CN115068687A - 梯度纳/微纤维支架及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纳/微纤维支架及其制备方法与应用。本发明采用I型胶原、聚己内酯和羟基磷灰石仿生腱骨止点，I型胶原为腱骨主要成分，聚己内酯为支架材料提供力学支撑，纳米羟基磷灰石为骨组织主要的无机成分；基于腱骨止点的分级结构特征，采用静电纺丝技术与冷冻干燥技术相结合，高取向性纳微纤维用以仿生肌腱组织；低取向性纳微纤维用于仿生骨组织。本专利从天然腱骨组织的组成、拓扑结构、力学性质等方面多维仿生干细胞微环境，为腱骨修复提供了一种新的途径。

Description

梯度纳/微纤维支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种梯度纳/微纤维支架及其制备方法与应用。

背景技术

腱-骨损伤是临床常见的运动性疾病。肌腱和韧带分别将肌肉连接到骨骼或将骨骼连接到骨骼，肌腱或韧带连接到骨骼的界面被称为腱-骨止点。肌腱在组织结构、成分和机械性能方面表现出梯度，从而能够在不同的组织之间有效地传递机械应力以及维持体内平衡。腱-骨止点的复杂性使骨骼肌功能得以实现，但也给腱-骨修复和再生带来了巨大的挑战。

临床上多采用自体或异体肌腱来修复腱-骨损伤，然而自体移植和异体移植等方法具有局限性，并且易产生并发症。自体移植会造成患者二次损伤，导致供体部位损伤、畸形及瘢痕，也同时存在出血、炎症、感染和慢性疼痛等手术风险。与自体移植不同，异体移植的风险主要与免疫反应、感染反应相关。

组织工程的出现为腱-骨损伤修复提供了新策略。通过构建组织工程支架材料，随后将体外培养的细胞接种于支架材料上并进行扩增，进而构成生物-细胞复合材料，将其植入病损部位后，在材料降解以及细胞增殖的作用下，最终形成与自身功能和形态相适宜的组织或器官，从而实现腱-骨损伤修复。在此过程中，支架材料的选择是组织工程的关键，不仅要满足生物功能性、生物相容性，还要易于加工成型、满足适宜的理化要求等多种条件。

合成聚合物表现出优异的机械性能、降解速率和易加工性，但其低生物活性和酸性降解产物限制了其应用；天然聚合物因其固有的生物相容性和生物降解性而被广泛用于组织工程，但它们缺乏足够的机械性能。总而言之，应用于组织工程技术的生物材料不仅需要考虑生物相容性，以确保移植细胞和局部细胞群的生长和分化，而且还需要生物可降解性，以便逐渐被新再生的组织所取代。

为了克服在腱-骨组织工程中单一类型生物材料的缺点，本专利利用不同材料的有利性能，通过复合材料赋予支架优异的性能，以实现肌腱/韧带-骨的功能性再生。

公开号为CN105688274B的发明专利公开了一种聚己内酯/明胶电纺复合支架的制备工艺，该发明虽然以聚己内酯、明胶、羟基磷灰石为原料制备该支架，但制备方法与本发明并不相同，且制备工艺比较复杂。

发明内容

有鉴于此，本专利采用I型胶原、聚己内酯和羟基磷灰石仿生腱-骨止点，I型胶原为腱骨主要成分，聚己内酯为支架材料提供力学支撑，纳米羟基磷灰石为骨组织主要的无机成分；基于腱骨止点的分级结构特征，采用静电纺丝技术与冷冻干燥技术相结合，高取向性纳微纤维用以仿生肌腱组织；低取向性纳微纤维用于仿生骨组织。

本发明的目的之一在于提供一种制备纳/微纤维支架的方法，该方法简单易操作，且成本较低。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

纳/微纤维支架的制备方法，所述纳/微纤维支架以I型胶原、聚己内酯和纳米羟基磷灰石为原料制备，所述方法具体包括以下步骤：

S1：制备酶溶性胶原蛋白；

S2：利用静电纺丝技术制备聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜；

S3：利用冷冻干燥技术将所述纳米羟基磷灰石沉积到所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜上，制得所述纳/微纤维支架。

