CN113244451A - 一种仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肌腱补片材料技术领域,特别涉及一种仿生天然肌腱‑骨梯度界面的补片材料及其制备方法,所述补片材料为表面覆盖磷酸钙结晶的医学用纳米纤维,纳米纤维的纤维排列方式由一端的单轴取向排列逐渐过渡为另一端的无规则排列,磷酸钙结晶由无规则排列端向单轴取向排列端梯度减少;以医学用纤维材料与近红外染料为原料制备单轴取向纳米纤维膜;通过不同时间的激光照射使单轴取向排列逐渐转变为无规则排列;然后垂直放置于培养皿中,照射时间最长端向下,逐滴加入模拟体液,得到仿生天然肌腱‑骨梯度界面的补片材料;本发明的补片材料具有取向结构与矿化双重梯度变化,其弹性优良,力学性能好,能够满足体内微环境需要的生物力学强度和顺应性。
Description
技术领域:
本发明属于肌腱补片材料技术领域,特别涉及一种仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料及其制备方法,所述补片材料具有取向结构与矿化组分双重梯度变化,并具有良好的生物力学性能、降解性能以及细胞相容性。
背景技术:
肌腱是全身各个关节功能活动的重要组成结构,是肌肉的一部分。肌肉包括肌腹和肌腱,肌腱指肌肉末端与骨头相连的位置,通过肌腱在肌肉用力收缩时起到活动关节的作用,实现人体正常的功能活动。肌腱的生物学性能在一定程度上影响着肌肉的收缩力和运动成绩。肌腱损伤是一种常见病,常见或多见于老年人和特定人群,是一种在解剖学结构意义上的异常,内在实质病因是肌腱受伤受损,局部或全部撕裂,甚至是彻底地断裂。反复的剧烈运动通常会导致脆弱的软组织遭到磨损或撕裂损伤;这些肌腱的损伤可引起疼痛和功能障碍。对肌腱损伤的治疗,因个体差异和损伤部位,损伤程度以及治疗时机,治疗方法,选用产品,医术水平等不同,治疗效果,以及术后康复效果也有很大差异。肌腱损伤时,采用外科补片材料修复可减少术后疼痛,同时也有利于受损组织部分的结构和功能的恢复,在实际应用中渐渐得到一定的认可和较高的满意度。
肌腱-骨梯度界面的补片材料的设计一般从仿生肌腱-骨梯度界面的组成、结构和功能这几方面来考虑。从组成上来说,天然肌腱-骨梯度界面主要包含一些腱细胞、平行排列的胶原纤维、细胞外基质和钙化的骨质;从结构上来说,天然肌腱-骨界面呈现梯度变化,依次为肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨及骨质;从功能上来说,肌腱-骨界面可将肌肉收缩力转化为肢体运动,从而进行正常的生理活动。对于肌腱-骨组织工程来说,除了以上各方面之外,尤其还要仿生天然肌腱-骨的结构变化、矿物质含量变化。天然肌腱-骨界面有4部分,肌腱为平行排列的Ⅰ型胶原纤维、腱细胞、细胞外基质组成,未钙化的纤维软骨主要由Ⅱ型胶原、细胞外基质组成,钙化的纤维软骨中加入了钙,骨质主要由钙组成。
为了能够制备出具有仿生天然肌腱-骨成分、结构和功能的组织工程肌腱-骨界面补片材料,静电纺丝技术得到广泛的应用。静电纺丝技术操作简单、可重复性强、能够大批量生产,原材料廉价,易得。目前,大部分合成高分子、天然蛋白、可降解聚合物或他们的共混复合物都可用于静电纺丝技术,可制备出纳米级的单轴取向纤维结构。
目前,还未见有报道取向结构与矿化组分双重梯度变化的组织工程肌腱-骨界面补片材料及其制备方法。
发明内容:
本发明的目的是克服现有技术存在的缺点,提供一种仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料及其制备方法,该方法制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料模拟天然肌腱-骨界面梯度结构变化与矿物质组分含量变化,并具有良好的生物力学性能、降解性能以及细胞相容性。
为了实现上述目的,本发明提供一种仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,所述补片材料为表面覆盖磷酸钙结晶的医学用纳米纤维,纳米纤维的纤维排列方式由一端的单轴取向排列逐渐过渡为另一端的无规则排列,磷酸钙结晶的量由无规则排列一端向单轴取向排列一端梯度减少。
所述补片材料由肌腱侧向骨质侧分为4部分,依次为肌腱侧单轴取向排列部分(Ⅰ)、肌腱侧过渡部分(Ⅱ)、骨质侧过渡部分(Ⅲ)和骨质侧无规则排列部分(Ⅳ);其中,肌腱侧单轴取向排列部分的取向结构能够诱导肌腱干细胞规则排列,并诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化;肌腱侧过渡部分和骨质侧过渡部分的纤维取向由单轴取向向无规则取向过渡,其表面覆盖的磷酸钙结晶逐渐增多;骨质侧无规则排列部分的纤维表面覆盖磷酸钙结晶,能够使肌腱干细胞无规则排列,无规排列及磷酸钙结晶能够诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化。
