CN114404668A - 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 - Google Patents
无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114404668A CN114404668A CN202210100922.4A CN202210100922A CN114404668A CN 114404668 A CN114404668 A CN 114404668A CN 202210100922 A CN202210100922 A CN 202210100922A CN 114404668 A CN114404668 A CN 114404668A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- injection
- solution
- crosslinking
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 147
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 147
- 239000000945 filler Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002347 injection Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 title abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims abstract description 17
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 8
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 6
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- -1 0.3 w/v%) Substances 0.000 claims description 2
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- LAOZSCRCYVBSJA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound CC1(C)C(=O)NC(=O)NC1=O LAOZSCRCYVBSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN QXPRJQPCFXMCIY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=NC=C1 GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWTPDFFBLQEBOE-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O TWTPDFFBLQEBOE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- CSMYMGFCEJWALV-WDSKDSINSA-N Gly-Ser-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O CSMYMGFCEJWALV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000005461 lubrication Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 1
- 230000005541 medical transmission Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
- A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法。本发明的注射用胶原蛋白填充剂包含经碳二亚胺(EDC)交联的胶原蛋白、注射用水以及辅料,且无交联剂残留。本发明的无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂的制备方法使用EDC对胶原蛋白进行交联,所用交联剂浓度低,操作简单易行,可通过二次交联提高交联度,且交联反应完成后仅通过简单的磷酸缓冲液清洗操作即可基本完全除去EDC。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种注射用重组胶原蛋白填充剂,所述注射用重组胶原蛋白填充剂基本不包含化学交联剂,具有更好的生物安全性。
背景技术
胶原蛋白是一种生物高分子蛋白,是动物结缔组织中的主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白,占蛋白质总量的25%~30%。胶原蛋白与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系,是生物科技产业最关键的原材料之一,在医学材料、化妆品、食品工业中均有广泛应用。
