JP2023500294A - 低分子量コンドロイチン硫酸、組成物、製造方法及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、低分子量硫酸コンドロイチン及びその製造方法に関するものである。高分子硫酸コンドロイチンを原料として使って、コンドロイチン硫酸リアーゼ分解、脱蛋白、濾過及び滅菌乾燥の製造工程を経て、平均分子量１０００ダルトン未満の低分子量コンドロイチン硫酸を得ることができる。低分子量コンドロイチン硫酸は分子量分布範囲の狭い、コンドロイチン硫酸二糖の比率は４３～６０％、コンドロイチン硫酸四糖の比率は３０～４５％であり、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖の合計は８７％超、低分子量コンドロイチン硫酸のオリゴ糖含有率が９７％超、タンパク質含有率が０．５％未満であり；一般市場の高分子コンドロイチン硫酸と比較して、本生成物は５０～１００μｇ／ｍＬの濃度で、１ｍＭ過酸化水素で損傷を受けた軟骨細胞に対して、より顕著な修復効果を有し、その修復能力は強く、修復率は１４％～２３％である。この低分子量コンドロイチン硫酸は、関節損傷の治療に用いることができ、医療品、ヘルスケア製品、化粧品、食品などの重要な原料となる。【選択図】なし

Description

本発明は、生化学の技術分野に関し、特に、低分子量コンドロイチン硫酸、組成物、製造方法及びそれらの使用に関するものである。

コンドロイチン硫酸（ＣＳ、即ち高分子コンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸多糖）は、ポリアニオンを含む直鎖多糖の一種である。Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）がβ－１，３グリコシド結合で結合して二糖単位となり、それらがβ－１,４グリコシド結合で互いに結びつき、その後の生合成過程において異なる位置に硫酸基が導入される。コンドロイチン硫酸は、様々な動物の軟骨や結合組織中に広く存在している。

多くの研究により、ＣＳは血中脂質低下作用、抗動脈硬化作用、免疫力増強作用、抗ウイルス肝炎作用、抗腫瘍作用を有することが明らかにされており、整形外科、眼科、循環器疾患、口腔疾患などの医療・食品分野で広く臨床利用されている。例えば、欧州リウマチ連盟が発表した変形性膝関節症の治療に関する勧告では、ＣＳは変形性膝関節症の治療に有効な薬剤とされており、日本では、ＣＳは関節痛緩和のための経口製剤、涙液充填や角膜保護のための点眼剤として、米国では、栄養サプリメントとしてＣＳが販売されており、オーストラリアでは、ＣＳは主に複合製剤に調製されて栄養サプリメントとして販売されている。又、コンドロイチン硫酸ナトリウム（ＣＳ－Ｎａ）、ＣＳ－Ｎａ錠剤、ＣＳ－Ｎａカプセル剤が、中国薬局方２０１５年版に収載され、血中脂質低減、骨・関節疾患治療薬として分類されている。したがって、ＣＳは多様な生物活性と広い応用範囲を持つ高分子物質の一種として、開発上の希少価値が高く及びその利用価値も高い。しかし、従来の高分子ＣＳは見かけの粘度が高く、構造が複雑で、細胞膜を通過しにくいという欠点がある。臨床応用においては、主に生物学的利用能が低く、経口吸収性が悪く、効能が不安定であるという問題に直面する。

天然ＣＳの相対分子量（Ｍｒ）は概して５０～１００ｋＤａであり、異なるプロセス及び供給源によって調製されたＣＳのＭｒ範囲は、概して１０～４０ｋＤａである。Ｍｒが１０ｋＤａより低い場合、低分子量コンドロイチン硫酸（ＬＭＷＣＳ）又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖（ＣＳＯ）と呼ばれる。

ＬＭＷＣＳは通常、酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素法などによってＣＳ製品を分解することによって調製される。酸分解による反応生成物には多くの不純物が含まれ、それらを除去することは容易でない。又、コンドロイチン硫酸上のスルホン基が反応中に程度の差こそあれ脱落し、環境汚染の原因となる。これに対し、酵素加水分解の反応条件は温和であるため、汚染が軽減され、制御し易く、又、酵素加水分解ではスルホン酸基の分解が起こらないため、工業生産に向いている。

特許文献の中国特許第１０２６７６６１３（Ｂ）号明細書の先行技術によれば、牛睾丸由来のヒアルロニダーゼは特異性が低く効率が悪いことが開示され、さらに、コンドロイチン硫酸二糖、四糖、六糖の混合物を得た後、それぞれを分子量５２１Ｄａ、１０２４Ｄａ、１５２７Ｄａの３つの単量体に分離したところ、本発明の低分子量コンドロイチン硫酸とその組成物及び分子量の異なるものが得られたことが開示されている。尚、本工程における二糖の分子量は約３７９Ｄａ及び約４５９Ｄａであり、四糖の分子量は約８３８Ｄａ及び約９１８Ｄａである。又、得られた生成物の薬力学的な検討は、特許文献１では行われていない。

中国特許出願第１０８０７０６２７（Ａ）号明細書には、高コストのコンドロイチン硫酸ＡＣ酵素を使用して、特定の構造と分子量を有するコンドロイチン硫酸Ｄ四糖を得ることが開示されているが、その分子量は１０７８Ｄａで、現行の低分子量コンドロイチン硫酸四糖の約８３８Ｄａ及び約９１８Ｄａとは異なっている。又、この特許出願では、得られた生成物の薬力学的な検討は行われていない。

中国特許第１０３６０２７１１（Ｂ）号明細書には、バクテリアｓｕｌｆｏｌｉｆｏｌｉａを使って発酵時の酵素液を使用するも、その効率は低く、１０００Ｌの発酵液を使っても４００ｋｇの製品しか触媒化できず、得られるコンドロイチン硫酸二糖は４５０～４８０Ｄａの分子量を持ち、二糖の含有量は９７％超であった、ことが開示されている。本発明の組成、分子量における低分子量コンドロイチン硫酸とは異なり、本工程における二糖の分子量は約３７９Ｄａ及び約４５９Ｄａであり、二糖の含有比率は４２～５８％である。また、特許文献１には、その生成物は、鶏軟骨、豚軟骨、牛軟骨を原料とし、特に心筋炎の治療に使用することが開示されている。

定期刊行物「酵素法によるコンドロイチン硫酸オリゴ糖の調製とその抗酸化活性」（食品産業科学技術、２０１７、１３，ｐｐ４８～５２）には、酵素生産株Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.Ｃ２６を使った発酵時のコンドロイチン硫酸酵素（分子量７６ｋＤａ）を利用することが開示されている。触媒効率は低く、反応濃度も２％としか報告されておらず、オリゴ糖の割合も分析されていない。コンドロイチン硫酸二糖と四糖は熱分解によって得られる。二糖のｍ/Ｚは３４２Ｄａと４５８Ｄａ、四糖のｍ/Ｚは９３９Ｄａであり、本発明における、二糖の分子量は約３７９Ｄａと約４５９Ｄａ、四糖の分子量は約８３８Ｄａと、約９１８Ｄａとは異なることがわかる。又、この文献で得られた生成物は、抗酸化活性についてのみ試験されており、他の薬力学的な検討は行われていない。

したがって、低分子量コンドロイチン硫酸の薬力学に関する国内外の研究は十分ではなく、特に、含有量が一定範囲に制御され、平均分子量が１０００ダルトン未満に安定的に制御され、分子量分布の狭い、コンドロイチン硫酸二糖やコンドロイチン硫酸四糖を主成分とするものについての薬力学的な研究は不十分であると考えられる。今後、低分子量コンドロイチン硫酸の関節損傷治療への応用をさらに検討し、国内外の技術研究を補完する必要がある。

本発明は、先行技術における上記欠陥を克服することを目的とし、新規な低分子量コンドロイチン硫酸、組成物、製造方法及びその使用を提供するものである。

上記目的を実現するために、本発明の目的の一つは、以下の技術的解決策を提供することである：低分子量コンドロイチン硫酸であって、前期低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量が１０００ダルトン未満であり、前記低分子量コンドロイチン硫酸の分子量分布の狭い、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖を主成分として含み、前記コンドロイチン硫酸二糖の含有量が４３～６０％、前記コンドロイチン硫酸四糖の含有量が３０～４５％、前記コンドロイチン硫酸二糖と前記コンドロイチン硫酸四糖の合計が８７％超であり、そして、前記低分子量コンドロイチン硫酸の構造の一般式は、以下の式Ｉ：

上記式（Ｉ）中、ｎ＝０～５であり、ｎは整数、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃＝－Ｈ又は－ＳＯ₃Ｎａである、で示される。

また、低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量は、５９０～８３０Ｄａ、好ましくは６７７～７４２Ｄａである。

さらに、低分子量コンドロイチン硫酸において、コンドロイチン硫酸二糖の含有量は４８～５５％であり、コンドロイチン硫酸四糖の含有量は３５～４０％である。

本発明の第２の目的は、以下の技術的解決策を提供することである：低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法であって、原料である高分子コンドロイチン硫酸を、コンドロイチン硫酸リアーゼで加水分解し、平均分子量が１０００ダルトン未満に安定に制御され、分子量分布の狭い低分子量コンドロイチン硫酸生成物を得；この低分子量コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖を主成分として含み、前記コンドロイチン硫酸二糖の含有量が、４３～６０％、前記コンドロイチン硫酸四糖の含有量が、３０～４５％で、前記コンドロイチン硫酸二糖と前記コンドロイチン硫酸四糖の合計が８７％超であり；そして、前記低分子量コンドロイチン硫酸の構造の一般式が、以下の式Ｉ：

である。

上記式（Ｉ）中、ｎ＝０～５であり、ｎは整数、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃＝－Ｈ又は－ＳＯ₃Ｎａである。さらに、コンドロイチン硫酸リアーゼは、以下の工程：沿岸地域、河川堤防、ファーマーズマーケット、屠殺場、食堂からの土壌サンプル、下水又はシルトを選別して同定し、そして大腸菌又は枯草菌によって最適に発現させることにより得られる。

さらに、当該技術的方法は、市販の高分子コンドロイチン硫酸を原料として製造するものであり、原料は、陸上動物及び海洋動物の軟骨組織から得られるものである。原料はさらに、鶏軟骨、豚軟骨、牛軟骨又は鮫骨、好ましくは鮫骨の1種以上の混合物を意味する。

さらに、酵素加水分解反応の操作条件は、以下の通りである。リッター当たりの発酵ブロスに対するコンドロイチン硫酸リアーゼの添加量が１００～３００Ｕ／Ｌ、原料である高分子コンドロイチン硫酸の濃度が１００～７００ｇ／Ｌ、酵素加水分解の時間が６～４０時間、好ましくは６～１０時間、より好ましくは６～８時間、酵素加水分解の温度が２５～３５℃、撹拌速度が１００～７００ｒｐｍ、酵素加水分解のｐＨが６.５～８．５である。さらに、タンパク質を、酵素加水分解反応後に加水分解物から、混合溶媒により除去するが、その際、前記加水分解物と前記混合溶媒の体積比は２～５：１、混合溶媒中のジクロロメタンとイソプロピルアルコールの体積比は３～５：１、混合物は１００～５００ｒｐｍで１０～４０分間撹拌し、３０００～５０００ｒｐｍで１０～３０間遠心分離して、上層の反応溶液を採取する。

