CN103272282A - 一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架及其制备方法，应用仿生、纳米、冷冻干燥相分离技术构建具有类似天然骨生物特性的人工骨支架材料；以壳聚糖/鱼皮胶原为有机基体，钙-磷盐溶液为无机相羟基磷灰石前驱体，模仿天然骨组织形成过程中无机钙磷矿物在有机基质生物大分子调控下的原位析晶过程，制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原骨组织工程支架。本发明的制备工艺简单，反应条件温和，制得的复合支架具有可塑性，可以根据实际需要加工成各种形状。
Description
技术领域
本发明属于骨缺损修复支架材料制造领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架及其制备方法。
背景技术
骨缺损是骨科临床常见的病症，治疗比较困难。如何促进骨缺损的尽快愈合，一直是骨科领域努力解决的问题。传统的治疗方法一般采用自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨材料替代，这些方法均不同程度地存在着供源不足、造成供体受损，免疫排斥及成骨能力不确定等缺点。20世纪80年代组织工程学的诞生，为骨缺损的临床治疗开辟了崭新的道路。
组织工程的基本原理和方法是将体外扩增的自体或异体细胞种植于体外构建的支架（细胞外基质模拟物）中，形成细胞-支架复合物。然后将该细胞和支架复合物植入受损的组织或器官部位，通过植入细胞的增殖与分化以及类细胞外基质支架相匹配的降解吸收而形成结构、功能与目标组织(或器官)相一致的新组织(或器官)，从而达到创伤修复和功能重建的目的。组织工程的发展提供了一种组织再生的技术手段，将改变外科传统的“以创伤修复创伤”的治疗模式迈入无创修复的新阶段。同时组织工程的发展也将改变传统的医学模式，使得再生医学得以进一步的发展并最终用于疾病的临床治疗。在这个过程中，支架材料所形成的三维结构不但为细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间，也为植入的细胞分泌细胞外基质并最终形成相应的组织或器官提供了一个良好的微环境。由此可以看出，支架材料是组织工程的关键因素之一，支架材料对组织工程的发展有着不可分割和替代的重要作用。作为组织工程用的支架材料应朝着仿生化、智能化和工程化方向发展。理想的支架材料应当模仿天然细胞外基质的结构和功能，尽可能地与组织的细胞外基质相似。因此，需要选择合适的材料、制备工艺来构建骨组织工程支架。
胶原蛋白是生物体内的重要蛋白质，主要存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤，是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，具有支撑器官和保护肌体的功能，也是组成细胞间质最重要的功能蛋白质。目前胶原蛋白广泛用于食品、制药、化妆品、生物医学等领域。传统的胶原蛋白主要从陆生动物如猪、牛等的结缔组织中提取。但随着胶原蛋白需要量逐渐增大，从陆生动物中提取的胶原蛋白已满足不了社会需求。此外，近些年来，由于疯牛病、口蹄疫等疾病的发生，陆生动物来源的胶原蛋白在应用方面受到了很大的限制。从水产品中获取胶原蛋白或制备胶原活性肽成为国内外研究的热点。随着我国渔业的发展, 水产品的综合利用也越来越引起人们的重视。鱼类在加工过程中产生出大量的废弃物，如皮、骨、鳞和鳍等含有丰富的胶原蛋白, 具有开发和利用的价值。从鱼类加工的废弃物鱼皮中提取胶原蛋白，能变废为宝，增加附加值，开发新型胶原资源。由于鱼类属于变温动物，因此鱼皮胶原蛋白与哺乳类动物皮的胶原蛋白相比，在I型胶原性质上具有若干特异性：（1）鱼皮中的胶原纤维即使在低温下也易溶于中性盐溶液或稀酸，比较易于调制可溶性胶原溶液。（2）相对哺乳类动物的皮胶原蛋白，其胶原纤维束更粗，对酶、热等反应更容易，即鱼皮胶原蛋白的热稳定性比较低(用热收缩温度(Ts)或热变性温度(Td)表示)，这和鱼皮中羟脯氨酸含量较哺乳类动物皮低有关，因为胶原蛋白的热稳定性和羟脯氨酸含量呈正相关性。（3）鱼皮胶原蛋白热稳定性呈现鱼种特异性，即暖水性鱼类的鱼皮胶原蛋白较冷水性鱼类的鱼皮胶原蛋白的热稳定性高，这也与羟脯氨酸含量因鱼种不同有关。而鱼皮胶原蛋白与鱼肉胶原蛋白相比，其真皮的Td要比肌肉的低l℃左右，这与肌肉胶原中脯氨酸的羟基化率较真皮胶原高有关。(4) 绝大多数的真骨鱼类真皮的胶原含有其他脊椎动物所没有的第三条α链，即其由3条异种α链所形成的单一型杂分子αl(Ⅰ) α2(Ⅰ) α3(Ⅰ)组成。鱼皮胶原蛋白，特别是深海鱼皮胶原蛋白，由于鱼的体温低，胶原蛋白的变性温度相当低，不会像牛皮胶原蛋白那样限制细胞的增殖，有实验表明它能促进细胞的粘附和增殖，不会诱发细胞的癌化。还有一些相关研究表明，鱼皮胶原蛋白具有良好的理化性质，如低抗原性、优良的生物相容性、可降解性和止血功能，具有良好的应用前景。
壳聚糖是一种带正电荷的天然聚多糖，其结构与细胞外基质的主要成分—糖胺聚糖十分类似，降解产物对人体无毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。它可与核心蛋白通过共价键连接成蛋白多糖，形成多孔亲水的凝胶结构，有利于水分及小分子的渗透，并调节细胞生长、分化与胶原形成。在外形方面，壳聚糖可制成管状、膜、片、微粒等多种形状的多孔材料，已广泛应用于生物领域。
羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2是一种微溶于水的弱碱性磷酸的钙盐，是人体骨骼组织主要的无机成分，植入体内后在体液的作用下，钙和磷会游离出材料表面被机体组织所吸收，并生长出新的组织。相对其他的无机材料来说，羟基磷灰石有很高的化学稳定性和耐磨性，而且具有良好的生物相容性和骨传导性。
天然骨基质（骨的细胞间质）是由无机和有机基质巧妙结合在一起形成的天然复合体，其中无机质大部分是羟基磷灰石 (HAP)，有机质大部分是纤维性胶原蛋白和少量多糖。在天然骨组织中，生物大分子调控无机钙磷矿物的生长，同时与其它蛋白和细胞相互作用，最终形成具有复杂多级结构的天然骨组织。因此本发明在设计骨缺损修复支架材料时，将天然骨组织中的这种生物大分子调控无机矿物形成的机理（仿生合成原理）应用于骨修复材料的合成制备。选用具有极好生物活性的壳聚糖结合鱼皮胶原、羟基磷灰石为组分的组合，采用仿生、纳米、冷冻干燥相分离技术制备具有类似天然骨组织生物特性的人工骨支架材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架及其制备方法，应用仿生、纳米、冷冻干燥相分离技术构建具有类似天然骨生物特性的人工骨支架材料，使其与天然骨的组成、微结构相近，为种子细胞提供与天然骨类似的微环境。制备工艺简单，反应条件温和，制得的复合支架具有可塑性，可以根据实际需要加工成各种形状。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