本发明还提供所述仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的制备方法,以医学用纤维材料和近红外染料为原料制备单轴取向纳米纤维膜;然后通过不同时间的激光照射,使纳米纤维膜的单轴取向排列逐渐转变为无规则排列;然后垂直放置于培养皿中,照射时间最长端向下,逐滴加入模拟体液使其矿化,得到仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料;具体步骤如下:
(1)将医学用纤维材料与近红外染料共混在溶剂中溶解均匀,得到纺丝溶液,然后通过单喷头静电纺丝设备制备单轴取向纳米纤维膜;
(2)将步骤(1)中得到的单轴取向纳米纤维膜裁剪至合适大小,将一端遮盖,其余部分用激光照射,促使被照射部分的纳米纤维膜结构由单轴取向排列逐渐转变为无规则排列,得到由单轴取向逐渐过渡为无规则排列的纳米纤维膜;
(3)将步骤(2)中得到的由单轴取向逐渐过渡为无规则排列的纳米纤维膜垂直放置于容器中,未进行激光照射的一端在上,逐滴加入市售的模拟体液10×SBF,得到梯度矿化的纳米纤维膜,即仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料。
所述医学用纤维材料为聚氨酯、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚氧化乙烯中的至少一种。
所述近红外染料为吲哚菁绿、对甲基苯磺酸盐和吲哚绿荧光探针中的至少一种。
所述步骤(1)中医学用纤维材料与近红外染料的质量比为100:(0.5-5);医学用纤维材料与近红外染料的总质量与溶剂的体积为(8-15)g:100mL。
所述步骤(1)中静电纺丝设备包括推进装置、针筒、高压静电发生器和高速转筒。
所述步骤(1)中纺丝参数如下:PU/ICG纺丝溶液流速为0.013mL/min,喷头电压为18KV,转筒接地线,喷头与转筒的距离为12-15cm,转筒的转速为2500-3000rpm。
所述步骤(1)中溶剂为六氟异丙醇。
所述步骤(2)中的激光照射强度根据近红外染料吸收激光能量所释放的热量确定;,激光照射时间根据选用的医学用纤维材料达到熔点的时间而调整;激光照射分三部分进行,每一部分照射时,其余部分均遮盖;沿不进行激光照射的遮盖端向进行激光照射端的方向上的照射时间逐渐增加,随着激光照射时间的延长,纤维的熔化程度越大,纤维取向逐渐呈现无规则排列。
所述步骤(3)中市售的模拟体液10×SBF的浓度为正常模拟体液SBF浓度的10倍,使用时先用HCl及NaOH调节10×SBF溶液PH至4.2-4.5,然后加入NaHCO3调节PH至6.5-6.8。
所述步骤(3)中容器为直径10cm培养皿;10×SBF的滴加速度为0.5mL/min,滴加时间为2-2.5小时。
从整体上来说,该肌腱-骨梯度界面补片材料仿生了天然肌腱-骨界面处矿物质含量及结构的梯度变化,具有良好的力学性能、生物相容性和降解性能;从细节上来说,聚氨酯PU材料弹性优良,力学性能好,能够满足体内微环境需要的生物力学强度和顺应性;肌腱侧单轴取向部分(Ⅰ)的纳米纤维结构,有利于肌腱干细胞的黏附、增殖以及取向生长,并诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化;骨质侧无规则排列部分(Ⅳ)可使肌腱干细胞无取向生长,表面覆盖的磷酸钙结晶可诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化;肌腱侧过渡部分(Ⅱ)、骨质侧过渡部分(Ⅲ)能够实现两端肌腱侧和骨质侧两种细胞类型的过渡。因此,本发明制备的肌腱-骨梯度界面补片材料在肌腱-骨组织重构和修复方面有很好的应用前景。
本发明与现有技术相比,有益效果如下:
(1)发明人首次将光热材料与单轴取向纳米纤维相结合,仿生天然肌腱-骨梯度界面的矿化组分以及结构梯度变化的不同特点,制备出取向结构与矿化双重梯度变化的组织工程肌腱-骨界面补片材料,该补片材料弹性优良,力学性能好,能够满足体内微环境需要的生物力学强度和顺应性;
(2)本发明制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的肌腱侧轴向取向部分的纤维结构,有利于肌腱干细胞的黏附、增殖以及取向生长,并诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化;骨质侧无规则排列部分的纤维结构能够使肌腱干细胞无取向生长,表面覆盖的磷酸钙结晶涂层能够诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化;肌腱侧过渡部分、骨质侧过渡部分能够实现两种细胞类型的过渡;