天然的人胶原蛋白来源受限,目前工业上使用的天然胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白,其主要来源为动物结缔组织。但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险,同时大规模的制备对供给侧的动物饲养造成巨大的压力。
随着基因工程技术的广泛应用,通过采用合适的工程菌株(大肠杆菌、毕赤酵母等)外源性表达人胶原蛋白,成功地解决了人胶原蛋白大规模制备的瓶颈问题。但是,利用工程菌株例如毕赤酵母基因工程菌株表达人胶原蛋白时,人胶原蛋白会在发酵、纯化及保存过程中发生降解,这增加了生产成本,并且影响了这种方法生产的人胶原蛋白的性能。
推测人胶原蛋白发生降解的原因可能是其氨基酸序列中含有较多的易发生水解的位点。因此,技术人员通过选择来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列进行重复来构建重组胶原蛋白,以期回避易发生水解的位点,从而提高胶原蛋白的稳定性,同时还能保持天然人胶原蛋白的优良性能。但是,通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白,其氨基酸组成及分布都相对单调,理论上讲,这会造成其表面的电荷负载大,整体不容易达到稳定的平衡状态,因而在水溶液中容易水解、变性,且存在短氨基酸序列重复单元越短、重复次数越多,重组胶原蛋白分子在水溶液中越不稳定的倾向。
可以尝试通过对来自天然胶原蛋白的短氨基酸序列进行突变并以此作为重复单元,从而获得更耐降解的重组胶原蛋白。但是,这样通过突变改造得到的重组胶原蛋白与天然人胶原蛋白的同源性降低,可能出现免疫原性问题,因而不适合应用于需与人体长期接触的生物材料。
另一方面,组织工程材料例如皮下填充剂等是人胶原蛋白的一个重要应用方向,作为组织工程材料,要求胶原蛋白具有良好的力学强度和在水溶液中的稳定性(可在水溶液中长期保存)。一般而言,胶原蛋白的分子量越大,其力学强度就越好,而其在水溶液中的稳定性越差,对于通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白而言更是如此。
天然人胶原蛋白的单链分子量约为110-130kD,从实用性的观点出发,技术人员普遍认为适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白的分子量需要达到100kD以上。然而,正如前述,天然的人胶原蛋白来源受限,动物源胶原蛋白存在传播疾病的风险,基因工程表达的人胶原蛋白容易在发酵、纯化及保存过程中发生降解,通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白在水溶液中不稳定,而通过突变改造得到的重组胶原蛋白又存在免疫原性问题,因此,如何获得适合替代天然人胶原蛋白用作组织工程材料的胶原蛋白成为本技术领域的限制性问题。
而且,本领域技术人员还会通过交联来提升重组胶原蛋白的力学性能和延长其在体内的降解时间。但是对于胶原蛋白注射液产品而言,交联所使用的交联剂(例如戊二醛等)最终会随胶原蛋白一起进入并长期存在于人体中,这些交联剂会对人体产生毒性。这种情况下,本领域技术人员期望找到合适的重组胶原蛋白,使得针对该重组胶原蛋白的交联反应简单易行、交联效率高、且能够通过简单的操作基本上完全除去交联剂。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题,发明人进行了深入研究。发明人首先对通过来自天然人胶原蛋白的短氨基酸序列重复构建的重组胶原蛋白进行了技术文献调研,选取了现有技术中的一些来自天然人I型胶原蛋白(应用最广泛的组织工程材料)的短氨基酸序列,然后分别将这些短氨基酸序列作为重复单元,构建不同分子量的重组胶原蛋白,考察这些重组胶原蛋白在水溶液中长期保存的稳定性,以期获得能够在水溶液中长期稳定保存且能够满足作为组织工程材料的力学强度要求的大分子量(100kD以上)重组胶原蛋白。
上述研究的结果是,发明人意外发现,通过将来自天然的人I型胶原蛋白的一段十五肽(G A P G A P G S Q G A P G L Q)进行75~110次重复而得到的重组I型胶原蛋白具有异常优异的稳定性。具体体现在:(1)尽管其重复单元的长度是发明人测试的所有重组胶原蛋白中最短的,但其在水溶液中的稳定性是最好的;而通常认为,重复单元越短,氨基酸组成及分布就越单调,由此构建的重组胶原蛋白的表面电荷负载越大,越不容易达到稳定的平衡状态,因而更易水解。(2)其甚至比将该十五肽进行52次或62次或72次重复而得到的重组I型胶原蛋白更加稳定,而通常认为,重复次数越多,分子量越大,重组胶原蛋白的表面电荷负载越大,越不容易达到稳定的平衡状态,因而更易水解。
基于上述发现,发明人完成了本发明。即本发明包括:
1.一种大分子I型重组胶原蛋白,其由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成,其中,所述短氨基酸序列如SEQ ID No.:1(G A P G A PG S Q G A P G L Q)所示,重复次数为75~110次。
2.根据项1所述的大分子I型重组胶原蛋白,其中,所述重复次数为80~105次,优选82~102次。
3.根据项1所述的大分子I型重组胶原蛋白,其分子量为100kD以上。
4.根据项1所述的大分子I型重组胶原蛋白,其还带有使其易于纯化的标签。
5.根据项4所述的大分子I型重组胶原蛋白,其中,所述标签为His标签、Flag标签或c-Myc标签。
