CN111304921A - 一种一步法制备超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法，包括以下步骤：将双键修饰多巴胺和两性离子材料(MPC或半胱氨酸甲基丙烯酸酯)在有机溶剂中共聚，得到聚合物；将聚合物溶解，得到聚合物溶液；将高分子纳米纤维膜浸泡在聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯、聚乳酸、明胶或壳聚糖。本发明将多巴胺采用一步法嫁接到高分子纳米纤维膜上，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜。MPC接枝膜具有典型的水化润滑性能；体外实验中，两性离子聚合物接枝膜可显着抑制成纤维细胞的粘附，而纯高分子纳米纤维膜则不能；体内数据表明MPC等两性离子聚合物接枝的膜具有极好的抗肌腱粘附能力。

Description

一种一步法制备超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法
技术领域
本发明属于纤维膜技术领域，尤其涉及一种一步法制备超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法。
背景技术
到目前为止，静电纺丝是制备具有特殊功能的纳米纤维最强大和最简便的技术之一。通过对电纺纳米纤维的组成、结构和表面性能的控制，开发出了具有超疏水/亲水性、压电转换、和多重响应等特殊性能的电纺纳米纤维，从而拓展了其在能源、环境、生物医学等领域的广泛研究和应用。在生物医学领域，有报道称，通过调节纳米纤维的表面性质(如纤维取向、花纹结构)，可以实现细胞在纤维表面的特异性粘附和生长。良好的细胞粘附是组织再生的关键，然而，在某些疾病的治疗过程中，不良的细胞粘附会导致严重的后果，如肌腱粘连，肠粘连，和宫内粘连。因此，开发出具有高细胞黏附抑制率的纳米纤维膜可能具有广大临床应用前景。
值得注意的是，有报道指出，材料的表面润滑性能与生物粘附有关。在最近的大多数研究中，将丝裂霉素、布洛芬等药物封装在电纺纳米纤维中是抑制细胞在纤维膜表面粘附的常用策略。然而，由于缺乏润滑的纳米纤维表面容易被细胞粘附，而药物递送方法不会改变纳米纤维膜的表面性质，因此该策略不能完全抑制细胞粘附。此外，药物的局部副作用限制了它们的临床应用。据申请人所知，迄今为止还没有关于超润滑电纺纳米纤维膜实现对纤维表面的细胞粘附完全抑制的文献报道。因此，在不使用药物的情况下，利用易操作的技术开发具有超润滑表面的电纺纳米纤维来抑制细胞粘附是一个巨大的挑战。
水合润滑目前被认为是实现超润滑的有效方法之一。Klein教授提出，关节软骨之间的超低摩擦系数(COF)是由于存在稳定的水合层。人关节软骨系统磷脂酰胆碱脂质具有两性离子结构，其中带正电荷(N+(CH3)3)基团和带负电荷(PO4 -)基团能强吸附水分子形成稳定的水合润滑层，使关节软骨之间形成超低COF。
MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)等两性离子聚合物是目前常用的两性离子材料，具有良好的生物相容性，同时具有带正电荷(N+(CH3)3)基团和带负电荷(PO4 -)基团的结构。构建水化表面的常用方法是将MPC分子刷接枝到材料表面。然而，化学接枝方法如ATRP(原子转移自由基聚合)和RAFT(可逆加成断裂链转移聚合)通常需要使用有毒化学物质和有机溶剂容易溶解或破坏纳米纤维结构，且合成步骤比较复杂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种一步法制备超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法，该方法简单，且能增强纤维膜的抗细胞黏附效果。
本发明提供了一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法，包括以下步骤：
将双键修饰多巴胺和两性离子材料在有机溶剂中共聚，得到聚合物；所述两性离子材料包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和/或半胱氨酸甲基丙烯酸酯；
将所述聚合物溶解，得到聚合物溶液；