さらに、タンパク質を、酵素加水分解反応後の加水分解物から限外濾過により除去し、反応溶液を得ることも可能である。

さらに、タンパク質を除去した上層の反応溶液を、０．２２μｍのカプセルフィルターで濾過及び滅菌し、そして反応溶液を８～１２倍量の無水エタノール中に添加して沈殿させ、そして真空乾燥させる。

さらに、タンパク質を除去した後で、反応溶液を、０．２２μｍのカプセルフィルターで限外濾過及び滅菌し、スプレードライする。

さらに、鮫骨由来の高分子コンドロイチン硫酸と比較して、鮫骨と鶏軟骨の１種以上を酵素加水分解して得られる低分子量コンドロイチン硫酸は、１ｍＭ過酸化水素により損傷を受けた軟骨細胞に対して、５０～１００μｇ／ｍＬの濃度でより著しい修復効果を示し、そしてその修復率は１４％～２３％である。

さらに、特定の含有量範囲の二糖及び四糖を有する低分子量コンドロイチン硫酸は、５０～１６００μｇ／ｍＬの濃度範囲で、１ｍＭ過酸化水素により損傷を受けた軟骨細胞を修復することができ、その修復率は２０％～６２．４％である。

さらに、特定の二糖及び四糖の含有量範囲を有する低分子量コンドロイチン硫酸は、５０～１６００μｇ／ｍＬの濃度範囲で、１ｍＭ過酸化水素により損傷を受けた軟骨細胞を修復でき、その修復率は２０％超、好ましくは４０％超、さらに好ましくは５０％超、そしてさらに好ましくは６０％超とすることができる。

さらに、低分子量コンドロイチン硫酸は、薬剤、化粧品、ヘルスケア製品、食品を製造する分野での応用が可能である。

本発明の別の態様によれば、骨密度を増加させ、関節炎を緩和する加水分解コンドロイチン硫酸組成物が提供される。加水分解性コンドロイチン硫酸とグルコサミンとの組成物の１日の投与量は、現在知られている市販のコンドロイチン硫酸とグルコサミンとの組成物より少なく、例えば、Ｍｏｖｅ ｆｒｅｅ中のコンドロイチン硫酸とグルコサミンの１日の投与量は１７００ｍｇ／日、ＢＪトムソン中のコンドロイチン硫酸とグルコサミンの１日の投与量は１１６０ｍｇ／日である。投与量を減らすことにより、投与を受け入れやすくはなり、骨密度の増加の効果及び関節炎の緩和効果は減りえない。

以下の文脈では、グルコサミンを単に「アンモニア糖」と称することがある。

この文脈では、用語「加水分解性コンドロイチン硫酸」は、用語「コンドロイチン硫酸オリゴ糖（ＣＳＯ）」及び用語「低分子量コンドロイチン硫酸」と同じ意味を有する。

本明細書中で使用される用語「加水分解性コンドロイチン硫酸」は、種々の分子量の加水分解性コンドロイチン硫酸の混合物を意味する。例えば、分子量は、約３００Ｄａ超１００００Ｄａ未満、例えば３７９～１００００Ｄａ、例えば約３５０Ｄａ超、約４００Ｄａ超、約５００Ｄａ超、約６００Ｄａ超、約７００Ｄａ超、約８００Ｄａ超、約９００Ｄａ超、約９０００Ｄａより低く、約８０００Ｄａより低く、約７０００Ｄａより低く、約約６０００Ｄａより低く、約５０００Ｄａより低く、約４０００Ｄａより低く、約３０００Ｄａより低く、約２０００Ｄａより低く、又は約１０００Ｄａより低い、低分子量コンドロイチン硫酸生成物であり、より好ましくは約５９０Ｄａ～８３０Ｄａ、例えば約６００Ｄａ～７５０Ｄａ、さらには６７７～７４２Ｄａである。

一実施形態において、本発明は、以下の技術提案を採用する加水分解コンドロイチン硫酸組成物を提供する：本発明は、加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物に関し、ヒトのための１日量の５０ｍｇ～８００ｍｇの加水分解コンドロイチン硫酸を含有することを特徴とする、加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物に関する。いくつかの実施形態では、加水分解コンドロイチン硫酸を含む組成物は、約５０ｍｇ～８００ｍｇの加水分解コンドロイチン硫酸を含む。別の実施形態では、加水分解コンドロイチン硫酸を含む組成物は、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６１０ｍｇ、約６２０ｍｇ、約６３０ｍｇ、約６４０ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６６０ｍｇ、約６７０ｍｇ、約６８０ｍｇ、約６９０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７１０ｍｇ、約７２０ｍｇ、約７３０ｍｇ、約７４０ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７６０ｍｇ、約７７０ｍｇ、約７８０ｍｇ、約７９０ｍｇ、約８００ｍｇの加水分解コンドロイチン硫酸を含む組成物である。

加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物は、グルコサミンを含有することができることを特徴とする、加水分解コンドロイチン硫酸含有組成物に関する。

本発明は、グルコサミンが、グルコサミン塩酸塩及びグルコサミン硫酸塩の一方又は両方の混合物であってもよいことを特徴とする、加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物に関するものである。

加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物は、加水分解コンドロイチン硫酸が種々の分子量の加水分解コンドロイチン硫酸の混合物であることを特徴とする。

加水分解コンドロイチン硫酸を含む組成物は、グルコサミンに対する加水分解コンドロイチン硫酸の比が、約１：３～１：１０、例えば約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３であり、好ましくは約１：６～１：４、より好ましくは約１：５であることが特徴である。組成物は、ヒトの１日投与量として、約１５０ｍｇ～８０００ｍｇのグルコサミンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、約７２００ｍｇ、約６４００ｍｇ、約５６００ｍｇ、約４８００ｍｇ、約４０００ｍｇ、約３２００ｍｇ、約２４００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約８００ｍｇ、約６００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約１５０ｍｇのグルコサミンを含んでいても良い。組成物は、より好ましくは、約１００ｍｇの加水分解コンドロイチン硫酸と、約５００ｍｇのグルコサミンを含む。組成物は又、約２００ｍｇの加水分解コンドロイチン硫酸と、約１０００ｍｇのグルコサミンとを含んでもよい。

本発明は、加水分解コンドロイチン硫酸組成物に関し、加水分解コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸を酵素加水分解、精製、濃度、スプレードライして得られる混合物で、その分子量は３７９～１００００Ｄａである。

加水分解コンドロイチン硫酸を含む組成物は又、充填剤、崩壊剤、接着剤、オドラント、潤滑剤及びフィルムコーティング剤から選択される、薬剤的に許容可能な賦形剤を含む。

本発明は、加水分解コンドロイチン硫酸組成物及びその製造方法に関するものであり、充填剤としては、微結晶セルロース、デンプン、デキストリン、マンニトール、乳糖等が挙げられるが、これらに限定されないことを特徴としている。崩壊剤としては、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、アルファ化デンプン、低置換ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ－ヒドロキシプロピルセルロース）、重炭酸ナトリウム、クエン酸、酒石酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。粘着剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルク、水添植物油、ポリエチレングリコール、ステアリン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。フィルムコーティング剤組成物としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、レーキ顔料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、加水分解コンドロイチン硫酸組成物及びその製造方法に関するものであり、その調製物としては、錠剤、顆粒、カプセル、丸薬などが挙げられるが、これらに限定されないことを特徴とする。

本発明の組成物は、関節炎を軽減し、痛みを和らげるヘルスケア製品又は医薬品の製造に使用することができる。特に、本発明の組成物は、変形性関節症の軽減、骨密度の増加、骨粗鬆症の改善、又は痛みを和らげるヘルスケア製品又は医薬品の製造に使用することができる。

低分子量コンドロイチン硫酸組成物又は加水分解コンドロイチン硫酸組成物により、血清中の炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β及びＴＮＦ－αのレベル及び／又は血清中の補体Ｃ５ｂ－９のレベルを減少させることができる。

低分子量コンドロイチン硫酸組成物又は加水分解コンドロイチン硫酸組成物は、大腿骨中のヒドロキシプロリンレベルを増加させることができる。

先行技術と比較して、コンドロイチン硫酸の酵素加水分解により製造された加水分解コンドロイチン硫酸は、骨密度の増加、骨粗鬆症の改善、関節炎の緩和を目的としたヘルスケア製品の製造に用いることができ、投与量が少なく、胃腸への刺激も少ない。本発明の組成物に含まれる加水分解コンドロイチン硫酸及びグルコサミン成分のヒトの１日投与量は、現在市販されている公知のコンドロイチン硫酸及びグルコサミンより低い。投与量を減らすことによって服用のコンプライアンスを改善することができるが、骨密度の増加や関節炎の軽減の効果を低下させることはない。マウスを用いた関節炎の痛みの程度とヒト１日投与量を評価した結果、加水分解コンドロイチン硫酸の１日投与量が５０～８００ｍｇであると、変形性関節症の痛みに対する明らかな緩和と治療の効果があり、組成物にグルコサミンを加えることで変形性関節症及び骨粗鬆症の痛みに対する緩和と治療の効果を増大させ得ることが分かった。

先行技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。
１．コンドロイチン硫酸リアーゼは、沿岸地域、河川堤防、ファーマーズマーケット、屠殺場及び食堂からの、土壌サンプル、下水又はヘドロを選別し同定してから、大腸菌又は枯草菌によって最適に発現されることにより得られ、良好な特定化能を持ち、酵素活性の高いコンドロイチン硫酸リアーゼを、酵素加水分解に用いる。平均分子量１０００ダルトン未満の低分子量コンドロイチン硫酸が安定的に得られ、特に平均分子量５９０～８３０Ｄａで分子量分布の狭い、低分子量コンドロイチン硫酸を得ることができること。
２.タンパク質を溶媒法又は限外濾過法により除去し、そのタンパク質含有量は０．５％以下であること。
３.１００Ｌの発酵ブロスで、４００ｋｇ超の高分子コンドロイチン硫酸を触媒化する。このことには、生産サイクルが短く、効率が高く、工業的な倍増化に適しているという利点がある。
４.ＬＣ－ＭＳ分析により、各成分のオリゴ糖の割合を測定する。製品品質は安定している。低分子量コンドロイチン硫酸中の二糖、四糖、六糖、八糖の総オリゴ糖含有量は９７％を超え、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖が主成分として含有される。コンドロイチン硫酸二糖の含有量は４３～６０％、コンドロイチン硫酸四糖の含有量は３０～４５％で、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖の合計が８７％超であることを特徴とする。
５.鮫骨に含まれる高分子コンドロイチン硫酸に比べ、鮫骨と鶏軟骨の１種以上を酵素加水分解して得られる低分子量コンドロイチン硫酸は、１ｍＭ過酸化水素で損傷を受けた軟骨細胞に対して、その濃度が５０～１００μｇ／ｍＬでより顕著な修復効果を示し、その修復率は１４～２３％で、関節損傷の治療に使用可能である。鮫骨から得られる低分子量コンドロイチン硫酸の修復効果は、鶏軟骨、豚軟骨、牛軟骨及び混合骨から得られる修復効果よりも優れている。鮫骨、鶏軟骨、豚軟骨、牛軟骨、混合骨から得られた低分子量コンドロイチン硫酸は、５０μｇ／ｍＬの濃度で、１ｍＭ過酸化水素で損傷を受けた軟骨細胞に対して、鮫骨から得られた高分子コンドロイチン硫酸よりも顕著な修復効果を示すことが分かった。