应用仿生、纳米、冷冻干燥相分离技术构建具有类似天然骨生物特性的人工骨支架材料；以壳聚糖/鱼皮胶原为有机基体，钙-磷盐溶液为无机相羟基磷灰石前驱体，模仿天然骨组织形成过程中无机钙磷矿物在有机基质生物大分子调控下的原位析晶过程，制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原骨组织工程支架。制备方法包括以下步骤：
步骤一：壳聚糖/鱼皮胶原有机基质的预组装；
将壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为1～2%的乙酸溶液中，连续搅拌30～60min，使其充分混合均匀——壳聚糖、鱼皮胶原通过物理交联：静电作用、氢键作用和链的缠绕等形式，预组织形成有序的基质大分子；
步骤二：壳聚糖、鱼皮胶原有机基质与无机离子的界面识别；
（1）配置2mol/L可溶性钙盐溶液和1.2mol/L可溶性磷酸盐溶液；
（2）将可溶性钙盐溶液缓慢加入步骤一的混合溶液中，搅拌0.5～1h，再加入可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌2.5～4h，混合体系中钙-磷摩尔比为10：6；
步骤三：复合支架前驱体的预成型；
（1）加入交联剂碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对步骤二（2）的混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为0.5～2g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.25～1g/L；
（2）步骤三（1）的混合溶液在常温下交联4～8h，注入模具，移至2～4℃冰箱预冷冻1～5h，再放入-10～-80℃冷冻；
（3）将步骤三（2）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
步骤四：纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的成型：
（1）将步骤三（3）所得的干燥样品置于3～6wt% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶；
（2）接着将步骤四（1）所得的复合支架用去离子水反复浸洗至中性，-10～-80℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。复合支架中各组分的质量百分比为：壳聚糖1～3%、鱼皮胶原0.1～1%、羟基磷灰石1～2%、余量为去离子水。
所述的鱼皮胶原是从废弃的鱼皮中提取的，其制备工艺如下：鱼皮的预处理-酶解-盐析-冷冻干燥-鱼皮胶原。
所述的钙盐是硝酸钙或氯化钙，磷酸盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种的混合物。
步骤四（1）中乙醇和去离子水的体积比为1～2：1。
本发明的显著优点在于：壳聚糖/鱼皮胶原组分间通过物理交联如静电作用、氢键和链的缠绕等形式，预组织形成有序的基质大分子, 其分子上的官能团：酰胺基、羧基、氨基、羟基与无机钙离子、磷酸根离子通过离子螯合、静电作用以及氢键结合等方式，为后续无机晶体的定位生长提供了有效的成核位点，降低成核活化能；采用仿生、纳米、冷冻干燥相分离技术制备三维立体连通多孔骨组织工程支架—纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原骨组织工程支架，相对于其他支架有以下优点：
（1）该复合支架的制备工艺简单、条件温和，可以最大限度地保留胶原分子的活性，增加了支架的细胞亲和性；
（2）采用仿生技术、纳米技术等制备方法，使得羟基磷灰石在支架上呈纳米级分散状态，相界面的结合力得到加强；
（3）通过化学交联来控制有机基质的交联度，得到具有不同生物降解性能和力学性能的复合支架；
（4）采用实验室自制的鱼皮胶原为原料，充分利用鱼类加工的副产品，并进一步探究鱼皮胶原在生物医学材料领域的应用；
（5）该复合支架的原料来源广泛，制备成本低，有研究价值。
附图说明
图1-2为本发明实例1和实例2制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
图3-4为本发明实例2和实例4制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的Olympus光学显微镜图。
图5-6为纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架前驱体的SEM扫描电子显微镜图。
图7-8 为本发明实例2制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的SEM扫描电子显微镜图。
图9-10为本发明实例3制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的SEM扫描电子显微镜图。
图11为本发明实例2制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的X射线衍射图（XRD）。
图12-14为本发明实例2制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架在模拟体液(SBF)中浸泡矿化12h、48h、72h的SEM扫描电子显微镜图。
具体实施方式
实施例1
纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖 2%
鱼皮胶原 0.2%
羟基磷灰石 1.2%
余量为去离子水。
上述的复合支架由以下步骤制备：
1）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液；
2）将所述配比的壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为1%乙酸溶液，持续搅拌45min，使其充分混合均匀；
