CN110772668A - 一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架及其制备方法 - Google Patents

一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架及其制备方法属于医用生物材料制备技术领域。由纤维搭接、孔隙率大于90％、具有孔径在30‑150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别、从支架顶层到支架底层的组成仿生天然软硬组织过渡结构的梯度三维纤维支架，纤维由具有生物相容性的天然高分子和具有生物相容性的合成高分子复合制备，其中，在软组织层支架的复合纤维中添加有糖胺聚糖成分，中间过渡层和硬组织层支架的复合纤维表面沉积有羟基磷灰石成分。本发明制备了一种具有不同功能层的、满足软硬组织再生修复需求的梯度支架，可分层诱导支架内的细胞和组织同时向软组织和成骨向分化。

Description

一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架及其制备 方法
技术领域
本发明属于医用生物材料制备技术领域，涉及一种软硬组织再生修复的三维支架及其制备方法，具体涉及到一种软硬组织一体化再生修复的仿生梯度三维纤维支架及其制备方法。
背景技术
由于运动创伤或疾病，可能会在某些部位同时造成软组织和硬组织损伤，如骨软骨、腱骨等具有复杂的梯度结构的部位。天然关节骨软骨结构主要分为透明软骨层、软骨钙化层以及软骨下骨；正常的腱骨结合部位则由肌腱组织、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织四部分组织构成。不同的部分在组成成分、结构及细胞成分等方面有着明显的差异，这给基础研究和临床治疗工作带去了巨大的难题。目前，微骨折术是一种释放自体骨髓间充质干细胞用于骨软骨修复的方法，但该法动员出的骨髓间充质干细胞仅占骨髓有核细胞成分的0.001-0.01％，对于大面积的骨软骨损伤仍束手无策。而手术重建是腱骨损伤的重要治疗手段，但术后腱骨界面愈合的情况往往不尽人意，手术重建的长期疗效并不乐观。组织工程支架自提出以来，已经广泛地应用于临床的各个领域，包括骨、软骨、肌腱、神经、血管、皮肤等多个组织再生修复，它也为修复软硬组织损伤提供了新思路，其中，仿生软硬组织结构进行具有梯度结构组织工程支架的构建，是进行软硬组织一体化再生修复的关键。
可以用于软组织层支架的生物可降解材料主要有两类，即天然高分子材料(如胶原、明胶、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖等)和合成高分子材料(如聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯等)。蛋白质和多糖这两类天然高分子作为支架材料，优势是具有优异的亲水性、生物相容性和细胞相容性，作为来自细胞外基质的成分，在调控细胞生长和分化方面扮演重要角色，但天然高分子单独作为支架材料也存在力学性能较差以及降解较快等不足。聚乳酸等合成高分子材料具有生物相容性良好、降解速率可调节、力学强度高、易于加工成型等优点，但是其单独作为支架材料的缺陷也很明显，如呈现疏水性质、缺乏细胞结合位点和生物活性，且降解产物偏酸性，存在局部发生无菌性炎症反应导致细胞凋亡的可能性。可以用于硬组织层支架的材料，除了前述的天然高分子和合成高分子材料外，更重要的一类是无机生物陶瓷材料，如羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等。生物陶瓷材料因具有与人体骨骼矿物相似的化学组成，可为骨组织再生提供生物活性离子而促进新骨生成，被广泛作为骨修复材料得到关注。但陶瓷材料所固有的脆性、可塑性差，影响了它们单独作为骨组织工程支架应用的前景。