腱-骨基质主要由50-500nm纤维构成，传统技术如自组装、相分离等往往难以满足需求，而静电纺丝技术具有低成本、能够获得具有取向性的纤维等优点，因此，本专利采用静电纺丝技术制备纳/微纤维支架。

静电纺丝技术是一种在高压静电作用下连续拉伸聚合物溶液或熔体，并通过溶剂挥发或熔体固化获得超细纤维的方法。由静电纺丝技术制备而得的纳/微纤维材料具有高孔隙率和大比表面积的特征，并且纳/微纤维的直径与人体中细胞大小大致相同。在应用静电纺丝技术制备纳/微纤维材料过程中，影响纳/微纤维材料制备的因素主要有纺丝液的物理化学性质、施加电压、液体流动速度、收集装置与喷射针头的距离等。为了获得取向性较好的纳/微纤维以达到仿生腱-骨的目的，本专利选用了滚轮收集，所以滚轮的转速大小也是实验成功与否所需要考虑因素。

进一步，S1具体为：

(1)将牛皮真皮层先后经过碱浸泡、酸膨胀、高压脱纤处理后得到胶原松弛纤维凝胶；

(2)将胶原纤维凝胶浸泡在去离子水中，加入4％的NaOH溶液调节pH值至6.8-7.0，使得胶原纤维从溶液中析出；

(3)反复用去离子水洗涤胶原纤维，并用纱布过滤掉盐分，大量冲洗后，采用10％AgNO₃溶液检测；

(4)称取胶原纤维并记录好质量，加入0.5mol/L醋酸(固液比1：100)和3％(按照胶原纤维的固含量计算)胃蛋白酶，在磁力搅拌48h后，在4℃的条件下进行离心；

(5)吸出上清液，缓慢加入NaCl晶体至2mol/L，4℃盐析过夜，离心，弃上清；

(6)加入适量0.5mol/L醋酸重新溶解胶原，将其装入截留分子量为8kDa的透析袋中，透析48h后用10％AgNO₃溶液检测其透析程度，最后通过冷冻干燥便得到胶原。

进一步，所述I型胶原和所述聚己内酯的质量比为3：16，即胶原含量为聚己内酯的18.75％。

进一步，所述聚己内酯还可以是聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸和/或聚乙二醇。

进一步，S2中，所述聚己内酯浓度为8％，所述聚己内酯和所述Ⅰ型胶原的良溶剂为六氟异丙醇。

以纯胶原为材料存在力学性能差，成膜能力较弱、柔韧性差以及植入体内后降解速率过快等缺点，无法满足制备腱-骨支架的要求，因此要对胶原改性处理。共混改性是一种简单、便捷且可明显提高其各项性能的一种方法。通过在体系中引入其他高分子材料，与胶原蛋白形成氢键和/或静电作用来改善其性能。

聚己内酯(PCL)是一种人工合成高分子材料，具有力学强度高、柔韧性好、生物相容性好以及可生物降解等优点，但存在亲水性不佳的缺点。胶原与PCL两种组分的性能存在互补性，共混改性后可使胶原的拉伸强度和柔韧性提高，同时使PCL的亲水性得到改善。

进一步，所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜包括高取向性纳/微纤维和低取向性纳/微纤维；所述高取向性纳/微纤维用以仿生肌腱组织；所述低取向性纳/微纤维用于仿生骨组织。

进一步，所述纳米羟基磷灰石沉积于所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜低取向性的一端。

进一步，S2中静电纺丝参数为：电压31kV，滚轮转速2000rpm，推注速度0.004mm/s，接收距离22cm。

本发明的目的之二在于提供一种纳/微纤维支架，该支架具有良好的生物降解性、生物相容性、低免疫原性以及与细胞外基质的结构和组成高度相似，可有效促进肌腱-骨愈合。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

用上述方法制备的纳/微纤维支架。

进一步，所述纳/微纤维支架中纳/微纤维的方向集中在±15°以内。

进一步，所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜的水接触角为40°～90°。

本发明的目的之三在于提供一种用所述纳/微纤维支架促进细胞粘附、增殖及迁移的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

