CN103623006A

CN103623006A - 一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法

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Publication number: CN103623006A
Application number: CN201310605720.6A
Authority: CN
Inventors: 刘少芳; 杨庆利; 曹荣军; 余玉奎; 台文静; 陈杰; 姚秀芬; 鲁涛
Original assignee: BETTER (QINGDAO) BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BETTER (QINGDAO) BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，鱼类软骨经过混合酶酶解后，用超滤膜截留得到含有分子量小于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素和胶原蛋白肽的提取物。本发明采用复合酶水解技术，实现硫酸软骨素和胶原蛋白的同步水解，实现了鱼类软骨的综合利用。所得产物为低分子量硫酸软骨素，解决了硫酸软骨素临床应用生物利用率低的问题。该提取物能显著改善骨关节炎的症状，具有良好的保健和治疗功效。

Description

一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法

技术领域

本发明属于鱼软骨提取物的生产技术领域，具体涉及一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法。

背景技术

硫酸软骨素与胶原蛋白是形成软骨基质的主要生物高分子。通常，硫酸软骨素作为软骨结构的成分之一，可以加速关节的修复、保留水分、使营养成分快速渗透至软骨中。而软骨组织的II型胶原蛋白，是软骨再生的重要成分。人类骨关节炎的病理生理主要是影响软骨基质中II 型胶原蛋白和硫酸软骨素这两种成分，以关节软骨胶原纤维断裂、蛋白多糖进行性耗损为特征。因此，硫酸软骨素和骨胶原蛋白通常作为治疗骨性关节炎的保健食品和药品应用广泛。

虽然硫酸软骨素在治疗骨性关节炎方面应用广泛，但近年来研究发现，硫酸软骨素的相对分子量大，它的大体积往往妨碍其顺利的穿越细胞膜，因而不能在机体内良好地发挥其多种药理功能，而低分子量的硫酸软骨素具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点。近年来，低分子硫酸软骨素在防治冠心病、关节炎以及抗肿瘤等方面正日益受到广泛重视。因此，含低分子量硫酸软骨素的保健食品和药品的开发具有重要的现实意义。

鱼类软骨是我国水产品加工过程中产生的副产物。鱼类软骨的结构比较松散，主要成分是粘多糖、蛋白质和无机盐。粘多糖是由氨基己糖和己糖醛酸交替结合形成的酸性杂聚多糖，软骨中的主要成分为硫酸软骨素。硫酸软骨素与胶原蛋白也是鱼类软骨基质的重要组成部分。因此，利用鱼类软骨生产硫酸软骨素和胶原蛋白，一方面能实现了鱼类软骨的综合利用，减少环境污染；另一方面，可以作为提供硫酸软骨素和骨胶原蛋白的重要来源。目前，从鱼类软骨中提取硫酸软骨素和胶原蛋白已经引起研究者的重视。专利一种鱼软骨提取物的制备方法及所得的产品（200810200881.6），通过酶解鱼软骨的方法制备得到含分子量为5000 ～15000 道尔顿硫酸软骨素鱼软骨提取物。一种鱼类软骨生产硫酸软骨素联产水解胶原蛋白的方法（201310262059.3），实现硫酸软骨素和水解胶原蛋白的同步生产。但是上述专利所得产物均未解决硫酸软骨素分子量过大临床生物利用率较低的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，即制备含有低分子量硫酸软骨素和胶原蛋白肽的鱼类软骨提取物的方法，以及其在治疗骨性关节炎中的应用。

本发明采取的技术方案为：

一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述的生产方法包括如下步骤：

（1）鱼类软骨预处理：将鱼类软骨洗净，用水浸泡2h 后置于蒸煮锅中100℃煮30min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，切碎成大小为1cm×1cm 的块状，备用；

（2）酶解：向预处理后的鱼类软骨中加入鱼软骨重量的0.8-2 倍的水，按照2-10g/kg的用量加入混合酶控制酶解温度为30-55℃，调节pH 为6.0-8.0，酶解2-6h；

（3）灭酶：将上述得到酶解液升高温度为80-100℃进行热处理10-15min，然后降温至75℃以下；

（4）离心除杂：采用2000-6000r/min 的转速，离心15 -40min，过滤得到上清液；

（5）超滤干燥：上清液用分子量5000 的超滤膜截留，收集膜透过液喷雾干燥得到软骨提取物。

上述步骤（1）中的鱼类软骨为鲑鱼、孔鳐鱼或鲨鱼中的一种或多种的含软骨部位。

上述步骤（2）中的加入的混合酶是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和软骨素酶组成的，添加比例为1：1 ：1 或1 ：2 ：1 或1 ：1 ：2。

上述步骤（2）中的pH的调节采用氢氧化钠或盐酸。

上述步骤（4）中的过滤可以添加适量助滤剂白陶土或硅藻土助滤。

上述步骤（5）中的干燥方法可以采取冷冻干燥。

上述的方法制得的鱼软骨提取物，其特征在于，所述的鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素含量为20-80%，分子量小于500 道尔顿的低分子量硫酸软骨素占总软骨素含量的95%以上。