将高分子纳米纤维膜浸泡在所述聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；所述高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯、聚乳酸、明胶或壳聚糖。
优选地，所述共聚的温度为60～70℃，所述共聚的时间为22～28h；所述共聚在氮气气氛下进行；聚合物在真空干燥箱内干燥24小时备用。
优选地，所述浸泡的时间为22～25h；浸泡的温度为20～37℃。
优选地，所述双键修饰多巴胺和两性离子材料的质量比为1:1～9。
优选地，所述聚合物溶液中的溶剂为三氯化氢；所述聚合物溶液的浓度为0.9～1.2mg/mL。
优选地，所述双键修饰多巴胺按照以下方法制得：
将盐酸多巴胺、硼酸钠、碳酸氢钠和水在氮气气氛下共溶，再加入甲基丙烯酸酐和四氢呋喃，调节pH值至8，搅拌11～13h后再调节pH至＜2，萃取，过滤，沉淀，得到双键修饰多巴胺。
本发明提供了一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法，包括以下步骤：将双键修饰多巴胺和两性离子材料在有机溶剂中共聚，得到聚合物；将所述聚合物溶解，得到聚合物溶液；所述两性离子材料包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和/或半胱氨酸甲基丙烯酸酯；将高分子纳米纤维膜浸泡在所述聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；所述高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯、聚乳酸、明胶或壳聚糖。本发明将多巴胺采用一步法嫁接到聚己内酯或聚乳酸、明胶、壳聚糖等高分子纳米纤维膜上，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜。摩擦学测量结果表明，MPC等两性离子聚合物接枝膜具有典型的水化润滑性能；在体外实验中，MPC等两性离子聚合物接枝膜可显着抑制成纤维细胞的粘附，而纯高分子纳米纤维膜则不能；基于大鼠肌腱黏附模型，对其在体内作为抗黏附生物膜的潜在生物医学应用进行了评价，体内数据表明MPC等两性离子聚合物接枝的膜具有极好的抗肌腱粘附能力。因此，采用一步接枝技术研制的超润滑电纺纳米纤维膜，在生物材料设计创新和生物医学应用方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为肌腱粘连大鼠模型图；
图2-1为一步法表面接枝示意图；
图2-2为Poly(DMA-co-MPC)、1:1膜，1:4膜和1:9膜的红外结果；
图3为MPC接枝纳米纤维膜的SEM图像；
图4为1：1膜的XPS测试结果；
图5为1:4膜的XPS测试结果；
图6为1:9膜的XPS测试结果；
图7为不同膜的COF；
图8为不同的正常载荷和转速对COF的影响；
图9为PCL和1:1膜在水中和空气中的摩擦学值；
图10为PCL和1:1膜在空气和水中润滑测试的大体照片及SEM测试结果；
图11为纺丝膜接触角测试结果；
图12为纺丝膜液滴倒置测试结果；
图13为1:1膜、1:4膜和1:9膜的透气性测试结果；
图14为PCL、1:1膜、1:4膜和1:9膜的杨氏模量、断裂应力和断裂伸长率测试结果图；
图15为PCL、1:1膜、1:4膜、1:9膜培养1、3、7天后的增殖、存活和粘附情况；
图16为动物体内防粘连结果。
具体实施方式
本发明提供了一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法，包括以下步骤：
将双键修饰多巴胺和两性离子材料在有机溶剂中共聚，得到聚合物；所述两性离子材料包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和/或半胱氨酸甲基丙烯酸酯；
将所述聚合物溶解，得到聚合物溶液；
将高分子纳米纤维膜浸泡在所述聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；所述高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯、聚乳酸、明胶或壳聚糖。
本发明将双键修饰多巴胺和两性离子材料在有机溶剂中共聚，得到聚合物。在本发明中，所述共聚的温度优选为60～70℃，更优选为65℃；所述共聚的时间优选为22～28h，更优选为24h；所述共聚优选在氮气气氛下进行。