用所述纳/微纤维支架促进细胞粘附、增殖及迁移的方法，所述纳/微纤维支架能够仿生干细胞微环境，在细胞生长发育过程中为其提供新陈代谢、物质交换的场所。

进一步，所述纳/微纤维支架在制备用于修复腱-骨损伤的仿生腱-骨中的应用。

本发明的有益之处在于：

1.本专利制得的梯度PCL/胶原纳米羟基磷灰石纤维支架具有良好的梯度纤维取向。

2.本专利从天然腱骨组织的组成、拓扑结构、力学性质等方面多维仿生干细胞微环境，为腱-骨修复提供了一种新的途径。

3.本专利采用I型胶原、聚己内酯和羟基磷灰石仿生腱-骨止点，I型胶原为腱-骨主要成分，聚己内酯为支架材料提供力学支撑，纳米羟基磷灰石为骨组织主要的无机成分。

4.基于腱-骨止点的分级结构特征，本专利将静电纺丝技术与冷冻干燥技术相结合，高取向性纳/微纤维用以仿生肌腱组织；低取向性纳/微纤维用于仿生骨组织，为腱-骨修复提供了一种新的途径。

附图说明

图1为纳/微纤维支架材料结构示意图；

图2为纳/微纤维角度定义；

图3为自提胶原DSC曲线；

图4为胶原傅里叶红外光谱分析图；

图5为电镜扫描下的5％PCL纺丝效果图；

图6为电镜扫描下的10％PCL纺丝效果图；

图7为电镜扫描下的8％PCL纺丝效果图；

图8为显微镜下的不同条件8％PCL静电纺丝观察图；

图9为考马斯亮蓝染色后的PCL-Ⅰ型胶原复合膜，其中，图9-a：PCL_6.25；图9-b：PCL_12.25；图9-c：PCL_18.75；图9-d：PCL₂₅；图9-e：PCL₅₀；图9-f：PCL₁₀₀(PCLx中，下角标x表示胶原相对于PCL质量百分比，即胶原的质量/PCL的质量％)；

图10为复合膜应力-应变曲线示意图；

图11为复合膜水接触角测试结果图；

图12为PCL-胶原复合膜DSC曲线；

图13为标尺50.0μm的PCL-Ⅰ型胶原纳/微纤维膜的扫描电镜图；

图14为标尺10.0μm的PCL-Ⅰ型胶原纳/微纤维膜的扫描电镜图；

图15为纳/微纤维方向分布直方图；

图16为电镜下的梯度PCL/胶原/纳米羟基磷灰石纳/微纤维支架材料图(低取向性纤维沉积纳/微羟基磷灰石的一端)；

图17为电镜下的梯度PCL/胶原/纳米羟基磷灰石纳/微纤维支架材料图(高取向性和低取向性纤维的临界处)；

图18为纤维膜的表面元素分析；

图19为制备梯度取向纳/微纤维支架的装置示意图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整所获得的技术方案，仍属于本发明的保护范围。

表1和表2为实施例部分涉及的主要仪器和试剂。

表1.试剂名称、厂家及作用

试剂	公司	作用
			聚己内酯(PCL)	SIGMA-ALDRICH	纳/微纤维支架的构建
纳米羟基磷灰石	SIGMA-ALDRICH	纳/微纤维支架的构建
			胶原	MACKLIN	纳/微纤维支架的构建
牛皮	屠宰场	提取胶原
			六氟异丙醇	阿拉丁	溶解PCL和胶原
冰醋酸	重庆川东化工	溶解PCL和胶原
			正己烷	重庆川东化工	溶解PCL和胶原
二甲亚砜	成都市科隆化学品	溶解PCL和胶原
			二氯甲烷	重庆川东化工	溶解PCL和胶原

表2.仪器名称、厂家及作用

设备	公司	作用
			L-550型台式离心机	Thermo Fisher Scientific	离心
静电纺丝机	大连鼎通科技	制备纳/微纤维膜
			VAB-100-1倒置显微镜	Thermo Fisher Scientific	材料观察
电子天平	Thermo Fisher Scientific	称量
			超纯水系统	Thermo Fisher Scientific	纯化水
场发射扫描电镜	日本日立	形貌观察
			差示扫描量热仪	美国TA	热性能表征
红外光谱仪	美国Nicolet	结构表征