上述的方法制得的鱼软骨提取物，其特征在于，所述的鱼软骨提取物中的鱼胶原蛋白肽含量为20-80%，为一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35% 以上，分子量小于1000道尔顿的小分子胶原蛋白肽占总蛋白肽的95%以上。

上述的方法制得的鱼软骨提取物，其特征在于，用于制备治疗、改善或预防骨关节炎疾病的保健食品和药品中。

上述的保健食品和药品，其特征在于，所述骨关节炎包括由退行性骨关节炎引起的骨损伤或归因于关节老化引起的磨损。

本发明的有益效果为：

1、本发明采用复合酶水解技术，实现硫酸软骨素和胶原蛋白的同步水解，实现了鱼类软骨的综合利用。

2、所得产物为低分子量硫酸软骨素，解决了硫酸软骨素临床应用生物利用率低的问题，具有对受损软骨的修复作用，具有良好的保健和治疗功效。

3、本发明的含低分子量硫酸软骨素和胶原蛋白肽的鱼类提取物可以作为一种制备治疗、改善或预防骨关节炎疾病的保健食品的候选成分，所述骨关节炎包括由退行性骨关节炎引起的骨损伤或归因于关节老化引起的磨损。

附图说明

图1 鱼软骨提取物中低分子硫酸软骨素薄层层析图谱。

1：硫酸软骨素；2：二糖、四糖、六糖、八糖、硫酸软骨素对照品3：鱼软骨提取物中低分子硫酸软骨素，其中98%以上为二糖（分子量低于500）。

图2 鱼软骨提取物对兔软骨损失的病理组织学切片图谱。

A-对照组；B-模型组；C-鱼类软骨提取物组；D-硫酸软骨素组。

具体实施方式

鱼类软骨提取物的制备，通过氨基酸分析法检测胶原蛋白肽纯度（总氨基酸含量）及羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的含量（质量百分比）；所制得的硫酸软骨素通过咔唑—硫酸法测得其含量，薄层层析法测定分子量。

实施例1

将鲑鱼软骨洗净，用水浸泡2h 后置于蒸煮锅中100℃煮30min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，切碎成大小为1cm×1cm 的块状，备用；选用已处理的软骨500g，按料液比1：2加水，用氢氧化钠或盐酸调节pH=7.0，加入木瓜蛋白酶5g/kg、中性蛋白酶5g/kg 和软骨素酶5g/kg。控制温度为45℃酶解5h，将得到酶解液升高温度为80℃进行热处理15min，然后降温至70℃，采用2000 r/min 的转速，离心40min，添加适量助滤剂白陶土助滤得到上清液用分子量5000 的超滤膜截留，收集膜透过液喷雾干燥得到软骨提取物。

制得的鱼软骨提取物含有低分子量硫酸软骨素和鱼胶原蛋白肽，鱼软骨提取物中的鱼胶原蛋白肽含量为40%，为一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35% ，分子量为小于1000道尔顿的小分子胶原蛋白肽占总肽的96%；所述的鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素含量为60%，分子量小于500 道尔顿的低分子量硫酸软骨素占总软骨素含量的98%。

实施例2

将孔鳐鱼软骨洗净，用水浸泡2h 后置于蒸煮锅中100℃煮30min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，切碎成大小为1cm×1cm 的块状，备用；选用已处理的软骨500g，按料液比1：2加水，用氢氧化钠或盐酸调节pH=7.0，加入木瓜蛋白酶5g/kg、中性蛋白酶10g/kg 和软骨素酶5g/kg。控制温度为45℃酶解5、6h，将得到酶解液升高温度为90℃进行热处理13min，然后降温至70℃，采用4000 r/min 的转速，离心30min，添加适量助滤剂硅藻土助滤得到上清液用分子量5000 的超滤膜截留，收集膜透过液喷雾干燥得到软骨提取物。

制得的鱼软骨提取物含有低分子量硫酸软骨素和鱼胶原蛋白肽，鱼软骨提取物中的鱼胶原蛋白肽含量为43%，为一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占36% ，分子量为小于1000道尔顿的小分子胶原蛋白肽占总肽的96%；所述的鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素含量为65%，分子量小于500 道尔顿的低分子量硫酸软骨素占总软骨素含量的98%。

实施例3

将鲨鱼软骨洗净，用水浸泡2h 后置于蒸煮锅中100℃煮30min，捞出后剔除鱼肉和油脂，用清水冲洗，切碎成大小为1cm×1cm 的块状，备用；选用已处理的软骨500g，按料液比1：2加水，用氢氧化钠或盐酸调节pH=7.0，加入木瓜蛋白酶5g/kg、中性蛋白酶5g/kg 和软骨素酶10g/kg。控制温度为45℃酶解5、6h，将得到酶解液升高温度为100℃进行热处理10min，然后降温至70℃，采用6000r/min 的转速，离心15 min，添加适量助滤剂白陶土助滤得到上清液用分子量5000 的超滤膜截留，收集膜透过液喷雾干燥得到软骨提取物。

制得的鱼软骨提取物含有低分子量硫酸软骨素和鱼胶原蛋白肽，鱼软骨提取物中的鱼胶原蛋白肽含量为41%，为一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占37% ，分子量为小于1000道尔顿的小分子胶原蛋白肽占总肽的97%；所述的鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素含量为63%，分子量小于500 道尔顿的低分子量硫酸软骨素占总软骨素含量的98%。

采取实施例2制得的鱼类软骨提取物进行生物活性研究

动物模型制备及分组：将新西兰大白兔随机分成4组。分别为对照组(A组)、模型组(B组)、鱼类软骨提取物组(C组)、硫酸软骨素组(D组)。每组7只。25%乌拉坦(4ml/kg)行耳缘静脉注射麻醉，麻醉后，在股骨内髁滑车面用电动骨钻，钻出直径3mm、深3mm的全层关节软骨缺损区，造成软骨缺失，用生理盐水和80万单位的青霉素钠进行冲洗。之后行关节复位，缝合伤口，关闭膝关节。对照组不做任何处理。术后注射青霉素钠80万，1次/d，连续3d，并在第5天强化一次，以防感染。

动物术后喂养：术后第二天进行灌胃，每日一次，连续5周(给药量按人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表计算)。鱼类软骨提取物组和硫酸软骨素组每日灌胃剂量为0.4g/kg，模型组给予等量的蒸馏水进行灌胃，对照组正常饲养不灌胃。

实验取材：灌胃5周后，25%乌拉坦(4ml/kg)经腹腔注射麻醉后，从髌上囊部位注射1毫升无菌PBS进入关节腔，反复活动关节后，抽取灌洗液，做好标记后置于-80℃冰箱中保存备用；腹主动脉取血，离心后取血清，标记，放入-80℃冰箱中保存备用。切开关节腔，取关节并固定于10%甲醛固定液中。

软骨修复情况：模型组、鱼类软骨提取物组与硫酸软骨素组结构均良好，但鱼类软骨提取物组与其他两组相比软骨表面较为平整，凹陷基本已填充，肉眼可见缺陷处有乳白色半透明膜样组织，颜色与正常软骨相近。模型组与硫酸软骨素组中肉眼清晰可见股骨內髁滑车面上有凹陷，软骨表面不平滑与周围正常软骨界限清楚，组织修复以纤维组织性修复为主，质量差，颜色与周围软骨相近。与对照组相比，软骨表面仍与正常软骨表面有一定界限。

病理组织学观察：图2显示在损伤修复处均可见初期修复反应。实验组，HE染色见缺损处已经被明显修复。给予硫酸软骨素组（D），损伤处被少量死骨，增生的成骨细胞及纤维组织所填充，而且给予鱼类软骨提取物组（C）发现表面有增生的骨膜组织生成，底部可见新生骨小梁。相比之下模型组和硫酸软骨素组损伤处软骨细胞和纤维组织填充较少，且骨膜亦无形成。

通过生物活性研究实验，可以看出本发明得到的低分子量硫酸软骨素，具有对受损软骨的修复作用。因此本发明的含低分子量硫酸软骨素和胶原蛋白肽的鱼类提取物可以作为一种制备治疗、改善或预防骨关节炎疾病的保健食品的候选成分，所述骨关节炎包括由退行性骨关节炎引起的骨损伤或归因于关节老化引起的磨损。

Claims

1.一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述的生产方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中的鱼类软骨为鲑鱼、孔鳐鱼或鲨鱼中的一种或多种的含软骨部位。

3.根据权利要求1所述的一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述步骤（2）中的加入的混合酶是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和软骨素酶组成的，添加比例为1：1 ：1 或1 ：2 ：1 或1 ：1 ：2。

4.根据权利要求1所述的一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述步骤（2）中的pH的调节采用氢氧化钠或盐酸。

5.根据权利要求1所述的一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中的过滤可以添加适量助滤剂白陶土或硅藻土助滤。

6.根据权利要求1所述的一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法，其特征在于，所述步骤（5）中的干燥方法可以采取冷冻干燥。

7.根据权利要求1 所述的方法制得的鱼软骨提取物，其特征在于，所述的鱼软骨提取物中低分子量硫酸软骨素含量为20-80%，分子量小于500 道尔顿的低分子量硫酸软骨素占总软骨素含量的95%以上。

8.根据权利要求1 所述的方法制得的鱼软骨提取物，其特征在于，所述的鱼软骨提取物中的鱼胶原蛋白肽含量为20-80%，为一种羟脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量占35% 以上，分子量小于1000道尔顿的小分子胶原蛋白肽占总蛋白肽的95%以上。

9.根据权利要求1 所述的方法制得的鱼软骨提取物，其特征在于，用于制备治疗、改善或预防骨关节炎疾病的保健食品和药品中。

10.根据权利要求9所述的保健食品和药品，其特征在于，所述骨关节炎包括由退行性骨关节炎引起的骨损伤或归因于关节老化引起的磨损。