CN115990288A - 一种鱼鳞基生物活性补片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鱼鳞基生物活性补片及其制备方法和应用。所述鱼鳞基生物活性补片包括鱼鳞基底和无机活性组分;所述鱼鳞基生物活性补片具有螺旋排列的多层微结构,且每个片层是由鱼鳞基底的胶原纤维与无机活性组分原位矿化结合而成;所述鱼鳞基底为脱钙后的天然鱼鳞;所述无机活性组分占鱼鳞基生物活性补片的质量百分比为0~60wt%,优选为20~42wt%。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼鳞基生物活性补片及其制备方法,和其在制备肌腱/韧带修复材料方面的应用,属生物材料领域。
背景技术
肌腱/韧带损伤是一类常见的运动医学疾病,往往需要手术进行修复,由于肌腱本身血供较差、加之退行性变化等原因,手术后修复的肌腱需要经过一个长期的自我愈合过程。此外,由于本身肌腱存在一定的张力,手术修复后的肌腱同样面临着张力过大的问题,会导致肌腱难以愈合甚至再次撕裂。且一些严重的肌腱损伤,如巨大型肩袖撕裂等,肌腱已难以通过手术缝合,导致肌腱和骨界面之间存在缝隙。
针对以上问题,采用肌腱补片或肌腱移植物用于辅助性治疗受损的肌腱、肌腱移植是个可行的治疗手段。肌腱补片可以降低肌腱和骨之间的张力,为细胞生长提供了附着点,从而改善肌腱以及腱骨界面的愈合。人工肌腱补片因其来源广泛、可避免供区损伤、低免疫原性和无传染病风险等因素越来越受到临床医生的青睐。虽然近年来有一系列人造肌腱补片的制备方法被提出,但是现有的人工肌腱补片难以兼顾高强度与高生物活性,这一问题仍待解决。
一些自然生物的外骨骼具有良好的力学性质,例如鱼鳞、贝壳、龙虾外壳等。其中,鱼鳞是一种高强度的柔性天然材料,因其特殊的螺旋排列的多层微结构,使之具有优异的抗拉强度。目前,国内鲜少有基于具有特殊微结构的天然材料制备生物材料的报道,这一类天然材料经过合适的方法进行处理,可以在保留多层微结构的条件下,提高其生物活性,用于制备兼具高强度与高生物活性的人工肌腱补片。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种用于肌腱/韧带修复的鱼鳞基生物活性补片及其制备方法。
一方面,本发明提供了一种鱼鳞基生物活性补片,所述鱼鳞基生物活性补片包括鱼鳞基底和无机活性组分;所述鱼鳞基生物活性补片具有螺旋排列的多层微结构,且每个片层是由鱼鳞基底的胶原纤维与无机活性组分原位矿化结合而成;所述鱼鳞基底为脱钙后的天然鱼鳞(利用脱钙时间控制在钙化层刚好完全去除、鱼鳞中胶原纤维充分暴露且未被破坏的程度,此时脱钙后的鱼鳞基底具有定向胶原纤维束构成的螺旋楼梯状微结构,达到了最佳的力学性质,且胶原纤维束的充分暴露,可作为矿化位点,便于后续的原位矿化处理);所述无机活性组分占鱼鳞基生物活性补片的质量百分比为0~60wt%,无机活性组分的加入有利提高补片的生物活性性质,使补片可以通过释放钙、硅等活性无机离子,局部调控干细胞分化、血管再生、并能够诱导腱骨界面过渡组织的再生,改善肌腱缺损的修复,所述生物活性补片中无机活性组分最优的含量为20~42wt%。
本发明中,鱼鳞基生物活性补片保留了天然鱼鳞原始的螺旋排列的多层微结构,每个片层由胶原纤维和无机活性组分结合构成(或不含无机活性组分),按照一定角度旋转排列成螺旋状。其中,无机活性组分的含量控制在上述范围内,可以避免接触因高浓度溶液导致鱼鳞内部的胶原蛋白大量水解,从而导致力学性质降低,无法承受肌腱部位的张力。
较佳的,在脱钙之前,天然鱼鳞为鱼类生物鳞片,优选为鲢鱼鱼鳞片、鲤鱼鱼鳞片、草鱼鱼鳞片、或青鱼鱼鳞片,最优选为青鱼鱼鳞。将新鲜的天然鱼鳞洗净剥离筋膜组织后,浸泡于脱钙液中进行脱钙处理,以形成鱼鳞基底。
较佳的,所述脱钙所用脱钙液为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度为0.1~0.5mol/L;所述脱钙的时间为3~14天。根据不同的鱼鳞片,脱钙时间需控制在钙化层刚好完全去除、鱼鳞微结构中胶原纤维充分暴露且未被破坏,此时脱钙后的鱼鳞基底具有定向胶原纤维束构成的螺旋楼梯状微结构,达到了最佳的力学性质;且胶原纤维束的充分暴露,可作为矿化位点,便于后续的原位矿化处理。具体来说,鲢鱼鱼鳞片所用脱钙液为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度为0.3~0.5mol/L,脱钙的时间为10~14天。鲤鱼鱼鳞片所用脱钙液为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度为0.3~0.5mol/L,脱钙的时间为10~14天。草鱼鱼鳞片所用脱钙液为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度为0.3~0.5mol/L,脱钙的时间为6~10天。青鱼鱼鳞片所用脱钙液为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度为0.3~0.5mol/L,脱钙的时间为3~7天。