实施例1.酶溶性胶原

1.酶溶性胶原的提取

(1)将牛皮真皮层先后经过碱浸泡、酸膨胀、高压脱纤处理后得到胶原松弛纤维凝胶；

(2)将胶原纤维凝胶浸泡在去离子水中，加入4％的NaOH溶液调节pH值至6.8-7.0，使得胶原纤维从溶液中析出；

(3)反复用去离子水洗涤胶原纤维，并用纱布过滤掉盐分，大量冲洗后，采用10％AgNO₃溶液检测；

(4)称取胶原纤维并记录好质量，加入0.5mol/L醋酸(固液比1：100)和3％(按照胶原纤维的固含量计算)胃蛋白酶，在磁力搅拌48h后，在4℃的条件下进行离心；

(5)吸出上清液，缓慢加入NaCl晶体至2mol/L，4℃盐析过夜，离心，弃上清；

(6)加入适量0.5mol/L醋酸重新溶解胶原，将其装入截留分子量为8kDa的透析袋中，透析48h后用10％AgNO₃溶液检测其透析程度，最后通过冷冻干燥便得到胶原。

2.酶溶性胶原的结构和性能分析

(1)傅里叶红外光谱(FTIR)分析

将制备得到的胶原通过FTIR采集范围为4000-400cm^-1的谱图，分辨率为4cm^-1。所有的测量都是室温下的干燥环境中完成。

分析与结果：

胶原蛋白的二级主链构象可以在红外光谱中得到反映。完整构象的胶原蛋白具有完整的右手三股螺旋结构，这可以通过红外光谱中的酰胺键来表征。通常，酰胺A和酰胺B带在大约3400～3440cm^-1和3080～3100cm^-1处，主要与N-H基团的伸缩振动相关。酰胺Ⅰ带通常出现在1600～1660cm^-1左右，主要是由C＝O羰基伸缩振动引起的，酰胺Ⅱ带出现在1500～1600cm^-1左右，主要由N-H弯曲振动和C-N伸缩振动引起。酰胺Ⅲ在大约1200～1300cm^-1处的吸光度，主要与C-N和N-H弯曲振动，以及甘氨酸主链和脯氨酸侧链中的-CH₂非平面摇摆振动有关。

图4为上海麦克林公司的胶原蛋白与自提酶溶性牛皮胶原的红外扫描光谱。与上海麦克林公司胶原样品类似，本实验用牛皮制得的胶原在相似的波数下获得了峰值。图中在3270.37cm^-1、1631.11cm^-1和1240～1450cm^-1附近件均出现了胶原蛋白的特征性吸收峰，初步表明提取样品为胶原蛋白。此外，现有文献研究指出，当酰胺III带与1450cm^-1处的比值(记为：A_III/A₁₄₅₀)约为1时，胶原蛋白具有完整的三股螺旋结构。如表3所示，麦克林公司胶原与自提胶原的A_III/A₁₄₅₀比值都在0.93左右，与1接近，表明本实验所提取的胶原的三股螺旋结构基本保持其完整性。

表3.Ⅰ型胶原蛋白FTIR吸收峰归属

(2)差示扫描量热仪(DSC)

称取大约3±0.1mg胶原样品放在DSC铝锅里，以空铝锅为参照，然后将铝锅至于仪器中，氮气为保护气体，以扫描速率为5℃/min在温度范围为0～120℃的条件下采集升温和降温曲线。

热变性记录为典型峰值，并测量了与峰值(变性期间最大功率吸收温度)和起始温度(初始功率与温度线的切线穿过基线的温度)相对应的两个温度。此外还记录了热焓变(ΔH)。

分析与结果：

通常情况下，胶原蛋白的变性被认为是胶原蛋白三股螺旋结构塌陷成无规则卷曲状，并且胶原的性能也会在变性后减弱。胶原样品虽然保持着特殊的三股螺旋结构，但是胶原的三股螺旋结构趋向于更松散和更松弛，这似乎是为变性过程做好准备。

