CN102499997A - 复合纳米纤维支架材料、制备方法及在骨修复方面的应用 - Google Patents

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孙宏晨
姜力铭
孙海珠
张恺
杨柏
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Abstract

本发明属于骨修复材料技术领域，涉及一种PLGA/HA/S载药复合纳米纤维支架材料、制备方法及在骨修复方面的应用。其中羟基磷灰石、辛伐他汀与PLGA的质量比为1∶100～1∶10，将上述原料配成含有辛伐他汀的载体高分子混合溶液；常温下利用高压静电纺丝装置制得。通过控制共混比例，反应温度，时间等因素来控制材料的物理化学性能以及降解速率，这种PLGA/HA/S共混载药纳米纤维具有良好的生物相容性；形貌类似于细胞外基质，利于细胞的粘附与生长；并具有较好的生物降解性，其可通过PLGA缓慢降解释放出骨组织的主要成分羟基磷灰石以及促进成骨的药物辛伐他汀，使该生物材料特别适合作为骨修复材料。

Description

复合纳米纤维支架材料、制备方法及在骨修复方面的应用
技术领域
本发明属于骨修复材料技术领域，涉及一种PLGA/HA/S载药复合纳米纤维支架材料、制备方法及在骨修复方面的应用。
背景技术
他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，作为经典的降脂药物广泛应用于高脂血症的治疗，辛伐他汀是他汀类药物中的一种，其化学结构式如式：
Figure BDA0000125262920000011
最新研究表明他汀类药物特别是辛伐他汀可以促进成骨细胞骨形成蛋白的表达，对骨缺损的修复有促进作用。很多学者也进行了大量的研究。吴哲[International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery37(2008)170-176]等制备了辛伐他汀缓释材料用于牙槽骨缺损的修复。Tomomi Tanigo等[Journal ofControlled Release 143(2010)201-206]利用可降解的水凝胶作为载体局部释放辛伐他汀证明其可以促进骨再生。
针对他汀类药物的研究主要包括系统给药和局部给药，系统给药具有一定的毒副作用，局部给药的载体主要包括明胶海绵、水凝胶等等，局部给药缓释体系依然存在不能控制缓释速率等问题，寻找一种合适的缓释载体仍然很关键。
目前利用生物材料治疗骨缺损已经在临床上得到了一定程度的认可，其中包括可降解聚合物、无机材料以及复合材料。PLGA是经过美国FDA认证的可作为药物载体的可降解聚合物，其具备良好的生物相容性、生物降解性，被广泛用于药物或基因控释以及骨、肌腱的组织工程方面。但由于单一聚合物的力学性能不好，很多学者将无机材料与聚合物结合形成复合材料，应用较多的无机成分主要包括羟基磷灰石、磷酸三钙等，这些无机成分类似于骨组织的主要成分，生物相容性好，与聚合物复合可以提高生物材料的力学性能，有很多研究已将无机成分用于骨缺损的修复。Wang等[Carbohydr Polym 2007；68：740-5]将羟基磷灰石复合壳聚糖丝素得到了具有更好抗压强度的复合物，成分类似于骨组织。通过静电纺丝法制备的纳米纤维支架具有比表面积大，形貌类似于细胞外基质，成本低廉等优点，因而成为一种理想的载体形式。然而通过静电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架仍未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进骨修复的复合纳米纤维支架材料及其制备方法和用途。通过PLGA的缓慢降解释放骨组织的主要成分羟基磷灰石和可促进成骨的药物辛伐他汀，为骨再生提供一个良好的微环境。
本发明所述的聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架材料(PLGA/HA/S)，其直径为50～1500nm，是聚乳酸(PLA)-羟基乙酸(PGA)纳米纤维基体、羟基磷灰石和辛伐他汀的电纺丝复合物，其中PLA与PGA的质量比为85∶15～50∶50，纳米羟基磷灰石(HA)粒径为40～200nm，HA与PLGA的质量比为1∶100～1∶10，辛伐他汀(S)与PLGA的质量比为1∶100～1∶10。
本发明所述的聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架的制备方法，包括如下步骤：
a)制备浓度为6～10％(WN)的聚乳酸-羟基乙酸溶液，溶剂为氯仿与N，N-二甲基甲酰胺的等体积混合，常温条件下磁力搅拌4～8小时直至得到透明溶液；
b)将纳米羟基磷灰石和辛伐他汀溶于氯仿与N，N-二甲基甲酰胺等体积的混合溶剂中，超声溶解；
c)将步骤a)和步骤b)的溶液混合后继续磁力搅拌1～2小时，然后采用高压静电纺丝装置进行纺丝；
d)将纺丝产物真空干燥后，即为本发明所述的复合纳米纤维支架材料。
所述的高压静电纺丝装置的纺丝电压为15～25kv，正负电极间的距离为10～20cm，纺丝液在喷口处的流速为0.5mL/h～1.5mL/h。
本发明制备的聚乳酸-羟基乙酸/羟基乙酸/辛伐他汀载药复合纳米纤维支架主要应用于修复受损骨组织的再生。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明制备的载辛伐他汀的PLGA/HA纳米纤维支架，形貌类似于细胞外基质，利于细胞的粘附和生长；通过控制共混比例，反应温度，时间等因素来控制材料的物理化学性能以及降解速率，这种PLGA/HA/S共混载药纳米纤维具有良好的生物相容性，其中羟基磷灰石在一定程度上增强了支架材料的机械强度，利于体内骨组织无机成分的沉积；PLGA降解缓释的辛伐他汀可以提高骨组织的修复效率，并且该载药支架缓释期近2个月，是一种优良的缓释药物载体，具有较好的应用前景。
(2)该制备方法简便可行，对设备无特殊要求并具有良好的经济效益。
附图说明
图1：(a)PLGA纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为6％(WN)；(b)PLGA/HA纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为6％(WN)，HA与PLGA的质量比为1∶20；(c)PLGA/HA纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为6％(WN)，HA与PLGA的质量比为1∶10；(d)PLGA/S纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为6％(WN)，S与PLGA的质量比为1∶10；(e)PLGA/HA/S纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为6％(WN)，HA与PLGA的质量比为1∶20；S与PLGA的质量比为1∶20；
图2：(a)PLGA纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为10％(WN)；(b)PLGA/HA纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为10％(WN)，HA与PLGA的质量比为1∶20；(c)PLGA/HA/S纳米纤维支架的扫描电镜图，其中PLGA的浓度为10％，HA与PLGA的质量比为1∶20，S与PLGA的质量比为1∶20；
图3：浓度为10％(WN)的PLGA/HA/S纳米纤维支架的药物累积释放曲线；
图4：细胞与支架材料相互作用的扫描电镜图；
图5：支架材料碱性磷酸酶活性检测对比图；