较佳的,所述无机活性组分为硅酸钙、硅酸镁、硅酸锌、硅酸锰、磷酸钙、磷酸镁、磷酸锌、磷酸锰中的至少一种。
较佳的,所述鱼鳞基生物活性补片的最大拉力为15~145MPa;所述鱼鳞基生物活性补片的杨氏模量为350~770MPa;所述鱼鳞基生物活性补片的韧性为1~18MJ·m-3。
另一方面,本发明提供了一种鱼鳞基生物活性补片的制备方法,在真空条件下,将脱钙后的天然鱼鳞浸泡在含有金属阳离子的矿化液中保持4~12小时,再经清洗和干燥,得到所述鱼鳞基生物活性补片。
本发明提出鱼鳞基生物活性补片的制备方法,可以在保持补片良好力学的情况下,将一种或多种无机活性组分与鱼鳞自身的胶原纤维结合,提高生物活性。
较佳的,所述含有金属阳离子的矿化液中金属阳离子为钙离子、镁离子、锰离子、锌离子中的至少一种(优选钙离子、镁离子、锰离子、锌离子中的至少两种);所述含有金属阳离子的矿化液中金属阳离子浓度范围为0.1~2M。
较佳的,所述含有金属阳离子的矿化液中金属阳离子源为钙的硅酸盐、镁的硅酸盐、锰的硅酸盐、锌的硅酸盐、钙的磷酸盐、镁的磷酸盐、锰的磷酸盐、锌的磷酸盐中的至少一种。
较佳的,所述真空条件的真空度<500Pa。
再一方面,本发明提供了一种鱼鳞基生物活性补片在制备肌腱/韧带修复材料中的应用。
有益效果:
本发明中,鱼鳞基生物活性补片由鱼鳞基底和无机活性组分构成(或不含无机活性组分),具有良好的抗拉强度和生物活性,能够支持细胞黏附和增殖、刺激肌腱—骨组织来源的多种细胞的分化和表型维持,有望用于肌腱/韧带损伤的修复。
附图说明
图1是本发明一实施方式硅酸钙修饰的鱼鳞基生物活性补片的制备流程图;
图2中的(a)为天然鱼鳞的微结构示意图和横截面的扫描电镜图(O-FS),(b)、(c)、(d)、(e)、(f)分别为实施例1-5中不含无机活性组分脱钙后鱼鳞基底的微结构示意图和扫描电镜图(即0FS、0.2CS-FS、0.5CS-FS、0.75CS-FS、1CS-FS),(g)为实施例5中硅酸钙修饰的鱼鳞基生物活性补片的高分辨透射电镜图(1CS-FS),(h)为实施例5中硅酸钙修饰的鱼鳞基生物活性补片的能谱分析(1CS-FS);
图3为中的天然肌腱(Tendon)、天然鱼鳞(O-FS)、各种鱼鳞基生物活性补片(0FS、0.2CS-FS、0.5CS-FS、0.75CS-FS、1CS-FS)的材料力学性质检测,(a)为最大抗拉强度,(b)为韧性,(c)为杨氏模量;
图4a-4c和图5是在各种鱼鳞基生物活性补片上,培养兔骨髓间充质干细胞、兔软骨细胞、兔肌腱干细胞的生长情况;(4a)CCK-8法检测兔骨髓间充质干细胞在各组补片上培养1、4、7天的的细胞活力,(4b)CCK-8法检测兔软骨细胞在各组补片上培养1、4、7天的的细胞活力,(4c)CCK-8法检测兔肌腱干细胞在各组补片上培养1、4、7天的的细胞活力,(5中d)兔骨髓间充质干细胞在各组补片上接种24小时后的共聚焦显微镜图像和扫描电镜图像,(5中e)兔软骨细胞在各组补片上接种24小时后的共聚焦显微镜图像和扫描电镜图像,(5中f)兔肌腱干细胞在各组补片上接种24小时后的共聚焦显微镜图像和扫描电镜图像;
图6a-6c是各种鱼鳞基生物活性补片刺激多种细胞定向分化相关基因的表达情况,检测基因为兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中成骨分化相关基因(Runx2、Opn、Col-1、Ocn)的表达情况、兔软骨细胞(chondrocyte)中软骨表型的相关基因(Sox9、N-Cadh、Col-2、Aggrecan)表达情况、以及兔肌腱干细胞(TSPCs)中成肌腱分化相关基因(Dcn、Tnc、Col-1、Bgn)的表达情况;由图6a-6c可知,0.5CS-FS、0.75CS-FS、1CS-FS三组均能够刺激不同种类细胞分化相关基因的表达,由热重分析得知此三组对应的无机组分的含量分别为20.17wt%、28.07wt%和41.26wt%(实施例3、4、5),由此得出无机含量组分的最优范围是20~42wt%;
图7中(a)兔肩袖肌腱损伤造模及修复的模型示意图,(b)、(c)、(d)为使用鱼鳞基生物活性补片(0.5CS-FS)修复兔肩袖损伤的手术术中照片。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明,应理解,下述实施方式仅用于说明本发明,而非限制本发明。
本公开中,鱼鳞基生物活性补片是基于天然鱼鳞制备的,其具有螺旋排列的多层微结构,每个片层是由胶原纤维与无机活性组分结合而成(或不含无机活性组分,参见图2中的(b)、(c)、(d)、(e)、(f))。图2中的(g)可以看出硅酸钙颗粒,作为补片中的无机活性组分均匀地矿化在胶原纤维的表面。
采用万能力学测试机测试所述鱼鳞基生物活性补片的最大拉力为15~145MPa。采用万能力学测试机测试所述鱼鳞基生物活性补片的杨氏模量为350~770MPa。采用万能力学测试机测试所述鱼鳞基生物活性补片的韧性为1~18MJ·m-3。通过材料力学实验检测发现,所述的鱼鳞基生物活性补片的最大抗拉力和韧性超过了天然肌腱,完全满足肌腱修复的需要,且杨氏模量与肌腱组织相近,说明了鱼鳞基生物活性补片具有良好的力学性质。