図１は、実施例９の鮫骨由来の低分子量コンドロイチン硫酸のオリゴ糖分布スペクトルである。 図２は、実施例１０の鮫骨由来の低分子量コンドロイチン硫酸のオリゴ糖分布スペクトルである。 図３は、実施例１１の鮫骨由来の低分子量コンドロイチン硫酸のオリゴ糖分布スペクトルである。 図４は、実施例１２の鮫骨由来の低分子量コンドロイチン硫酸のオリゴ糖分布スペクトルである。 図５は、実施例１４における異なる供給源からの低分子量コンドロイチン硫酸の有効性及び活性試験結果である。 図６は、本発明の組成物のマウスの体重への効果を示す図である。 図７は、本発明の組成物のマウスの支持力への効果を示す図である。 図８は、コントロール群１における、純度９７．７２％の低分子量コンドロイチン硫酸のオリゴ糖分布スペクトルを示す図である。 図９は、異なる濃度レベルにおける、１ｍＭ過酸化水素傷害により損傷を受けた軟骨細胞に対する実施例９のサンプルとコントロール群１及び２の修復効果を示す図である。 図１０Ａは、マウスにおける、種々の投与群の、ＩＬ－６（Ａ）、ＩＬ－１β（Ｂ）、ＴＮＦ－α（Ｃ）及びＣ５ｂ－９（Ｄ）の血清濃度への効果を示す図である。 図１０Ｂは、マウスの大腿骨におけるヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）レベルの決定を示す図である。 図１０Ｃは、マウスの膝関節におけるサフラニンＯ－ファストグリーン染色（１００倍）を示す図である。 図１０Ｄは、マウス膝関節におけるサフラニンＯ－ファストグリーン染色時の病理学的スコアを示す図である。 図１０Ｅは、マウス膝関節のＣ５ｂ－９免疫組織化学染色（×１００）を示す図である。 図１０Ｆは、マウス膝関節のＣ５ｂ－９陽性細胞数を示す図である。 図１１Ａは、膝関節へのパパイン注入により誘発されたラット変形性関節症モデルにおいて、ＣＳＯ投与試験を行った際の、ラットの体重変化を示す図である。 図１１Ｂは、膝関節へのパパイン注入により誘発されたラット変形性関節症モデルにおいて、ＣＳＯ投与試験を行った際の、ラットの血清ＩＬ－６のレベルを示す図である。 図１１Ｃは、膝関節へのパパイン注入により誘発されたラット変形性関節症モデルにおいて、ＣＳＯ投与試験を行った際の、ラットの血清ＩＬ－１βのレベルを示す図である。 図１１Ｄは、膝関節へのパパイン注入により誘発されたラット変形性関節症モデルにおいて、ＣＳＯ投与試験を行った際の、ラットの血清ＴＮＦ－αのレベルを示す図である。 図１１Ｅは、膝関節へのパパイン注入により誘発されたラット変形性関節症モデルにおいて、ＣＳＯ投与試験を行った際の、ラットの膝関節の病理学的染色（１００倍）結果を示す。 図１１Ｆは、膝関節へのパパイン注入により誘発されたラット変形性関節症モデルにおいて、ＣＳＯ投与試験を行った際の、ラットの膝関節の病理学的スコアを示す図である。 図１２Ａは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの体重変化を示す図である。 図１２Ｂは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、雄ラットの体重変化を示す図である。 図１２Ｃは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、雄ラットの大腿骨重量係数を示す図である。 図１２Ｄは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、雌ラットの大腿骨重量係数を示す図である。 図１２Ｅは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、雌ラットの骨密度を示す図である。 図１２Ｆは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、雄ラットの骨密度を示す図である。 図１２Ｇは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの大腿骨灰レベルを示す図である。 図１２Ｈは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣摘出誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの骨リンレベルを示す図である。 図１２Ｉは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣摘出誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルを示す図である。 図１２Ｊは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣摘出誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ－４）の血清レベルを示す図である。 図１２Ｋは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣摘出誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの血清カルシトニン（ＣＴ）濃度を示す図である。 図１２Ｌは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣摘出誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの血清副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベルを示す図である。 図１２Ｍは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発性骨粗鬆症及び雄ラットの精巣摘出誘発性骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの大腿骨骨梁（femoral trabecula）の面積を示す図である。 図１２Ｎは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの大腿骨骨梁面積の百分率を示す図である。 図１２Ｏは、ＣＳＯによる、雌ラットの卵巣摘出誘発骨粗鬆症及び雄ラットの精巣誘発骨粗鬆症への治療効果を調べる試験における、ラットの大腿骨骨梁の数を示す図である。

当業者が本発明を理解しやすくするために、以下、実施例を参照して本発明の技術的解決策をさらに説明するが、以下の内容は添付の請求項により請求される発明の範囲を何ら限定するものではない。

以下の実施例で使用した材料、試薬等は、特に断らない限り、市販のものである。コンドロイチン硫酸リアーゼは、沿岸地域、河川堤防、ファーマーズマーケット、屠殺場及び食堂からの、土壌サンプル、下水又はシルトを選別し同定し、大腸菌又は枯草菌によって最適に発現されることにより得られるものである。酵素としての最高活性は１１９７６．５Ｕ／Ｌで、酵素には９９８個のアミノ酸が含まれ、分子量は１１３ｋＤａであった。コンドロイチン硫酸リアーゼのアミノ酸配列は、同一出願人の発明に係る別の特許出願（出願日：２０１９年４月３日、出願番号：２０１９１０２６４３８５．５、公開日：２０１９年６月２１日、公開番号：中国特許出願第１０９９１３４３７（Ａ）号明細書において開示されている。当該特許出願の関連内容は全て本特許出願に援用されている。

低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量の計算式は、以下の通りである。

上記の式中、ｒ_t＝ｒ_U1＋ｒ_U2＋ｒ_U3＋ｒ_U4＋ｒ_U5である。
ここで、ｒ_u1：サンプル溶液中の成分１（六糖、八糖）のピーク応答値；Ｍ_w1は、サンプル溶液中の成分１の分子量である。
ｒ_u2：サンプル溶液中の成分２（四糖）のピーク応答値；Ｍ_w2はサンプル溶液中の成分２の分子量である。
ｒ_u3：サンプル溶液中の成分３（四糖類）のピーク応答値；Ｍ_w3はサンプル溶液中の成分３の分子量である。
ｒ_u4：サンプル溶液中の成分４（二糖類）のピーク応答値；Ｍ_w4はサンプル溶液中の成分４の分子量である。
ｒ_u5：サンプル溶液中の成分５(二糖類)のピーク応答値；Ｍ_w5はサンプル溶液中の成分５の分子量。
ｒ_t：サンプル溶液中の成分１、成分２、成分３、成分４、成分５のピーク応答値の総和。

鮫骨由来の高分子コンドロイチン硫酸を酵素加水分解して得られた低分子量コンドロイチン硫酸中の二糖（ｎ＝０）、四糖（ｎ＝１）、六糖（ｎ＝２）、八糖（ｎ＝３）の分子量は異なっていることが判った。十糖（ｎ＝４）、十二糖（ｎ＝５）の含有量は非常に少ないので、オリゴ糖組成物の平均分子量を計算する際には無視した。実施例９で得られたサンプルについて、液体質量分析法で測定した二糖、四糖、六糖、八糖の分子量を以下の表１に示す。

実施例１．酵素加水分解反応

５Ｌのガラスビーカーに２Ｌの精製水を加え、攪拌速度４００ｒｐｍで鮫骨由来のコンドロイチン硫酸８００ｇを添加した。溶解後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調整し、２００Ｕ／Ｌのコンドロイチン硫酸リアーゼを添加した。系内を３０℃で６時間撹拌し、平均分子量が１０００Ｄａ未満になったかどうかを検出した。反応が完了していない場合は、さらに４時間反応時間を延長し、中心制御を継続した。平均分子量が１０００Ｄａ未満になるまで反応を継続した。

実施例２．酵素加水分解反応

５Ｌのガラスビーカーに２Ｌの精製水を加え、攪拌速度７００ｒｐｍで鮫骨由来のコンドロイチン硫酸４００ｇを添加した。全ての原料が溶解した後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６．５に調整し、３００Ｕ／Ｌのコンドロイチン硫酸リアーゼを添加した。系を３５℃で６時間攪拌し、平均分子量が１０００Ｄａ未満になったかどうかを検出した。反応が完了していない場合は、さらに４時間反応時間を延長し、中心制御を継続した。平均分子量が１０００Ｄａ未満になるまで反応を継続した。

実施例３．酵素加水分解反応

５Ｌのガラスビーカーに２Ｌの精製水を加え、攪拌速度１００ｒｐｍで鮫骨由来のコンドロイチン硫酸２００gを添加した。全ての原料が溶解した後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを８．０に調整し、１００Ｕ／Ｌのコンドロイチン硫酸リアーゼを添加した。系を２５℃で６時間撹拌し、平均分子量が１０００Ｄａ未満になったかどうかを検出した。反応が完了していない場合は、さらに４時間反応時間を延長し、中心制御を継続した。平均分子量が１０００Ｄａ未満になるまで反応を継続した。

実施例４．酵素による加水分解反応

５Ｌのガラスビーカーに２Ｌの精製水を加え、攪拌速度を５００rpmに制御し、鮫骨由来のコンドロイチン硫酸１４００ｇを添加した。全ての原料が溶解した後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを８．５に調整し、２８０Ｕ／Ｌのコンドロイチン硫酸リアーゼを添加した。系を２８℃で６時間攪拌し、平均分子量が１０００Ｄａ未満になったかどうかを検出した。反応が完了していない場合は、さらに４時間反応時間を延長し、中心制御を継続した。平均分子量が１０００Ｄａ未満になるまで反応を継続した。

実施例５．タンパク質の除去

実施例１の反応後の加水分解物２Ｌを採取し、遠心分離機に移した。反応後の加水分解物を４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離して葉状態物を除去し、上清を取り、０．４Ｌの有機溶媒（ジクロロメタンとイソプロピルアルコールの体積比＝５：１）を加えて、タンパク質を除去した。１００ｒｐｍで４０分間攪拌し、４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、反応溶液の上層を取り出し、注液した。

実施例６．タンパク質の除去

実施例２の反応後の加水分解物２．１Ｌを採取し、遠心分離機に移した。反応後の加水分解物を４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離して葉状態物を除去し、上清を取り、０．７Ｌの有機溶媒（ジクロロメタンとイソプロピルアルコールの体積比＝４：１）を加えて、タンパク質を除去した。５００ｒｐｍで１０分間攪拌し、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、反応溶液の上層を取り出し、注液した。

実施例７．タンパク質の除去

実施例３の反応後の加水分解物２Ｌを採取し、遠心分離機に移した。反応後の加水分解物を４２００ｒｐｍで１５分間遠心分離して葉状態物を除去し、上清を取り、有機溶媒（ジクロロメタンとイソプロピルアルコールの体積比＝３：１）１Ｌを加えてタンパク質を除去した。３００ｒｐｍで３０分間攪拌し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、反応溶液の上層を取り出し、注液した。