6.根据项1~5中任一项所述的大分子I型重组胶原蛋白作为组织工程材料的用途。
7.根据项6所述的用途,其中,所述组织工程材料选自皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、血管支架、细胞间质支架和胶原蛋白海绵。
8.根据项1~5中任一项所述的大分子I型重组胶原蛋白作为皮下填充剂、人工骨、人工皮肤、口腔可吸收生物膜、骨植入剂、血管支架、细胞间质支架和胶原蛋白海绵的用途。
关于本发明的大分子I型重组胶原蛋白具有异常优异的稳定性的原因,发明人正在进行更为深入的研究。初步的研究结果表明,这可能是因为:以某一氨基酸序列作为重复片段进行重复的重组胶原,其稳定性与表面电荷密切相关,而表面电荷与氨基酸组成及蛋白的空间结构相关联,达到某一特定的重复次数后刚好形成了某一空间结构,使得表面荷载处于平衡或近平衡的状态,因此会表现出异常稳定的状态。发明人刚好找到了该15个氨基酸重复序列胶原蛋白处于荷载平衡的范围,因而本发明的大分子I型重组胶原蛋白具有异常优异的稳定性。
而且,发明人还发现本发明的大分子I型重组胶原蛋白特别适合使用EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)进行交联。使用EDC对本发明的大分子I型重组胶原蛋白进行交联,所用的交联剂浓度低,操作简单易行,可通过二次交联提高交联度,且交联反应完成后仅通过简单的磷酸缓冲液清洗操作即可基本完全除去EDC(根据《中华人民共和国药典》四部通则3206碳二亚胺残留量测定,碳二亚胺残留量为未检出)。
因此,本发明还包括:
4-1.一种注射用胶原蛋白填充剂,其包含经EDC交联的胶原蛋白、注射用水以及辅料。
4-2.根据权利要求4-1所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述胶原蛋白是大分子I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成,其中,所述短氨基酸序列如SEQ ID No.:1(G A P G A P G S Q G A P G L Q)所示,重复次数为75~110次。
4-3.根据权利要求4-2所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述重复次数为80~105次,优选82~102次。
4-4.根据权利要求4-2所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述大分子I型重组胶原蛋白的分子量为100kD以上。
4-5.根据权利要求4-2所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述大分子I型重组胶原蛋白还带有使其易于纯化的标签。
4-6.根据权利要求4-2所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述大分子I型重组胶原蛋白带有的使其易于纯化的标签为His标签、Flag标签或c-Myc标签。
4-7.根据权利要求4-1所述的注射用胶原蛋白填充剂,其基本上不包含碳二亚胺(EDC)。这里,基本上不包含碳二亚胺是指:根据《中华人民共和国药典》四部通则3206碳二亚胺残留量测定,碳二亚胺残留为未检出。
4-8.根据权利要求4-1所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述辅料是选自磷酸盐缓冲剂、利多卡因(例如0.3w/v%)、维生素和/或高分子微球(例如PVA微球或蛋白微球)。
4-9权利要求4-1~4-8中任一项所述的注射用胶原蛋白填充剂的制备方法,其包括:
步骤1:将胶原蛋白溶解于用注射用水配制的0.05-0.5mM的EDC溶液中,进行交联,得到一次交联液;其中,交联温度为-80℃~10℃,交联时间为10~48小时;
步骤2:将所述一次交联液进行冷冻干燥,得到海绵状物1;
步骤3:将所述海绵状物1浸泡在用50%-99体积%乙醇水溶液配制的1mM~20mM的EDC溶液中,常温交联5~48小时,得到二次交联产物,其为凝胶状固体;
步骤4:将所述二次交联产物进行冷冻干燥,得到海绵状物2;
步骤5:将所述海绵状物2粉碎成直径为0.2~1mm的颗粒;
步骤6:将所述颗粒置于50-1200倍体积的磷酸缓冲液或注射用水中进行清洗,每间隔1~120分钟换液一次,累计换液5~15次;
步骤7:将经步骤6清洗完毕的所述颗粒溶胀于磷酸缓冲液中,使得所述胶原蛋白的含量为20-150mg/mL,得到所述注射用胶原蛋白填充剂。
4-10.根据权利要求4-8所述的制备方法,其所述步骤7中的磷酸缓冲液的渗透浓度为270mOsmol/L~350mOsmol/L。
4-11.根据权利要求4-8所述的制备方法,其中,所述步骤7之后还包括湿热灭菌步骤,湿热灭菌的条件为110~130℃、30~60分钟。
4-12根据权利要求4-8所述的制备方法,其中,所述胶原蛋白是大分子I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成,其中,所述短氨基酸序列如SEQ ID No.:1(G A P G A P G S Q G A P G L Q)所示,重复次数为75~110次。
附图说明
图1为实施例1制备的部分I型重组胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图。对照蛋白以No.4、6、7、10为例。