结果如图3所示，所提取的胶原蛋白的收缩温度为16.60℃，变性温度为55.54℃。收缩温度较低，说明提取胶原里面可能有一小部分三股螺旋解链，发生了变性。而变性温度较高，说明了所提胶原的热稳定性较好。

实施例2.PCL-Ⅰ型胶原共混体系的制备

1.溶剂溶解实验

使用电子天平取0.01gPCL和0.01g胶原分别溶解于盛有3mL冰醋酸、二氯甲烷、二甲亚砜、正己烷、0.5mol/L醋酸、六氟异丙醇的六只透明玻璃样品瓶中，观察PCL和Ⅰ型胶原的溶解性，找到适用于两种组分的良溶剂。

结果：表5为PCL溶解性能测试结果，从表5可以看出，PCL以二氯甲烷和六氟异丙醇为溶剂时，溶解性良好；表6为胶原溶解性能测试结果，当胶原以0.5mol/L醋酸、二甲亚砜、冰醋酸或六氟异丙醇为溶剂时，溶解性表现都不错，其中冰醋酸和六氟异丙醇效果最佳。综合PCL和胶原的溶解性能测试结果，确定六氟异丙醇为PCL和胶原的良溶剂。

表5.PCL溶解性能测试结果

编号	溶剂	实验现象	溶解性
				1	0.5mol/L醋酸	无色透明，有明显颗粒	不溶解
2	正己烷	无色透明，有明显颗粒	不溶解
				3	二甲亚砜	无色透明，有明显颗粒	不溶解
4	二氯甲烷	无色透明，无明显沉淀	完全溶解
				5	冰醋酸	无色透明，有少量颗粒	不完全溶解
6	六氟异丙醇	无色透明，无明显沉淀	完全溶解

表6.胶原溶解性能测试结果

编号	溶剂	实验现象	溶解性
				1	0.5mol/L醋酸	无色透明，无明显沉淀	完全溶解
2	正己烷	浑浊，有明显颗粒	不溶解
				3	二甲亚砜	无色透明，无明显沉淀	完全溶解
4	二氯甲烷	浑浊，有明显颗粒	不溶解
				5	冰醋酸	无色透明，无明显沉淀	完全溶解
6	六氟异丙醇	无色透明，无明显沉淀	完全溶解

2.考马斯亮蓝染色观察

在溶解实验的基础上，选取PCL和Ⅰ型胶原的良溶剂，按照表7配制，并在聚四氟乙烯板上流延制备复合膜。剪去复合膜一小块浸没于考马斯亮蓝染液中30s后，用去离子水反复洗涤后，置于光学显微镜下拍照。

表7.PCL-Ⅰ型胶原共混液相溶液配比表

	PCL(g)	Ⅰ型胶原(g)	HFIP(mL)	溶液浓度(g/mL)
					第一组	0.8	0.05	10	0.085
第二组	0.8	0.10	10	0.900
					第三组	0.8	0.15	10	0.950
第四组	0.8	0.20	10	1.000
					第五组	0.8	0.40	10	1.200
第六组	0.8	0.80	10	1.600

分析与结果：

胶原蛋白与PCL两种组分混合的均匀性，对材料的力学性能会产生直接的影响。因此，利用考马斯亮蓝染液可以使胶原蛋白快速染色且效果直观的特点，我们采用考马斯亮蓝染液将复合膜染色，在显微镜下通过颜色的分布直观地观察的胶原与PCL混合后的均匀程度。如图9所示：PCL_12.25复合膜和PCL_18.75复合膜的胶原分布均匀程度明显好于其他组，并且PCL_18.75复合膜在拉伸后显示出较好的取向性。所以，根据考马斯亮蓝染色结果，PCL_18.75组为两种组分共混均匀的较优配比，更适合后续实验。