実施例８．タンパク質の除去

実施例４の反応後の加水分解物２．３Ｌを採取し、低温条件下でカットオフ分子量が５０，０００～８０，０００の膜バッグにより限外濾過を行い、タンパク質を除去して限外濾過反応溶液を得た。

実施例９．アルコールの沈殿と乾燥

実施例５で得られた反応溶液の上層２Ｌを、０．２２μｍのカプセルフィルターでろ過し、クリーン域へ滅菌して入れた。次に、得られた濾液を２０Ｌの無水エタノールに滴下し、０．５時間撹拌した後、２時間静置した。固形分を完全に沈殿させた後、上澄みを除去した。遠心濾過により固形分を回収し、真空乾燥炉で４５℃、２４時間、重量減少が１０％以下になるまで乾燥させた。そして、６５０ｇの低分子量コンドロイチン硫酸生成物を収率８１．３％で得た（即ち、鮫骨からの原料としてのコンドロイチン硫酸８００ｇに対する低分子量コンドロイチン硫酸６５０ｇの割合）。クーマシーブライトブルー法で検出されたタンパク質含有量は０．３％であった。液体質量分析法により分子量分布を求めたところ、図１に示すように、成分１のピーク保持時間は５．８７９分、成分１の含有量は９．５１％であり、六糖と八糖を主成分とするものであった。ピーク保持時間が８．６３２分の成分２は四糖であり、その含有量は３３．８３％であった。ピーク保持時間８．９６６分の成分３も四糖であり、その含有量は５．０７％であった。ピーク保持時間９．８４６分の成分４は二糖で、その含有量は４７．０８％であった。ピーク保持時間が１０．７８６分の成分５も二糖であり、その含有量は２．０３％であった。ピークの保持時間が１２．５０６分である成分６は塩のピークであった。したがって、二糖類、四糖類、六糖類、八糖類を含む低分子量コンドロイチン硫酸の総含有量は、二糖類と四糖類を主成分とする９７．５２％で、そのうち二糖類と四糖類の含有量の和は８８．０１％であることが分かった。鮫骨の酵素加水分解で得られた低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量は７０４．３～７４１．２Ｄａで、特別に計算すると次のようになった。

成分１がすべて六糖であったと仮定すると、その平均分子量は、

であり、
成分１がすべて八糖類であったとすると、その平均分子量は、

となる。

分子量は、液体質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）により、以下の具体的な分析条件にて分析した。
クロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム１：ＴＳＫガードカラム ＳＷＸＬ ７μｍ，６ｍｍ×４ｃｍ
クロマトグラフィーカラム２：ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ ５μｍ，７．８ｍｍ×３０ｃｍ
フローレート：１ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：１０μＬ
カラム温度：３０℃
検出波長：１９５ｎｍ
捕集時間：２５分
バッファー：０．３８ｇのギ酸アンモニウムを水で２０００ｍＬに希釈し、均一に混合した後、ろ過して得た。
移動相：緩衝液とメタノールの体積比は９：１であった。
マススペクトルの条件：
イオンモード：負イオンモード［Ｍ－Ｈ］－。
破砕電圧：７０Ｖ
質量／電荷比の範囲：３００－１０００ｍ／ｚ
乾燥ガス流量：１２Ｌ/ｍｉｎ
スプレー器圧力：３５ｐｓｉｇ
キャップ電圧:３０００Ｖ。

分子量検出の結果は以下の通りであり、二糖の対応する分子量は３７８．１及び４５８．１であり、四糖の対応する分子量は８３７．２及び９１７．１であった。

実施例１０．アルコールの沈殿と乾燥

実施例６で得られた反応溶液の上層２Ｌを、０．２２μｍのカプセルフィルターでろ過し、クリーン域へと滅菌していれた。次に、得られた濾液を１６Ｌの無水エタノールに滴下し、０．５時間撹拌した後、２時間静置した。固形分を完全に沈殿させた後、上澄みを除去した。遠心濾過により固形分を回収し、真空乾燥炉にて５０℃、２４時間、重量減少が１０％以下になるまで乾燥させた。そして、低分子量コンドロイチン硫酸生成物３２０ｇを収率８０．０％で得た（即ち、鮫骨由来のコンドロイチン硫酸原料４００ｇに対する低分子量コンドロイチン硫酸３２０ｇの割合）。クーマシーブライトブルー法により検出されたタンパク質含有量は０．４％であった。液体質量分析法により分子量分布を測定したところ、図２に示すように、成分１のピーク保持時間は５．８７８分、成分１の含有量は９．５０％であり、主に六糖と八糖から構成されていた。ピーク保持時間が８．６２５分の成分２は四糖であり、その含有量は３３．９０％であった。ピーク保持時間８．９５８分の成分３も四糖であり、その含有量は５．０８％であった。ピーク保持時間９．８３８分の成分４は二糖であり、その含有量は４６．８６％であった。ピーク保持時間１０．７８５分の成分５も二糖類であり、その含有量は２．１３％であった。ピークの保持時間が１２．５０５分の成分６は塩のピークであった。したがって、二糖、四糖、六糖、八糖を含む低分子量コンドロイチン硫酸の総含有量は９７．４７％であり、主に二糖と四糖であって、二糖と四糖の含有量の和は８７．９７％であった。鮫骨の酵素加水分解で得られた低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量は７０４．７～７４１．６Ｄａで、具体的な計算過程は次の通りであった。

成分１がすべて六糖類であったとすると、その平均分子量は、

であり、
成分１がすべて八糖類であったと仮定すると、その平均分子量は

である。

実施例１１．アルコール沈殿と乾燥

実施例７で得られた反応溶液の上層２Ｌを、０．２２μｍのカプセルフィルターでろ過し、クリーン域へ滅菌していれた。次に、得られた濾液を２４Ｌの無水エタノール中に滴下し、０．５時間撹拌した後、２時間静置し、固形分を完全に沈殿させた後、上澄みを除去した。遠心濾過により固形分を回収し、真空乾燥炉にて４０℃、２４時間、重量減少が１０％以下になるまで乾燥させた。低分子量コンドロイチン硫酸生成物１５０ｇを、収率７５．０％で得た（すなわち、鮫骨由来のコンドロイチン硫酸原料２００ｇに対する低分子量コンドロイチン硫酸１５０ｇの割合）。クーマシーブライトブルー法により検出されたタンパク質含有量は０．４％であった。液体質量分析法により分子量分布を求めたところ、図３に示すように、成分１のピーク保持時間は５．８７９分、成分１の含有量は８．６２％であり、六糖と八糖を主成分とするものであった。ピーク保持時間が８．６３２分の成分２は四糖であり、その含有量は３０．７９％であった。ピーク保持時間８．９６６分の成分３も四糖であり、その含有量は４．４１％であった。ピーク保持時間９．８７２分の成分４は二糖類であり、その含有量は５２．４９％であった。ピーク保持時間が１０．７８６分の成分５も二糖で、その含有量は２．０２％であった。ピークの保持時間が１２．５１２分の成分６は塩のピークであった。したがって、二糖、四糖、六糖、八糖を含む低分子量コンドロイチン硫酸の総含有量は９８．３２％で、主に二糖と四糖であって、二糖と四糖の含有量の和は８９．７０％であった。鮫骨の酵素加水分解で得られた低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量は６７９．２～７１２．５Ｄａであり、具体的な計算過程は以下の通りであった。

成分１がすべて六糖であったと仮定すると、その平均分子量は

であった。
成分１がすべて八糖類であったと仮定し、その平均分子量は

であった。

実施例１２．スプレードライ

実施例８で得られた反応溶液の上層２Ｌを、０．２２μｍのカプセルフィルターを通してクリーン域に濾過・滅菌して入れ、スプレードライした。スプレードライの条件は、入口空気温度１２０℃、出口空気温度６０℃、流速１００ｒｐｍとした。そして、低分子量コンドロイチン硫酸生成物１２００ｇを収率８５．７％で得た（即ち、鮫骨由来のコンドロイチン硫酸原料１４００ｇに対する低分子量コンドロイチン硫酸１２００ｇの割合）。クーマシーブライトブルー法により検出されたタンパク質含有量は０．５％であった。液体質量分析法により分子量分布を測定したところ、図４に示すように、成分１のピーク保持時間は５．８７６分、成分１の含有量は８．５０％であり、主に六糖と八糖で構成されていることがわかった。ピーク保持時間が８．６３６分の成分２は四糖であり、その含有量は３０．５９％であった。ピーク保持時間８．９６３分の成分３も四糖であり、その含有量は４．４３％であった。ピーク保持時間９．８７０分の成分４は二糖であり、その含有量は５２．６９％であった。ピーク保持時間が１０．７８３分の成分５も二糖類であり、その含有量は２．１４％であった。ピークの保持時間が１２．５１０分の成分６は塩のピークであった。したがって、二糖、四糖、六糖、八糖を含む低分子量コンドロイチン硫酸の総含有量は９８．３５％で、主に二糖と四糖であって、二糖と四糖の含有量の和は８９．８５％であった。鮫骨の酵素加水分解で得られた低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量は６７７．４～７１０．２Ｄａで、具体的な計算過程は以下の通りであった。

成分１がすべて六糖であったと仮定すると、その平均分子量は

であった。
成分１がすべて八糖類であったと仮定すると、その平均分子量は

であった。

実施例１３

実施例１の酵素加水分解反応、実施例５のタンパク質除去工程、実施例９のアルコール沈殿乾燥工程に従い、山東宝麗居社から入手した、牛軟骨、豚軟骨、鶏軟骨、及び鶏軟骨と鮫骨の混合骨コンドロイチン硫酸を用いて、それぞれ９０％の含有量で４種類の異なる供給源からの低分子量コンドロイチン硫酸を得た。

実施例１４．効能と活性の試験

（1）サンプルの製造
（１．１）実施例９のサンプルは、実施例１の酵素加水分解反応工程で得たものである。
（１．２）コントロール群１のサンプル：純度９７．７２％の二糖０．６３gと深海魚由来のオリゴマーペプチド（寧夏バニラバイオテクノロジー社製、規格９８％）０．４１gとの混合物である。計算上、深海魚由来の二糖は６１．５６％、オリゴペプチドは４０．１８％となった。
９７．７２％の二糖サンプルの製造プロセスは以下の通りである。
移動相の調製
Ａ：２０ｍＭ トリス、ＨＣｌでｐＨを７．５に調整したもの。
Ｂ：２０ｍＭ トリス、１ＭＮａＣｌ、ＨＣｌによりｐＨを７．５に調整。
サンプルの処理
実施例９のサンプル２０ｇの粉末を秤量し、１Ｌの移動相Ａに溶解させた。
工程：精製前にＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ充填剤を移動相Ｂで洗浄し、移動相Ａで平衡化した後、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－ＦＦ充填剤にサンプルを充填し、透過ピークを採取した。カラムに吸着した四糖を移動相Ｂで洗浄し、溶出したピークを回収し、単一の二糖のピークが検出されるまでクロマトグラフィー精製相内を再循環させた。
脱塩：検出された単一の二糖類のピークを合わせて回収し、グルコースゲルカラムで脱塩した。サンプルを、注入前に、導電率が０．１ｍｓ／ｃｍより低くなるまで精製水で洗浄し、サンプル注入量がカラム容量の２０％～３０％になるようにした。その後、精製水でカラムを洗浄し、導電率が１ｍｓ／ｃｍより低いピークを回収した。
凍結乾燥：脱塩したピークを回収し、－２０℃で予備凍結した後、凍結乾燥機に投入し凍結乾燥させた。凍結乾燥して粉末にした後、純度９７．７２％の二糖類を回収した。この二糖の純度は次のようにして測定した。ＨＰＬＣを用いて分子量分布を測定したところ、図８に示すような結果が得られた。ピーク保持時間が９．２６５分の成分１は四糖であり、含有量は２．２８％であった。ピーク保持時間１０．０７０分の成分２は二糖で、その含有率は６５．７９％であった。ピーク保持時間１０．９３７分の成分２は二糖で、その含有率は３１．９３％であった。図８中の塩のピークは積分していない。
（１．３）コントロール群２のサンプル：山東宝理亞公司社製の鮫骨高分子コンドロイチン硫酸を９０％含有するものを使用した。平均分子量は約７００００Ｄａで、二糖と四糖はほとんど含まれていない。