由此可见，单一的材料是很难满足组织再生修复要求的，尤其是修复在组成和功能上存在梯度变化的软硬组织缺损时，如何根据骨软骨或腱骨组织的天然特性，仿生构建具有梯度结构组织工程支架，对材料的选择和支架制备方法都提出了更高要求。将天然高分子材料和合成高分子材料复合可以兼具两者的优点，弥补各自的不足，将生物陶瓷材料按照软硬组织梯度进行复合，制备多相支架用于梯度组织的再生修复，是一条可行有效的思路。多孔支架的制备方法有很多，如致孔剂法、相分离法、三维打印快速成型法等，但从仿生天然细胞外基质的胶原纤维网络结构考虑，用溶液静电纺丝制备的各种组成的纤维，来构建一种软硬组织一体化修复的梯度三维纤维支架，可以同时满足支架从组成和结构上对天然软硬组织的双重仿生，获得更理想的修复效果。
发明内容
针对软硬组织复杂的结构，按照仿生一体化的构建理念，需要制备一种具有不同功能层的、满足软硬组织再生修复需求的梯度支架，可分层诱导支架内的细胞和组织同时向软组织和成骨向分化。
静电纺丝技术可以制备纳米到微米直径范围的纤维，在仿生天然细胞外基质纤维网络方面具有绝对优势，例如纤维直径、形貌和组成可控，但静电纺丝制备的纤维膜较为致密，直接复合制备支架不利于细胞的迁移。本发明提出结合剪切分散、致孔剂添加、冷冻干燥、热交联和梯度生物矿化技术，制备一种具有贯通的大孔结构、具有仿生的从软组织到硬组织过渡结构的梯度三维纤维支架，实现骨软骨、腱骨、牙周等多种具有过渡结构的组织再生修复。
本发明的一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架的制备方法，具体如下：
(1)将具有生物相容性的天然高分子和具有生物相容性的合成高分子按3:1-1:3的质量比在三氟乙醇中配成混合溶液，静电纺丝得到用于硬组织层或中间层的纤维膜；
(2)混合溶液中加入糖胺聚糖，糖胺聚糖加入量是高分子混合物即具有生物相容性的天然高分子和具有生物相容性的合成高分子的0.5-10wt.％，静电纺丝得到用于软组织层的纤维膜；
(3)将硬组织层、中间层和软组织层的纤维膜在叔丁醇中经高速均质机以10000-15000rpm高速剪切分散，得到浓度为1-5wt.％的纤维悬液，加入致孔剂，纤维膜与致孔剂质量比为1:0-1:30，然后冷冻干燥成型得到用于硬组织层或中间层的聚乳酸/明胶空白三维支架和软组织层的三维纤维支架；
(4)将用于中间层或硬组织层的空白支架和软组织层的三维纤维支架于160-190℃加热交联1-4h后，用去离子水浸泡去除致孔剂，经冷冻干燥得到具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的空白支架或软组织层的三维纤维支架；
(5)将用于中间层或硬组织层的空白支架分别浸泡在模拟体液中，37℃生物矿化，24h-3d得到羟基磷灰石沉积量为5-20wt.％的中间层三维纤维支架，28h-7d得到羟基磷灰石沉积量为20-50wt.％的硬组织层三维纤维支架；
(6)将不同层的三维纤维支架用丙烯酸酯改性明胶水溶液经光固化机光照复合，光照功率为20-40MW，光照时间为10-20min，得到具有不同组成的梯度三维纤维支架。
进一步，步骤(3)中，致孔剂为氯化钠和蔗糖中的一种，致孔剂的粒径范围为100-250μm。
进一步，步骤(6)中的梯度三维纤维支架，选择性叠加硬组织层、中间层和软组织层的三维纤维支架，叠加的层数为2-4层。
所述制备步骤(1)中的合成高分子为乳酸、羟基乙酸、己内酯的均聚物及它们的共聚物中的一种，天然高分子为胶原、明胶、纤维蛋白原、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素的一种或一种以上。
所述制备步骤(1)中，用于制备中间层和硬组织层支架纤维的静电纺丝溶液的配置，优选地，为将乳酸、羟基乙酸、己内酯的均聚物及它们的共聚物中的一种，将胶原和明胶中的一种，按3:1-1:3质量比共溶于三氟乙醇得到的混合溶液。
所述制备步骤(1)中，用于制备软组织层支架纤维的静电纺丝溶液的配置，优选地，具体包括以下步骤：