图6：支架材料体内成骨能力检测图——Micro-CT。
具体实施方式
实施例1：
将0.12g的PLGA(分子量为8万，PLA与PGA的质量比为85∶15)溶于2mL的三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，磁力搅拌4小时后，得到PLGA的三氯甲烷与二甲基甲酰胺混合溶液；然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到浓度为6％(WN)的PLGA纳米纤维支架，真空干燥后备用。其纤维直径在100nm～200m，纤维交错，有少量的纺锤体，如图1(a)。
实施例2：
将0.006g的羟基磷灰石溶于0.5mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，超声溶解后加入到实施例1制备的PLGA溶液中，然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到PLGA/HA纳米纤维支架，真空干燥后备用。其纤维直径为50～100nm，如图1(b)所示。
实施例3
将0.012g的羟基磷灰石溶于0.5mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，超声溶解后加入到实施例1制备的PLGA溶液中，然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到PLGA/HA纳米纤维支架，真空干燥后备用。其纤维直径为20～50nm，并含有较多的纺锤体，所得纤维支架孔隙较大，可达数微米，如图1(c)所示。
实施例4
将0.012g的辛伐他汀溶于0.5mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，超声溶解后加入到实施例1制备的PLGA溶液中，然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到PLGA/S纳米纤维支架，真空干燥后备用。其纤维直径为50～100nm，支架含有的纺锤体数目不多，但直径均较大。如图1(d)所示。
实施例5
将0.006g羟基磷灰石和0.006g辛伐他汀的混合物溶于0.5mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，超声溶解后加入到实施例1制备的PLGA溶液中，然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到PLGA/HA/S的载药复合纳米纤维支架，真空干燥后备用。其纤维直径为小于100nm，但含有较多的纺锤体，如图1(e)所示。
实施例6：
将0.2g的PLGA(分子量为8万，PLA与PGA的质量比为85∶15)溶于2mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，磁力搅拌4小时后，得到PLGA的三氯甲烷与二甲基甲酰胺溶液；然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到浓度为10％(WN)的PLGA纳米纤维支架，真空干燥后备用。其纤维直径在300nm～1μm，如图2(a)所示。
实施例7：
将0.01g的羟基磷灰石溶于0.5mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，超声溶解后加入到实施例6制备的PLGA溶液中，然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到PLGA/HA纳米纤维支架，真空干燥后备用。PLGA/HA纳米纤维直径较小，约420～900nm，表面粗糙，如图2(b)所示。
实施例8
将0.01g羟基磷灰石和0.01g辛伐他汀的混合物溶于0.5mL三氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中(体积比为1∶1)，超声溶解后加入到实施例6得到的PLGA溶液中，然后利用静电纺丝装置纺丝(电压为18V，距离为15cm)，制备得到PLGA/HA/S的复合纳米纤维支架，真空干燥后备用。PLGA/HA/S纳米纤维支架纤维直径为500nm～1.5μm，纤维支架表面粗糙，孔隙较大，如图2(c)，此仿生纳米纤维材料有助于细胞的粘附和生长。
实施例9
取0.02g实施例5制备的PLGA/HA/S复合纳米纤维支架浸泡于15mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，在特定时间(第1、3、5、7、15、28、35、56天)时将缓释液全部取出，并换以等量新鲜的PBS，首先利用UV-3600可见分光光度计测得各时间点的吸光度，然后依据标准曲线方程y＝0.0536x+0.0255{r＝0.99945，y是吸光度，x是辛伐他汀浓度(μg/ml)}计算辛伐他汀的释放量，如图3所示。本发明所涉及的PLGA/HA/S纳米纤维支架在7周内可以逐步缓慢释放辛伐他汀，保证成骨的良好微环境，可满足骨愈合的需要。
实施例10
将支架材料(实施例8)正反面分别进行紫外线照射消毒一小时后，用细胞培养基(α-DMEM)预湿支架一小时后，在材料上接种小鼠前成骨细胞MC3T3-E1(1.0×105细胞/支架)。细胞/支架置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养，每两天换一次细胞培养基，在第三天时用磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗支架两次，4％(VN)戊二醛固定半小时后，乙醇逐级脱水，空气干燥，SEM观察。如图4所示，细胞数量较多，成片状生长，细胞-细胞间连接紧密，并分泌出很多细胞外基质，证明该支架材料具有良好的生物相容性，纵横交错的网状结构利于细胞的粘附和生长。
实施例11
由于碱性磷酸酶(ALP)是早期成骨标志物，对于骨基质的形成有很重要的作用。故将支架材料正反面分别进行紫外照射消毒一小时后置于48孔板内，每孔接种50000个小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，细胞/支架置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养，每两天换一次细胞培养基，分别在第7天、14天、21天检测碱性磷酸酶(ALP)和总蛋白的含量。具体方法是：用PBS将细胞/支架冲洗两次，经胰酶消化后加入二次蒸馏水，反复冻融三次使细胞膜破裂。ALP检测采用传统的pNPP法：取50μl样品加入50μl pNPP(1mg/ml)二乙醇胺缓冲液(含0.5mM氯化镁，pH为9.8)，37℃水浴震荡30min后用50μl 1M的NaOH终止反应，测试405nm波长处的吸光度。总蛋白用考马斯亮蓝试剂盒测得。碱性磷酸酶水平通过总蛋白含量进行标准化。如图5所示，在第7天时，三组实验组(PLGA组、PLGA/HA组、PLGA/HA/S组)成骨细胞的ALP活性没有明显差异；但随着时间的延长，PLGA/HA/S组ALP活性明显高于其他各组，说明该载药复合纳米支架材料更能有效的促进前成骨细胞的成骨分化，对于促进骨再生起到重要作用。
实施例12
在SD雌性大鼠(6W，180～200g)的头部耳缘后做长度为1cm的横行切口，分离骨膜，用慢速手机在头盖骨人字缝区域制备直径为5mm的圆形缺损，将支架材料植入缺损处，操作过程中不断用生理盐水冲洗，最后用3/0手术缝合线缝合。术后四周将大水心脏灌流(4％多聚甲醛)处死后，将头盖骨取出，固定48小时后用于Micro-CT测量。如图6所示，(a)为PLGA/HA组，(b)为PLGA/HA/S组，PLGA/HA/S组较PLGA/HA组缺损明显缩小，缺损边缘不光滑，缺损中心和边缘均有较多的新生骨组织形成。

