模盒中的胶原溶液充满整个模盒，胶原液外观应平整、均一，不得有气泡。如有少量气泡，可用注射器针头/或移液枪除去气泡。
进一步的，步骤7)中干燥的方法为，将真空干燥箱抽真空至～90Kpa以上，并保持1h以上，升温至80℃后恒温2h以上，然后升温至100～125℃，恒温 6～12h。
进一步的，检查敷料外观性状，规格尺寸，若有不规整需用刀片剪裁规整。将检查合格的样品再次装入灭菌复合袋中，进行封口，同时检查密封性，合格后放入灭菌袋，等待灭菌，灭菌专用袋扎口，装入纸箱，贴标，辐照灭菌。
硫酸乙酰肝素是存在于细胞外的氨基多糖，可以和包括生长因子在内的多种生物活性物质结合，这种结合不仅可以保护生长因子免受各种蛋白酶的降解，而且还可以促进生长因子与其受体结合而产生生物效应。
胶原～硫酸乙酰肝素复合敷料作用于创面，在初始期(炎症阶段)，吸附血小板，与凝血因子相互作用，并引起血小板聚合，起止血作用，另外血小板的破坏，使其释放出多种活性物质(如生长因子)，硫酸乙酰肝素则对生长因子的活性起保护作用，进而主动诱导创面愈合的启动；在中间期(肉芽组织生长期)，促进体内胶原的再生、排列，增强渗出物的吸收及氧交换，促进肉芽组织生长；在后期(成熟痊愈期)，形成上皮细胞的支架，诱导成纤维母细胞及异胶原纤维的产生及排列，促进肉芽组织的产生，促进血管和新生瘢痕组织的形成，达到创面修复愈合。
胶原～硫酸乙酰肝素复合敷料能覆盖大面积创面，保持创面湿润状态，具有一定黏附能力、抵抗机械作用力、抵御细菌侵袭、缓解疼痛、减少体液的损失。胶原蛋白和硫酸乙酰肝素联合作用，可主动诱导细胞的生长、增殖，促进伤口愈合。
本发明将硫酸乙酰肝素与胶原复合，且硫酸乙酰肝素与胶原的复合及交联同时完成，保证了硫酸乙酰肝素的有效浓度和有效固定，二者联合作用，可主动诱导细胞的生长、增殖，促进伤口愈合；(2)采用冻干～交联～二次交联～二次冻干的方式，使得产品具备良好的液体吸收性(大于自身重量的25倍)和透气性 (大于5000g/m2.24h)，舒适性好，同时使得产品具备了均一的三维结构，能更好的引导并加速组织的修复。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的扫描电镜图片。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备6mg/mL的胶原溶液，连续搅拌12h以上；
2)、将搅拌均匀的胶原溶液装入离心杯中，离心，脱泡，然后灌注到模盒中，并冷冻干燥，得到胶原海绵；
3)、将冷冻干燥后的胶原海绵于110℃真空热交联48h；
4)、配置0.5mM的EDC/NHS交联液，并添加胶原海绵质量的10％的硫酸乙酰肝素，搅拌溶解，放入胶原海绵二次交联12h；
5)、弃交联液，将胶原海绵先用注射水冲洗2遍，再置于注射水中清洗，每 100片需15L注射水，每隔3h更换一次注射用水，更换8次；
6)、将清洗完毕后的胶原海绵置于模盒中，铺平整，并注入20mL注射水，使注射水浸润海绵上表面，放入冻干机中，二次冻干；
7)、将二次冻干的海绵放入真空干燥箱内进行干燥；
8)、将冻干后胶原海绵装入灭菌复合袋中，依次排列于压制机板层中，压制 5min后，即可制得胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料，装入灭菌复合袋中，辐照灭菌。
实施例2
一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)、制备18mg/mL的胶原溶液，连续搅拌12h以上；
2)、将搅拌均匀的胶原溶液装入离心杯中，离心，脱泡，然后灌注到模盒中，并冷冻干燥，得到胶原海绵；
3)、将冷冻干燥后的胶原海绵于125℃真空热交联72h；
4)、配置10mM的EDC/NHS交联液，并添加胶原海绵质量的20％的硫酸乙酰肝素，搅拌溶解，放入胶原海绵二次交联36h；
5)、弃交联液，将胶原海绵先用注射水冲洗3遍，再置于注射水中清洗，每 100片需25L注射水，每隔4h更换一次注射用水，更换6次；
6)、将清洗完毕后的胶原海绵置于模盒中，铺平整，并注入35mL注射水，使注射水浸润海绵上表面，放入冻干机中，二次冻干；
7)、将二次冻干的海绵放入真空干燥箱内进行干燥；
8)、将冻干后胶原海绵装入灭菌复合袋中，依次排列于压制机板层中，压制 10min后，即可制得胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料，装入灭菌复合袋中，辐照灭菌。
实施例3
一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)、制10mg/mL的胶原溶液，连续搅拌12h以上；
2)、将搅拌均匀的胶原溶液装入离心杯中，离心，脱泡，然后灌注到模盒中，并冷冻干燥，得到胶原海绵；
