CN112043866A - 一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法 - Google Patents

一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，包括如下步骤：(1)、对鱼鳞片进行碱处理和酸处理，去除杂质，得鱼鳞片初成品；(2)、将步骤(1)获得的鱼鳞片初成品用蛋白酶抑制剂处理；(3)、将步骤(2)获得的产物用表面活性剂处理，得鱼鳞半成品；(4)、将步骤(3)获得的鱼鳞半成品用DNA酶和RNA酶消化处理；(5)、将步骤(4)获得的产物再次用蛋白酶抑制剂处理；(6)、将步骤(5)获得的产物再次进行酸处理，水洗至中性，得鱼鳞基生物材料。该方法制备的鱼鳞膜材料中主要保留了胶原蛋白和羟基磷灰石两种组分，具有天然组成和表面微观结构，解决了鱼鳞原料的综合利用问题。

Description

一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法。
背景技术
鱼鳞是鱼真皮的变形物，是鱼外表保护自身，用于防御的外壳，占鱼体质量的2～3％，根据鱼鳞的形态不同可以分为盾鳞、硬鳞和圆鳞。鱼鳞中含有丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素和多种矿物质。其中，鱼鳞中富含的胶原蛋白是人体细胞外基质的重要组成部分，可维持皮肤正常生理功能和创伤组织的再生修复。同时，鱼鳞中的羟基磷灰石占鱼鳞总重的40％，是获取天然钙质的理想原料，在医疗健康领域与组织工程领域具有极大的应用前景。
我国是渔业大国，也是渔业加工大国，我国每年渔业加工中产生的下脚料高达200余万吨，占鱼体总重的30％～50％，其中5％左右是鱼鳞，大部分作为废物丢弃，造成了严重的环境污染和极大的经济损失。通过现代加工技术变废为宝，成功利用鱼鳞下脚料将极大增加渔业发展的附加值，对生物材料的开发利用也具有十分重要的意义。
目前，现有技术中出现了很多利用鱼鳞为原材料加工提取胶原蛋白或胶原蛋白肽的方法，生产的胶原蛋白或胶原蛋白肽可用于食品、保健品、化妆品和组织工程等领域，例如：中国专利CN104800094B；同时，也有相关科学研究利用鱼鳞原料去除有机组分制备不同形式的羟基磷灰石，可用于骨组织替代或填充领域或以及其它组织工程方面的应用；以上两个方法是分别从鱼鳞原料中提取了有机组分和无机组分并加以利用，对鱼鳞资源的开发利用具有积极促进作用，在一定程度解决鱼鳞资源浪费的问题，但是缺乏对鱼鳞天然生物材料完整性的利用；另外，对加工鱼鳞的利用还包括鱼鳞粉，作为美白来源用于牙膏的添加剂，例如：中国专利CN102648893A。
因此，在这些现有关于鱼鳞的加工处理技术中，均未涉到利用鱼鳞原料制备具有胶原蛋白和羟基磷灰石两种主要组分按照天然排布方式形成表面具有特定微观结构的天然膜材料，为弥补现有技术的不足特提出本发明一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，该方法制备的鱼鳞膜材料中主要保留了胶原蛋白和羟基磷灰石两种主要组分，具有天然组成和表面微观结构，解决对鱼鳞原料的综合利用问题。
具体技术方案如下：
一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，包括如下步骤：
(1)对鱼鳞片进行碱处理和酸处理，去除杂质，得鱼鳞片初成品；
(2)将步骤(1)获得的鱼鳞片初成品用蛋白酶抑制剂处理；
(3)将步骤(2)获得的产物用表面活性剂处理，得鱼鳞半成品；
(4)将步骤(3)获得的鱼鳞半成品用DNA酶和RNA酶消化处理；
(5)将步骤(4)获得的产物再次用蛋白酶抑制剂处理；
(6)将步骤(5)获得的产物再次进行酸处理，水洗至中性，得鱼鳞基生物材料。
进一步，步骤(1)中：碱处理剂为碳酸钠和/或碳酸钾溶液，酸处理剂为柠檬酸和/或苹果酸溶液，处理后水洗至中性。进行酸处理或碱处理时，酸溶液或碱溶液应当完全浸没鱼鳞。
其中，碱处理剂的浓度为优选为1wt％～10wt％，碱处理时间优选为1～3h；酸处理剂的浓度为优选为1wt％～10wt％，酸处理时间优选为1～3h。
优选先进行碱处理再进行酸处理。
进一步，步骤(2)中，所述的蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟。
再进一步，步骤(2)中，苯甲基磺酰氟的浓度优选为1×10-7～5×10-7mol/L。
其中，步骤(2)中，所述的苯甲基磺酰氟优选溶解于Tris缓冲溶液中，形成蛋白酶抑制剂溶液。步骤(1)获得的鱼鳞片初成品与上述蛋白酶抑制剂溶液的体积比优选为1：(1～3)。上述Tris缓冲溶液优选浓度为10mmol/L，pH＝7.4。
步骤(2)的反应条件优选为：将步骤(1)获得的鱼鳞片初成品与蛋白酶抑制剂溶液混合，搅拌均匀，2～8℃处理10～24h，水洗沥干。
进一步，步骤(3)中，所述的表面活性剂包括TritonX-100。
再进一步，步骤(3)中，TritonX-100的体积百分浓度优选为0.1％～0.5％。
其中，步骤(3)中，TritonX-100优选溶解于Tris缓冲溶液中，形成表面活性剂溶液。步骤(2)获得的样品与表面活性剂溶液的体积比优选为1：(1～3)。此处Tris缓冲溶液优选浓度为50mmol/L，pH＝7.4。
步骤(3)的反应条件优选为：将步骤(2)获得的样品与上述表面活性剂溶液混合，搅拌均匀，2～8℃处理10～24h，水洗沥干。
进一步，步骤(4)中：酶溶液中，DNA酶和RNA酶的浓度均为5μg/mL。
步骤(3)获得的鱼鳞半成品与酶溶液的体积比优选为1：(1～3)。
步骤(4)的反应条件优选为：将步骤(3)获得的鱼鳞半成品使用上述含有DNA酶和RNA酶的酶溶液在30～40℃下静置处理1～3h，水洗沥干。
进一步，步骤(5)中：所述的蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟，苯甲基磺酰氟的浓度为1×10-7～5×10-7mol/L。
再进一步，步骤(5)中，除蛋白酶抑制剂外，还添加了TritonX-100，TritonX-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
步骤(5)中，苯甲基磺酰氟与TritonX-100优选共同溶解于Tris缓冲溶液中，形成处理剂溶液。步骤(4)获得的产物此处的处理剂溶液的体积比优选为1：(1～3)。此处Tris缓冲溶液优选浓度为50mmol/L，pH＝7.4。
步骤(5)的反应条件优选为：将步骤(4)获得的样品与上述处理剂溶液溶液混合，搅拌均匀，2～8℃处理10～24h，洗涤沥干。此处洗涤过程优选采用的是PBS磷酸盐缓冲液多次洗涤，每次用量优选为1～3倍鱼鳞的体积，洗涤次数为5～10次。
进一步，步骤(6)中：所述的酸为柠檬酸、盐酸和硝酸中的一种或多种。
进一步，所述的再次酸处理先使用稀酸浸泡，再使用浓酸浸泡。具体步骤为：先使用1wt％～10wt％的酸浸泡1～10h沥干；再使用10wt％～50wt％的酸浸泡0.5～3h，水洗至中性。
进一步，步骤(1)～(6)在间歇超声中进行。
再进一步，上述间歇超声的操作条件为：鱼鳞置于超声振荡池，超声波强度0.2W～0.5W，波频率40kHz，间歇时间1min～5min，温度4℃～40℃。
通过上述方法，本发明获得了一种膜材料，其除去了鱼鳞表面的粘液、色素、不必要的杂质和鱼腥味，使得鱼鳞膜材料无色、无味、有良好的透明度，微观结构清晰，保留了鱼鳞胶原蛋白和羟基磷灰石两种主要组分，结构组成天然无变化。
其中，膜材料中，胶原蛋白含量31wt％-48wt％，羟基磷灰石含量25wt％-37wt％，膜材料具有柔韧度好和引导生物组织再生修复性能，可应用于软组织修复、创伤组织修复生物医用材料。
经测试，本发明获得的膜材料的透明度大于85％，溶血率小于3％；柔韧性强，折叠180度，无断裂；其应变能力大于0.2，大大高于单独的胶原膜和单独的羟基磷灰石膜。
单独的羟基磷灰石无柔韧性，脆，折叠断裂。单独的胶原膜透明度大于95％，柔韧性与本发明相近，应变能力大大低于本发明获得的膜材料。
本发明的有益效果如下：
本发明的鱼鳞膜材料的纯化处理制备方法包括脱杂处理、脱细胞处理、部分脱蛋白处理和部分脱钙处理等过程，本发明充分除去了鱼鳞表面的粘液、色素、不必要的杂质和鱼腥味，去除了鱼鳞表面的杂蛋白，只保留了鱼鳞中胶原蛋白和羟基磷灰石两种主要组分，并使鱼鳞表面微观矩阵结构充分暴露出来，增加鱼鳞膜材料在使用过程中的特性；本发明使鱼鳞中胶原蛋白和羟基磷灰石两种组分以天然组成方式得到保留，操作简单，便易于掌握，易于实现产业化生产，本发明所得的鱼鳞膜材料无色、无味、有良好的透明度，微观结构清晰，安全性好。本发明获得的膜材料具有柔韧度好和引导生物组织再生修复性能，可应用于软组织修复、创伤组织修复生物医用材料。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的鱼鳞基生物材料的电镜照片；
图2为本发明实施例1获得的鱼鳞基生物材料的照片。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施方式中：DNA酶的酶活为1500units/mg；RNA酶的酶活为50units/mg。酶生产商：索莱宝。
实施例1
一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，包括如下步骤：
(1)将鱼鳞置于超声振荡池，超声波强度0.2W，波频率40kHz，间歇时间5min；向鱼鳞中加入浓度为1wt％的碳酸钠溶液，将鱼鳞完全浸没，室温下搅拌均匀，3h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干；所得的样品添加浓度为1wt％的柠檬酸溶液，将鱼鳞完全浸没，3h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干，得鱼鳞片初成品；
(2)将步骤(1)获得的鱼鳞片初成品加入以其体积计2倍的含有苯甲基磺酰氟的Tris缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)处理，苯甲基磺酰氟的体积摩尔浓度为1×10-7mol/L，搅拌均匀，4℃处理10h，水洗沥干；
(3)将步骤(2)获得的产物中加入以其体积计2倍的含有TritonX-100的Tris缓冲溶液(50mmol/L，pH＝7.4)，TritonX-100的体积百分浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃处理10h，水洗沥干，得鱼鳞半成品；
(4)将步骤(3)获得的鱼鳞半成品加入以其体积计2倍的酶溶液，酶溶液中，含有5μg/mL的DNA酶和5μg/mL的RNA酶，调节pH值为7.4，在30℃下静置处理1h，水洗沥干；
(5)将步骤(4)获得的产物加入以其体积计2倍的含有5×10-7mol/L的苯甲基磺酰氟和体积浓度0.5％的TritonX-100的Tris缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，4℃处理10h，PBS磷酸盐缓冲液洗涤5～10次；
(6)将步骤(5)获得的产物用浓度为10wt％的柠檬酸室温下处理1h，沥干后再用浓度为50wt％的柠檬酸室温下处理3h，水洗浸泡至中性，得鱼鳞基生物材料。
实施例2
一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，包括如下步骤：
(1)将鱼鳞置于超声振荡池，超声波强度0.5W，波频率40kHz，间歇时间1min；向鱼鳞中加入浓度为1wt％的碳酸钠溶液，将鱼鳞完全浸没，室温下搅拌均匀，1h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干；所得的样品添加浓度为10wt％的柠檬酸溶液，将鱼鳞完全浸没，1h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干，得鱼鳞片初成品；
(2)向步骤(1)获得的鱼鳞片初成品加入以其体积计2倍的含有苯甲基磺酰氟的Tris缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)处理，苯甲基磺酰氟的体积摩尔浓度为3×10-7mol/L，搅拌均匀，4℃处理24h，水洗沥干；
(3)向步骤(2)获得的产物中加入以其体积计2倍的含有TritonX-100的Tris缓冲溶液(50mmol/L，pH＝7.4)，TritonX-100的体积百分浓度为0.5％，搅拌均匀，4℃处理10h，水洗沥干，得鱼鳞半成品；
(4)向步骤(3)获得的鱼鳞半成品加入以其体积计2倍的酶溶液，酶溶液中，含有5μg/mL的DNA酶和5μg/mL的RNA酶，在40℃下静置处理1h，水洗沥干；
(5)向步骤(4)获得的产物加入以其体积计2倍的含有1×10-7mol/L的苯甲基磺酰氟和体积浓度0.1％的TritonX-100的Tris缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，4℃处理24h，PBS磷酸盐缓冲液洗涤5～10次；
(6)向步骤(5)获得的产物用浓度为1wt％的盐酸室温下处理10h，沥干后再用浓度为50wt％的柠檬酸室温下处理0.5h，水洗浸泡至中性，得鱼鳞基生物材料。
实施例3
一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，包括如下步骤：
(1)将鱼鳞置于超声振荡池，超声波强度0.4W，波频率40kHz，间歇时间1min；向鱼鳞中加入浓度为10wt％的碳酸钠溶液，将鱼鳞完全浸没，室温下搅拌均匀，3h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干；所得的样品添加浓度为5wt％的柠檬酸溶液，将鱼鳞完全浸没，3h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干，得鱼鳞片初成品；
(2)向步骤(1)获得的鱼鳞片初成品加入以其体积计2倍的含有苯甲基磺酰氟的Tris缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)处理，苯甲基磺酰氟的体积摩尔浓度为5×10-7mol/L，搅拌均匀，4℃处理24h，水洗沥干；
(3)向步骤(2)获得的产物中加入以其体积计2倍的含有TritonX-100的Tris缓冲溶液(50mmol/L，pH＝7.4)，TritonX-100的体积百分浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃处理24h，水洗沥干，得鱼鳞半成品；
(4)向步骤(3)获得的鱼鳞半成品加入以其体积计2倍的酶溶液，酶溶液中，含有5μg/mL的DNA酶和5μg/mL的RNA酶，在37℃下静置处理3h，水洗沥干；
(5)向步骤(4)获得的产物加入以其体积计2倍的含有5×10-7mol/L的苯甲基磺酰氟和体积浓度0.1％的TritonX-100的Tris缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，4℃处理10h，PBS磷酸盐缓冲液洗涤5～10次；
(6)向步骤(5)获得的产物用浓度为5wt％的柠檬酸室温下处理1h，沥干后再用浓度为40wt％的硝酸室温下处理3h，水洗浸泡至中性，得鱼鳞基生物材料。
实施例4
一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，包括如下步骤：
(1)将鱼鳞置于超声振荡池，超声波强度0.3W，波频率40kHz，间歇时间3min；向鱼鳞中加入浓度为8wt％的碳酸钠溶液，将鱼鳞完全浸没，室温下搅拌均匀，2h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干；所得的样品添加浓度为7wt％的柠檬酸溶液，将鱼鳞完全浸没，2h后去除溶液中杂质，水洗至中性，沥干，得鱼鳞片初成品；
(2)向步骤(1)获得的鱼鳞片初成品加入以其体积计2倍的含有苯甲基磺酰氟的Tris缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)处理，苯甲基磺酰氟的体积摩尔浓度为4×10-7mol/L，搅拌均匀，4℃处理16h，水洗沥干；
(3)向步骤(2)获得的产物中加入以其体积计2倍的含有TritonX-100的Tris缓冲溶液(50mmol/L，pH＝7.4)，TritonX-100的体积百分浓度为0.3％，搅拌均匀，4℃处理16h，水洗沥干，得鱼鳞半成品；
(4)向步骤(3)获得的鱼鳞半成品加入以其体积计2倍的酶溶液，酶溶液中，含有5μg/mL的DNA酶和5μg/mL的RNA酶，在36℃下静置处理2h，水洗沥干；
(5)向步骤(4)获得的产物加入以其体积计2倍的含有2×10-7mol/L的苯甲基磺酰氟和体积浓度0.4％的TritonX-100的Tris缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，4℃处理16h，PBS磷酸盐缓冲液洗涤5～10次；
(6)将步骤(5)获得的产物用浓度为5wt％的柠檬酸室温下处理10h，沥干后再用浓度为25wt％的盐酸室温下处理1h，水洗浸泡至中性，得鱼鳞基生物材料。
对实施例1-4获得的鱼鳞基生物材料进行性能测试，测得实施例1-4获得的生物材料的透明度大于85％，溶血率小于3％；柔韧性强，折叠180度，无断裂；其应变能力大于0.2，大大高于单独的胶原膜和单独的羟基磷灰石膜。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鱼鳞片纯化处理制备膜材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对鱼鳞片进行碱处理和酸处理，去除杂质，得鱼鳞片初成品；
(2)将步骤(1)获得的鱼鳞片初成品用蛋白酶抑制剂处理；
(3)将步骤(2)获得的产物用表面活性剂处理，得鱼鳞半成品；
(4)将步骤(3)获得的鱼鳞半成品用DNA酶和RNA酶消化处理；
(5)将步骤(4)获得的产物再次用蛋白酶抑制剂处理；
(6)将步骤(5)获得的产物再次进行酸处理，水洗至中性，得鱼鳞基生物材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中：碱处理剂为碳酸钠和/或碳酸钾溶液，酸处理剂为柠檬酸和/或苹果酸溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(2)与步骤(5)中：所述的蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟，苯甲基磺酰氟的浓度为1×10-7～5×10-7mol/L；
步骤(5)中还添加了TritonX-100，TritonX-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的苯甲基磺酰氟与TritonX-100均溶解于Tris缓冲溶液中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：所述的表面活性剂包括TritonX-100，TritonX-100的体积百分浓度为0.1％～0.5％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：所述的TritonX-100溶解于Tris缓冲溶液中。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中：DNA酶和RNA酶的浓度均为5μg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中：
所述的酸为柠檬酸、盐酸和硝酸中的一种或多种；
所述的再次酸处理的具体步骤为:先使用1wt％～10wt％的酸浸泡1～10h沥干；再使用10wt％～50wt％的酸浸泡0.5～3h，水洗至中性。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)～(6)在间歇超声中进行。
10.一种膜材料，其特征在于，应用如权利要求1～9任一项所述的方法制备获得。
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