在可选的实施方式中,通过调控鱼鳞基生物活性补片中无机活性组分的含量来进一步调控补片的生物活性。无机活性组分占鱼鳞基生物活性补片的质量百分比优选为0~60wt%,进一步优选为20~42wt%左右。一些实施方式中,采用0.5M矿化液矿化可实现20%左右的矿化量。所述鱼鳞基生物活性补片具有优异的力学性质和生物活性,能够刺激多种细胞的分化,能够实现调控肌腱再生、修复肌腱损伤,并改善腱骨界面的愈合和生物力学。通过体外细胞实验发现本发明的鱼鳞基生物活性补片能够促进细胞黏附和生长,较高硅酸钙含量的补片虽然对细胞增殖有一定抑制作用,但也能支持细胞的长期增殖。体内动物实验发现鱼鳞基生物活性补片能够促进腱骨界面的再生,以及肌腱损伤修复,并改善了受损肌腱的生物力学性质。综上,本发明的鱼鳞基生物活性补片能够承受肌腱损伤部位的张力,更有利于多种细胞的粘附和增殖,具有良好的体内促进肌腱和腱骨界面再生的生物活性,适合于肌腱/韧带损伤的修复。
如图1所示,以下示例性说明本发明所述鱼鳞基生物活性补片的制备方法。该方法利用真空诱导原位矿化的新方法,成功实现制备不同无机活性组分含量的鱼鳞基生物活性补片。该鱼鳞基生物活性补片用于肌腱损伤的修复,不仅具有优异的力学性能,而且具有良好的生物活性。
天然鱼鳞进行预处理。天然鱼鳞可为鲢鱼鱼鳞片、鲤鱼鱼鳞片、草鱼鱼鳞片、青鱼鱼鳞片等,优选青鱼鱼鳞片。新鲜的鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等有机组织后,浸泡于脱钙液中进行脱钙处理(常温下即可实现脱钙,例如18~28℃),以形成鱼鳞基底。所述的脱钙液可为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度可为0.1~0.5mol/L。脱钙处理的时间可为3-14天。制备的鱼鳞基底,如不再进行后续的矿化步骤,即为不含无机活性组分的鱼鳞基生物活性补片。
制备矿化液。根据鱼鳞基生物活性补片中的无机活性组分的组成成分,制备一定浓度的包含矿化物质的金属源的阳离子溶液和其对应的阴离子溶液。所述的包含矿化物质的金属源的阳离子溶液包括钙、镁、锰、锌的水溶性无机盐和所述无机盐对应水合物中的至少一种,阳离子溶液的浓度范围可为0.1~2M。所述包含矿化物质其对应的阴离子溶液包括含有硅酸根、磷酸根的水溶性无机盐和所述无机盐对应水合物中的至少一种。阴离子溶液的浓度范围可为0.1~2M,与阳离子溶液浓度保持一致。
原位矿化处理:在真空条件下将鱼鳞补片基底先后浸泡于阳离子和阴离子溶液,进行真空诱导原位矿化以在鱼鳞基底的片层上修饰无机活性组分。烘干:矿化完成后的鱼鳞基底洗涤、二次烘干后得到鱼鳞基生物活性补片。
当以硅酸钙为作鱼鳞基生物活性补片中的无机活性组分时,具体操作为:将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以硝酸钙溶液浸泡(0.1M-2M),离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持4-10小时。将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,在-10~-50℃下冷冻干燥4-10小时,得到冻干后的鱼鳞基底。将冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加硅酸钠溶液浸泡(0.1M-2M),选用的硝酸钙溶液和硅酸钠溶液浓度需保持一致,滴加了硅酸钠溶液的鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态(例如<500Pa)下保持4-12小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,和干燥(例如,放于60℃烘箱中烘干1-3小时)。然后取出,将鱼鳞基底以去离子水浸泡30-60min,去除硝酸根离子和钠离子,而后再次放于烘箱中二次烘干(例如,60℃烘箱中二次烘干1-3小时),得到硅酸钙修饰的鱼鳞基生物活性补片。在该过程中,硅酸钙颗粒原位矿化于鱼鳞片层的胶原纤维上。
本发明首选通过真空诱导矿化使鱼鳞中的胶原纤维上均匀地修饰硅酸钙等无机活性组分,由于胶原纤维上的羰基和羧基基团能够于钙离子等金属阳离子产生螯合作用,可以成为原位矿化的矿化位点,然后钙离子等金属阳离子在与硅酸根等阴离子结合形成矿化物质,使得胶原纤维上能够原位矿化、结合硅酸钙等无机活性组分。尤其是矿化量控制在一定的范围内,不会破坏鱼鳞的螺旋排列的多层微结构,使得该鱼鳞基生物活性补片仍能保持良好的力学性质。然后利用补片中硅酸钙的生物活性,调控多种细胞的分化、增殖,以及体内肌腱和腱骨界面复杂组织的再生,从而使该鱼鳞基生物活性补片兼具良好的力学性质和生物活性。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解,以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例,即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择,而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