在本发明中，所述双键修饰多巴胺优选按照以下方法制得：
将盐酸多巴胺、硼酸钠、碳酸氢钠和水在氮气气氛下共溶，再加入甲基丙烯酸酐和四氢呋喃，调节pH值约至8，搅拌11～13h后再调节pH至pH值＜2，萃取，过滤，沉淀，得到双键修饰多巴胺。
所述盐酸多巴胺、硼酸钠、碳酸氢钠和水的质量比为1:1.8～2.2:0.75～0.85:95～105，更优选为1:2:0.8:100。所述甲基丙烯酸酐的体积、四氢呋喃的体积和盐酸多巴胺的质量比为1mL：(4.5～5.5)mL：(0.95～1.05)g，更优选为1mL：5mL：1g。本发明优选采用乙酸乙酯萃取；采用过量的硫酸镁过滤；采用正己烷沉淀过滤后的溶液。
在本发明中，所述有机溶剂优选为2,2-偶氮二异丁腈和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。共聚结束后对共聚产物用去离子水透析，然后冷冻干燥，得到聚合物；在本发明一个具体实施例中，所述聚合物为聚多巴胺-2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱，记作聚(DMA-co-MPC)。
所述双键修饰多巴胺和两性离子材料的质量比为1:1～9；具体实施例中，所述双键修饰多巴胺和两性离子材料的质量比具体为1:1、或1:4或1:9。
所述聚合物优选在真空干燥箱内干燥24小时备用。
本发明将所述聚合物溶解，得到聚合物溶液。本发明优选将聚合物溶解在三氯化氢溶液中；所述三氯化氢溶液的pH值约为8.5。所述聚合物溶液的浓度优选为0.9～1.2mg/mL；具体实施例中，所述聚合物溶液的浓度为1.0mg/mL。
本发明将高分子纳米纤维膜浸泡在所述聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；所述高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯(PCL)、聚乳酸、明胶或壳聚糖。所述高分子纳米纤维膜选自聚己内酯纳米纤维膜、聚乳酸纳米纤维膜、明胶纳米纤维膜或壳聚糖纳米纤维膜。在本发明中，所述聚己内酯纳米纤维膜优选按照以下方法制得：
将聚己内酯纳米纤维溶解，电纺，得到纳米纤维膜。
在本发明中，所述聚己内酯纳米纤维采用本领域技术人员熟知的方法进行制备；如优选参考以下文献报导的方法：Lee,H.；Lee,Y.；Statz,A.R.；Rho,J.；Park,T.G.；Messersmith,P.B.,Substrate-Independent Layer-by-Layer Assembly by UsingMussel-Adhesive-Inspired Polymers.Adv.Mater.2008,20,1619-1623；或Wang,Y.；Cui,W.；Chou,J.；Wen,S.；Sun,Y.；Zhang,H.,ElectrospunNanosilicates-Based Organic/Inorganic Nanofibers for Potential Bone Tissue Engineering.Colloids andSurfaces B:Biointerfaces2018,172,90-97；或Wang,Y.；Luo,C.；Yang,G.；Wei,X.；Liu,D.；Zhou,S.,A Luteolin-Loaded Electrospun Fibrous Implantable Device forPotential Therapy of Gout Attacks.Macromol.Biosci.2016,16,1598-1609；或Wang,Y.；Cui,W.；Zhao,X.；Wen,S.；Sun,Y.；Han,J.；Zhang,H.,Bone Remodeling-Inspired DualDelivery Electrospun Nanofibers for Promoting Bone Regeneration.Nanoscale2019,11,60-71。所述聚己内酯纳米纤维的直径优选为100～400nm。
在本发明中，所述高分子纳米纤维膜优选按照以下方法制得：
将高分子纳米纤维溶解在三氟乙醇中；所述高分子纳米纤维为聚己内酯纳米纤维、聚乳酸纳米纤维、明胶纳米纤维或壳聚糖纳米纤维。所述高分子纳米纤维的质量和三氟乙醇的体积比优选为1g:(9～11)mL，更优选为1g:10mL。本发明中，所述电纺的电压为18～20kv；所述电纺的速度为6～8mL/h。高分子纳米纤维膜的厚度为0.1～1mm。所述高分子纳米纤维的分子量为5万～26万g/mol。