(3)本发明制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的原料均为生物可降解的高分子,无毒,组织相容性好,能够随着肌腱组织的新生和重构而逐渐降解,能够减少瘢痕的愈合;同时也能够根据需求制备出不同大小和梯度变化的补片材料,在肌腱-骨组织重构和修复方面具有很好的应用前景。
附图说明:
图1为本发明涉及的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的数码照片。
图2为本发明涉及的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的矿化步骤操作示意图,矿化含量曲线以及矿化后的SEM表征图,其中,A为矿化步骤操作示意图;B为矿化含量曲线示意图;C、D、E和F分别为补片材料四个部分的扫描电镜图;G、H、I和J分别为补片材料四个部分的放大倍数的扫描电镜图;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别代表补片材料的四个部分,依次为肌腱侧单轴取向部分、肌腱侧过渡部分、骨质侧过渡部分和骨质侧无规则排列部分。
图3为本发明涉及的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料对细胞形态的影响试验结果图,A、B、C、D图分别代表细胞在仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ部分的形态。
图4为本发明实施例3涉及的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的应用实验结果图,其中,A表示对肩胛下肌腱部分损伤的建立;B表示补片材料的植入与固定;C和E表示对照组在3周、6周所获得的标本;D、F表示实验组在3周、6周所获得的标本。
具体实施方式:
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1:
本实施例涉及一种仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的制备方法,其中,医学用纤维材料选用聚氨酯,近红外染料选用吲哚箐绿;具体步骤包括:
(1)用电子天平准确称取0.8g的聚氨酯(PU)和0.008g的吲哚菁绿(ICG)溶于10mL六氟异丙醇中,磁力搅拌器过夜搅拌,搅拌均匀,得到PU/ICG纺丝液;采用现有技术的静电纺丝设备制备PU/ICG单轴取向纳米纤维膜,纺丝参数为:纺丝液流速分别为0.013mL/min,喷头与滚筒之间的距离为15cm,喷头电压为18KV,转筒接地线,滚筒转速为2500rpm,5小时后得到PU/ICG单轴取向纳米纤维膜;
(2)将步骤(1)得到的PU/ICG单轴取向纳米纤维膜截取为2cm×2cm大小,固定于2×2cm盖玻片上,将纤维膜沿一个方向分为四部分,第一部分从始至终一直遮盖,不进行激光照射;将第三部分和第四部分遮盖,第二部分用近红外激光照射5s,热像仪观察照射部位温度达110℃;将第二部分和第四部分遮盖,第三部分用近红外激光照射7s,热像仪观察照射部位温度达130℃;将第二部分和第三部分遮盖,第四部分用近红外激光照射10s,热像仪观察照射部位最高温度达到145℃;近红外激光波长为808nm,激光照射的强度为2W/cm2;得到由单轴取向逐渐过渡为无规则排列的纳米纤维膜;近红外激光照射能够激发ICG产热达到纤维熔点,引导纤维“光焊”;
(3)将步骤(2)得到的由单轴取向逐渐过渡为无规则排列的纳米纤维膜垂直放置于直径10cm培养皿,未进行激光照射的一端向上,以0.5mL/min速度向培养皿中加入10×SBF,2小时后得到梯度矿化纳米纤维膜,反复用无水乙醇与蒸馏水清洗,放入干燥箱12小时进行干燥,得到成型的具有取向结构与矿化双重梯度的纳米纤维膜,即仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料。
所述10×SBF为市售模拟体液,其浓度为正常模拟体液SBF浓度的10倍,先用HCl及NaOH调节10×SBF溶液PH至4.2-4.5,然后加入NaHCO3调节PH至6.5-6.8,即可使用。
本实施例制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料为表面覆盖磷酸钙结晶的聚氨酯纳米纤维,聚氨酯纳米纤维的纤维排列方式由一端的单轴取向排列逐渐过渡为另一端的无规则排列,磷酸钙结晶的量由无规则排列一端向单轴取向排列一端梯度减少。