新鲜的青鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为7天。脱钙后使用大量去离子水洗涤、烘干后即为不含无机成分的鱼鳞基生物活性补片,命名为0FS。
实施例2
新鲜的青鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为7天。配置用于矿化的硝酸钙溶液(浓度为0.2M)以及硅酸钠溶液(浓度为0.2M)。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以硝酸钙溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的硝酸钙溶液液滴,冷冻干燥4小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加与硝酸钙溶液浓度相同的硅酸钠溶液。然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出。将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的硝酸根离子和钠离子。而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到硅酸钙矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。经热重分析得知无机成分含量16.89%,命名为0.2CS-FS。
实施例3
新鲜的青鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为7天。配置用于矿化的硝酸钙溶液(浓度为0.5M)以及硅酸钠溶液(浓度为0.5M)。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以硝酸钙溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的硝酸钙溶液液滴,冷冻干燥4小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加与硝酸钙溶液浓度相同的硅酸钠溶液。然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出。将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的硝酸根离子和钠离子,而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到硅酸钙矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。经热重分析得知无机成分含量20.17%,命名为0.5CS-FS。
实施例4
新鲜的青鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为7天。配置用于矿化的硝酸钙溶液(浓度为0.75M)以及硅酸钠溶液(浓度为0.75M)。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以硝酸钙溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时.,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的硝酸钙溶液液滴,冷冻干燥4小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加与硝酸钙溶液浓度相同的硅酸钠溶液,然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出,将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的硝酸根离子和钠离子,而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到硅酸钙矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。经热重分析得知无机成分含量28.07%,命名为0.75CS-FS。
实施例5
新鲜的青鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为7天。配置用于矿化的硝酸钙溶液(浓度为1M)以及硅酸钠溶液(浓度为1M)。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以硝酸钙溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的硝酸钙溶液液滴,冷冻干燥4小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加与硝酸钙溶液浓度相同的硅酸钠溶液,然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出。将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的硝酸根离子和钠离子。而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到硅酸钙矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。经热重分析得知无机成分含量41.26%,命名为1CS-FS。