Claims (4)

1.一种聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架材料，其特征在于：其直径为50～1500nm，是聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维基体、羟基磷灰石和辛伐他汀的电纺丝复合物，其中聚乳酸与羟基乙酸的质量比为85∶15～50∶50，纳米羟基磷灰石粒径为40～200nm，羟基磷灰石与聚乳酸-羟基乙酸的质量比为1∶100～1∶10，辛伐他汀与聚乳酸-羟基乙酸的质量比为1∶100～1∶10。
2.权利要求1所述的聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架材料的制备方法，包括如下步骤：
a)制备浓度为6～10％(WN)的聚乳酸-羟基乙酸溶液，溶剂为氯仿与N，N-二甲基甲酰胺的等体积混合，常温条件下磁力搅拌4～8小时直至得到透明溶液；
b)将纳米羟基磷灰石和辛伐他汀溶于氯仿与N，N-二甲基甲酰胺等体积的混合溶剂中，超声溶解；纳米羟基磷灰石粒径为40～200nm，纳米羟基磷灰石与聚乳酸-羟基乙酸的质量比为1∶100～1∶10，辛伐他汀与聚乳酸-羟基乙酸的质量比为1∶100～1∶10；
c)将步骤a)和步骤b)的溶液混合后继续磁力搅拌1～2小时，然后采用高压静电纺丝装置进行纺丝；
d)将纺丝产物真空干燥后，即为聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架材料。
3.如权利要求2所述的聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于：高压静电纺丝装置的纺丝电压为15～25kv，正负电极间的距离为10～20cm，纺丝液在喷口处的流速为0.5mL/h～1.5mL/h。
4.权利要求1所述的聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/辛伐他汀复合纳米纤维支架材料在骨修复方面的应用。
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