（２）培地、溶液、細胞の調製。
（２．１）基本培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地。
（２．２）増殖培地：１８０ｍＬの基本培地に、２０ｍＬの牛胎児血清（ＦＢＳ）を加え、２℃～８℃で保存した。
（２．３）完全培地：ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）＋ウシ胎児血清細胞Ｐ５(第５世代)。
（２．４）１ｍＭＨ₂Ｏ₂刺激液：３０％（９７９０ｍＭ）の過酸化水素を０．２μｍの滅菌フィルターで濾過し、基本培地で１ｍＭに希釈して使用した。
（２.５）サンプル原液１及び２：一定重量のサンプル［牛骨由来ＣＳＯオリゴ糖（実施例１３）、豚骨由来ＣＳＯオリゴ糖（実施例１３）、鮫骨由来ＣＳＯオリゴ糖（実施例９）、鶏骨由来ＣＳＯオリゴ糖（実施例１３）、鶏骨・鮫骨由来ＣＳＯオリゴ糖（実施例１３）、鮫骨由来ＣＳＯ多糖（山東宝鶏）］を計量し、サンプル原液とした。希釈液にはＤＰＢＳを用い、１０ｍｇ／ｍＬのサンプル原液１を調製し、０．２μｍの滅菌濾過膜で濾過して使用した。
実施例９のサンプル、コントロール群１及び２のサンプルを一定重量ずつ秤量し、ＤＰＢＳを希釈液として１０ｍｇ／ｍＬのサンプル原液２を調製し、０．２μｍの滅菌濾過膜で濾過して使用した。
（２．６）グラジエント溶液１及び２で検出されたサンプル。
上記で調製したサンプル溶液１をさらに塩基性培地で希釈し、それぞれ５０μg／mLと１００μg／mLの濃度の２種類の希釈系列を調製した。
上記で調製したサンプル溶液２をさらに塩基性培地で希釈し、５０～３２００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で７系列の希釈液を調製した、すなわち、それぞれ、５０、１００、２００、４００、８００、１６００、３２００μｇ／ｍＬとした。
（２．７）細胞培養の製造
ＡＴＤＣ５細胞を増殖培地で蘇生し、湿潤下、温度３７±２℃、二酸化炭素濃度５±１％のインキュベーターで培養した。培養の約７０％から９０％にコンフルエンスが、適当な倍率の顕微鏡（例えば：１０－４０倍）により観察されたとき、増殖培地をサブカルチャーとして使用した。
細胞培地を細胞通過のために除去した。細胞はＤＰＢＳで１回洗浄した。その後、０．２５％のトリプシンを含む約０．５ｍＬの溶液で約１分間浸潤させると、細胞は丸くなり、表面から剥がれた。顕微鏡で見ると、細胞の形態は丸くなり、一部は瓶の壁から離れるので、直ちに完全培地に加え、消化を止めた。ピペットで培地を吸い、細胞を瓶壁から吹き飛ばし、細胞を培地中に均一に分散させた後、細胞懸濁液を１５ｍＬの遠心管に移し、１０００ｒ／ｍで５分間遠心分離を行った。遠心上清を捨てた後、細胞を２ｍＬの完全培地で再懸濁し、新しいＴ２５角フラスコ２本にそれぞれ移し替えた。各角フラスコにそれぞれ５ｍＬの完全培地を加え、穏やかに混合し、炭酸ガス（３７℃、５％ＣＯ₂）を含むインキュベーターに入れ、培養を行った。
細胞通過４～２０、コンフルエンス７０～９０％を使って、細胞を２～５日以内に二次培養した。細胞培養の調製手順に従って、２×１０⁶／ｍＬの生細胞を含む適量の細胞溶液を増殖培地に調製した。９６ウェルの透明な細胞培養プレートを取り、各ウェルに約６０００個の細胞が入るように１００μＬの細胞溶液を添加した。細胞の沈降を防ぎ、各ウェルの均一性を確保するため、細胞液を添加する際、頻繁に攪拌した。このプレートを炭酸ガスからなるインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内で一晩（２４時間）培養した。
培養後、翌日（２４時間）、元の培地を捨て、１ｍＭＨ₂Ｏ₂の５０μＬを各ウェルに添加した（１ｍＭＨ₂Ｏ₂刺激液の製造方法は工程４．２参照）。次に、異なる供給源、異なる濃度のコンドロイチン硫酸の勾配検出溶液を各ウェルに添加し（サンプル検出勾配溶液製造法は工程４．３参照）、さらに炭酸ガス（３７℃、５％ＣＯ₂）からなるインキュベーター内に入れ、１２時間培養を行った。
培養後、翌日（１２時間）にさらに２時間、各ウェルに１０μＬのＣＣＫ－８溶液を添加した。反応後、直ちに多機能酵素プレートアナライザーで４５０ｎｍの吸光度値を検出した。各サンプルについて２回並行して実験を行い、最終的に吸光度の平均値を取ることとした。

（３）異なる動物由来の低分子量コンドロイチン硫酸と高分子コンドロイチン硫酸との細胞活性の比較。
異なる動物由来の低分子量コンドロイチン硫酸と高分子コンドロイチン硫酸について、損傷を受けた軟骨細胞に対する修復効果をＣＣＫアッセイにより調べた。図５に示すように、有効性試験の結果、鮫骨由来の高分子コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸多糖類）と比較して、鮫骨と鶏骨の１つ以上を酵素加水分解して得られる低分子量コンドロイチン硫酸は、５０～１００μｇ／ｍＬの濃度下で、１ｍＭ過酸化水素で損傷を受けた軟骨細胞に対して、より著しい修復効果があることが示され、その修復能は１４％～２３％であり、関節損傷の治療に利用することができた。

（４）異なる成分を含む、鮫骨由来の低分子量コンドロイチン硫酸と鮫骨由来の高分子コンドロイチン硫酸の細胞活性の比較。
コントロール群１では、純度９７．７２％の二糖類０．６３ｇを、フィッシュコラーゲンオリゴペプチド０．４１ｇと混合した。計算上、二糖の含有量は６１．５６％、深海魚由来のオリゴペプチドの含有量は４０．１８％（寧夏バニラバイオテクノロジー社製、規格は９８％）であった。
その結果を表Ａ及び図９に示す。１ｍＭ過酸化水素で損傷を受けた軟骨細胞に対する本発明の生成物の修復効果は、５０～３２００μｇ／ｍＬの濃度範囲において、コントロール群１及び２よりも顕著であった。中でも、本発明の生成物は、５０～１６００μｇ／ｍＬの濃度範囲で軟骨細胞の修復率に改善効果を示し、濃度が高くなれなるほど、より高い改善効果が得られることが確認できた。しかし、濃度が３２００μｇ／ｍＬになると、濃度が高すぎるため抑制効果が現れ、修復率は２０％～６２．４％となり、明らかに低下する傾向を示した。

実施例１５．加水分解コンドロイチン硫酸カプセル

製造方法
（１）実施例９の加水分解コンドロイチン硫酸と微結晶セルロースを別個に８０メッシュの篩を通過させ、すぐに使用できるようにした。
（２）加水分解コンドロイチン硫酸と微結晶セルロースを均一に混合した後、所定量のクロスポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウムを順次添加し、１５分間混合した。
（３）混合物をカプセル充填機に通してカプセルシェルに充填し、カプセル剤を形成した。

実施例１６．加水分解コンドロイチン硫酸錠剤

製造方法
（１）実施例９の加水分解コンドロイチン硫酸と微結晶セルロースを別個に８０メッシュの篩を通過させ、すぐに使用できるようにした。
（２）加水分解コンドロイチン硫酸と微結晶セルロースを均一に混合した後、所定量のクロスカルメロースナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素及びステアリン酸マグネシウムを順次添加し、１５分間混合した。
（３）混合物を回転式錠剤機で加圧し、錠剤の硬度が６～１０ｋｇになるように制御した。
（４）精製水を用いて、固形分１０％のコーティング剤を調製した。
（５）高性能コーティング機で錠剤をコーティングした。吸気温度は５５℃、微粒子化圧力は０．２ＭＰａ、シート床温度は４０～４５℃に制御した。コーティングが完了した後、錠剤を得た。

実施例１７．加水分解コンドロイチン硫酸錠剤

製造方法
（１）実施例９の加水分解コンドロイチン硫酸と乳糖を別個に８０メッシュの篩を通過させ、すぐに使用できるようにした。
（２）加水分解コンドロイチン硫酸と乳糖を均一に混合した後、所定量のヒドロキシプロピルセルロース、L－ヒドロキシプロピルセルロース、コロイド状二酸化ケイ素及びステアリン酸マグネシウムを順次加え、１５分間混合した。
（３）混合物を回転式錠剤機で加圧し、錠剤の硬度が６～１０ｋｇになるように制御した。
（４）精製水を用いて固形分１０％のコーティング剤を調製した。
（５）高性能コーティング機で錠剤をコーティングした。吸気温度は５５℃、微粒子化圧力は０．２ＭＰａ、シート床温度は４０～４５℃に制御した。コーティングが完了した後、錠剤を得た。

実施例１８．加水分解コンドロイチン硫酸錠剤

製造方法
（１）実施例９の加水分解コンドロイチン硫酸、澱粉、デキストリンを別個に８０メッシュの篩を通過させ、すぐに使用できるようにした。
（２）加水分解コンドロイチン硫酸、澱粉及びデキストリンを均一に混合した後、所定量のヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチル澱粉ナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素及びステアリン酸マグネシウムを順次加え、１５分間混合した。
（３）混合物を回転式錠剤機で加圧し、錠剤の硬度が６～１０ｋｇになるように制御した。
（４）精製水を用いて固形分１０％のコーティング剤を調製した。
（５）高性能コーティング機で錠剤をコーティングした。吸気温度は５５℃、微粒子化圧力は０．２ＭＰａ、シート床温度は４０～４５℃に制御した。コーティングが完了した後、錠剤を得た。

実施例１９．加水分解コンドロイチン硫酸カプセル

実施例２０．加水分解コンドロイチン硫酸とグルコサミン硫酸塩錠剤

製造方法
（１）実施例９の加水分解コンドロイチン硫酸、グルコサミン硫酸塩、微結晶セルロース及び乳糖を個別に８０メッシュの篩にかけ、すぐに使用できるようにした。
（２）加水分解コンドロイチン硫酸、グルコサミン硫酸塩、微結晶セルロース及び乳糖を均一に混合した後、所定量のクロスカルメロースナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素及びステアリン酸マグネシウムを順次添加し、１５分間混合した。
（３）混合物を回転式錠剤機で加圧し、錠剤の硬度が６～１０ｋｇになるように制御した。
（４）精製水を用いて固形分１０％のコーティング剤を調製した。
（５）高性能コーティング機で錠剤をコーティングした。吸気温度は５５℃、微粒子化圧力は０．２ＭＰａ、シートベッド温度は４０～４５℃に制御した。コーティングが完了した後、錠剤を得た。

実施例２１．本発明により製造された組成物によるマウス内側半月板不安定性（ＤＭＭ）のモデル試験

１.材料
１．１ 試験サンプル：本発明の実施例１５～２０に従って組成物を製造し、実施例１５、実施例１６、実施例１７、実施例１８、実施例１９及び実施例２０において、組成物の１日の推奨投与量を２錠（顆粒）／日、朝夕に１錠（顆粒）とした。
１．２ 被験物質の調製：試験サンプルを飼料に混合して供した。実施例１５、１６、１７、１８、１９、２０については、サンプルを１日１５０ｍｇ／日、マウスに与えた。
１．３ 対象の投与経路：各実施例のサンプルを胃内投与により各群の動物に与えた。

２.モデルの構築

マウスを抱水クロラールで麻酔し、右後肢の膝関節の毛を剃毛した。ヨウ素とアルコールで消毒した後、マウスの内骨格の側面に沿って長さ約１ｃｍの開口部を長手方向に切り落とし、膝関節を露出させた。顕微手術用鋏を用いて関節腔を開き、脛骨プラトー上の内側半月板リベットを切り落とした。６－０吸収性縫合糸で関節包を閉じた。関節皮膚を６－０縫合糸で縫合し，縫合した皮膚には感染予防のため少量のペニシリンを塗布した。コントロール群（９匹）に対しては、内側半月板脛腓靭帯を切断しない以外は同様の処置を施した。手術後２日目にＤＭＭマウスを無作為に７群に分け、各群１３匹ずつとした（１.モデルコントロール群；２.実施例１５；３.実施例１６；４.実施例１７；５.実施例１８；６.実施例１９；７.実施例２０）。

３.実験結果

手術後２日目にマウスに胃内投与を行い、ブランク群とモデル群には同量の通常生理食塩水を胃内に投与した。日１回、１２週間投与した。週１回、動物の体重を測定し、体重に応じて投与量を調整した。

結論：図６に示すように、実験開始０日目から、各群のマウスの体重は若干の増加傾向を示し、各時点で群間の有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。

マウスに１２週間、胃内投与を行った後、マウスの足支持力測定用にＹＬＳ－１１Ａチャンネルモードの測定器を用いて、マウスの起立時の２本の後肢の支持力の差を検出し、マウスの変形性関節症の痛みの程度を評価した。マウスを１つのチャンネルに導き、６０度の角度で斜面を登る実験を行った。マウスが斜面に沿って立ち始めると、左右の後肢の支持力の差を記録できるようにした。支持力の差が大きいほど、変形性関節症の程度が深刻であることを示す。

マウスの支持力の差を検出することにより、マウスの変形性関節症の痛みの程度を評価した。図７に示すように、モデル群における足の支持力の差が最も大きく、モデル群における変形性関節症の痛みの程度が最も深刻であることが示された。又、偽手術群と比べても有意差があり、モデルとして確立できたことが分かる。実施例１５、１６、１９、２０では、モデル群と比較して、足支持力の差を有意に減少させることができ（Ｐ＜０．０１）、実施例１７、１８も足支持力の差を減少させることができた（Ｐ＜０．０５）。尚、マウスの１日投与量は、ヒト投与量＝マウス投与量^*体重／等価用量比の式により算出することができる。尚、ヒトの１日投与量は、以下のように算出される。

その結果、加水分解コンドロイチン硫酸の１日投与量が５０～８００ｍｇであれば、変形性関節症の痛みに対して顕著な緩和と治療の効果を示し、組成物中にグルコサミンを添加することにより、変形性関節症の痛みに対する緩和と治療の効果を向上させることができることが判明した。

実施例２２．コンドロイチン硫酸オリゴ糖（ＣＳＯ）及びＣＳＯとグルコサミン（アミノ糖）の組み合わせによる、マウスの内側半月板不安定症（ＤＭＭ）により誘発された変形性関節症への治療効果を、血清中の炎症因子、骨水酸、サフラニンＯファストグリーン染色について病理組織科学的に検出し、評価すること。

Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス、８～９週齢、１００匹に対して、自由飲水及び自由摂食させた。マウスを抱水クロラールで麻酔し、右後肢の膝関節の毛を剃毛した。マウスをヨウ素とアルコールで消毒後、マウスの内骨格の側面に沿って長さ約１ｃｍの開口部を長手方向に切り、膝関節を露出させた。顕微手術用バサミで関節腔を開き，脛骨プラトーにある内側半月板リベットを切り落とした．６－０吸収性縫合糸で関節包を縫合した．関節皮膚を６－０縫合糸で縫合し，感染予防のため縫合した皮膚に少量のペニシリンを塗布した。偽手術群（９匹）にも同様の処置を施したが，内側半月板脛腓靭帯は切断しなかった．

手術後２日目に、ＤＭＭマウスをランダムに７群に分け、各群に１３匹のマウスを配置した。
１）モデルコントロール群
２）最高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群。
３）高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群。
４）中用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群（１５ｍｇ／ｋｇ）群。
５）低用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群（７．５ｍｇ／ｋｇ）群。
６）コンドロイチン硫酸オリゴ糖（１５ｍｇ／ｋｇ）＋グルコサミン塩酸塩（７５ｍｇ／ｋｇ）群。
７）高分子コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（８０ｍｇ／ｋｇ）＋グルコサミン（４００ｍｇ／ｋｇ）群。

手術後２日目に、０．２ｍＬ/２０ｇをマウスの胃内に投与し、偽手術群及びモデル群には同量の通常生理食塩水を投与した。高分子コンドロイチン硫酸（ＣＳ）群（８０ｍｇ/ｋｇ）＋グルコサミン（４００ｍｇ/ｋｇ）を０．５％ＣＭＣ－ＮＡに懸濁させた。動物に１日１回、１２週間投与した。週１回体重を測定し、体重に応じて投与量を調整した。

マウスの眼球から血液を採取し、血清を分離した。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、Ｃ５ｂ－９はＥＬＩＳＡ法により測定した。マウスを犠牲にし、右後肢大腿骨を採取し、骨中のヒドロキシプロリン酸をキット法に従って測定した。後肢の右膝関節を採取し、病理検査（サフラニンＯ-ファストグリーン染色）及びＣ５ｂ－９の発現（免疫組織化学）により調べた。評価指標をまとめると以下のようになった。

－血清中の炎症性サイトカインレベルへの影響

マウスの変形性関節症の重篤度を、血清中の炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及び補体Ｃ５ｂ－９のレベルを測定することにより評価した。図１０Ａに示すように、モデル群の炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及び補体Ｃ５ｂ－９のレベルが最も高く、モデル群が最も重度の変形性関節症であることが示された。又、偽手術群と比較して有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

図１０Ａに示すように、モデル群と比較して、最高用量、高用量、中用量、低用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群における、炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、補体Ｃ５ｂ－９のレベルは程度の差はあれ減少しており、各用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖が、変形性関節症に対して緩和と治療の効果を有することが示された。

中用量群と比較して、ＣＳＯ＋グルコサミン群の血清中の炎症因子ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及び補体Ｃ５ｂ－９のレベルは様々な程度でもって減少し、コンドロイチン硫酸オリゴ糖とグルコサミンの組み合わせにより、変形性関節症の緩和及び治療効果を改善できることが示された。

高分子＋グルコサミン群と比較して、ＣＳＯ＋グルコサミン群及び本発明のオリゴ糖群の血清中の炎症因子ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及び補体Ｃ５ｂ－９のレベルが有意に低下しており、コンドロイチン硫酸オリゴ糖の変形性関節症治療効果は、高分子＋グルコサミン群より優れていることが示された。

－大腿骨のヒドロキシプロリンレベルに対する効果

マウスの大腿骨中のヒドロキシプロリンを検出することにより、マウスの変形性関節症の重篤性を評価した。図１０Ｂに示すように、モデル群の大腿骨中のヒドロキシプロリンレベルは最も低く、モデル群の変形性関節症が最も深刻であることが示された。偽手術群と比較して有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことがわかる。

モデル群と比較して、最高用量、高用量、中用量、低用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群及びコンドロイチン硫酸オリゴ糖＋グルコサミン群は、マウス大腿骨のヒドロキシプロリンレベルを有意に増加させた（Ｐ＜０．０１）。

中用量群と比較して、ＣＳＯ＋グルコサミン群のヒドロキシプロリンレベルは、有意に上昇し、グルコサミンとＣＳＯの併用により変形性関節症の治療効果が促進されることが示された。

高分子＋グルコサミン群と比較して、ＣＳＯ＋グルコサミン群のデータからは、ＣＳＯの効果がＣＳよりも優れていることが示された。

－膝関節の病理学的検査

マウスの変形性関節症の重症度を、膝関節をサフラニンＯ-ファストグリーン染色で染色することにより評価した。その結果を図１０Ｃ及び図１０Ｄに示した。モデル群のマウスの膝関節を、サフラニンＯ－ファストグリーンで染色した時の病理スコアが最も高く、モデル群が最も重度の変形性関節症に罹患していることが示された。又、偽手術群と比較して有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

モデル群と比較して、最高用量と高用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群、及び中用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖＋グルコサミン群の場合には、サフラニンＯファストグリーン染色時の病理スコアが有意に減り（Ｐ＜０．０５）、コンドロイチン硫酸オリゴ糖に骨関節炎緩和作用があることが示唆された。

－膝関節軟骨表面におけるＣ５ｂ－９レベル

マウスの変形性関節症の重症度を、膝関節Ｃ５ｂ－９の免疫組織化学染色により評価した。その結果を図１０Ｅ及び図１０Ｆに示した。モデル群のマウスの膝関節におけるＣ５ｂ－９陽性細胞数が最も多く、モデル群の変形性関節症が最も重篤であることが示された。又、偽手術群と比較して有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立に成功したことが示された。

モデル群と比較して、最高用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群及び高用量のオリゴ糖＋グルコサミン群の場合、マウスの膝関節におけるC５ｂ－９陽性細胞数を有意に減少させることができ（Ｐ＜０．０１）、コンドロイチン硫酸オリゴ糖は、変形性関節症の軟骨障害を緩和することが示された。

実施例２３．膝関節へのパパイン注入により誘発されたラットの変形性関節症モデルにおけるＣＳＯの投与。

Ｗｉｓｔａｒ雄ラット８０匹、１８０～２２０ｇ。４％パパインと０．０３ｍｏｌ/ＬのＬ－システインを２：１の割合で混合し、３０分間静置した。実験開始０日目、３日目、６日目に、０．３ｍＬの混合溶液をラットの膝腔内に注入することを、変形性関節症モデルとした。正常コントロール群には等量の普通生理食塩水を注射した。

パパイン混合物を最後に注射した後、モデル動物を無作為に７群に分け、各群に１０匹のラットを配置した。
１）モデルコントロール群；
２）最高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群。
３）高用量（１５ｍｇ／ｋｇ）のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群。
４）中用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群（７．５ｍｇ/ｋｇ）。
５）低用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群（３．８ｍｇ／ｋｇ）。
６）コンドロイチン硫酸オリゴ糖（７．５ｍｇ／ｋｇ）＋グルコサミン塩酸塩（３７．５ｍｇ／ｋｇ）群。
７）高分子コンドロイチン硫酸（４０ｍｇ／ｋｇ）＋グルコサミン（２００ｍｇ／ｋｇ）群。

モデル実験後２日目に、０．２ｍＬ/１００ｇをラットの胃内に投与した。正常コントロール群及びモデル群には、同量の通常生理食塩水を投与した。高分子コンドロイチン硫酸（８０ｍｇ/ｋｇ）＋グルコサミン（４００ｍｇ/ｋｇ）群を０．５％ＣＭＣ－Ｎａに懸濁させた。１日１回、１２週間投与した。３日ごとに動物の体重を測定し、体重に応じて投与量を調節した。

モデル実験前、投与前、投与後１、３、６、９、１２週目に両膝関節の幅を測定した。関節の腫れの程度は、以下の式に従って算出した。関節腫脹の程度（ｍｍ）＝炎症後の膝の幅（投与後）－炎症前の膝の幅。

１２週間の胃内投与後、ラットの腹部大動脈から採血し、血清を分離した。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６をＥＬＩＳＡ法により測定した。ラットの大腿骨を採取し、骨中のヒドロキシプロリン酸をキット法に従って測定した。膝関節を採取し、病理学的検査（ＨＥ染色）を行った。評価指標をまとめると、以下のようになる。

図１１Ａに示すように、実験開始０日目から、各群のラットの体重は増加傾向を示し、各時点で群間に有意差はなかった。この結果から、コンドロイチン硫酸オリゴ糖は１２週間後のラットの体重に有意な影響を及ぼさなかったことが示された。

ラットの変形性関節症の重篤度を、ラットの血清中の炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αの濃度を測定することにより評価した。その結果を図１１Ｂ、図１１Ｃ及び図１１Ｄに示した。モデル群の血清中の炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β及びＴＮＦ－αの濃度は最も高く、モデル群が最も重度の変形性関節症を患っていることが示された。又、偽手術群と比較して有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

中用量オリゴ糖＋グルコサミン投与群のラットの血清中の炎症因子ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αのレベルは中用量群と比較して種々の程度に減少し、コンドロイチン硫酸オリゴ糖とグルコサミンとの併用により、変形性関節症の緩和と治療の効果を高めることができることが示された。

高分子＋グルコサミン群と比較して、ＣＳＯ＋グルコサミン群のラットの血清中の、炎症性サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αのレベルは有意に減少しており、コンドロイチン硫酸オリゴ糖の変形性関節症に対する効果は、高分子＋グルコサミン群のそれよりも優れていることが示された。

ラットの変形性関節症の重症度を、膝関節の病理学的検査により評価した。その結果を図１１Ｅ及び図１１Ｆに示した。モデル群のラットの膝関節の病理学的スコアは最も高く、モデル群の変形性関節症が最も深刻であることが示された。又、偽手術群と比較して有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことがわかる。

モデル群と比較して、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を最高用量にした群、高用量群、オリゴ糖中用量＋グルコサミン群の場合、病理学的スコアを有意に減少させることができ（Ｐ＜０．０１）、コンドロイチン硫酸オリゴ糖が、変形性関節症を緩和する効果を有することが示された。

実施例２４．ＣＳＯ治療の卵巣摘出雌ラット及び精巣摘出雄ラットの骨粗鬆症への治療効果

雌ラット

体重２００～２２０ｇの雌ＳＤラット９０匹を使用した。ラットを３日間環境に順応させた。手術前に２４時間絶食させたが、水は自由に摂取させた。ラットに対して３％抱水クロラールの腹腔内注射を行い、麻酔をかけた。卵巣を摘出せず、腰椎と背骨の両側から皮膚と筋肉を縦に切開したマウスを１０匹、偽手術群として使用した。その他のマウスについては、腰椎と背骨の両側から皮膚と筋肉を縦に切開し、両卵巣を摘出し、傷口を縫合した。すべてのマウスに術後３日間連続でペニシリンを筋肉内注射した(雄ラットも同様の方法で睾丸を摘出する手術を行った）。

手術後２日目に、卵巣摘出ラットを無作為に８群に分け、各群８匹ずつとした。
１）偽手術群。
２）モデル群。
３）酢酸カルシウム（１５８ｍｇ／ｋｇ）群。
４）コンドロイチン硫酸オリゴ糖を最高用量(３０ｍｇ/ｋｇ)使用+酢酸カルシウム(１５８ｍｇ/ｋｇ)群。
５）高用量（１５ｍｇ/ｋｇ）のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群＋酢酸カルシウム（１５８ｍｇ/ｋｇ）群。
６）コンドロイチン硫酸オリゴ糖を中用量使用した群（７．５ｍｇ/ｋｇ）＋酢酸カルシウム（１５８ｍｇ/ｋｇ）
７）低用量(７．５ｍｇ/ｋｇ)＋酢酸カルシウム(１５８ｍｇ/ｋｇ)のコンドロイチン硫酸オリゴ糖群。
８）コンドロイチン硫酸オリゴ糖（７．５ｍｇ/ｋｇ）＋グルコサミン塩酸塩（３７．５ｍｇ/ｋｇ）＋酢酸カルシウム（１５８ｍｇ/ｋｇ）群。
９）高分子コンドロイチン硫酸（４０ｍｇ/ｋｇ）＋グルコサミン（２００ｍｇ/ｋｇ）＋酢酸カルシウム（１５８ｍｇ/ｋｇ）群。

手術後２日目に、０．２ml/１００gをラットの胃内に投与した。尚、偽手術群及びモデル群には、同量の通常生理食塩水を投与した。１２週間連続投与後、週１回体重を測定し、体重により投与量を調整した。

最終投与から２４時間後に、ラットの眼窩から採血を行った。血清アルカリホスファタ－ゼ（ＡＬＰ）、骨形成タンパク質（ＢＧＰ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）及びカルシトニン（ＣＴ）を測定した。

ラットを犠牲にし、両側の大腿骨を分離した。右大腿骨を採取し、骨重量係数（ｇ／１００ｇ体重）、骨密度、灰分レベル、骨カルシウム又は骨リン、骨ヒドロキシプロリン、ＨＥ病理を指標として測定した。評価指標をまとめると、以下のようになる。

雄ラット

体重２００～２２０gの雄のＳＤラットを合計９０匹使用した。ラットを３日間環境に適応させた。手術前２４時間絶食させたが、水は自由に摂取できるようにした。体重２００～２２０gの雄のＳＤラットを合計９０匹使用した。ラットを３日間環境に適応させた。手術前２４時間絶食させたが、水は自由に摂取できるようにした。ラットに対して、３％抱水クロラールの腹腔内注射を行い、麻酔をかけ、陰嚢の皮膚を水平姿勢の状態で、ヨウ素、アルコールで消毒した。縦方向の切開を両側で２回、縦隔１ｃｍにて行った。膣中膜を切断後、１０匹のラットに対して、両側睾丸を精巣上体から分離し（切除せず）、陰嚢内に戻し、切開部を縫合したものを偽手術群とした。他の８０匹の精巣切除群については、両側の精巣を見つけ、同じように切除した。手術後３日間、全てのマウスにペニシリンを筋肉内注射した。

手術後２日目に、卵巣摘出ラットを無作為に８群に分け、各群に８匹のラットを配置した。
残りの工程は、雌ラットの場合と同じであった。

実験結果

－体重の変化

図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、実験開始０日目から、各群のラットの体重は増加傾向を示し、各時点で群間に有意差はなかった。このことから、コンドロイチン硫酸オリゴ糖は、１２週間投与後の雌及び雄ラットの体重に大きな影響を与えないことが分かった。

－骨量係数

図１２Ｃ及び図１２Ｄに示すように、偽手術群と比較して、モデル群のラットの骨重量係数は有意に減少しており（Ｐ＜０．０１）、モデル化に成功したことを示している。モデル群と比較して、オリゴ糖高用量群の場合、雌及び雄ラットの骨重量係数を有意に増加させた（Ｐ＜０．０５）。

－骨ミネラル密度

骨粗鬆症の重篤度は、ラットの骨密度を検出することにより評価した。図１２Ｅ及び図１２Ｆに示すように、モデル群のラットの骨ミネラル密度は著しく減少しており、モデル群のラットの骨ミネラル密度が最も深刻であり、モデル群と偽手術群の間に有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示される。

モデル群と比較して、雌骨粗鬆症ラットの大腿骨軸及び骨端のＢＭＤは、各投与群で有意に増加し（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）、コンドロイチン硫酸オリゴ糖は骨粗鬆症改善作用を有することが示された。

モデル群と比較して、最高、高、中、低、ＣＳＯ＋グルコサミン群及び高分子＋グルコサミン群の場合、雄ラットの大腿骨骨端部ＢＭＤを有意に増加させ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）、ＣＳＯ＋グルコサミン群及び高分子＋グルコサミン群では、雄ラットの大腿骨軸部の骨ミネラル量が有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。

－灰のレベル

ラットの骨粗鬆症の重篤度を、ラットの大腿骨灰中のレベルを測定することにより評価した。図１２Ｇに示すように、モデル群では骨灰のレベルが有意に低下しており、モデル群が最も骨粗鬆症の重篤度が高く、偽群と有意差があり（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）、モデルとしての確立に成功したことが示された。

モデル群と比較して、ＣＳＯ＋グルコサミン投与群については、雌ラットの大腿骨灰が有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、他の投与群では増加傾向にあり、統計的な差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。ＣＳＯ高用量群、中用量群、低用量群、ＣＳＯ＋グルコサミン群、Ｃａ群では、雄ラットの大腿骨灰量が有意に増加した（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。この結果から、コンドロイチン硫酸オリゴ糖は骨粗鬆症を改善する効果があることが示された。

－骨リン

骨粗鬆症の重篤度を、ラットの骨リン値を測定することにより評価した。図１２Ｈに示すように、モデル群のラットの骨リン値は有意に低下しており、モデル群の骨リン値が最も深刻であり、偽手術群と有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとしての確立に成功したことが示される。

モデル群と比較して、ＣＳＯ高用量群、中用量群、高分子＋グルコサミン群、ＣＳＯ＋グルコサミン群の雌ラットの骨リン値は有意に上昇した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＣＳＯ低用量群、ＣＳＯ＋グルコサミン群、ＣＡ群では、雄ラットの骨リン値が有意に増加した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。この結果から、コンドロイチン硫酸オリゴ糖は骨粗鬆症を改善する効果があることが示された。

－血清アルカリホスファターゼ

骨粗鬆症の重症度を評価するために、ラットの血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルを測定した。図１２Ｉに示すように、モデル群のラットの血清アルカリホスファターゼレベルは有意に低下しており、モデル群が最も骨粗鬆症の重症度が高く、偽手術群と有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