鱼鳞基生物活性补片的性能评价,包括力学性能、体外生物活性、动物体内修复肌腱损伤的功能。通过扫描电镜和高分辨透射电镜和对鱼鳞生物活性补片的微结构和成分变化进行表征。
从图2看出本发明制备的鱼鳞基生物活性补片,即实施例1-4,仍保留了螺旋排列的分层微结构,每层由胶原纤维与无机活性组分结合而成,硅酸钙颗粒均匀地矿化在胶原纤维上,颗粒大小在40nm左右。随着矿化液浓度的增大,硅酸钙颗粒的沉积量增多。
从图3看出多数鱼鳞基生物活性补片的最大抗拉力和韧性均高于天然肌腱,表现出了良好的力学特性,仅实施例4的1CS-FS最大抗拉力和韧性略低于天然肌腱的数值。说明在一定的矿化量范围内,鱼鳞基生物活性补片仍能保持良好的力学特性。鱼鳞基生物活性补片与天然肌腱的杨氏模量大致相似,可避免应力遮挡带来的肌腱难以愈合的问题。
鱼鳞基生物活性补片对于多种细胞,如骨髓间充质干细胞(BMSCs)、软骨细胞(chondrocyte)、肌腱干细胞(TSPCs)的细胞相容性和分化调节作用。
从图4a-4c和图5中可以看出,实施例1-4的鱼鳞基生物活性补片能够很好地支持各种多种细胞的黏附和增殖,细胞呈现出伸展的形貌,无蜷缩的细胞形貌。鱼鳞基生物活性补片也能够支持兔BMSCs、兔chondrocyte和兔TSPCs的细胞增殖,细胞在补片上接种1、4、7天后呈现出明显的细胞增殖,说明鱼鳞基生物活性补片具有良好的细胞相容性。
从图6a-6c可以看出,鱼鳞基生物活性补片能够刺激多种细胞的定向分化相关或表型维持基因的表达,说明其具有多样性的生物活性,不仅能够调控肌腱来源的多种细胞的分化,对于其他部位骨骼、软骨来源的细胞同样具有生物活性。
从图7可以看出鱼鳞基生物活性补片(1CS-FS)可用适用于肌腱修复手术,将补片裁剪为0.5×1cm尺寸大小,补片具有很好的力学性质,可很好地通过手术移植在兔肩袖肌腱损伤部位,良好地桥接受损的岗上肌肌腱和骨。
以上可知鱼鳞基生物活性补片具有优异的力学性质和生物活性,说明该鱼鳞基生物活性补片可以应用于临床的肌腱相关损伤。
实施例6
新鲜的鲤鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为10天。配置用于矿化的氯化镁溶液(浓度为0.5M)以及硅酸钠溶液(浓度为0.5M),将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以氯化镁溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的氯化镁溶液液滴,冷冻干燥5小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加与氯化镁溶液浓度相同的硅酸钠溶液,然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持8小时,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出,将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的氯离子和钠离子,而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,硅酸镁矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。
实施例7
新鲜的鲤鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为10天。配置用于矿化的氯化镁/氯化钙混合溶液(溶液中浓度为:氯化镁浓度为0.2M、氯化钙浓度为0.3M),以及硅酸钠溶液浓度为0.5M。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以氯化镁氯化钙混合溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的混合溶液液滴,冷冻干燥5小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加硅酸钠溶液,然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持8小时,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出,将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的硝酸根离子和钠离子,而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到硅酸镁/硅酸钙混合矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。