在本发明具体实施例中，聚己内酯纳米纤维膜制备时，所述电纺的电压为20kv；所述电纺的速度为6mL/h；电纺时针尖距收集器的距离为18cm；聚己内酯纳米纤维膜的厚度具体为0.5mm。
在本发明中，所述浸泡的时间优选为22～25h，具体实例中，所述浸泡的时间为24h；浸泡的温度优选为20～37℃，具体实施例中，浸泡的温度为37℃。
浸泡结束后，取出膜，用双蒸水冲洗三次，以便去除表面物理吸附的聚合物，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜。
本发明对得到的超润滑防粘连电纺纳米纤维膜进行表征，表征采用的仪器如下：对于傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量，采用Nicolet 6700红外光谱仪(上海热电子公司)对微小重量的样品进行了测试。采用核磁共振波谱仪(AVANCE III HD 400mhz,Bruker,swiss)记录了不同原料配比的聚(DMA-CO-MPC)的H1 NMR谱。所有样品先用真空离子溅射仪(EM ACE600,Leica,Germany)喷Pt 10min，然后用扫描电镜(SEM,Quanta200,FEI,Eindhoven,Netherlands)随机扫描。XPS(x射线光电子能谱)是通过一台250XI x射线光电子能谱仪(Thermo,Waltham,USA)获得的。水接触角测量采用OCA-20接触角系统(Dataphysics Instruments,Filderstadt,Germany)。纳米纤维样品(5cm(长)×6mm(宽))的力学性能是通过机械试验机(Instron 5567,Norwood,MA)进行的33,35。纳米纤维样品的透气性是根据EN ISO 9237标准在100Pa空气压力下通过透气性测试仪(FX 3300,TEXTEST AGZurich,Switzerland)测定的。
摩擦实验：
对于傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量，采用Nicolet 6700红外光谱仪(上海热电子公司)对微小重量的样品进行了测试。采用核磁共振波谱仪(AVANCE III HD 400mhz,Bruker,swiss)记录了不同原料配比的聚(DMA-CO-MPC)的H1NMR谱。所有样品先用真空离子溅射仪(EM ACE600,Leica,Germany)喷Pt 10min，然后用扫描电镜(SEM,Quanta200,FEI,Eindhoven,Netherlands)随机扫描。XPS(x射线光电子能谱)结果是通过一台250XI x射线光电子能谱仪(Thermo,Waltham,USA)获得的。水接触角测量采用OCA-20接触角系统(Dataphysics Instruments,Filderstadt,Germany)。纳米纤维样品(5cm(长)×6mm(宽))的力学性能是通过机械试验机(Instron 5567,Norwood,MA)进行的。纳米纤维样品的透气性是根据EN ISO 9237标准在100Pa空气压力下通过透气性测试仪(FX3300,TEXTEST AGZurich,Switzerland)测定的。
细胞实验：
NIH/3T3成纤维细胞用于评估纤维膜表面的细胞生长。使用含10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM培养基，每2天更新一次。将电纺膜切成直径为15mm的圆盘状，放入24孔板中，在紫外光下灭菌24h。然后将密度为每孔4×104的细胞悬液接种于不同电纺膜表面，5％CO2下37℃孵育。采用细胞计数试剂盒(CCK-8,Dojindo,Japan)和活/死细胞试剂盒(Life Tech,US)分别培养1天、3天和7天，观察细胞增殖情况。详细操作过程参考产品说明书。在CCK-8测量中，记录每个样品的450nm吸光度(Infinite F50,TECAN,swiss)。采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM,LSM800,ZEISS,Germany)观察细胞活/死染色。此外，使用phalloidin(Cytoskeleton,U.S.)