3.力学拉伸性能测试

将薄膜裁剪成30mm×10mm的样条，测试程序设置为中间有效距离为10mm，拉伸速率为10mm/min。拉伸样条直至其断裂，并实时记录位移–力曲线。

分析与结果：

在混合体系中，组分的含量对共混材料的力学性能有明显的影响。因此，为了得到力学性能最优的组合，我们设置了6组不同浓度梯度，相应的PCL-Ⅰ型胶原复合膜的力学拉伸性能参数如表8。结果显示：在一定范围内，随着胶原含量的增加，PCL-Ⅰ型胶原复合膜的应力增强，所对应的应变增大，在PCL_18.75组(即胶原含量占PCL的18.75％)中应力和应变达到最大值，即最大应力为19.85±1.81MPa，应变为1364±172％。在此范围内，PCL_6.25、PCL_12.5、PCL_18.75三组的弹性模量、屈服点应力和屈服点应变无明显差异。然而，当胶原含量超过18.75％后，PCL-Ⅰ型胶原复合膜的拉伸应力和应变出现了明显的下降，特别是PCL₁₀₀组各项性能出现陡降，推测此时胶原在复合薄膜中的分散性受到严重影响，过多的胶原将使复合膜内部产生缝隙，导致其无法承受过大的载荷，详见图9-f。

表8.PCL-Ⅰ型胶原复合膜力学拉伸性能

注：表8中实验数据表示为平均值±标准偏差(means±SD)，n≥3；表中“-”表示数据在实际测量过程中不存在或为无效数据。

综上，PCL_18.75为力学性能最优组，可使PCL-Ⅰ型胶原共混体系的拉伸应力和应变达到最大值。其应力-应变曲线如图10所示，与典型的韧性高分子聚合物的应力-应变曲线一致。复合膜最初经过外力拉伸产生弹性形变，应力指数上升迅猛直至到达屈服点，在这一段的斜率即为弹性模量，随后应力稍微降低，并趋于稳定，这一过程为应变软化，后一阶段应力持续增加，这一过程为应变硬化，最后应力骤降，表示复合膜材料断裂。该组复合膜整体在拉伸过程中表现出良好的韧性和断裂伸长率，且具有较好的拉伸强度，基本满足腱-骨支架材料的需求。从力学性能数据来看，选用PCL_18.75配比来进行后续的静电纺丝实验为最佳。

4.静态水接触角测定

在室温条件下，使用水接触角仪器测量在薄膜上一滴蒸馏水的接触角。使用垂直于样品表面的注射器滴加一滴5μL去离子水在薄膜表面，当水滴在表面稳定后约1s，捕捉图像。每个样品重复测量3个不同的区域，并使用配套软件对接触角进行分析。

分析与结果：

材料的亲疏水性能将直接影响细胞在材料表面的行为，亲水性较好的材料更利于细胞的粘附、增殖及迁移行为。PCL分子内存在5个亚甲基，材料表现为疏水性，随着胶原蛋白的引入，-OH、-NH₂、-COOH等极性基团的增多，可改善其表面亲水性能。图11为胶原含量不同的六组PCL-Ⅰ型胶原复合膜水接触角测试结果数据图。通过测量静态水接触角，可以衡量材料表面与水之间的亲疏水性能，通常情况下，如果水接触角小于90°，材料表面亲水，如果大于90°，则为疏水表面。PCL作为一种有机高分子聚合物，其本身表面是疏水材料，而胶原是一种蛋白质，其表面具有亲水性。测试结果表明复合膜的水接触角小于90°，故具有亲水表面，说明胶原的加入使得复合膜表面的亲水性提高，这将有利于细胞的黏附和增殖。从整体来看，复合膜的水接触角随着胶原含量的升高而降低，这可以进一步说明PCL与胶原在复合膜中分散均匀。综合之前的性能测试，18.75％胶原含量的PCL-Ⅰ型胶原混合体系成为后续实验的首选。

5.差示扫描量热仪(DSC)

称取大约3±0.1mg样品放在DSC铝锅里，以空铝锅为参照，然后将铝锅至于仪器中，氮气为保护气体，以扫描速率为5℃/min在温度范围为0～120℃的条件下采集升温和降温曲线。