所述补片材料由肌腱侧向骨质侧分为4部分,依次为肌腱侧单轴取向排列部分(Ⅰ)、肌腱侧过渡部分(Ⅱ)、骨质侧过渡部分(Ⅲ)和骨质侧无规则排列部分(Ⅳ);其中,肌腱侧单轴取向排列部分的取向结构能够诱导肌腱干细胞规则排列,并诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化;肌腱侧过渡部分和骨质侧过渡部分为中间部位纤维取向及磷酸钙结晶逐渐变化的过渡部分;骨质侧无规则排列部分的纤维表面覆盖磷酸钙结晶,能够使肌腱干细胞随机排列,随机排列及磷酸钙结晶能够诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化。
本实施例采用能量弥散X射线探测器对制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料纤维表面矿化涂层进行含量检测,结果如图2B所示,结果显示,部分Ⅰ无矿化含量,即部分Ⅰ的纤维表面无磷酸钙结晶;部分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ矿化含量逐渐增多,即部分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的纤维表面覆盖的磷酸钙结晶逐渐增多。
本实施例采用扫描电镜对仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料进行表征,结果如图2C-2J所示,由左到右,纤维结构逐渐改变,由取向纤维逐渐转变为无规则结构纤维,纤维表面的矿化涂层也逐渐增多。
实施例2:
本实施例为实施例1制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料对细胞形态的影响实验。将肌腱干细胞以1×104个/孔的浓度接种在含有实施例1制备的补片材料的24孔板中,培养3天后,F-actin/DAPI染色观察细胞形态,具体方法为:
1、肌腱干细胞完全培养液(体积百分比组分为:89%低糖DMEM+10%胎牛血清+1%青/链霉素)培养3天后,移除旧的培养液,然后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次;
2、用质量百分比浓度为3%的戊二醛水溶液1mL/孔室温固定肌腱干细胞10min,移除戊二醛,然后用PBS洗3次;
3、用体积百分比浓度为0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)水溶液1mL/孔室温通透5min,移除Triton X-100溶液,然后用PBS洗3次;
4、用质量百分比浓度为1%的BSA(牛血清蛋白)水溶液1mL/孔封闭30min-60min,移除BSA溶液然后用PBS洗3次;
5、将F-actin(纤维状肌动蛋白绿色荧光染液)和质量百分比浓度为1%的BSA(牛血清蛋白)水溶液按体积比为1:1000混合,然后在每孔中加入上述混合液200μL,室温下避光染色45min;
6、用PBS洗3次,每次5min;
7.用含DAPI(苯基吲哚)的封片剂封片,显微镜下观察并拍照,结果如图3A-3D所示。
结果显示:肌腱干细胞在纤维膜的部分I中排列规则且细长,呈现典型的纺锤状成纤维细胞表型;在部分II和III的细胞形态发生了改变,排列逐渐不规则;部分Ⅳ中的细胞向周围延伸,排列不规则。以上说明,仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的不同区域的结构可对肌腱干细胞形态变化产生影响。
实施例3:
本实施例涉及实施例1制备的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料的应用实验,具体为:
首先,构建损伤模型,在新西兰大白兔12只的耳缘静脉注射戊巴比妥钠(1.5%,2mL/Kg)全身麻醉,然后将兔子侧身固定于手术台上,常规术前备皮,消毒,铺无菌洞巾,肩部局部利多卡因浸润麻醉;经皮开一长约3cm的手术切口,并将皮下筋膜逐层分离,暴露肱骨头后,找到肩胛下肌腱;在肌腱与骨骼相连的位置处,将肩胛下肌腱切开50%的厚度;然后清理肱骨头的表面残端;然后随机分为2组,分别为实验组和对照组,实验组用仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料覆盖肌腱的损伤区域,并用缝合线固定;对照组对损失区域未采取任何措施;然后将2组的组织逐层缝合。最后,用纱布包扎,然后将它们分别放在兔笼中而不限制其活动。手术后,3天内肌肉注射青霉素(8万单位)以抵抗感染。并与手术后3周和6周分别处死兔,然后获取肱骨及相连的肩胛下肌肌腱,进行大体观察,结果如图4所示。