和DAPI(Sigma,USA)对纤维膜上的细胞骨架排列进行荧光染色。操作步骤参考前序文章Zhao,X.；Jiang,S.；Liu,S.；Chen,S.；Lin,Z.Y.W.；Pan,G.；He,F.；Li,F.；Fan,C.；Cui,W.,Optimization of Intrinsic and Extrinsic TendonHealing through Controllable Water-Soluble Mitomycin-C Release FromElectrospun Fibers by Mediating Adhesion-Related GeneExpression.Biomaterials2015,61,61-74。采用CLSM(LSM800,ZEISS,Germany)分别于第1天、第3天和第7天进行细胞骨架拍摄。用Image J软件计算平均细胞密度和平均细胞面积。
动物实验：
所有动物实验均经上海交通大学医学院动物护理与使用委员会批准，所有操作程序均按照美国国立卫生研究院护理指南执行。手术过程如图1所示，图1为肌腱粘连大鼠模型图。采用戊巴比妥钠(30mg kg-1)腹腔麻醉雄性SD大鼠18只，体重200～250g。之后，双下肢剃毛并消毒，沿外侧做手术切口，在距跟骨结节5mm处肌腱横行切断，通过改良的Kessler缝合技术(Ethicon Ltd.，Edinburgh,UK)用4-0丝线将肌腱缝合修复。本实验共设3组:对照组(单纯造模组，未加任何治疗)，PCL实验组，1:9膜包裹组。
术后21天，在处死大鼠之前拍摄大体照片以检查有无炎症或溃疡。此外，根据手术结果，特定区域的腱周粘连的严重程度以1至5的粘连评分的形式量化。粘附评分的定义参照之前的研究：评分1表示几乎没有粘连；评分2表示通过钝性解剖可轻易分离的粘连；评分3表示小于或等于50％的粘附区域必须通过锐利的解剖分开；评分4意味着51-97.5％的粘连区域必须通过锐利的解剖分开；评分5意味着超过97.5％的粘连区域必须通过锐利的解剖分开。对于组织学评估，将在修复部位中心约1cm的解剖肌腱在4％多聚甲醛中固定24小时。然后，将这些肌腱包埋在石蜡中，切成5μm切片，通过分级系列的乙醇脱水，并用苏木素和伊红(HE)以及Masson三色染色。通过光学显微镜拍摄组织学粘附区域的照片。同样，组织学粘连也按如下方式分为五个等级：1级，无粘连；2级，温和(肌腱表面粘附面积<25％)；3级，中等(肌腱表面粘合面积25-50％)；4级，严重(肌腱表面粘附面积50-75％)；5级，最严重(肌腱表面粘附面积>75％)。通过流变仪(Instron，US)评估修复的肌腱的恢复情况：肌腱的两侧固定在流变仪中后，肌腱末端以10mm min-1的速度被拉开，直到肌腱断裂并且流变仪记录最大破裂力。
统计分析：
所有数据均以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用SPSS 19.0软件进行统计学差异分析。p<0.05为差异有统计学意义。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种一步法构建超润滑防粘连电纺纳米纤维膜进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1～3
将5g盐酸多巴胺、10g硼酸钠和4g碳酸氢钠在100mL去离子(DI)水中在氮气气氛(N2)下共溶。然后加入5mL甲基丙烯酸酐和25mL四氢呋喃溶液，用0.2mol/L氢氧化钠溶液将上述溶液的pH值调节到8左右。在氮气下搅拌12h后，用0.5mol/L盐酸将反应溶液调至pH<2，然后用乙酸乙酯进行净化萃取，再用过量的硫酸镁过滤。最后用正己烷沉淀过滤后的溶液，得到双键修饰多巴胺。
将1g DMA与MPC在不同原料配比(1:1,1:4,1:9)的情况下与3mg AIBN在50ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中共溶，在氮气下65℃搅拌24h。反应结束后，最终溶液对DI水进行透析，冷冻干燥3天，得到聚(DMA-CO-MPC)产物。
将2g分子量为8万g/mol的PCL纳米纤维置于20ml三氟乙醇中，在磁力搅拌器上以相对合适的速度持续搅拌12h，获得均匀透明溶液，静止后待用。用10ml注射器抽取上述一定量的PCL溶液，置于微量注射泵上，纺丝液推进速度设为6ml h-1，纺丝环境电压控制在20k，针尖距收集器为18cm，得到电纺的PCL纳米纤维膜，厚度为0.5mm。