3）将一定体积的可溶性钙盐溶液缓慢加入上述有机组分溶液中，持续搅拌0.5h，再加入一定体积的可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌3h，混合体系中钙-磷摩尔比为10:6；
4）加入交联剂碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对上述混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为1g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.5 g/L；混合溶液在常温下交联5h，注入模具，移至4℃冰箱预冷冻2h，再放入-10℃冷冻12h；
5）将上述所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
6）将所得的干燥样品置于3% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-10℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
实施例2
纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖 2%
鱼皮胶原 0.4%
羟基磷灰石 1.2%
余量为去离子水。
上述的复合支架由以下步骤制备：
1）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钠溶液；
2）将所述配比的壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为1%乙酸溶液，持续搅拌60min，使其充分混合均匀；
3）将一定体积的可溶性钙盐溶液缓慢加入上述有机组分溶液中，持续搅拌1h，再加入一定体积的可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌4h，混合体系中钙-磷摩尔比为10:6；
4）加入交联剂碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对上述混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为1g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.5g/L；混合溶液在常温下交联4h，注入模具，移至4℃冰箱预冷冻3h，再放入-20℃冷冻12h；
5）将上述所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
6）将所得的干燥样品置于5% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性， -20℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
实施例3
纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖 2%
鱼皮胶原 0.3%
羟基磷灰石 1.5%
余量为去离子水。
上述的复合支架由以下步骤制备：
1）配制2mol/L氯化钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液；
2）将所述配比的壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为2%乙酸溶液，持续搅拌45min，使其充分混合均匀；
3）将一定体积的可溶性钙盐溶液缓慢加入上述有机组分溶液中，持续搅拌0.5h，再加入一定体积的可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌3.5h，混合体系中钙-磷摩尔比为10:6；
4）加入交联剂碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对上述混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为1.2g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.5g/L；混合溶液在常温下交联5h，注入模具，移至4℃冰箱预冷冻2.5h，再放入-80℃冷冻12h；
5）将上述所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
6）将所得的干燥样品置于4% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性， -80℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
实施例4
纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖 1.8%
鱼皮胶原 0.4%
羟基磷灰石 1.2%
余量为去离子水。
上述的复合支架由以下步骤制备：
1）配制2mol/L氯化钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钠溶液；
2）将所述配比的壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为1%乙酸溶液，持续搅拌60min，使其充分混合均匀；
3）将一定体积的可溶性钙盐溶液缓慢加入上述有机组分溶液中，持续搅拌1h，再加入一定体积的可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌2.5h，混合体系中钙-磷摩尔比为10:6；
4）加入交联剂碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对上述混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为0.5g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.25g/L；混合溶液在常温下交联6h，注入模具，移至4℃冰箱预冷冻4h，再放入-10℃冷冻12h；
5）将上述所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