3)、将冷冻干燥后的胶原海绵于118℃真空热交联60h；
4)、配置5mM的EDC/NHS交联液，并添加胶原海绵质量的15％的硫酸乙酰肝素，搅拌溶解，放入胶原海绵二次交联18h；
5)、弃交联液，将胶原海绵先用注射水冲洗2遍，再置于注射水中清洗，每 100片需20L注射水，每隔4h更换一次注射用水，更换7次；
6)、将清洗完毕后的胶原海绵置于模盒中，铺平整，并注入32mL注射水，使注射水浸润海绵上表面，放入冻干机中，二次冻干；
7)、将二次冻干的海绵放入真空干燥箱内进行干燥；
8)、将冻干后胶原海绵装入灭菌复合袋中，依次排列于压制机板层中，压制 8min后，即可制得胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料，装入灭菌复合袋中，辐照灭菌。
本发明制得的胶原～硫酸乙酰肝素复合敷料样品表面细腻，在电镜下扫描可呈现出致密的三维网络结构。敷料内孔径集中分布为20～100μm。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、制备6～18mg/mL的胶原溶液，连续搅拌12h以上；
2)、将搅拌均匀的胶原溶液装入离心杯中，离心，脱泡，然后灌注到模盒中，并冷冻干燥，得到胶原海绵；
3)、将冷冻干燥后的胶原海绵于110～125℃真空热交联48～72h；
4)、配置0.5～10mM的EDC/NHS交联液，并添加胶原海绵质量的10～20％的硫酸乙酰肝素，搅拌溶解，放入胶原海绵二次交联12～36h；
5)、弃交联液，将胶原海绵先用注射水冲洗2～3遍，再置于注射水中清洗，每100片需15L～25L注射水，每隔3～4h更换一次注射用水，更换6～8次；
6)、将清洗完毕后的胶原海绵置于模盒中，铺平整，并注入20～35mL注射水，使注射水浸润海绵上表面，放入冻干机中，二次冻干；
7)、将二次冻干的海绵放入真空干燥箱内进行干燥；
8)、将冻干后胶原海绵装入灭菌复合袋中，依次排列于压制机板层中，压制5～10min后，即可制得胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料，装入灭菌复合袋中，辐照灭菌。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中胶原溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)取新鲜动物组织，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将组织破碎成小颗粒状，按照固液比1:30～1:40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时，过滤，备用；
(2)在上述预处理后的组织中加入质量为组织质量6～8倍的无水乙醚或者丙酮，于35～40℃回流5～8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；
(3)将上述组织浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25～30小时；
(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声处理1小时；
(5)加入2～3％的H2O2溶液，混合静置2～4小时，调节pH至5.0，离心；
(6)取上清液，加入NaCl，搅拌20～30小时，离心，沉淀物加入0.6～0.7moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌20～30小时，离心；
(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6～0.7moL/L冰醋酸，先以0.6～0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5～7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体。
3.如权利要求1所述的胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中灌注到模盒中的胶原溶液充满整个模盒，胶原液外观应平整、均一，不得有气泡。
4.如权利要求1所述的胶原蛋白-硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中干燥的方法为，将真空干燥箱抽真空至90Kpa以上，并保持1h以上，升温至80℃后恒温2h以上，然后升温至100～125℃，恒温6～12h。
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