将上述不同原料配比的聚(DMA-CO-MPC)以1mg mL-1的浓度溶于三氯化氢溶液(pH～8.5)中。然后将电纺的PCL纳米纤维膜在37℃下浸泡在聚(DMA-co-MPC)溶液中24小时。然后取出膜，用双蒸水冲洗三次，去除表面物理吸附的聚合物，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜，分别记作1：1膜、1:4膜和1:9膜。
图2-1为一步法表面接枝示意图。如图2-1所示，采用基于多巴胺的胎贝启发的移植物法来实现表面功能化。首先通过甲基丙烯酸酐与多巴胺反应合成了双键DMA(见图2-1中a)。然后采用自由基聚合法制备了不同原料配比(DMA:MPC)为1:1、1:4和1:9的聚DMA-co-MPC(见图2-1中a)。红外光谱结果初步证实了聚(DMA-co-MPC)的制备成功(见图2-1中d)，因为存在相应的苯骨架特殊峰(1400-1600cm-1)、P-O和P＝O基团(960cm-1、1060cm-1、1244cm-1)。如图2-1中e所示，H1 NMR谱进一步表明成功合成了聚(DMA-co-MPC)，并且可以通过DMA与MPC的原料配比来调节MPC的浓度。在成功获得聚(DMA-co-MPC)产品后，采用浸涂法将MPC一步接枝到电纺PCL纳米纤维上(见图2-1中b)。图2-2为Poly(DMA-co-MPC)、1:1膜，1:4膜和1:9膜的红外结果。从FTIR结果可以看出，1:1膜，1:4膜和1:9膜均具有与Poly(DMA-co-MPC)相同的特征峰位置，这可能初步表明嫁接成功。已有报道表明，MPC的两性离子结构具有强吸附水分子的能力，因此，MPC接枝纤维表面可形成稳定的水化层，有望进一步防止细胞粘附(见图2-1中c)。
图3为MPC接枝纳米纤维膜的SEM图像：图3可以看出：所有的纳米纤维都具有相对均匀的多孔纳米纤维结构，说明生物启发的一步表面接枝过程并没有破坏纤维结构。图4为1：1膜的XPS测试结果、图5为1:4膜的XPS测试结果和图6为1:9膜的XPS测试结果；图4、图5和图6的结果明显的N,P元素峰通过XPS检测在1:1膜、1:4膜和1:9膜探测到，由于N,P元素的只有来自MPC，证明MPC被成功接枝到表面的纤维膜。此外，可以看出，随着聚(DMA-co-MPC)中MPC含量的增加，N和P的原子百分数增加，说明调整DMA与MPC的原始比例可以调节接枝到纤维表面的MPC的数量。
摩擦学性能：
考虑到聚合物纳米纤维样品是在反复摩擦模式下容易破碎的软材料，申请人采用恒速旋转模式来测量电纺膜的摩擦学性能。图7为不同膜的COF；由图7可以看出：电纺PCL纳米纤维膜的COF相对较高，约为0.32，而1:1膜、1:4膜和1:9膜的COF明显较低，分别约为0.19、0.14和0.10。结果表明，研制的MPC接枝电纺膜具有显著的润滑性能，随着接枝量的增加，膜表面的COF呈下降趋势。图8为不同的正常载荷和转速对COF的影响：正常载荷为0.5N、1N、2N和3N和转速为15mm min-1、30mm min-1、60mm min-1和120mm min-1。图8可以看出：随着正常负荷的增加，COF值呈上升趋势。这一现象可能是由于不同载荷作用下的变形不同造成的。正常载荷越大，弹性变形越大，摩擦力越大。此外，转速对COF也有影响。当转速从15mmmin-1增加到120mm min-1时，COF由0.2左右降低到0.15。接触区下沉深度与接触时间密切相关。随着转速的增加，单个接触点的接触时间减小，导致切口变小，摩擦力减小。
为验证水化润滑效果，分别测定了PCL和1:1膜在水中和空气中的摩擦学值，见图9，图9为PCL和1:1膜在水中和空气中的摩擦学值。图9显示：无论是在水中还是在空气中，由于缺乏表面润滑性能，PCL样品的COF在50秒内急剧上升；而对于1:1膜，整个摩擦测试过程在水中和空气中都是稳定的，水中的COF几乎是空气中的2倍。这些结果证明，纤维表面的MPC分子在大量水分子存在下可以形成稳定的水化层，使纳米纤维具有典型的水化润滑性能。摩擦试验完成后，拍照并观察SEM图像，如图10所示，图10为PCL和1:1膜在空气和水中润滑测试的大体照片及SEM测试结果。从实验结果可以看出，PCL试样在空气中被磨损，磨损面积较大，在水中仍可发现明显的磨损面积(虽然较小)。这一结果说明水并不是PCL膜的有效润滑剂。然而，在水或空气中测试的1:1膜没有发现明显磨损区域。在空气中测试的1:1膜的SEM图像中，膜表面可见明显的褶皱，但单个纳米纤维结构没有被破坏。在水中测试时，1:1膜表面无褶皱，摩擦接触边缘表面结构趋于平坦。这是由于水比空气中的水蒸气能形成更稳定的水化层。通过对PCL与1:1膜的磨损性能比较，发现所研制的MPC接枝纳米纤维具有良好的水化润滑性能。
材料表征：
测定了各膜的接触角、透气性和拉伸性能。图11为纺丝膜接触角测试结果；从图11看出，PCL、1:1,1:4、1:9膜的水接触角分别为132°±4、124°±2、121°±5、116°±3。所有试样表面均为疏水性，水接触角均在90°以上；可以看出，由于MPC分子的水化润滑作用，纤维表面的水接触角随着MPC分子数量的增加而减小。典型的多孔纳米纤维结构是疏水性表面的原因，正如一项研究报道实际上电纺纯MPC纳米纤维也拥有水接触角约120°。此外，所有的纤维试样表面都能使水滴垂直挂在纤维表面而不下降，见图12，图12为纺丝膜液滴倒置测试结果，并且在MPC接枝膜中水滴更小。这说明所制备的膜具有良好的吸水能力，可以使样品更好地贴合周围组织，并在体内植入时保持营养物质的吸附。所有MPC膜的透气性均具有良好的透气性，图13为1:1膜、1:4膜和1:9膜的透气性测试结果，从图13看出：1:1膜、1:4膜和1:9膜的透气性介于5～15L m-2s-1之间但略低于PCL膜。图14为PCL、1:1膜、1:4膜和1:9膜的杨氏模量、断裂应力和断裂伸长率测试结果图，图14表明，PCL和MPC接枝纳米纤维膜对杨氏模量、断裂应力和断裂伸长率没有显著影响。一步浸渍法不影响涂层的拉伸性能。上述表征结果表明，所制备的MPC接枝膜作为抗组织黏附膜等可植入生物膜的最佳候选材料具有很大的潜力。
细胞表面生长：
图15为PCL、1:1膜、1:4膜、1:9膜培养1、3、7天后的增殖、存活和粘附情况。在1天、3天和7天的活/死染色图像中(见图15中a)，所有样品表面都只发现代表活细胞的绿色荧光，说明所有这些膜都不会杀死附着在其表面的细胞。但可以明显看出，随着膜表面MPC含量的增加，细胞密度逐渐降低(见图15中a)。同样，OD值(见图15中c)和细胞数(见图15中d)的结果也证明了这一趋势。此外，随着时间的推移，各组细胞都在增殖，但与PCL膜组相比，1:1膜，1:4膜和1:9膜组的细胞增殖率较低。这些结果表明，MPC接枝膜能够减少附着在纤维表面的细胞数量。图14和图15可知：Day1：PCL细胞数(0.77*104)，1:1(0.56*104)，1:4(0.2*104)，1:9(0.086*104)；Day3：PCL(1.75*104)，1：1(1.34*104)，1:4(0.37*104)，1:9(0.14*104)；Day:7：PCL(3.6*104)，1:1(2.57*104)，1:4(0.79*104)，1:9(0.44*104)；
面积/μm2：Day1：PCL(12.07)，1:1(8.87)，1:4(3.16)，1:9(1.35)；Day3:PCL(27.42)，1:1(20.99)，1:4(5.77)，1:9(2.18)；Day 7:PCL(57.27),1:1(40.23),1:4(12.36),1:9(6.86)。
用F-actin蛋白(红色，细胞骨架)和细胞核(蓝色，细胞核)组成的细胞骨架染料研究细胞在不同膜表面的迁移(见图15中b)。图15中b和e染色结果显示，PCL膜表面细胞分布良好，细胞面积最大，而MPC接枝膜细胞胞质收缩，细胞面积明显缩小。此外，随着MPC接枝率的增加，细胞表面扁平形态逐渐减少，细胞面积呈下降趋势。在第7天，还观察到细胞膜表面1:4膜和1:9膜的细胞面积没有明显增加，说明这些纤维可能具有持久的抗粘连能力。基于水化润滑机理，接枝在纤维表面的两性离子MPC分子能够形成稳定的水化层，从而显著抑制细胞在已开发的超润滑纳米纤维表面的扩展区域。总的来说，MPC移植膜可以抑制附着在表面的成纤维细胞的扩散。综上，可以证明所制备的MPC接枝纳米纤维膜具有较强的抗细胞粘附能力。
体内抗粘连模型：
图16为动物体内防粘连结果；21天后直接观察植入区周围肌腱粘连情况(见图16中A)。切口周围无明显炎症或溃疡迹象。未治疗组修复部位大而严重的腱周粘连，刀柄难以通过缝合肌腱与周围组织之间的间隙。而实验组的结果则完全相反。在PCL膜处理下，只有小束肌纤维与周围组织连接。令人振奋的是，1:9包覆膜的抗粘连效果显著:几乎未见腱周组织与修复肌腱粘连，1:9膜组刀柄可以随意横移。根据手术结果，对照组(对照组是做了粘连手术没有加任何治疗措施)得分以4分和5分为主，PCL组得分以3分和4分为主，1:9膜组得分以1分和2分为主。如图16中D所示，1:9膜组评分统计结果明显低于PCL组，说明1:9膜组可能具有较强的抗粘附能力。图16中B和C为各组修复肌腱的典型组织学切片。在未治疗组的大多数样本中，大量纤维组织掺入修复肌腱周围的组织。PCL组修复后肌腱周围可见疏松的纤维束，1:9膜组少见散在的腱周粘连。此外，1:9膜被证明是所有候选材料中最有潜力的修复材料。未治疗组肌纤维束排列紊乱，并伴有粘连组织生长进入创面，导致肌腱不良愈合。PCL组和1:9膜组纤维束排列适度，断裂端修复肌腱连接良好。组织学黏附分级见图16中E，1:9组明显低于PCL组，与一般黏附结果一致。此外，在力学评价结果中，代表修复肌腱恢复效果的断裂力各组间无显著差异(见图16中F)。综上所述，体内抗粘附实验结果表明，1:9膜具有良好的抗组织粘附能力。
由以上实施例可知，本发明提供了一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的方法，包括以下步骤：将双键修饰多巴胺和两性离子聚合物在有机溶剂中共聚，得到聚合物；所述两性离子材料包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和/或半胱氨酸甲基丙烯酸酯；将所述聚合物溶解，得到聚合物溶液；将高分子纳米纤维膜浸泡在所述聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；所述高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯、聚乳酸、明胶或壳聚糖。本发明将多巴胺采用一步法嫁接到聚己内酯等高分子纳米纤维膜上，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜。摩擦学测量结果表明，MPC等两性离子聚合物接枝膜具有典型的水化润滑性能；在体外实验中，MPC等两性离子聚合物接枝膜可显着抑制成纤维细胞的粘附，而纯高分子纳米纤维膜则不能；基于大鼠肌腱黏附模型，对其在体内作为抗黏附生物膜的潜在生物医学应用进行了评价，体内数据表明MPC等两性离子聚合物接枝的膜具有极好的抗肌腱粘附能力。因此，采用一步接枝技术研制的超润滑电纺纳米纤维膜，在生物材料设计创新和生物医学应用方面具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
将双键修饰多巴胺和两性离子材料在有机溶剂中共聚，得到聚合物；所述两性离子材料包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和/或半胱氨酸甲基丙烯酸酯；
将所述聚合物溶解，得到聚合物溶液；
将高分子纳米纤维膜浸泡在所述聚合物溶液中，得到超润滑防粘连电纺纳米纤维膜；所述高分子纳米纤维膜的材质选自聚己内酯、聚乳酸、明胶或壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述共聚的温度为60～70℃，所述共聚的时间为22～28h；所述共聚在氮气气氛下进行；聚合物在真空干燥箱内干燥24小时备用。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浸泡的时间为22～25h；浸泡的温度为20～37℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双键修饰多巴胺和两性离子材料的质量比为1:1～9。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物溶液中的溶剂为三氯化氢；所述聚合物溶液的浓度为0.9～1.2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双键修饰多巴胺按照以下方法制得：
将盐酸多巴胺、硼酸钠、碳酸氢钠和水在氮气气氛下共溶，再加入甲基丙烯酸酐和四氢呋喃，调节pH值至8，搅拌11～13h后再调节pH至＜2，萃取，过滤，沉淀，得到双键修饰多巴胺。
7.一种超润滑防粘连电纺纳米纤维膜，由权利要求1～6任一项所述制备方法制得。
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