6）将所得的干燥样品置于6% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-10℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
实施例5
纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架由以下质量百分比的组分制成：
壳聚糖 2%
鱼皮胶原 0.5%
羟基磷灰石 1.5%
余量为去离子水。
上述的复合支架由以下步骤制备：
1）配制2mol/L硝酸钙溶液，1.2mol/L磷酸氢二钾溶液；
2）将所述配比的壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为1.5%乙酸溶液,持续搅拌60min，使其充分混合均匀；
3）将一定体积的可溶性钙盐溶液缓慢加入上述有机组分溶液中，持续搅拌0.5h，再加入一定体积的可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌4h，混合体系中钙-磷摩尔比为10:6；
4）加入交联剂碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对上述混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为0.75g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.3g/L；混合溶液在常温下交联4h，注入模具，移至4℃冰箱预冷冻2h，再放入-20℃冷冻12h；
5）将上述所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
6）将所得的干燥样品置于5% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶，再用去离子水反复浸洗至中性，-20℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
本制备方法所得的复合支架具有可塑性，可以根据实际需要进行加工处理；由olympus光学显微镜图可以观察到复合支架具有连续的多孔网状结构；由SEM图可以观察到复合支架前驱体样品具有连通的多孔结构，但孔壁上无纳米颗粒形成；原位结晶处理后，复合支架不仅保持相互贯穿的连通多孔结构, 而且孔壁上形成了均匀分布的细小的纳米颗粒。由支架的XRD图谱，可发现支架中的无机结晶物的衍射峰与HAP的特征峰一致，且其衍射峰存在宽化、弥散现象，说明支架上已原位形成弱结晶度的纳米羟基磷灰石。由支架的仿生矿化图12-14，可发现矿化12h后支架上纳米颗粒数量有所增加；48h后支架上梭状的晶体颗粒数量越来越多，纳米级孔隙不断减少；矿化72h后随着结晶沉积的增加，支架表面的纳米级孔隙基本为晶体颗粒所覆盖，表明支架具有良好的生物矿化活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的制备方法，其特征在于：应用仿生、纳米、冷冻干燥相分离技术构建具有类似天然骨生物特性的人工骨支架材料；以壳聚糖/鱼皮胶原为有机基体，钙-磷盐溶液为无机相羟基磷灰石前驱体，模仿天然骨组织形成过程中无机钙磷矿物在有机基质生物大分子调控下的原位析晶过程，制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原骨组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：壳聚糖/鱼皮胶原有机基质的预组装；
将壳聚糖、鱼皮胶原溶解于体积分数为1～2%的乙酸溶液中，连续搅拌30～60min，使其充分混合均匀；
步骤二：壳聚糖、鱼皮胶原有机基质与无机离子的界面识别；
（1）配置2mol/L可溶性钙盐溶液和1.2mol/L可溶性磷酸盐溶液；
（2）将可溶性钙盐溶液缓慢加入步骤一的混合溶液中，搅拌0.5～1h，再加入可溶性磷酸盐溶液，继续搅拌2.5～4h，混合体系中钙-磷摩尔比为10：6；
步骤三：复合支架前驱体的预成型；
（1）加入交联剂碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺对步骤二（2）的混合溶液进行交联处理，其中碳化二亚胺的浓度为0.5～2g/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.25～1g/L；
（2）步骤三（1）的混合溶液在常温下交联4～8h，注入模具，移至2～4℃冰箱预冷冻1～5h，再放入-10～-80℃冷冻；
（3）将步骤三（2）所得的冷冻样品转入冷冻干燥机中进行冷冻干燥至完全脱水，获得连通多孔结构的支架前驱体样品；
步骤四：纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的成型：
（1）将步骤三（3）所得的干燥样品置于3～6wt% NaOH的乙醇／去离子水中进行原位结晶；
（2）接着将步骤四（1）所得的复合支架用去离子水反复浸洗至中性，-10～-80℃冷藏后进行冷冻干燥，最后得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架。
3.根据权利要求2所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的制备方法，其特征在于：所述的鱼皮胶原是从废弃的鱼皮中提取的，其制备工艺如下：鱼皮的预处理-酶解-盐析-冷冻干燥-鱼皮胶原。
4.根据权利要求2所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的制备方法，其特征在于：所述的钙盐是硝酸钙或氯化钙，磷酸盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求2所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架的制备方法，其特征在于：步骤四（1）中乙醇和去离子水的体积比为1～2：1。
6.一种如权利要求1所述的方法制得的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/鱼皮胶原复合支架，其特征在于：复合支架中各组分的质量百分比为：壳聚糖1～3%、鱼皮胶原0.1～1%、羟基磷灰石1～2%、余量为去离子水。
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