①将乳酸、羟基乙酸、己内酯的均聚物及它们的共聚物中的一种，与胶原和明胶中的一种，按3:1-1:3重量比共溶于三氟乙醇；
②将透明质酸和硫酸软骨素中的一种或两种，溶于去离子水，加入等量三氟乙醇，32％功率超声10min得到澄清溶液；
③将一定量步骤②配置的溶液，在超声振荡下，加入到步骤①配置的溶液中，混合均匀得到用于制备软组织层支架纤维的静电纺丝溶液，由此得到的软组织层支架纤维中，透明质酸和硫酸软骨素中一种或两种的添加量占高分子混合物即天然高分子和合成高分子质量之和的0.5-10wt.％。
所述制备步骤(2)中，纤维悬浮液浓度为1-5wt.％，纤维与致孔剂质量比为1:0-1:30，致孔剂为氯化钠和蔗糖中的一种，致孔剂的粒径范围为100-250μm。
所述制备步骤(4)中，使用的模拟体液为按ISO 23317-2007配置的标准模拟体液的1.5、2.5、5或10倍浓度溶液的一种，矿化浸泡时间为3h-7d，优选为5倍的模拟体液，矿化浸泡时间为6h-48h，支架上矿物质沉积量为5-50wt.％。
所述制备步骤(3)和步骤(4)得到的三维纤维支架，孔隙率在90％以上，具有连续贯通的孔隙结构，致孔剂所致的大孔孔径为30-150μm，孔壁由纤维搭接构成，纤维间距2-5μm，其中，大孔利于细胞迁移和组织长入，孔壁上的微孔利于营养物质的运输和细胞代谢废物的排出。
所述制备步骤(5)得到的梯度三维纤维支架，叠加的层数为2-4层，优选为仿生天然软硬组织过渡的软组织层、中间层和硬组织层的3层梯度结构，从软组织支架到硬组织支架，糖胺聚糖成分从有到无，无机物含量从无到有并逐层增加，可以作为一种软硬组织一体化再生修复支架材料。
发明效果
本发明所制备的软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架，是从结构和组成上对天然软硬组织进行双重仿生而构建的。从结构仿生考虑，静电纺丝纤维常被用来模拟天然细胞外基质的胶原纤维网络，为细胞增殖和分化提供仿生的微环境，但静电纺丝纤维膜中的纤维堆积紧密，并不利于细胞迁移和组织进入生长。而本发明支架的主体为纤维搭接形成的、具有贯穿大孔结构的三维网络，是通过将纤维膜分散、引入致孔剂、冷冻干燥和热交联稳定工艺，并借助模具成型制备的，支架的外观形状和微观形貌可控，具有利于细胞迁移和组织进入生长，以及营养物质的传输和细胞代谢废物排出的微观空间，热交联处理的纤维支架力学性能提高，具有压缩弹性，能提供利于软硬组织缺损再生修复和功能重建的力学性能和支撑作用。
本发明所制备的软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架，是以生物相容性良好的合成高分子材料和天然高分子材料为主要原料，综合天然高分子和合成高分子的优势，采用共混溶液静电纺丝制备的天然/合成高分子复合纤维，相比于纯的合成高分子或天然高分子纤维，复合纤维的亲水性、细胞亲和性、纤维形貌保持和力学性能等得到显著的综合提高。根据软组织和硬组织细胞外基质的组成，进一步在软组织层的支架纤维中引入糖胺聚糖成分如透明质酸和硫酸软骨素，在硬组织层的纤维支架中通过生物矿化引入无机生物陶瓷成分，并通过控制生物矿化条件调节支架中无机物的含量模拟软硬组织中间过渡层，由此得到的在组成上仿生天然软硬组织的支架材料，能有针对性地提供利于向软组织分化和向成骨分化的生物活性成分，提高促进软硬组织缺损再生修复和功能重建的效果。
本发明所制备的软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架，可以根据骨软骨、腱骨、牙周组织的修复需求，选择具有相应组成的纤维支架，按照组织修复的实际需求，选择相应厚度的纤维支架进行叠加组合，实现对具有梯度结构的软硬组织在组成和结构上的双重仿生，从软组织支架到硬组织支架，糖胺聚糖成分从有到无，无机物含量从无到有并逐层增加，可分层诱导迁移进入相应支架内的细胞向软组织、钙化软组织和向成骨分化。层与层纤维支架之间采用丙烯酸酯改性明胶溶液浸润、并通过光照聚合完成复合，操作简单、不会破坏纤维支架的形貌和各层支架间相互贯通，不会阻碍细胞迁移和组织长入，且没有引入新的组分增加支架的复杂性，利于软硬组织的一体化再生修复。应用于牙周再生修复时，考虑到引导组织再生对牙龈上皮细胞阻隔的需求，在梯度支架的构建中，还可以充分利用梯度复合支架构建的灵活性，通过叠加复合静电纺丝纤维膜来实现上述需求，拓宽支架在更多软硬组织修复中的应用。