实施例8
新鲜的鲢鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为14天。配置用于矿化的氯化锰溶液(浓度为1.5M),以及硅酸钠溶液(浓度为1.5M)。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以氯化锰混合溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时。然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的混合溶液液滴,冷冻干燥5小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加硅酸钠溶液,然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持8小时,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出,将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的硝酸根离子和钠离子,而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到硅酸锰矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。
实施例9
新鲜的草鱼鱼鳞片,以流水洗净,剥离鱼鳞表面的筋膜、表皮、肌肉等组织后,浸泡于EDTA脱钙液(0.4-0.5moL)中进行脱钙处理,脱钙时间为7天。配置用于矿化的氯化镁/氯化钙混合溶液(溶液中浓度为氯化镁浓度为0.6M、氯化钙浓度为0.6M),以及磷酸钠溶液浓度为1.2M。将脱钙后的鱼鳞基底置于离心管中,以氯化锰混合溶液浸泡,离心管置于真空烘箱中,真空状态下保持6小时,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的混合溶液液滴,冷冻干燥5小时。冻干后的鱼鳞基底平铺在平板上,表面滴加磷酸钠溶液,然后鱼鳞基底置于真空烘箱中,真空状态下保持8小时,然后将鱼鳞基底取出,轻轻擦去表面残留的液滴,放于60℃烘箱中烘干2小时后取出,将鱼鳞基底以去离子水浸泡30min,去除残留的氯离子和钠离子,而后再次放于60℃烘箱中二次烘干2小时,得到磷酸钙/磷酸镁混合矿化修饰的鱼鳞基生物活性补片。
Claims (10)
1.一种鱼鳞基生物活性补片,其特征在于,所述鱼鳞基生物活性补片包括鱼鳞基底和无机活性组分;所述鱼鳞基生物活性补片具有螺旋排列的多层微结构,且每个片层是由鱼鳞基底的胶原纤维与无机活性组分原位矿化结合而成;所述鱼鳞基底为脱钙后的天然鱼鳞;所述无机活性组分占鱼鳞基生物活性补片的质量百分比为0~60wt%,优选为20~42wt%。
2.根据权利要求1所述的鱼鳞基生物活性补片,其特征在于,在脱钙之前,天然鱼鳞为鱼类生物鳞片,优选为鲢鱼鱼鳞片、鲤鱼鱼鳞片、草鱼鱼鳞片、或青鱼鱼鳞片,最优选为青鱼鱼鳞。
3.根据权利要求2所述的鱼鳞基生物活性补片,其特征在于,所述脱钙所用脱钙液为EDTA脱钙液、甲酸水溶液、盐酸水溶液中的至少一种,浓度为0.1~0.5mol/L;所述脱钙的时间为3~14天。
4.根据权利要求1所述的鱼鳞基生物活性补片,其特征在于,所述无机活性组分为硅酸钙、硅酸镁、硅酸锌、硅酸锰、磷酸钙、磷酸镁、磷酸锌、磷酸锰中的至少一种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的鱼鳞基生物活性补片,其特征在于,所述鱼鳞基生物活性补片的最大拉力为15~145 MPa,杨氏模量为350~770 MPa,韧性为1~18 MJ·m-3。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的鱼鳞基生物活性补片的制备方法,其特征在于,在真空条件下,将脱钙后的天然鱼鳞浸泡在含有金属阳离子的矿化液中保持4~12小时,再经清洗和干燥,得到所述鱼鳞基生物活性补片。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述含有金属阳离子的矿化液中金属阳离子为钙离子、镁离子、锰离子、锌离子中的至少一种;所述含有金属阳离子的矿化液中金属阳离子浓度范围为0.1~2M。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述含有金属阳离子的矿化液中金属阳离子源为钙的硅酸盐、镁的硅酸盐、锰的硅酸盐、锌的硅酸盐、钙的磷酸盐、镁的磷酸盐、锰的磷酸盐、锌的磷酸盐中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述真空条件的真空度<500Pa。
10.一种权利要求1-5中任一项所述的鱼鳞基生物活性补片在制备肌腱修复材料和制备韧带修复材料中的应用。
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