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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen
von polyphenolischen Adhäsionsproteinen
aus Muschelfüßen; solche
Proteine werden hier als MAP bezeichnet. Die Erfindung bezieht sich
auch auf MAP-Produkte, die durch das Verfahren hergestellt sind.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der
Ausdruck MAP ist ein Akronym des englischen Ausdrucks Muscheladhäsionsprotein.
Die Bezeichnung basiert auf der Herstellung des betreffenden Proteins
aus einer Drüse
in den Füßen von Muscheln.
Das Protein haftet stark an allen Oberflächentypen, z. B. an lebenden
Zellen und anderen Materialien, wie Stein, Holz und ähnliche
Materialien, die sich unter Wasser befinden. Die Muscheln haften so
an einem geeigneten Unterwassergegenstand und leben dort.
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Muscheladhäsionsprotein
hat ein Molekulargewicht von etwa 130000 und besteht aus 75 bis
85 wiederholten Sequenzen von Hexapeptiden und Decapeptiden. Das
Protein enthält
bis zu 20% Lysin und einen ungewöhnlich
hohen Anteil von bis zu 50% von Hydroxy enthaltenden Aminosäuren, wie
Hydroxyproline, Serine, Threonine, Tyrosine und (was sehr ungewöhnlich in
einem Polypeptid ist) 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA). Die DOPA-Gruppen
bilden 10 bis 15% des Adhäsionsproteins.
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Die
Adhäsionsfestigkeit
von MAP pro Gewichtseinheit ist vergleichbar mit derjenigen von
synthetischem Cyanacrylat und Epoxyharzen. MAP ist auch wasserbeständig und
bindet sehr wirksam in Wasser und haftet sehr wirksam an zahlreichen
Feststoff- und Halbfeststoffoberflächen, wie Glas, Metall, biologisches
Gewebe und Kunststoffe, selbst an Teflon®-Oberflächen.
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Die
hohe Lysinkonzentration von Muscheladhäsionsprotein trägt wahrscheinlich
zu ihrer guten Haftung bei, insbesondere über Ionenbindungen zu negativ
geladenen Oberflächen,
wie zu zahlreichen Proteinen und Polysacchariden.
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Der
sehr hohe Hydroxylgehalt und die o-diphenolische Natur der DOPA-Gruppen
sind wahrscheinlich für
die einzigartige wasserabstoßende
Eigenschaft von Muscheladhäsi onsprotein
und folglich für
seine Fähigkeit
verantwortlich, an Unterwassergegenständen zu haften und in solchen
Umgebungen zu härten.
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Die
Hydroxyaminosäuren
tragen auch bemerkenswert zu Wasserstoffbindungen zum Erreichen
der Haftfestigkeit bei.
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Die
o-diphenolischen DOPA-Reste bilden starke Chelate mit Metallionen
und -oxiden und Halbmetallen, wie Silicium. Dies ist ein wesentlicher
Teil der Fähigkeit
von Muscheladhäsionsprotein,
an Stein, Glas und ähnlichen
Oberflächen
zu haften.
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DOPA
wird durch molekularen Sauerstoff zu einem Chinon oxidiert, und
es wird angenommen, dass es mit biogenen Aminen unter Bildung starker kovalenter
Bindungen reagiert. Intermolekulare Bindungen zu u. a. Lysinresten
tragen zu der "inneren" Haftung und einer
stärkeren
Adhäsionsbindung
bei.
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Muscheladhäsionsprotein
wird in biologischen Systemen gut angenommen. Es ist nichttoxisch
und ist im allgemeinen biokompatibel und weist nur eine geringe
oder keine Antigenität
auf. Dies macht es potenziell für
zahlreiche Zwecke verwendbar, wie mit Adhäsionsbiofilm zum Immobilisieren
von Zellen und Enzymen, als ein feuchtigkeitsverträglicher
Klebstoff zur Zahnbehandlung, als Zusatz zu oder als Ersatz für Wundnähte bei
der Behandlung von Wunden und Entzündungen, zum Fixieren und Heilen
komplizierter Knochenbrüche,
als Matrix für Arzneimittel
mit verzögerter
Wirkung usw. Muscheladhäsionsprotein
kann auch als ein Antikorrosionsmittel, einfach durch Beschichten,
z. B. eine Stahloberfläche
mit einem dünnen
Muscheladhäsionsfilm, der
an die Eisenatome des Stahls bildet, verwendet werden.
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In
der US-Patentschrift 4,496,397 ist ein Verfahren zum Herstellen
von Muscheladhäsionsprotein beschrieben,
das DOPA und Hydroxyprolin (hyp) enthält. Dieses Verfahren basiert
auf Muschelfüßen und beinhaltet
die Bildung eines wässrigen
Extrakts der Proteine, zu welchem dann ein Borat bei pH 7,0 bis 9,0
zugesetzt wird zum Herstellen eines löslichen Boratkomplexes des
DOPA enthaltenden Proteins, wobei die Verunreinigungen ausgefällt werden.