以下结合具体实施方式对本发明的内容进行详细说明，但本发明并不限于以下这些实例，在不脱离上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
附图说明：
图1：具有贯穿大孔结构的三维纤维支架形貌图
图2：5倍模拟体液生物矿化24h有机无机复合三维纤维支架中表面沉积有矿物质的纤维形貌
图3：具有模拟软组织、钙化中间层和硬组织的三层梯度三维纤维支架
图4：不同制备的三维纤维支架的压缩性能对比
图5：不同制备的三维纤维支架的细胞毒性评价
具体实施方式：
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。
实施例1：
(1)分别称取左旋聚乳酸和明胶各0.5g，共同加至10ml的三氟乙醇中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到无明显分相的稳定高分子共混溶液；
(2)利用静电纺丝工艺将步骤(1)的共混溶液纺丝、金属平板接收得到无纺纤维膜，纺丝参数为：电压20kV，接收距离为15cm，流速为0.8ml/h；
(3)将0.4g步骤(2)得到的纤维膜剪碎成0.5cm×0.5cm的碎片，悬浮于20ml叔丁醇中，用高速分散均质机以14000rpm高速剪切20min，得到分散均匀的纤维悬浮液，加入8g氯化钠作为致孔剂分散均匀；
(4)将步骤(3)得到的悬浮液转移到模具(如48孔板)中，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到高1mm、直径0.6mm的圆盘型三维纤维支架；
(5)将步骤(4)得到的三维支架放入170℃马弗炉中加热交联2h，将支架用去离子水浸泡6h，去离子水每隔2h更换一次，去除致孔剂后，置于-20℃冷冻24h，冷冻干燥48h，得到具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的聚乳酸/明胶三维纤维支架。
对比例1
(1)同实施例1步骤(1)-(4)。
(2)将步骤(1)得到的三维支架用去离子水浸泡6h，去离子水每隔2h更换一次，去除致孔剂后，置于-20℃冷冻24h，冷冻干燥48h，得到未交联的聚乳酸/明胶三维纤维支架。
实施例2
(1)同实施例1步骤(1)-(5)。
(2)将得到的聚乳酸/明胶三维纤维支架浸泡在配置好的5倍模拟体液中，37℃浸泡24h后，支架取出用去离子水洗涤，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到矿物质沉积量在5-20wt.％的中间层三维纤维支架。
实施例3
(1)同实施例1步骤(1)-(5)。
(2)将得到的聚乳酸/明胶三维纤维支架浸泡在配置好的5倍模拟体液中，37℃浸泡48h后，支架取出用去离子水洗涤，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到矿物质沉积量在20-40wt.％的硬组织层三维纤维支架。
实施例4：
(1)分别称取左旋聚乳酸0.7g和明胶0.3g，共同加至10ml的三氟乙醇中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到无明显分相的稳定高分子共混溶液；
(2)同实施例1步骤(2)-(5)，得到纤维组成不同的、具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的聚乳酸/明胶三维纤维支架。
实施例5
(1)同实施例4步骤(1)和(2)。
(2)将得到的聚乳酸/明胶三维纤维支架浸泡在配置好的2.5倍模拟体液中，37℃浸泡3d后，支架取出用去离子水洗涤，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到矿物质沉积量在5-20wt.％的中间层三维纤维支架。
实施例6
(1)同实施例4步骤(1)和(2)。
(2)将得到的聚乳酸/明胶三维纤维支架浸泡在配置好的2.5倍模拟体液中，37℃浸泡7d后，支架取出用去离子水洗涤，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到矿物质沉积量在30-50wt.％的硬组织层三维纤维支架。
实施例7
(1)分别称取明胶0.5g、乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸：羟基乙酸摩尔比＝75:25)1.5g，共同加至10ml的三氟乙醇中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到无明显分相的稳定高分子共混溶液；
(2)利用静电纺丝工艺将步骤(1)得到的共混溶液纺丝、金属平板接收得到无纺纤维膜，纺丝参数为：电压30kV，接收距离为15cm，流速为1ml/h；
(3)将0.8g步骤(2)得到的纤维膜剪碎成0.5cm×0.5cm的碎片，悬浮于20ml叔丁醇中，用高速分散均质机以12000rpm高速剪切20min，加致孔剂16g得到分散均匀的纤维悬浮液；
(4)将步骤(3)得到的悬浮液转移到模具(如48孔板)中，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到高1mm、直径0.6mm的圆盘型三维纤维支架；
(5)将步骤(4)得到的三维支架放入170℃马弗炉中加热交联1h，将支架用去离子水浸泡6h，去离子水每隔2h更换一次，去除致孔剂后，置于-20℃冷冻24h，冷冻干燥48h，得到具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶三维纤维支架。
实施例8
(1)同实施例7步骤(1)-(5)。
(2)将得到的乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶三维纤维支架浸泡在配置好的5倍模拟体液中，37℃浸泡24h后，支架取出用去离子水洗涤，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到矿物质沉积量在5-20wt.％的中间层三维纤维支架。
实施例9
(1)同实施例7步骤(1)-(5)。
(2)将得到的乳酸-羟基乙酸共聚物/明胶三维纤维支架浸泡在配置好的5倍模拟体液中，37℃浸泡48h后，支架取出用去离子水洗涤，然后置于-20℃冷冻24h，再冷冻干燥48h，得到矿物质沉积量在20-40wt.％的硬组织层三维纤维支架。
实施例10：
(1)分别称取明胶和左旋聚乳酸各1.3g，共同加至21ml的三氟乙醇中，放入37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到无明显分相的稳定高分子共混溶液；
(2)分别称取透明质酸和硫酸软骨素各0.04g，溶于5ml去离子水中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到澄清透明的溶液；
(3)在步骤(2)的溶液中加入5ml三氟乙醇，超声15min，得到澄清透明的溶液；
(4)取步骤(3)的溶液，加入步骤(1)的溶液中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到软组织层支架的纺丝溶液；
(5)利用静电纺丝工艺将步骤(4)得到的纺丝溶液纺丝、金属平板接收得到无纺纤维膜，纺丝参数为：电压18kV，接收距离为15cm，流速为1ml/h；
(6)将0.4g步骤(5)得到的纺丝膜剪碎成0.5cm×0.5cm的碎片，悬浮于20ml叔丁醇中，加入8g氯化钠作为致孔剂，用高速分散均质机以14000rpm高速剪切20min，得到分散均匀的纤维悬浮液；
(7)将步骤(6)得到的悬浮液转移到模具(如48孔板)中，然后置于-20℃冷冻12h，再冷冻干燥24h，得到高1mm、直径0.6mm的圆盘型三维纤维支架；
(8)将步骤(7)得到的三维支架放入170℃马弗炉中加热2h，将支架用去离子水浸泡6h，去离子水每隔2h更换一次，去除致孔剂后，置于-20℃冷冻12h，冷冻干燥24h，得到具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的软组织层三维纤维支架。
实施例11：
(1)分别称取明胶1.25g、乳酸-羟基乙酸共聚物(乳酸：羟基乙酸摩尔比＝75:25)3.75g，共同加至20ml的三氟乙醇中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到无明显分相的稳定高分子共混溶液；
(2)称取透明质酸0.15g，溶于5ml去离子水中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到澄清透明的溶液；
(3)在步骤(2)的溶液中加入5ml三氟乙醇，超声15min，得到澄清透明的溶液；
(4)取步骤(3)的溶液，加入步骤(1)的溶液中，于37℃的水浴中搅拌24h，转速为400rpm，得到软组织层支架的纺丝溶液；
(5)利用静电纺丝工艺将步骤(4)得到的纺丝溶液纺丝、金属平板接收得到无纺纤维膜，纺丝参数为：电压25kV，接收距离为15cm，流速为1ml/h；
(6)将0.4g步骤(5)得到的纺丝膜剪碎成0.5cm×0.5cm的碎片，悬浮于20ml叔丁醇中，用高速分散均质机以10000rpm高速剪切20min，得到分散均匀的纤维悬浮液；
(7)将步骤(6)得到的悬浮液转移到模具(如48孔板)中，然后置于-20℃冷冻12h，再冷冻干燥24h，得到高1mm、直径0.6mm的圆盘型三维纤维支架；
(8)将步骤(7)得到的三维支架放入190℃马弗炉中加热1h，得到具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的软组织层三维纤维支架。
实施例12：
(1)分别称取丙烯酸酯改性明胶1g、光引发剂I2959 0.02g于螺口瓶中，加入10ml去离子水，用铝箔纸包覆后，置于水浴超声中1h，得到均匀澄清的溶液；
(2)将实施例10、实施例2、实施例3得到的支架依次用步骤(1)得到的溶液润湿、堆叠，置于LED光固化灯箱中照射15min，光照功率为30MW，完成三层支架的复合，得到的仿生天然软硬组织结构和组成的梯度三维纤维支架，可用于骨-软骨组织缺损修复。
实施例13：
将实施例1、实施例11、实施例5、实施例6得到的支架依次用实施例12步骤(1)中得到的溶液润湿、堆叠，置于LED光固化灯箱中照射20min，光照功率为40MW，完成四层支架的复合，得到的仿生天然软硬组织结构和组成的梯度三维纤维支架，可用于腱-骨组织缺损修复。
实施例14：
将实施例1步骤(2)中得到的聚乳酸/明胶纤维膜和实施例3得到的支架，用实施例12步骤(1)中得到的溶液润湿、堆叠，置于LED光固化灯箱中照射10min，光照功率为20MW，得到的梯度结构纤维支架，可用于牙周组织缺损修复。
实施例15：
(1)将得到的三维纤维支架均采用钴60射线灭菌；
(2)灭菌完成后，支架置于48孔板中，用磷酸盐缓冲溶液洗涤、细胞培养液浸泡过夜备用；
(3)取第三代大鼠间充质干细胞(rBMSCs)，在每孔的支架表面分散接种5×103个细胞，然后转移至二氧化碳培养箱中、37℃孵育4h后，取出每孔补加细胞培养液400μl，放入培养箱中继续培养至第7d，每2d更换一次新鲜细胞培养液，对照组为将相同数量的细胞直接接种在组织培养板(TCPs)上进行培养；
(4)采用CCK-8检测rBMSCs的增殖活性，即在细胞接种后的第1、3、5、7d，将培养板取出，弃除孔内液体后，每孔加入含有10％CCK-8的新鲜培养基，放入培养箱中孵育2h后，应用酶标仪，于450nm波长下检测每个孔板内液体的吸光度值，并以每个样品第1d的数据为1进行归一化作图，吸光度值与活细胞数目呈正比，可定量表征细胞在支架上的存活情况。
其中实施例1、4、7为空白支架，实施例2、5、8为中间层支架，实施例3、6、9为硬组织层支架，实施例10、11为软组织层支架，实施例12、13、14为梯度支架。同类型支架效果相似，均为孔隙率高达90％以上、抗压强度达到兆帕级别、无细胞毒性的三维纤维支架。

Claims (6)

1.一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架，其特征在于其是一种由纤维搭接、孔隙率大于90％、具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别、从支架顶层到支架底层的组成仿生天然软硬组织过渡结构的梯度三维纤维支架，纤维由具有生物相容性的天然高分子和具有生物相容性的合成高分子复合制备，其中，在软组织层支架的复合纤维中添加有糖胺聚糖成分，中间过渡层和硬组织层支架的复合纤维表面沉积有羟基磷灰石成分。
2.根据权利要求1所述的梯度三维纤维支架，其特征是具有生物相容性的合成高分子是乳酸、羟基乙酸、己内酯的均聚物或它们的共聚物中的一种，具有生物相容性的天然高分子为胶原、明胶、纤维蛋白原、壳聚糖中的一种。
3.根据权利要求1所述的梯度三维纤维支架，其特征是在软组织层支架的复合纤维中添加的糖胺聚糖为透明质酸、硫酸软骨素的一种或一种以上，在中间过渡层和硬组织层支架的复合纤维表面沉积的羟基磷灰石是通过使用按ISO 23317-2007配置的标准模拟体液的1.5-10倍浓度溶液的一种，在37℃浸泡3h-7d得到的。
4.制备如权利要求1所述的一种软硬组织一体化再生修复梯度三维纤维支架的方法，其特征是通过以下步骤完成的：
(1)将具有生物相容性的天然高分子和具有生物相容性的合成高分子按3:1-1:3的质量比在三氟乙醇中配成混合溶液，静电纺丝得到用于硬组织层或中间层的纤维膜；
(2)混合溶液中加入糖胺聚糖，糖胺聚糖加入量是高分子混合物即具有生物相容性的天然高分子和具有生物相容性的合成高分子的0.5-10wt.％，静电纺丝得到用于软组织层的纤维膜；
(3)将硬组织层、中间层和软组织层的纤维膜在叔丁醇中经高速均质机以10000-15000rpm高速剪切分散，得到浓度为1-5wt.％的纤维悬液，加入致孔剂，纤维膜与致孔剂质量比为1:0-1:30，然后冷冻干燥成型得到用于硬组织层或中间层的聚乳酸/明胶空白三维支架和软组织层的三维纤维支架；
(4)将用于中间层或硬组织层的空白支架和软组织层的三维纤维支架于160-190℃加热交联1-4h后，用去离子水浸泡去除致孔剂，经冷冻干燥得到具有孔径在30-150μm的贯穿大孔结构、抗压强度达到兆帕级别的空白支架或软组织层的三维纤维支架；
(5)将用于中间层或硬组织层的空白支架分别浸泡在模拟体液中，37℃生物矿化，24h-3d得到羟基磷灰石沉积量为5-20wt.％的中间层三维纤维支架，28h-7d得到羟基磷灰石沉积量为20-50wt.％的硬组织层三维纤维支架；
(6)将不同层的三维纤维支架用丙烯酸酯改性明胶水溶液经光固化机光照复合，光照功率为20-40MW，光照时间为10-20min，得到具有不同组成的梯度三维纤维支架。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是步骤(3)中，致孔剂为氯化钠和蔗糖中的一种，致孔剂的粒径范围为100-250μm。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是步骤(6)中的梯度三维纤维支架，选择性叠加硬组织层、中间层和软组织层的三维纤维支架，叠加的层数为2-4层。
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