图2为实施例2制备的部分测试样本放置12个月后的HPLC图。对照蛋白以No.4、7、10、13为例。
图3为No.1和No.6的I型重组胶原蛋白的红外光谱图。
图4为No.1和No.6的I型重组胶原蛋白的拉曼光谱图。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是,这些描述仅仅是示例性的描述,并不构成对本发明范围的限制。
一般性说明:具体实施方式中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买,质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自北京索莱宝公司,基因重组试剂盒(ReorganizationKits)购自天根生物,具体操作完全按照试剂盒的说明进行。
实施例1.利用酵母表达系统制备各种I型重组胶原蛋白
1、酵母表达菌株的构建
构建了分别表达表1所示的No.1~18的I型重组胶原蛋白的酵母表达菌株。具体操作是:根据毕赤酵母密码子偏好优化后,通过全基因合成的方式合成对应的目标基因,并在基因的两端分别添加SnaB I和Not I酶切位点,以SnaBI和NotI酶对目标基因进行双酶切,与同样经SnaB I和Not I酶酶切的pPIC9k在T4连接酶的作用下进行连接,16℃连接过夜后,转入Top10感受态细胞,涂布氨苄抗性平板,挑取阳性转化子,提取质粒后用SacI进行线性化后,电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞中,以G418抗性平板筛选多拷贝转化子,即为I型重组胶原蛋白的表达菌株。
表1各酵母表达菌株表达的I型重组胶原蛋白
2、目标蛋白的诱导表达
(1)挑取酵母表达菌株的单菌落加入到5ml YPD液体培养基中(1%酵母提取物,2%蛋白胨和2%葡萄糖),30℃,200rpm培养过夜进行活化;
(2)以1%的接种量接种于100ml的BMGY液体培养基,30℃,200rpm培养至OD600=6.0~9.0;
(3)在1500g离心力作用下,25℃离心6min收集菌体,并将其悬浮于200ml BMMY液体培养基中,使其起始浓度为OD600=1.0,在30℃,200rpm条件下培养;
(4)每隔24h加甲醇,终浓度为0.5~1.0%,进行诱导表达;
(5)诱导72h,取培养液在12000rpm条件下离心2min,取上清液。
3、I型重组胶原蛋白制备
将发酵制备的上清液经过30kD超滤膜超滤浓缩后,采用CM离子交换柱进行柱分离,以35%的NaCl溶液进行洗脱,收集洗脱液,脱盐浓缩后冻干即为I型重组胶原蛋白制备。取0.1g冻干粉融入100ml生理盐水中,充分溶解后上SDS-PAGE凝胶电泳,进行分子量大小及蛋白电泳纯度的确认。
结果显示构建的18株表达菌均能成功的表达目标蛋白,经分离纯化后制备的蛋白电泳纯度均在99%以上,电泳结果如图1所示。
实施例2:各种I型重组胶原蛋白在水溶液中的稳定性实验
A实验材料
实验所用材料为实施例1中制备的I型重组胶原蛋白No.1~-18。
B实验方法
将A中的实验材料用ddH2O配置成蛋白浓度为1mg/mL的蛋白溶液,在超净工作台中用0.22μm的无菌滤器过滤后分装到无菌离心管中密封,置于25℃±2℃的条件下,分别于0个月、6个月、12个月取样,每次取样3管,检测蛋白纯度(高效液相色谱法测定蛋白纯度),根据纯度变化判定蛋白的稳定性。
C实验结果
测试结果如下表:
表2重组胶原蛋白溶液12个月稳定性测试结果(纯度,%)
通常认为,(1)分子量相同或相近的重组胶原蛋白,重复单元越短,氨基酸组成及分布就越单调,表面电荷负载越大,越不容易达到稳定的平衡状态,因而更易水解;(2)相同重复单元的重组胶原蛋白,重复次数越多,分子量越大,重组胶原蛋白的表面电荷负载越大,越不容易达到稳定的平衡状态,因而更易水解。
但是,由表2可知,本发明的I型重组胶原蛋白(No.1~3)表现出异常优异的水溶液中稳定性,其在水溶液中放置12个月,纯度仍可高达97%以上(参见图2A~G)。
实施例3:I型重组胶原蛋白No.1~3具有反常的水溶液中稳定性的原因初探
1)红外光谱测定
将表1中No.1和No.6的重组胶原蛋白分别配制成溶液后,进行红外光谱测定,用Bruker OPUS7.2对光谱数据进行傅里叶退卷积,截取1700~1600cm-1波段光谱数据,用peakfit v4.12进行二阶导分峰拟合处理,将处理后的数据用orgin作图得到二级结构分布,并计算二级结构的相对含量。两种蛋白的二级结构比较结果如表3及图3所示。
表3红外光谱测定的No.1和No.6的重组胶原蛋白的二级结构
β-sheet/% | random/% | α-helix/% | β-turn/% | R^2 | |
No.1 | 45.95 | 27.34 | 10.56 | 16.14 | 0.9998 |
No.6 | 34.01 | 34.74 | 13.79 | 17.45 | 0.9995 |
2)拉曼光谱测定
将表1中No.1和No.6的重组胶原蛋白分别配制成溶液后,进行拉曼光谱测定,用ThermoFisher Omnic9.2对光谱数据进行平滑基线校正处理,截取1700~1600cm-1波段光谱数据,用peakfit v4.12进行二阶导分峰拟合处理,将处理后的数据用orgin作图得到二级结构分布,并计算二级结构的相对含量。两种蛋白的二级结构比较结果如表4及图4所示。
表4拉曼光谱测定的No.1和No.6的重组胶原蛋白的二级结构
β-sheet/% | random/% | α-helix/% | β-turn/% | R^2 | |