结果显示:3周时,两组的损伤均未明显愈合;6周时,实验组愈合明显,仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料被包被在增生组织中,对照组愈合不佳;说明本发明仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料在肌腱-骨组织重构和修复方面具有很好的应用。
Claims (10)
1.一种仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,所述补片材料为表面覆盖磷酸钙结晶的医学用纳米纤维,纳米纤维的纤维排列方式由一端的单轴取向排列逐渐过渡为另一端的无规则排列,磷酸钙结晶的量由无规则排列一端向单轴取向排列一端梯度减少。
2.根据权利要求1所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,所述补片材料由肌腱侧向骨质侧分为4部分,依次为肌腱侧单轴取向排列部分、肌腱侧过渡部分、骨质侧过渡部分和骨质侧无规则排列部分;其中,肌腱侧单轴取向排列部分的取向结构能够诱导肌腱干细胞规则排列,并诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化;肌腱侧过渡部分和骨质侧过渡部分的纤维取向由单轴取向向无规则取向过渡,其表面覆盖的磷酸钙结晶逐渐增多;骨质侧无规则排列部分的纤维表面覆盖磷酸钙结晶,能够使肌腱干细胞无规则排列,无规排列及磷酸钙结晶能够诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化。
3.根据权利要求1所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,所述补片材料的制备方法为:
(1)将医学用纤维材料与近红外染料共混在溶剂中溶解均匀,得到纺丝溶液,然后通过单喷头静电纺丝设备制备单轴取向纳米纤维膜;
(2)将步骤(1)中得到的单轴取向纳米纤维膜的一端遮盖,其余部分用激光照射,促使被照射部分纳米纤维膜结构由单轴取向排列逐渐转变为无规则排列,得到由单轴取向逐渐过渡为无规则排列的纳米纤维膜;
(3)将步骤(2)中得到的由单轴取向逐渐过渡为无规则排列的纳米纤维膜垂直放置于容器中,未进行激光照射的一端在上,逐滴加入模拟体液,得到梯度矿化的纳米纤维膜,即仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料。
4.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,所述医学用纤维材料为聚氨酯、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚氧化乙烯中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,所述近红外染料为吲哚菁绿、对甲基苯磺酸盐和吲哚绿荧光探针中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,步骤(1)中医学用纤维材料与近红外染料的质量比为100:0.5-5。
7.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,步骤(1)中溶剂为六氟异丙醇。
8.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,步骤(2)中的激光照射强度根据近红外染料吸收激光能量所释放的热量确定;激光照射时间根据选用的医学用纤维材料达到熔点的时间而调整;激光照射分三部分进行,每一部分照射时,其余部分均遮盖;沿不进行激光照射的遮盖端向进行激光照射端的方向上的照射时间逐渐增加,随着激光照射时间的延长,纤维的熔化程度越大,纤维取向逐渐呈现无规则排列。
9.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,步骤(3)中的模拟体液的浓度为市售的10×SBF,其浓度为正常模拟体液SBF浓度的10倍,使用时,先用HCl及NaOH调节10×SBF溶液PH至4.2-4.5,然后加入NaHCO3调节PH至6.5-6.8。
10.根据权利要求3所述的仿生天然肌腱-骨梯度界面的补片材料,其特征在于,步骤(3)中容器为直径10cm的培养皿;10×SBF的滴加速度为0.5mL/min,滴加时间为2-2.5小时。
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