热变性记录为典型峰值，并测量了与峰值(变性期间最大功率吸收温度)和起始温度(初始功率与温度线的切线穿过基线的温度)相对应的两个温度。此外还记录了热焓变(ΔH)。

图12为不同胶原含量的PCL-胶原复合膜DSC曲线图，由图12可知各组的变性温度无明显差异，均为60℃左右，初步推测，胶原和PCL之间只形成了一些物理键合(比如氢键、分子间作用力)，无化学键合形成，对热稳定性基本无促进作用。

实施例3.不同取向PCL纳/微纤维制备条件的探索

称取0.5g、0.8g、1.0gPCL分别溶于盛有10mL六氟异丙醇的离心管中，加入磁力搅拌子，搅拌12h。制备出5％、8％、10％PCL的均质溶液。

在参数设置相同的条件下，使用三种溶液分别进行静电纺丝，在显微镜观察下，改变参数，选用相对成丝效果较好的纤维膜进行电镜扫描，找出3种浓度中，效果最佳的浓度。在PCL溶液浓度确定后，在此前的参数设置基础上，通过调整电压、推注速度、接收高度和滚轮转速等主要影响因素，优化纺丝条件，为后续PCL-Ⅰ型胶原共混溶液静电纺丝做铺垫。

分析与结果：

在5％、8％和10％PCL溶液的浓度选择预实验中，当静电纺丝的参数设为电压为31kV，推注速度为0.004mm/s，滚轮转速为870rpm，接收距离为22cm时，由图5～7可知，8％PCL溶液的纤维粗细程度更加均匀，成丝效果更加明显，所以选择8％PCL溶液作为后续实验纺丝的探索浓度。

由于8％PCL溶液通过静电纺丝制备出了效果不错的纤维膜，所以以电镜扫描过的8％PCL的静电纺丝设置的参数作为对照组，即电压为31kV，推注速度为0.004mm/s，滚轮转速为870rpm，接收距离为22cm，在其他条件不变的情况下，根据改变电压、推注速度、滚轮转速和接收距离这4个条件，制备了相对于对照组的高压和低压、高推注速度和低推注速度、高接收距离、零滚轮转速、较高滚轮转速和高滚轮转速等8个实验组，具体参数设置见表4。在光学显微镜观察并拍照，结果如图8所示：当电压降为15.56kV时(图8-b)，纤维均匀性较好，但与对照组相比，直径较大，不满足要求；当电压升高至34.58kV时(图8-c)，从整体上纤维直径变细，但均匀性下降，不满足要求。因此，电压值仍设置为31kV。当改变推注速度为0.007mm/s以及0.002mm/s时(图8-d和8-e)，纤维膜呈现出颗粒状，不满足要求；当接收距离为24.5cm时(图8-f)，纤维膜与对照组相似，并未得到优化，不满足要求。而当转速发生改变时(图8-g、8-h和8-i)，可以明显的看出纤维膜上的纤维取向随着转速的提高而增强。综上所述，静电纺丝参数优化为电压：31kV，推注速度：0.004mm/s，接收距离：22cm，转速：2000rpm。

表4.PCL静电纺丝参数设置

编号	电压(kV)	转速(rpm)	推注速度(mm/s)	接收距离(cm)
					a	31.00	870	0.004	22
b	15.56	856	0.004	22
					c	34.58	867	0.004	22
d	31.00	870	0.007	22
					e	30.98	882	0.002	22
f	31.29	876	0.004	24.5
					g	31.00	0	0.004	22
h	31.00	1500	0.004	22
					i	31.00	2000	0.004	22

实施例4.高取向性PCL/Ⅰ型胶原纤维膜的制备

基于实施例3优化条件的基础上，在电压：31kV，推注速度：0.004mm/s，接收距离：22cm，转速：2000rpm的条件下，电纺高取向性纳/微纤维膜。

1.表面形貌观察

把样品裁剪成10mm×10mm样条，并用导电胶将其粘贴于载物台上，溅射镀金，采用扫描电子显微镜(电压：3kV)对静电纺丝薄膜进行形貌观察并采集图片，放大倍数为100倍。