モデル群と比較して、投与群では、雌骨粗鬆症ラットの血清アルカリホスファターゼ値が有意に上昇した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＣＳＯ低用量投与群以外の投与群では、雄骨粗鬆症ラットの血清アルカリホヅファターゼ値は有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。

－骨形成タンパク質－４の血清レベル

骨粗鬆症の重篤度を評価するために、ラットの骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ－４）の血清レベルを測定した。図１２Ｊに示すように、モデル群のラットの骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ－４）の血清レベルは有意に低下しており、モデル群が最も重度の骨粗鬆症であることを示し、偽群と有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとしての確立に成功したことが示された。

モデル群と比較して、全ての投与群の中で、雌骨粗鬆症ラットの血清ＢＭＰ－４濃度は有意に上昇した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＣＳＯ低用量投与群を除き、他の投与群では、血清ＢＭＰ－４が有意に増加した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

－血清カルシトニン

骨粗鬆症の重篤度を評価するために、ラットの血清カルシトニン（ＣＴ）濃度を測定した。図１２Ｋに示すように、モデル群のラットの血清カルシトニン（ＣＴ）値は有意に低下しており、モデル群が最も重度の骨粗鬆症であることを示し、偽手術群と有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

モデル群に比べ、各投与群の中で、雌骨粗鬆症ラットの血清ＣＴ値は有意に上昇した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＣＳＯ低用量投与群を除く他の投与群の中で、雄骨粗鬆症ラットの血清ＣＴは、有意に上昇した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

－血清副甲状腺ホルモン

骨粗鬆症の重篤度を評価するために、ラットの血清副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）濃度を測定した。図１２Ｌに示すように、モデル群のラットの血清ＰＴＨ値は有意に低下しており、モデル群が最も重度の骨粗鬆症であることを示し、偽手術群と有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

モデル群と比較して、ＣＳＯ低用量投与群及びＣＡ群を除く他の投与群では、雌骨粗鬆症ラットの血清ＰＴＨ値が有意に低下した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。高分子＋グルコサミン投与群を除く他の投与群では、雄骨粗鬆症ラットの血清ＰＴＨ値は有意に低下した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

－大腿骨骨梁面積、骨梁面積の百分率及び骨梁の数

骨粗鬆症の重篤度を評価するために、ラットの大腿骨骨梁面積、骨梁面積の百分率、及び骨梁の数を測定した。結果は図１２Ｍ、図１２Ｎ、図１２Ｏに示すように、モデル群のラットの大腿骨骨梁面積、骨梁面積の百分率、骨梁の数は著しく減少しており、モデル群のラットが最も重度の骨粗鬆症であることが示された。偽手術群と有意に異なっており（Ｐ＜０．０１）、モデルとして確立できたことが示された。

モデル群と比較して、最高用量群、高用量群、中用量群及びオリゴ糖中用量＋グルコサミン群では、雄骨粗鬆症ラットの大腿骨骨梁面積及び骨梁面積の百分率は有意に増加した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、投与群では、雌骨粗鬆症ラットの大腿骨骨梁面積及び骨梁面積の百分率が有意に増加した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

モデル群と比較して、雄骨粗鬆症ラットの大腿骨骨梁の数は、Ｃａ群を除くすべての投与群で有意に増加した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。又、モデル群と比較して、ＣＳＯ低用量投与群及びＣａ投与群を除くすべての投与群において、雌骨粗鬆症ラットの大腿骨骨梁の数が有意に増加した（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。

これらの結果は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖が骨粗鬆症を緩和する効果を有することを示唆するものであった。

以上得られた実験データから、以下のような結論を導き出すことができた：様々な用量のコンドロイチン硫酸オリゴ糖は、変形性関節症の痛みと骨粗鬆症を緩和し治療する効果を有していた。コンドロイチン硫酸オリゴ糖とグルコサミンを併用することで、変形性関節症の痛みと骨粗鬆症を緩和し、治療する効果を向上させることができた。コンドロイチン硫酸オリゴ糖の、変形性関節症及び骨粗鬆症に対する治療効果は、高分子コンドロイチン硫酸のそれよりも優れていることが確認された。

本明細書出願中、上記の各引用文献は、参照することにより本明細書に援用された。前述の説明と文献との間に矛盾がある場合、本明細書でなされた説明を優先するものとする。

Claims (23)

1. 平均分子量が１０００ダルトン未満であり、分子量分布の狭い、低分子量コンドロイチン硫酸であって、前記低分子量コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖を主成分として含み、前記コンドロイチン硫酸二糖の含有量が４８～５５％、前記コンドロイチン硫酸四糖の含有量が３０～４５％、前記コンドロイチン硫酸二糖と前記コンドロイチン硫酸四糖の合計が８７％超であり、そして、前記低分子量コンドロイチン硫酸の構造の一般式は、以下の式Ｉ：
   

   

   上記式Ｉ中、ｎ＝０～５であり、ｎは整数であり、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃＝－Ｈ又は－ＳＯ₃Ｎａである、で示される、前記低分子量コンドロイチン硫酸。
2. 前記低分子量コンドロイチン硫酸の平均分子量が、５９０～８３０Ｄａ、好ましくは６７７～７４２Ｄａである、請求項1に記載の低分子量コンドロイチン硫酸。
3. 請求項１及び２のいずれか1項に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法であって、原料である高分子コンドロイチン硫酸を、コンドロイチン硫酸リアーゼで加水分解し、平均分子量が１０００ダルトン未満に安定に制御され、分子量分布の狭い低分子量コンドロイチン硫酸生成物を得；前記低分子量コンドロイチン硫酸が、コンドロイチン硫酸二糖とコンドロイチン硫酸四糖を主成分として含み、前記コンドロイチン硫酸二糖の含有量が、４３～６０％、前記コンドロイチン硫酸四糖の含有量が、３０～４５％で、前記コンドロイチン硫酸二糖と前記コンドロイチン硫酸四糖の合計が８７％超であり；そして、前記低分子量コンドロイチン硫酸の構造の一般式は、以下の式Ｉ：
   

   

   上記式Ｉ中、ｎ＝０～５であり、ｎは整数、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃＝－Ｈ又は－ＳＯ₃Ｎａである、で示される、前記低分子量コンドロイチン硫酸の調製方法。
4. 前記コンドロイチン硫酸リアーゼが、以下の工程：
   沿岸地域、河川堤防、ファーマーズマーケット、屠殺場及び食堂からの、土壌サンプル、下水又はシルトを選別し同定すること、及び
   大腸菌又は枯草菌によって最適に発現されること、
   によって得られる、請求項３に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
5. 原料となる前記高分子コンドロイチン硫酸が、鶏軟骨、豚軟骨、牛軟骨、又は鮫骨の１種以上から選ばれる陸上および海洋動物の軟骨組織由来である、請求項３に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
6. 原料としての前記高分子コンドロイチン硫酸が、鮫骨由来である、請求項５に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
7. 前記酵素加水分解反応の操作条件が、リッター当たりの発酵ブロスに対する前記コンドロイチン硫酸リアーゼの添加量が１００～３００Ｕ／Ｌ、原料である前記高分子コンドロイチン硫酸の濃度が、１００～７００ｇ／Ｌ、前記酵素加水分解の時間が６～１０時間、前記酵素加水分解の温度が、２５～３５℃、撹拌速度が１００～７００ｒｐｍ、前記酵素加水分解のｐＨが６.５～８．５である、請求項３に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
8. タンパク質を、酵素分解反応後に加水分解物から混合溶媒により除去する反応において、前記加水分解物と前記混合溶媒の体積比が２～５:１であり、及び前記混合溶媒中のジクロロメタンとイソプロピルアルコールの体積比が３～５：１であり、及び前記反応物を、１００～５００ｒｐｍで１０～４０分間撹拌し、３０００～５０００ｒｐｍで１０～３０分間遠心分離し、そして前記反応溶液の上層を採取する、請求項３に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
9. 前記タンパク質を、酵素加水分解反応後の加水分解物から限外濾過により除去して反応溶液を得る、請求項３に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
10. 前記タンパク質を除去した後、前記上層の反応溶液を０．２２μｍのカプセルフィルターでろ過及び滅菌し、そして前記反応溶液を８～１２倍量の無水エタノール中に添加して沈殿させ、そして真空乾燥する、請求項８に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
11. 前記タンパク質を除去した後、前記反応溶液を０．２２μｍのカプセルフィルターでろ過及び滅菌し、スプレードライする、請求項９に記載の低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法。
12. 鮫骨由来の高分子コンドロイチン硫酸と比較して、鮫骨及び鶏軟骨の１種以上を酵素加水分解して得られる低分子量コンドロイチン硫酸は、１ｍＭ過酸化水素により損傷を受けた軟骨細胞に対して５０～１００μｇ／ｍＬの濃度でより著しい修復効果を示し、そして前記修復率は１４％～２３%であるか、又は、５０～１６００μｇ／ｍＬの濃度範囲の、請求項１に記載の特定の含有量範囲の二糖と四糖を有する低分子量コンドロイチン硫酸は、１ｍＭの過酸化水素により損傷を受けた軟骨細胞を修復することができ、そして前記修復率は２０～６２．４％である、請求項１に記載の低分子量コンドロイチン硫酸。
13. 前記低分子量コンドロイチン硫酸が、薬剤、化粧品、ヘルスケア製品及び食品を製造する分野で使用される、請求項１又は２のいずれか1項に記載の低分子量コンドロイチン硫酸。
14. 加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物であって、前記組成物が、ヒトのための１日量の５０ｍｇ～８００ｍｇの加水分解コンドロイチン硫酸を含有する、加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
15. 前記組成物がグルコサミンを含んでもよい、請求項１４に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含む組成物。
16. 前記グルコサミンが、グルコサミン塩酸塩、グルコサミン硫酸塩又はそれらの混合物であってもよい、請求項１５に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
17. 前記加水分解コンドロイチン硫酸が、種々の分子量を有する加水分解コンドロイチン硫酸の混合物である、請求項１４に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
18. 加水分解コンドロイチン硫酸の平均分子量が、３７９～１００００Ｄａである、請求項１７に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
19. 充填剤、崩壊剤、粘着剤、オドラント、潤滑剤及びフィルムコーティング剤から選ばれる薬剤的に許容可能な賦形剤を含有する、請求項１４に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
20. 前記充填剤は、微結晶性セルロース、デンプン、デキストリン、マンニトール、乳糖を含むがこれらに限定されず、前記崩壊剤は、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、アルファ化デンプン、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、重炭酸ナトリウム、クエン酸、酒石酸を含むが、それらに限定されず、前記接着剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンを含むがこれらに限定されず、前記潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、水添植物油、ポリエチレングリコール、ステアリン酸を含むがこれらに限定されず；そして、前記フィルムコーティング剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール及びレーキ顔料を含むがこれらに限定されない、請求項１９に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
21. 前記組成物が、錠剤、顆粒剤、カプセル剤及び丸薬を含むがこれらに限定されない剤形である、請求項１４に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
22. 関節の炎症を抑え、痛みを和らげるための医薬品の調製に用いられる、請求項１４～２１のいずれか1項に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。
23. 骨粗鬆症を緩和し、治療するための医薬を調製するのに使用される、請求項１４～２１のいずれか1項に記載の加水分解コンドロイチン硫酸を含有する組成物。

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