No.1 | 37.96 | 35.78 | 13.08 | 13.18 | 0.9983 |
No.6 | 27.35 | 26.02 | 17.04 | 29.58 | 0.9966 |
从实施例3的测定结果可以看出,重复单元相同但重复次数不同的重组胶原蛋白在二级结构上存在较大差异,这也暗示两者的三级结构存在差异。可以推测No.1~3的I型重组胶原蛋白的空间结构使其表面电荷更为平衡,从而表现出良好的水溶液中的稳定性。
实施例4:注射用胶原蛋白填充剂的制备1
步骤一:将EDC按照0.2mM充分溶解于注射用水中,0.22μm的滤膜过滤除菌后,进行后续使用。
步骤二:将上述No.2的重组胶原蛋白按50mg/ml充分溶解在步骤一配制好的交联剂中,蛋白溶解完全,呈均一澄清的溶液;
步骤三:将步骤二制备的溶液放置于-20℃交联48h后,进行真空冷冻干燥,得到白色的海绵状的蛋白冻干物;步骤四:蛋白冻干物浸泡至注射用水配制的90体积%药用级乙醇溶液配制的5mM的EDC溶液中,进行二次交联,交联时间为36h,得到乳白色凝胶状固体。
步骤五:将上述乳白色凝胶状固体进行冷冻干燥后,粉碎到直径为0.5mm的颗粒,然后进行洗涤去除交联剂:磷酸缓冲液(100ml注射用水中溶解磷酸二氢钾18mg、磷酸氢二钠60mg、氯化钠900mg),洗涤去除交联剂残留,洗涤比例为1:1000,搅拌转速为150rpm,洗涤次数为13次,每40min换液一次。步骤六:洗涤去除交联剂后,按照胶原蛋白冻干物:磷酸缓冲液=1:5比例加入磷酸缓冲液进行溶胀,形成凝胶(此凝胶中的胶原蛋白含量为50±5mg/mL)后,灌装,进行湿热灭菌(121℃,21min)。
实施例5:注射用胶原蛋白填充剂的制备2
步骤一:将EDC按照0.1mM比例充分溶解于注射用水中,0.22μm的滤膜过滤除菌后,进行后续使用。
步骤二:将上述No.1的重组胶原蛋白按60mg/ml充分溶解在步骤一配制好的交联剂中,蛋白溶解完全,呈均一澄清的溶液;
步骤三:将步骤二制备的溶液放置-40℃交联36h后,进行真空冷冻干燥,得到白色的海绵状的蛋白冻干物;
步骤四:蛋白冻干物浸泡至注射用水配制的80体积%药用级乙醇溶液配制的8mMEDC溶液中,进行二次交联,交联时间为24h,交联后得到乳白色的凝胶状固体。
步骤五:将所述乳白色凝胶状固体进行冷冻干燥,粉碎到直径为0.5mm的颗粒,然后洗涤去除交联剂:用磷酸缓冲液和注射用水洗涤去除交联剂残留,洗涤比例为1:800,搅拌转速为150rpm,洗涤次数为16次,第1-10次用注射用水洗涤,第10-16次用磷酸缓冲液洗涤,每40min换液一次。
步骤六:洗涤去除交联剂后,按照胶原蛋白冻干物:磷酸缓冲液=1:5比例加入磷酸缓冲液进行溶胀,形成凝胶(此凝胶中的胶原蛋白含量为50±5mg/mL)后,灌装,进行湿热灭菌(121℃,21min)。
实施例6:注射用胶原蛋白填充剂的制备3
步骤一:将EDC按照0.15mM比例充分溶解于注射用水中,0.22μm的滤膜过滤除菌后,进行后续使用。
步骤二:将上述No.3的重组胶原蛋白按45mg/ml充分溶解在步骤一配制好的交联剂中,蛋白溶解完全,呈均一澄清的溶液;
步骤三:将步骤二制备的溶液放置4℃交联48h后,进行真空冷冻干燥,得到白色的海绵状的蛋白冻干物;
步骤四:蛋白冻干物浸泡至注射用水配制的95体积%药用级乙醇溶液配制的3mMEDC溶液中,进行二次交联,交联时间为48h,得到交联后的乳白色凝胶固体。
步骤五:将得到的乳白色凝胶状固体进行冷冻干燥,粉碎到直径为0.8mm的颗粒,然后进行洗涤去除交联剂:磷酸缓冲液和注射用水洗涤去除交联剂残留,洗涤比例为1:1100,搅拌转速为100rpm,洗涤次数为12次,第1-8次为注射用水洗涤,第10-12次为磷酸缓冲液洗涤,换液/30min。
步骤六:洗涤去除交联剂后,按照胶原蛋白冻干物:磷酸缓冲液=1:5比例加入磷酸缓冲液进行溶胀,形成凝胶(此凝胶中的胶原蛋白含量为50±5mg/mL)后,灌装,进行湿热灭菌(121℃,21min)。
实施例7:交联剂EDC残留量检测
样品的制备:取实施例4、5、6的灌装、湿热灭菌后的胶原蛋白填充剂样品,用无菌水配制2mg/ml的胰酶,取0.2ml胶原蛋白填充剂样品加入0.2ml配制好的胰酶,在37℃放置24h,胶原蛋白填充剂中的蛋白凝胶被胰酶消化为溶于水的肽段,依据《中国药典》2020版四部通则3206碳二亚胺残留量测定法进行检测。
试剂配制
二甲基巴比妥酸试液:称取二甲基巴比妥酸1g于16ml吡啶中,并加水至20ml,混匀。临用现配。
醋酸吡啶溶液:将等体积的冰醋酸和吡啶混匀制成,临用现配。
100μmol/L碳二亚胺对照品贮备液:称取0.0192g碳二亚胺,以水溶解并定容至100ml,得1mmol/L溶液,量取1mmol/L溶液1ml于10ml量瓶,加水定容至刻度,即得100μmol/L碳二亚胺对照品贮备液。临用现配。
碳二亚胺对照品工作液的制备:取100μmol/L碳二亚胺对照品贮备液,用水分别稀释至10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L,即为碳二亚胺对照品工作液。
测定法:取胶原填充剂样品浸提液和碳二亚胺对照品工作液各0.2ml,分别加入二甲基巴比妥酸试液1.8ml;另取水0.2ml作为空白对照,同法操作。混匀各管,室温暗处静置30分钟,分别加入醋酸吡啶溶液2.0ml,混匀后在波长599nm处测定吸光度(如试验有干扰,在测吸光度前以每分钟4000转离心5分钟)。