结果：如图13～14所示，本专利制备的纤维的直径小，分布均匀，具有较好的取向性。

2.统计纳/微纤维直径和纤维取向分布

为了进一步定量分析纳/微纤维的取向，将滚轴旋转的长轴方向定义为0°，采用Image J软件，随机选取了50根纤维(至少40根)与该长轴的夹角来确定制备膜的取向分布，如图2所示，逆时针夹角为-θ，顺时针夹角为θ。统计纳/微纤维的取向性，制得纳/微纤维方向分布直方图，详见图15。结果显示，纳/微纤维的方向集中在±15°以内，表现出预期效果。

实施例5.梯度PCL/胶原/纳米羟基磷灰石纳/微纤维支架的构建

将实施例4薄膜的一端用绝缘胶带遮挡，然后另一端在电压：31kV，推注速度：0.004mm/s，接收距离：22cm，转速：0rpm条件下电纺低取向性纳/微纤维膜，装置构建如图19所示。

称取0.1g纳米羟基磷灰石至试剂瓶中，加入10mL 0.5mol/L醋酸溶液，置于超声清洗仪进行超声处理20min，使羟基磷灰石分散均匀。加入0.1gⅠ型胶原，磁力搅拌至溶解(＜4℃)。将上述样品中低取向性一端浸没至溶液中，超声处理10min后置于-20℃冷冻，进一步进行冷冻干燥。

1.表面形貌观察

把样品裁剪成10mm×10mm样条，并用导电胶将其粘贴于载物台上，溅射镀金，采用扫描电子显微镜(电压：3kV)对静电纺丝薄膜进行形貌观察并采集图片，放大倍数为2000倍。

在放大2000倍的电镜扫描下，得到图16和图17。从图中可以直接观察到纳/微纤维支架材料的表面形貌特征。在高取向性和低取向性纤维材料的临界处能够清晰的看到纤维膜上的颗粒由高密度变为低密度，而在沉积了纳米羟基磷灰石的低取向性的一端能发现这样的颗粒分布得更广，我们可以初步推测电镜下的这种颗粒为纳米羟基磷灰石。

2.表面元素分析

当场发射扫描电子显微镜扫描样品的形态时，带有扫描电子显微镜附件的X射线能谱仪同时开始元素分析(EDS)，使用Oxford的Aztec软件进行分析。

为确定电镜下(图16～17)的颗粒的具体成分本专利对该纤维膜沉积了纳米羟基磷灰石的一端进行了表面元素分析，详见图18。计算得到Ca/P比为1.73，理论上纳米羟基磷灰石的Ca/P为1.67，由于在高取向性的一端只存在PCL和胶原，这两者都不含Ca和P元素，故此颗粒确定为纳米羟基磷灰石。

Claims (10)

1.纳/微纤维支架的制备方法，其特征在于，所述纳/微纤维支架以I型胶原、聚己内酯和纳米羟基磷灰石为原料制备，所述方法具体包括以下步骤：

S1：制备酶溶性胶原蛋白；

S2：利用静电纺丝技术制备聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜；

S3：利用冷冻干燥技术将所述纳米羟基磷灰石沉积到所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜上，制得所述纳/微纤维支架。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述I型胶原和所述聚己内酯的质量比为3：16。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，所述聚己内酯浓度为8％，所述聚己内酯和所述Ⅰ型胶原的良溶剂为六氟异丙醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜包括高取向性纳/微纤维和低取向性纳/微纤维；所述高取向性纳/微纤维用以仿生肌腱组织；所述低取向性纳/微纤维用于仿生骨组织。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纳米羟基磷灰石沉积于所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜低取向性的一端。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中静电纺丝参数为：电压31kV，滚轮转速2000rpm，推注速度0.004mm/s，接收距离22cm。

7.用权利要求1所述的方法制备的纳/微纤维支架。

8.根据权利要求7所述的纳/微纤维支架，其特征在于，所述纳/微纤维支架中纳/微纤维的方向集中在±15°以内。

9.根据权利要求7所述的纳/微纤维支架，其特征在于，所述聚己内酯/Ⅰ型胶原纤维膜的水接触角为40°～90°。

10.用权利要求7所述纳/微纤维支架促进细胞粘附、增殖及迁移的方法，其特征在于，所述纳/微纤维支架能够仿生干细胞微环境，在细胞生长发育过程中为其提供新陈代谢、物质交换的场所。

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