Der Boratkomplex wird dann abgetrennt und auf verschiedene Weise
behandelt, wie mit einer Essigsäurelösung oder
lyophilisiert in einer inerten Atmosphäre. Die gemäß diesem Verfahren hergestellten
Proteine haben einen Reinheitsfaktor von wenigstens 0,10, wobei
ein Produkt von maximaler Reinheit einen Faktor von größer als
0,16 haben sollte.
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Ein
weiteres Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsprotein ist in der Veröffentlichung Protein
Expression and Purification 1 147 150 (1990) beschrieben. Diese
Veröffentlichung
beschreibt die Herstellung von Muscheladhäsionsprotein (MAP) auf der
Grundlage von Muschelfüßen, wo
die Proteine in einer Lösung
extrahiert werden, die Tris-HCl (pH 7,5, der pH-Puffer) NaCl, ETA
(Ethylendiamintetraessigsäure),
EGTA (Ethylenglycolbis(aminoallylether)-N,N,N,N-tetraessigsäure, PMSF
(Phenylmethylsulfonylfluorid), KCN, NEM (N-Ethylmaleamid) und Trypsin-Inhibitor
aus Sojabohnen enthält.
Die Suspension wird in eine feste und eine flüssige Schicht getrennt, und
die feste Schicht wird in verdünnter
Essigsäure
homogenisiert, die PMSF und 2-Mercaptoethanol enthält. Anschließend an
eine Zentrifugation wird konzentrierte Perchlorsäure tropfenweise zu der festen
Schicht zugesetzt, die dann zentrifugiert wird, und die flüssige Schicht
wird wieder gesammelt. Die flüssige
Schicht wird dann mit kaltem Aceton vermischt, das Triton X 100,
HCl und 2-Mercaptoethanol enthält.
Die Muscheladhäsionsproteine fallen
dann aus und werden für
die weitere Verarbeitung isoliert.
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TECHNISCHES PROBLEM
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Das
vorstehend beschriebene Verfahren und auch andere bekannte Verfahren
zur Herstellung von Muscheladhäsionsproteinen
erfordern die Verwendung einer Anzahl von Hilfschemikalien und führen zu
einer niedrigen Ausbeute und zu relativ unreinen Produkten im Hinblick
auf bestimmte Muschelarten. Sie sind auch zeitaufwändig und
unwirtschaftlich.
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LÖSUNG
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Es
ist lange Zeit erwünscht
gewesen, Muscheladhäsionsproteine
in wirtschaftlicher Weise in größerem Maßstab herzustellen,
wobei Produkte von erwünschter
Reinheit erhalten werden. Demgemäß wird gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsproteinprodukten
aus Muschelfüßen bereitgestellt.
Das Verfahren ist gekennzeichnet durch das Extrahieren der Muschelfüße in einer
schwach sauren wässrigen
Lösung,
die 1 bis 10 Gew.-% Essigsäure
und 0,5 bis 3 Gew.-% Perchlorsäure
enthält,
wonach feste Substanzen aus der Lösung entfernt und die Proteine durch
Zugabe organischer oder anorganischer Salze ausgefällt werden
und die Proteinausfällung
dann von der Lösung
abgetrennt wird.
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Gemäß der Erfindung
sind geeignete Ausfällungssalze
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Natriumsulfat
und Kaliumsulfat in einer Konzentration von 5 bis 15 Gew.-% der
Lösung.
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Gemäß der Erfindung
werden die abgetrennten Proteine in geeigneter Weise in verdünnter Essigsäure wieder
aufgelöst,
und das nicht aufgelöste
Material wird dann von dem System abgetrennt. Gemäß der Erfindung
wird Perchlorsäure
in geeigneter Weise zu der wieder aufgelösten und abgetrennten Proteinlösung für die selektive
Ausfällung
von unerwünschten
Proteinen zugesetzt, wonach die Ausfällung von dem System abgetrennt
wird.
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Gemäß der Erfindung
ist es vorteilhaft, die abgetrennte Lösung einer Dialyse in verdünnter Essiglösung zu
unterwerfen, um Perchlorsäure
und Material mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Gemäß der Erfindung
kann das Muscheladhäsionsprotein
in Lösung
durch Zugabe von Ethanol, Propanol oder Aceton ausgefällt und
dann aus dem System abgetrennt und optional wieder in verdünnter Essigsäure aufgelöst werden.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf Muscheladhäsionsproteine, die gemäß dem vorstehenden Verfahren
hergestellt sind.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird mit Muschelfüßen, die
tiefgefroren sein können,
durchgeführt,
die zu einer wässrigen
Mischung zugesetzt werden, die Essigsäure in einer Konzentration
von 1 bis 10%, bevorzugt in dem Bereich von 5%, und Perchlorsäure in einer
Konzentration von 0,5 bis 3%, bevorzugt in dem Bereich von 1,5%,
enthält.
Die Extraktionsmischung wird dann einige Minuten in einem Mixer
homogenisiert, wonach die Suspension bei hoher Geschwindigkeit,
z. B. bei einer 15000 g erzeugenden Geschwindigkeit, zentrifugiert
wird.
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Die
wässrige
Lösung,
welche die Muscheladhäsionsproteine
enthält,
wird gesammelt, und die MAP-Proteine werden durch Zugabe von anorganischen
Salzen, bevorzugt Natriumchlorid, in hoher Konzentration ausgefällt. Es
ist notwendig, dass die Konzentration dieser anorganischen Salze
hoch ist und in dem Bereich von 10 Gew.-% liegt. Bei dieser hohen
Salzkonzentration fallen die Muscheladhäsionsproteine aus, während der
Hauptteil von anderen nicht interessierenden Proteinen in Lösung bleibt. Die
Muscheladhäsionsproteine
fallen auch bei niedrigeren Konzentrationen aus. Die Ausfällungschemikalie ist
nicht auf lediglich Natriumchlorid beschränkt. Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat,
Natriumsulfat usw. können
alternativ für
diesen Zweck verwendet werden. Nach einigen Stunden in einem Kühlschrank
hat sich eine Ausfällung
gebildet, die dann aus dem System entfernt wird, in geeigneter Weise
z. B. durch Zentrifugation bei 5000 g.
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Diese
MAP-Ausfällung
kann direkt ohne weitere Reinigung in einigen Fällen verwendet werden. In solchen
Fällen
kann sie optional mit anderen Substanzen, z. B. Kollagen, als Verstärkung vermischt und
auf Wunden oder Ähnlichem
verwendet werden, wobei Wasser angewandt wird und das MAP-Protein sowohl
an sich selbst als auch an die Umgebung bindet.
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Die
MAP-Ausfällung
kann jedoch alternativ z. B. in 5%iger Essigsäure aufgelöst werden, wobei bestimmte
unerwünschte
Proteine ausgefällt
werden. Die Mischung kann dann so zentrifugiert werden, dass nicht
aufgelöstes
Material sich davon abtrennt, das dann aus dem System entfernt wird.
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Die
MAP-Mischung kann weiter durch Zugabe von Perchlorsäure gereinigt
werden, wobei unerwünschtes
aufgelöstes
Material ausgefällt
wird. Die Perchlorsäure
mit einer Konzentration in dem Bereich von 15% wird bevorzugt langsam
zu der Mischung und in einer Menge entsprechend zu 5 bis 15% des
Volumens der Lösung
zugesetzt. Die Mischung wird dann eine halbe Stunde abgekühlt, und die
Ausfällung
wird entfernt, in geeigneter Weise durch Zentrifugation.
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Ein
hochreines Muscheladhäsionsproteinprodukt
kann erhalten werden, indem dann die Lösung, bevorzugt zwei- bis dreimal
in großen
Volumina in schwacher Essigsäure,
z. B. 3%ige Essigsäure,
dialysiert wird, wobei unerwünschte
Perchlorsäure durch
die Dialysemembran zusammen mit Material mit niedrigem Molekulargewicht
durchtritt. Diese Dialyseverfahren sind allgemein bekannt und brauchen daher
hier nicht im Einzelnen beschrieben zu werden. Die Dialyse führt zu einem
MAP-Produkt mit einer Reinheit von 90 bis 97% und einer Ausbeute
von 1 bis 2 mg Muscheladhäsionsprotein
pro Gramm des Muschelfuß-Ausgangsmaterials.
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Die
wässrige
MAP-Lösung,
die mit Perchlorsäure
behandelt wurde, kann auch durch Ausfällen des Muscheladhäsionsproteins
mit Hilfe von Aceton in einer sauren Umgebung, in geeigneter Weise über Nacht,
gereinigt werden. Die Ausfällung
wird abgetrennt, bevorzugt durch Zentrifugation, und wird dann in
einem kleinen Volumen von 5%iger Essigsäure aufgelöst. Das Protein hat dann eine
Reinheit von 95 bis 100%, wobei die Ausbeute im Vergleich zu der durch
Dialyse erhaltenen Ausbeute geringfügig abfällt, nämlich auf 0,5 bis 1 mg Muscheladhäsionsprotein
pro Gramm Muschelfuß-Ausgangsmaterial.
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Eine
extreme Reinheit kann durch Kombinieren der zwei Reinigungsverfahren
unter Verwendung von Dialyse und Acetonausfällung erhalten werden.
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Die
Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Herstellen von Muscheladhäsionsproteinen,
die verschiedene Reinheitsgrade haben und für verschiedene Verwendungen
angepasst sind, in einer besonders einfachen Weise ohne die Verwendung
einer großen
Anzahl von unnötigen
Chemikalien und in einer einfachen und wirtschaftlichen Weise bereit.