结果计算:以碳二亚胺对照品工作液的浓度对其相应的吸光度作直线回归,求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程,求出含量,取其平均值。
按下式计算
供试品碳二亚胺残留量(μmol/L)=供试品溶液碳二亚胺的平均浓度×稀释倍数
对于实施例4、5、6的胶原蛋白填充剂样品,测得碳二亚胺的残留量的吸光度平均数分别为0.431、0.442、0.425,水作为空白对照的吸光度平均数为0.440。因此,碳二亚胺的残留量检测结果为未检出,即样品中无交联剂残留。
序列表
<110> 陕西巨子生物技术有限公司
<120> 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法
<130> TPF02062
<141> 2022-01-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln
1 5 10 15
Claims (8)
1.一种注射用胶原蛋白填充剂,其包含经碳二亚胺(EDC)交联的胶原蛋白、注射用水以及辅料。
2.根据权利要求1所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述胶原蛋白是大分子I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成,其中,所述短氨基酸序列如SEQ ID No.:1(G A P G A P G S Q G A P G L Q)所示,重复次数为75~110次、优选80~105次,更优选82~102次。
3.根据权利要求1所述的注射用胶原蛋白填充剂,其基本上不包含碳二亚胺(EDC)。
4.根据权利要求1所述的注射用胶原蛋白填充剂,其中,所述辅料是选自磷酸盐缓冲剂、利多卡因(例如0.3w/v%)、维生素和/或高分子微球(例如PVA微球或蛋白微球)。
5.权利要求1~4中任一项所述的注射用胶原蛋白填充剂的制备方法,其包括:
步骤1:将所述胶原蛋白溶解于用注射用水配制的0.05-0.5mM的EDC溶液中,进行交联,得到一次交联液;其中,交联温度为-80℃~10℃,交联时间为10~48小时;
步骤2:将所述一次交联液进行冷冻干燥,得到海绵状物1;
步骤3:将所述海绵状物1浸泡在用50%-99体积%乙醇水溶液配制的1mM~20mM的EDC溶液中,常温交联5~48小时,得到二次交联产物,其为凝胶状固体;
步骤4:将所述二次交联产物进行冷冻干燥,得到海绵状物2;
步骤5:将所述海绵状物2粉碎成直径为0.2~1mm的颗粒;
步骤6:将所述颗粒置于50-1200倍体积的磷酸缓冲液或注射用水中进行清洗,每间隔1~120分钟换液一次,累计换液5~15次;
步骤7:将经步骤6清洗完毕的所述颗粒溶胀于磷酸缓冲液中,使得所述胶原蛋白的含量为20-150mg/mL,得到所述注射用胶原蛋白填充剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其所述步骤7中的磷酸缓冲液的渗透浓度为270mOsmol/L~350mOsmol/L。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其中,所述步骤7之后还包括湿热灭菌步骤,湿热灭菌的条件为110~130℃、30~60分钟。
8.根据权利要求4-8所述的制备方法,其中,所述胶原蛋白是大分子I型重组胶原蛋白由来自天然人I型胶原蛋白的短氨基酸序列作为重复单元进行多次重复而构成,其中,所述短氨基酸序列如SEQ ID No.:1(G A P G A P G S Q G A P G L Q)所示,重复次数为75~110次、优选80~105次,更优选82~102次。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210100922.4A CN114404668B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
PCT/CN2023/073215 WO2023143392A1 (zh) | 2022-01-27 | 2023-01-19 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210100922.4A CN114404668B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114404668A true CN114404668A (zh) | 2022-04-29 |
CN114404668B CN114404668B (zh) | 2022-10-14 |
Family
ID=81280108
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210100922.4A Active CN114404668B (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114404668B (zh) |
WO (1) | WO2023143392A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115920128A (zh) * | 2022-09-16 | 2023-04-07 | 西北大学 | 注射用可促进自体胶原生成的面部填充剂及其制备方法 |
CN116077743A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-05-09 | 浙江诸暨聚源生物技术有限公司 | 降解可控的可吸收医用防粘连膜及其制备方法 |
WO2023143392A1 (zh) * | 2022-01-27 | 2023-08-03 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140142200A1 (en) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Eyegenix LLC | Keratoprosthesis |
CN107308494A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-03 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种注射用胶原蛋白、制备方法及填充剂 |
CN107441549A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-12-08 | 无锡贝迪生物工程股份有限公司 | 一种胶原蛋白‑硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法 |
CN107812244A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-03-20 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种液态胶原填充剂的制备 |
US20200345897A1 (en) * | 2017-05-05 | 2020-11-05 | Ottawa Heart Institute Research Corporation | Biocompatible hydrogel compositions and uses thereof |
CN112717200A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-04-30 | 常州市中辉医疗器械有限公司 | 一种重组人胶原蛋白可吸收水凝胶皮肤支架及其制备方法、使用方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2337797A2 (en) * | 2008-08-22 | 2011-06-29 | Fibrogen, Inc. | Method for producing double-crosslinked collagen |
KR101317420B1 (ko) * | 2010-03-11 | 2013-10-10 | 한국과학기술원 | 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유 |
US8722854B2 (en) * | 2010-12-23 | 2014-05-13 | Medskin Solutions Dr. Suwelack Ag | Degradation-stabilised, biocompatible collagen matrices |
CN103333508A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-10-02 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 一种注射用胶原蛋白水凝胶及其制备方法 |
WO2019211854A1 (en) * | 2018-05-03 | 2019-11-07 | Collplant Holdings Ltd. | Dermal fillers and applications thereof |
CN114404668B (zh) * | 2022-01-27 | 2022-10-14 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210100922.4A patent/CN114404668B/zh active Active
-
2023
- 2023-01-19 WO PCT/CN2023/073215 patent/WO2023143392A1/zh unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140142200A1 (en) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Eyegenix LLC | Keratoprosthesis |
US20200345897A1 (en) * | 2017-05-05 | 2020-11-05 | Ottawa Heart Institute Research Corporation | Biocompatible hydrogel compositions and uses thereof |
CN107441549A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-12-08 | 无锡贝迪生物工程股份有限公司 | 一种胶原蛋白‑硫酸乙酰肝素复合敷料的制备方法 |
CN107308494A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-03 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种注射用胶原蛋白、制备方法及填充剂 |
CN107812244A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-03-20 | 北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司 | 一种液态胶原填充剂的制备 |
CN112717200A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-04-30 | 常州市中辉医疗器械有限公司 | 一种重组人胶原蛋白可吸收水凝胶皮肤支架及其制备方法、使用方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023143392A1 (zh) * | 2022-01-27 | 2023-08-03 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 |
CN115920128A (zh) * | 2022-09-16 | 2023-04-07 | 西北大学 | 注射用可促进自体胶原生成的面部填充剂及其制备方法 |
CN116077743A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-05-09 | 浙江诸暨聚源生物技术有限公司 | 降解可控的可吸收医用防粘连膜及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114404668B (zh) | 2022-10-14 |
WO2023143392A1 (zh) | 2023-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114404668B (zh) | 无交联剂残留的注射用胶原蛋白填充剂及其制备方法 | |
CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
CN101502677B (zh) | 一种注射用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 | |
CN114369156B (zh) | 包含稳定的大分子i型重组胶原蛋白的注射液 | |
CN114409807B (zh) | 一种稳定的大分子i型重组胶原蛋白及其用途 | |
CN104470530B (zh) | 来自prasinococcale的多糖 | |
CN113683679B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l6t及其制备方法和用途 | |
CN113683680B (zh) | 一种重组ⅰ型人源化胶原蛋白c1l1t及其制备方法和用途 | |
EP2209814A1 (en) | Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers | |
CN111253481B (zh) | 一种仿生智能水凝胶的制备及应用 | |
CN112778412B (zh) | 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
CN101914561B (zh) | 一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白及其生产方法和应用 | |
WO2023143395A1 (zh) | 一种高透皮吸收性的i型重组胶原蛋白及其用途 | |
CN116789804A (zh) | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 | |
CN114452444B (zh) | 低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
CN114350639A (zh) | 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达 | |
CN109464703B (zh) | 一种骨修复材料及其制备方法和应用 | |
JP2023500294A (ja) | 低分子量コンドロイチン硫酸、組成物、製造方法及びそれらの使用 | |
EP1407759B1 (en) | A cosmetic composition in colloidal form comprising hyaluronic acids and chitosan | |
CN117285616B (zh) | 一种重组人源化i+iii型胶原蛋白及应用 | |
CN113683678B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途 | |
CN116478274B (zh) | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 | |
CN118085064A (zh) | 一种重组多肽及其制备方法 | |
CN116102669A (zh) | 一种胶原蛋白的新型交联剂、交联胶原纤维的方法和应用 | |
CN117229430A (zh) | 一种活性短肽改性几丁质及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |