DE60222553T2 - Herstellung löslicher keratinderivate - Google Patents
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Description
- Gebiet der Erfindung
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von Derivaten von Keratin von tierischen Quellen wie z. B. Wolle, Haar, Hörnern, Hufen, Federn und Schuppen durch ein wirtschaftliches und umweltverträgliches Verfahren und eine Reihe von dadurch hergestellten Keratinderivatprodukten. Einige der Keratinderivate sind löslich und können bei der Herstellung eines Bereichs von Biopolymermaterialien verwendet werden.
- Hintergrund zur Erfindung
- Keratine sind eine Klasse von Strukturproteinen, die in biologischen Strukturen umfangreich dargestellt sind, insbesondere in Epithelialgeweben von höheren Wirbeltieren. Keratine können in zwei Hauptklassen unterteilt werden, die weichen Keratine (die in der Haut und in einigen anderen Geweben vorkommen) und die harten Keratine, die das Material von Nägeln, Klauen, Haar, Horn, Federn und Schuppen bilden.
- Die Zähigkeit und Unlöslichkeit von harten Keratinen, die ermöglichen, dass sie eine fundamentale Strukturrolle in vielen biologischen Systemen spielen, sind auch erwünschte Eigenschaften in vielen der industriellen und Verbrauchermaterialien, die derzeit von synthetischen Polymeren abgeleitet werden. Zusätzlich dazu, dass es ausgezeichnete physikalische Eigenschaften besitzt, ist Keratin als Protein ein Material mit einem hohen Grad an chemischer Funktionalität und weist folglich viele Eigenschaften auf, die synthetische Materialien nicht erreichen können. Keratin ist daher für die Entwicklung von Produkten mit hochwertigen Nischenmarktanwendungen gut geeignet. Keratin ist auch ein umweltverträgliches Polymer, das aus einer umweltverträglichen Ressource hergestellt wird, und weist daher Umweltvorteile gegenüber synthetischen Materialien auf. Dem globalen Trend der Entwicklung von Materialien aus erneuerbaren Quellen, die in einem umweltverträglichen Verfahren hergestellt werden, folgend wurde ein Bereich von Materialien aus Keratin, am üblichsten in Form von Keratinfilmen, hergestellt.
- Im Kern einer neuen Industrie, die Biopolymermaterialien aus Keratin herstellt, ist es wesentlich, ein Verfahren zum Extrahieren von Keratin aus seiner Quelle zu haben, das wirtschaftlich brauchbar, von einer Umweltperspektive umweltverträglich ist und ein stabiles und vielseitiges Produkt erzeugt. Verfahren, die bisher für die Extraktion von Keratin verwendet wurden, die die Integrität der individuellen Proteine aufrechterhalten, wurden für den Zweck der Proteinanalyse und Charakterisierung entworfen, und sind folglich nicht in einem industriellen Maßstab von einem wirtschaftlichen und Umweltgesichtspunkt brauchbar. Verfahren, die bisher für die wirtschaftliche Auflösung von Keratin verwendet wurden, besitzen signifikant verschlechternde Auswirkungen auf das Protein und folglich behält das aufgelöste Protein wenige der physikochemischen Eigenschaften bei, die zur Erwünschtheit von Keratin als Biopolymer führen, wie z. B. die Fähigkeit, es in zähe Materialien zu rekonstituieren.
- Es ist eine Aufgabe der Erfindung, einen gewissen Weg bei der Beseitigung der Nachteile bei bekannten Verfahren zu gehen oder zumindest die Öffentlichkeit mit einer nützlichen Wahl zu versehen.
- In mindestens einem Ausführungsbeispiel strebt die Erfindung nach der Bereitstellung eines wirtschaftlichen und umweltverträglichen Verfahrens für die Auflösung von Keratinproteinen, das die strukturelle Integrität und chemische Funktionalität der Proteine während des Auflösungsprozesses aufrechterhält und zu einem stabilen und vielseitigen Keratinderivatprodukt für die Entwicklung von Biopolymermaterialien führt.
-
US-A-3 644 084 betrifft ein Verfahren zum Erweichen von Keratinfasern. - THOMAS H. ET AL.: "In vitro reconstitution of wool intermediate filaments" INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES Band 8, Nr. 5, 1986, Seiten 258–264, betrifft ein Verfahren zum Rekonstituieren von Wollzwischenfilamenten.
- HARRAP B.S. ET AL.: "Soluble Derivatives of feather keratin" THE BIOCHEMICAL JOURNAL Band 92, Nr. 1, 1964, Seiten 8–18, betrifft die Isolierung von löslichen Derivaten von Federkeratin und die Bestimmung ihrer Aminosäurezusammensetzung.
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US-A-3-567 363 undFR-A-1 503 640 -
GB-A-2 115 427 - SWAN J.M.: "The reaction of Protein thiol and disulphide groups with cupric sulphite solutions" AUSTRALIAN JOURNAL OF CHEMISTRY Band 14, 1960, Seiten 69–83, betrifft die Reaktion von Thiol- und Disulfidgruppen mit Kupfer(II)-sulfitlösungen.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Auflösungsverfahren zur Herstellung eines Bereichs von stabilen, löslichen Keratinderivaten mit hohem Molekulargewicht bereit, wobei das Molekulargewicht ähnlich jenem oder größer als jenes von Proteinen ist, die ursprünglich in der Keratinquelle exprimiert sind, mit geringer oder keiner Beschädigung an der strukturellen Integrität der Bestandteilsproteine. Die Auflösung geschieht in einem zweistufigen Prozess, einschließlich einer ersten Stufe eines Verdauungsschritts der S-Sulfonierung einer Keratinquelle durch oxidative Sulfitolyse, gefolgt von einer zweiten Stufe eines Extraktionsschritts unter Verwendung von kontrolliertem Waschen mit Wasser, um dadurch ein S-sulfoniertes Keratinderivat mit hohem Molekulargewicht zu erhalten.
- Die Umwandlung von stark S-sulfoniertem Keratin von einem festen Zustand in Lösung geschieht ohne Verwendung von chaotropen Mitteln durch kontrolliertes allmähliches Waschen des sulfonierten Keratins mit Wasser, um die restlichen chemischen Reagenzien aus dem Extraktionsverfahren auszuwaschen und die Ionenstärke der Extraktionslösung zu ändern.
- Die erste Stufe beinhaltet eine oxidative Sulfitolyse, um Cystingruppen, die im Protein vorhanden sind, in S-Sulfocystein umzuwandeln, unter Verwendung von industriell annehmbaren Konzentrationen von kostengünstigen Reagenzien für den Zweck der Sulfonierung (z. B. Natriumsulfit) und Oxidation (z. B. Kupfertetramminhydroxid) Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für die Trennung eines gallertartigen Keratinprodukts von einer Lösung von S-sulfoniertem Keratin, das durch das obige Verfahren hergestellt wird, bereit, wobei die S-sulfonierte Keratinderivatlösung unter Verwendung eines sanften Schwerkraftfiltrationssystems, gefolgt von Trennung, behandelt wird. Vorzugsweise ist die Trennung zentrifugal.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein flüssiger Strom, der verbleibt, nachdem das gallertartige Keratin entfernt ist, durch Leiten über geschorene Wolle verarbeitet, wodurch restliche Chemikalien aus der Lösung entfernt werden und die Wolle für die anschließenden Proteinextraktionsprozesse vorbereitet wird.
- Nach der Umwandlung der Cystingruppen ist die zweite Stufe des Verfahrens eine, in der das stark S-sulfonierte Keratinderivat von einem festen oder gallertartigen Zustand durch ausgedehnte Verdünnung mit Wasser in Lösung gebracht wird. Die Rate und das Ausmaß der Auflösung können durch die Verwendung von Wärme, Tensiden, sanftem Bewegen und heftigem Zerhacken oder Homogenisierung gesteuert werden. Durch Steuern der Auflösungsrate können Reaktionslösungen isoliert werden, beispielsweise wenn ein Kupferoxidationsmittel verwendet wird, wird eine Reaktionslösung, die reich an Kupfer ist, aber wenig oder kein aufgelöstes Protein enthält, oder reich an Protein ist, aber wenig oder kein Kupfer enthält, hergestellt.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein flüssiger Strom, der sich aus der zweiten Stufe des Verfahrens ergibt, der restliche Chemikalien wie z. B. Kupfersulfat und -sulfit sowie S-sulfonierte Keratinderivate enthält, unter Verwendung von irgendeinem oder mehreren einer Vielzahl von Verfahren verarbeitet, die die Rückführung von Reagenzien aus der Lösung und die separate Isolation von gereinigtem (gereinigten) S-sulfonierten Keratinzwischenfilamentprotein(en) (SIFP) und S-sulfonierten Keratinprotein(en) mit hohem Schwefelgehalt (SHSP) ermöglichen. Dies wird durch die Verwendung von Chelatbildnern wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure oder chelatbildenden Ionenaustauschharzen, wie z. B. jenen, die die Iminodiessigsäure-Funktionsgruppe enthalten, und die Verwendung von isoelektrischer Fällung zur Trennung von Proteintypen erreicht. Ultrafiltration kann in verschiedenen Stufen in dem Verfahren verwendet werden, um den Wirkungsgrad der Reagenzienentfernung oder Proteintrennung zu verbessern. Metallische Verunreinigungen in den Proteinprodukten können durch das Waschen des Proteinderivats (der Proteinderivate) nach der Fällung mit verdünnten Säuren, Wasser oder Chelatbildnern weiter verringert werden. Sobald sie getrennt sind, können die Proteinprodukte durch einen Bereich von Verfahren wie z. B. Wirbelschicht-, Sprüh- oder Gefriertrocknen getrocknet werden.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Weiterverarbeitung von restlichem Keratin, das nicht durch das zweistufige Sulfitolyse-Verfahren aufgelöst wurde, durch die Verwendung von anderen Reagenzien wie z. B. Wasserstoffperoxid, Natriumsulfid oder proteolytischen Enzymen, um Keratinpeptide herzustellen.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Rückgewinnung von Proteinen aus einer natürlichen Quelle im großen Maßstab, einschließlich des Unterziehens der natürlichen Proteinquelle einer Behandlung, die ausreicht, um zumindest einige(s) des Proteins (der Proteine) wasserlöslich zu machen, und des anschließenden Trennens des (der) wasserlöslichen Proteins (Proteine).
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung einer Anlage für die Rückgewinnung von Proteinen aus einer natürlichen Quelle im großen Maßstab, eines Behandlungsgefäßes zum Aufnehmen und Unterziehen einer großen Menge einer natürlichen Proteinquelle einer Behandlung, die ausreicht, um zumindest einige(s) des (der) Proteins (Proteine), das (die) in der Zufuhr enthalten ist (sind), wasserlöslich zu machen, und einer Trennvorrichtung zum anschließenden Trennen des (der) wasserlöslichen Proteins (Proteine).
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum selektiven Solubilisieren eines Proteins mit einer Vielzahl von Disulfidbindungen aus einem Gemisch von Proteinen, einschließlich Unterziehen des Gemisches von Proteinen einer oxidativen Sulfitolyse, um eine lösliche S-sulfonierte Proteinfraktion zu erzeugen. Die oxidative Sulfitolyse wird vorzugsweise in Abwesenheit von chaotropen Mitteln mit wenig oder keiner Beschädigung an der strukturellen Integrität des Proteins bewirkt.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalten eines gereinigten Proteins aus einer unreinen Proteinquelle mit wenig oder keiner Beschädigung an der strukturellen Integrität des Proteins, einschließlich des Unterziehens der Proteinquelle einer Behandlung, die ausreicht, um zumindest einige(s) des (der) Proteins (Proteine) wasserlöslich zu machen, und des anschließenden Trennens des (der) wasserlöslichen Proteins (Proteine) in Abwesenheit von chaotropen Mitteln.
- Beschreibung von bevorzugten Beispielen der Erfindung
- Die Kombination von Aspekten, die das Verfahren als Ganzes bilden, sind schematisch in der beigefügten
1 zusammengefasst. - Dieses Prozessverfahren dient für die Herstellung von stark sulfonierten Keratinderivaten und kann auf eine beliebige Keratinquelle, wie z. B. tierische Wolle, Haar, Hörner, Hufe, Federn oder Schuppen, angewendet werden. Obwohl die Anwendung des Verfahrens auf verschiedene Keratinquellen lösliche Keratine mit unterschiedlicher Struktur und unterschiedlichen Eigenschaften ergeben kann, gilt der grundlegende Schritt des Auflösungsverfahrens, in dem Cystin in S-Sulfocystein umgewandelt wird, gleichermaßen gut für alle Keratin enthaltenden Materialien.
- Das Verfahren kann sich als in zwei Stufen stattfindend vorgestellt werden.
- Die Stufe eins, die die Umwandlung von Cystin in S-Sulfocystein beinhaltet, geschieht durch ein Verfahren der oxidativen Sulfitolyse. Dies kann unter Verwendung eines Sulfonierungsmittels wie z. B. Natriumsulfit oder Natriummetabisulfit, das das Cystin asymmetrisch in Cystein und S-Sulfocystein spaltet, und ein Oxidationsmittel, das das bei der Sulfonierung erzeugte Cystein in Cystin umwandelt, erreicht werden. Durch weitere Sulfonierung von Cystin wird eine vollständige Umwandlung des ganzen Cystins in S-Sulfocystein erreicht.
- Oxidationsmittel, die verwendet werden können, umfassen Natriumtetrathionat, Iodosobenzoat und Kupfertetramminhydroxid. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel dieser Erfindung ist das verwendete Sulfonierungsreagens Natriumsulfit in einem Konzentrationsbereich von 0,02 M bis 0,2 M und das verwendete Oxidationsmittel ist Kupfertetramminhydroxid im Konzentrationsbereich von 0,02 M bis 0,08 M, das durch die Kombination von Kupfersulfat und Ammoniak erzeugt wird. Die erste Stufe des Verfahrens zum Solubilisieren von Keratin ist das Tränken der Keratinquelle für eine Verweilzeit wie z. B. 24 Stunden in einer Lösung oder Folge von Lösungen, die das Cystin in S-Sulfocystein umwandeln, mit einem Lauge-Wolle-Verhältnis (Volumen:Gewicht) im Bereich von 5:1 bis 50:1.
- In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das verwendete Sulfonierungsmittel Natriummetabisulfit im Konzentrationsbereich von 0,1 M bis 0,5 M, das auf einem sauren pH-Wert gehalten wird. In diesem Ausführungsbeispiel wird die Wolle aus der Lösung, die Natriummetabisulfit enthält, entfernt, bevor sie zu einer Lösung zugegeben wird, die einen Kupfertetramminkomplex im Konzentrationsbereich von 0,02 M bis 0,08 M enthält.
- Eine vorherige Arbeit in Bezug auf die Verwendung des Verfahrens der oxidativen Sulfitolyse hat die Verwendung von großen Konzentrationen von chaotropen Mitteln wie z. B. Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid erfordert, um die Keratinquelle zu quellen und die Auflösung von Keratin zu erleichtern. Dieses Verfahren ist sowohl teuer als auch unpraktisch in einem industriellen Maßstab. Eine vorherige Arbeit in Bezug auf die Verwendung der oxidativen Sulfitolyse unter Verwendung von Kupfer als Oxidationsmittel wurde unter Bedingungen einer Temperatur und eines pH-Werts durchgeführt, die für die Integrität des Proteins schädlich sind, was hohe Umwandlungsraten von Cystin in Lanthionin verursacht.
- Die Stufe zwei des Verfahrens beinhaltet die Umwandlung von stark sulfoniertem Keratin von einem festen Zustand in Lösung ohne Verwendung von chaotropen Mitteln und unter Bedingungen von Temperatur und pH-Wert, die die strukturelle Integrität des Proteins aufrechterhalten, durch kontrolliertes, allmähliches Waschen des sulfonierten Keratins mit Wasser, um die restlichen chemischen Reagenzien aus dem Extraktionsverfahren auszuwaschen und die Ionenstärke der Extraktionslösung zu ändern. Diese Kombination von Effekten führt zur Umwandlung des stark sulfonierten Keratins vom festen Zustand in eine wässerige Lösung. Im bevorzugten Verfahren wird das Reaktionsvolumen alle 12 bis 48 Stunden entweder in einem Serienprozess oder auf einer kontinuierlichen Basis ausgetauscht.
- Die Rate und das Ausmaß der Auflösung können durch die Verwendung von Tensiden, die Wirkung von Wärme, Bewegung und Homogenisierung des sulfonierten Keratins gesteuert werden. Ein Merkmal der Erfindung besteht darin, diese Faktoren zu verwenden, um die Extraktionsrate zu steuern. Das stark S-sulfonierte Keratin kann daher im festen Zustand gehalten werden und von der Extraktionslösung getrennt werden, die die Masse der für den Sulfonierungsprozess verwendeten Chemikalien enthält. Das bevorzugte Verfahren verwendet ein nicht-ionisches Tensid wie z. B. Triton X 100 im Bereich von 0,1 bis 5 Gewichts-% und eine Temperatur, die im Bereich von 15°C bis 50°C gehalten wird.
- Ein Vorteil der Erfindung, wenn ein Oxidationsmittel auf Kupferbasis verwendet wird, ist die Wiederverwendung dieser an Kupfer reichen Extraktionslösung für die anschließenden Extraktionsprozesse, was sowohl die Kosten als auch die Umweltauswirkung des Verfahrens signifikant verringert. Die Wiederverwendung der an Kupfer reichen Lösung ist teilweise aufgrund der Regeneration der aktiven Kupferspezies durch Luftoxidation möglich. Ein Verfahren, in dem die an Kupfer reiche Lösung effizient wieder verwendet werden kann, ist durch Leiten der Lösung über Wolle. Wolle bindet Kupfer aus der Lösung und, wenn diese Wolle dann für die anschließenden Extraktionsprozesse verwendet wird, ist der Bedarf für Kupfer in diesen anschließenden Extraktionen verringert. In dieser Weise kann ein "Wollfilter" als Schlüsselschritt in der Verarbeitung der an Kupfer reichen Extraktionslösung verwendet werden, was den anschließenden Bedarf für die Eluatbehandlung und auch den Bedarf für zu den anschließenden Prozessen zuzugebendes Kupfer verringert. In einem typischen Verfahren enthielt der flüssige Strom aus der Stufe 1 ungefähr 1800– 1500 (Parts per Million) ppm Kupfer und nach dem Leiten über den Wollfilter wurde dieses auf ungefähr 400–300 ppm verringert.
- Die erste Stufe des Verfahrens und die Rückgewinnung von Reagenzien für die Verwendung in dem Prozess sind in der beigefügten
1 angegeben. - Nach der S-Sulfonierung und Homogenisierung wird das Keratinmaterial zu einer gallertartigen, gequollenen, faserförmigen Masse.
- Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Trennung der stark S-sulfonierten Keratinderivate im festen Zustand aus Lösungen, die entweder im Extraktionsprozess verwendete Chemikalien oder das Keratinprotein in Lösung enthalten. Diese Trennung wird unter Verwendung einer sanften Filtration auf Schwerkraftbasis durch ein Sieb mit feinen Maschen, gefolgt von Zentrifugaltrennung des Filtrats von den feinen Partikeln, effektiv erreicht.
- Lösungen von stark S-sulfonierten Keratinderivaten können in Bezug auf Metallionen, insbesondere die Kupferionen, die als Teil des Extraktionsprozesses verwendet werden, durch die Verwendung von Ionenaustauschmedien, insbesondere jenen, die Iminodiessigsäurefunktionalität enthalten, von denen bekannt ist, dass sie eine hohe Affinität für zweiwertige Metallionen besitzen, gereinigt werden. Dieses Ionenaustauschmedium kann in Form einer gepackten Harzsäule, über die die Proteinlösung geleitet wird, vorliegen, oder es kann alternativ einen Teil einer elektrochemischen Zelle bilden, in der Kupfer aus dem Ionenaustauschmedium durch die Verwendung einer angelegten Spannung und eines Systems, das permeable Membranen enthält, zurückgewonnen wird.
- Sobald die stark S-sulfonierten Keratinderivate in Lösung sind, können spezielle Proteine, z. B. das S-sulfonierte Keratinzwischenfilamentprotein, leicht durch isoelektrische Fällung um pH 4 oder darunter unter Verwendung von Säuren wie z. B. Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Zitronensäure oder Essigsäure mit dem bevorzugten Verfahren unter Verwendung von Schwefelsäure isoliert werden. Ein Vorteil der Erfindung ist die Minimierung der Bindung von Kupfer und anderen metallischen Verunreinigungen an das Protein vor der isoelektrischen Fällung durch die Verwendung von Ionenaustauschmedien, wie beschrieben, oder durch Zugabe eines Chelatbildners wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zur Proteinlösung. Im bevorzugten Beispiel wird EDTA (0,2 M) zum flüssigen Strom aus der Stufe 2 mit einer Rate von 25 ml pro Liter oder mit einer Rate, die geeignet ist, um alle in Lösung vorhandenen Kupferionen zu maskieren, wie durch Analyse der Lösung angegeben, zugegeben. Metallische Verunreinigungen können weiter durch Waschen des Proteins, sobald es durch Fällung isoliert ist, mit einer verdünnten Säurelösung oder Lösung eines Chelatbildners wie z. B. EDTA oder Wasser verringert werden.
- Nach der Fällung und dem Waschen kann das abgetrennte Protein in einem stabilen, trockenen Zustand unter Verwendung von Trocknungsverfahren isoliert werden, die Luftströme bei etwa Umgebungstemperatur beinhalten, beispielsweise unter Verwendung eines Wirbelschichttrockners. Alternativ kann das Produkt unter Verwendung eines Gefriertrockners getrocknet werden. Das trockene Proteinprodukt enthält Cystingruppen in Form von S-Sulfonsäure und folglich ist das Protein nur in Gegenwart einer Base wie z. B. Natriumhydroxid oder Ammoniumhydroxid löslich. Diese Verfahren sind als Trocknen in der beigefügten
1 dargestellt. - Die sehr löslichen Keratinderivate, die nach der isoelektrischen Fällung in Lösung bleiben, die im Fall von Wolle hauptsächlich die Matrixproteine mit hohem Schwefelgehalt von innerhalb der Wollfaser sind, können in einer stabilen Form aus der Lösung durch einen Prozess der Ultrafiltration, um nicht proteinartige Spezies wie z. B. restliches Kupfer oder EDTA zu entfernen, gefolgt von Sprühtrocknen, isoliert werden.
- Ein Merkmal der Erfindung ist die Verwendung einer Kombination einer isoelektrischen Fällung und Ultrafiltration, gefolgt von Sprühtrocknen, um stark S-sulfonierte Keratine gemäß ihren Eigenschaften in Lösung abzutrennen. Im Fall von Wollkeratin trennt dies effektiv die Zwischenfilamentprotein-Klasse mit niedrigem Schwefelgehalt von der Matrixproteinklasse mit hohem Schwefelgehalt und stellt zwei Produktströme mit verschiedenen chemischen Eigenschaften bereit.
- Ferner wird die Fällung einer stabilen, wasserlöslichen Form des stark S-sulfonierten Keratinderivats durch Auflösen der S-Sulfonsäureform von Keratin in Gegenwart von einer Base und Sprühtrocknen der resultierenden Lösung erwähnt.
- Ein Merkmal der Erfindung ist die Kombination von technischen Komponenten, um die Solubilisierung des Keratins und die Isolierung des S-sulfonierten Keratins aus Lösung in einem kontinuierlichen, halbkontinuierlichen oder Serienprozess zu ermöglichen. Diese Kombination von technischen Komponenten und Einheitsoperationen ist in
1 detailliert dargestellt. - Ein Vorteil der Erfindung ist die Rückgewinnung und Wiederverwendung von Kupfer aus den Reaktionsgemischen und Eluatströmen des Verfahrens. Kupfer kann unter Verwendung von elektrochemischen Verfahren zurück gewonnen werden, einschließlich der Verwendung von selektiven permeablen Membranen, um Kupferionen von EDTA vor der elektrochemischen Abscheidung zu trennen. Alternativ können immobilisierte Bindemittel in Form von für Kupfer spezifischen Ionenaustauschharzen verwendet werden, um Kupfer aus dem Eluatstrom zu trennen. Unter Verwendung dieser Verfahren entferntes Kupfer kann wieder verwendet werden, wodurch die Umweltauswirkung des Verfahrens minimiert wird.
- Die Verwendung von Ionenaustauschmedien und/oder Chelatbildnern wird als Reinigung in der beigefügten
1 dargestellt. - Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Weiterverarbeitung von restlichem Keratin, das im festen Zustand bleibt, gefolgt vom Extraktionsverfahren. Dieses funktionalisierte Keratin ist stark S-sulfoniert, daher wurden die Disulfidbindungen, die im natürlichen Keratin vorliegen, die es gegen chemischen und enzymatischen Angriff beständig machen, gespalten und das Keratin ist unter Verwendung von anderen Extraktionsverfahren leicht verdaulich. Eine Lösung, die an Keratinpeptiden reich ist, kann beispielsweise durch die Einwirkung von alkalischen Lösungen eines starken Oxidationsmittels wie z. B. Wasserstoffperoxid im Konzentrationsbereich von 10–100 ml von 50% Wasserstoffperoxid pro kg des Keratinrückstands unter alkalischen Bedingungen auf dieses restliche Keratin hergestellt werden. Der Keratinrückstand enthält ungefähr 5% Feststoffe. Alternativ können Lösungen von starken Reduktionsmitteln wie z. B. Natriumsulfid im Konzentrationsbereich von 0,5%–15%, die zum Keratinrückstand zugegeben werden, verwendet werden, um eine an Keratinpeptiden reiche Lösung herzustellen. Alternativ können proteolytische Enzyme wie z. B. jene der Subtilisin-, Papain- oder Trypsingruppen in Anteilen im Bereich von 0,1 mg–20 mg Enzym pro Gramm Keratinrückstand bei Temperatur- und pH-Bedingungen, die für das spezifische Enzym geeignet sind, um das restliche Keratin leicht zu verdauen und eine an Keratinpeptiden reiche Lösung herzustellen, verwendet werden. Alle diese Verfahren führen zur Bildung einer an Keratinpeptiden reichen Lösung, die in einer ähnlichen Weise zum flüssigen Strom verarbeitet werden kann, der sich aus der vorstehend beschriebenen Stufe 2 ergibt, das heißt durch die Verwendung von Ionenaustauschmedien, pH-Einstellung und Trocknen (als Reinigung und Trocknen in
1 gezeigt), um Keratinpeptidfeststoffe zu erzeugen. Die Verdauung des Keratinrückstandes in dieser Weise minimiert den durch das Verfahren erzeugten Keratinabfall insgesamt und stellt einen maximalen Nutzen des in der Keratinquelle vorhandenen Keratinproteins bereit. - Die zwei intakten Proteinprodukte aus dem Prozess sind S-sulfoniertes Keratinzwischenfilamentprotein und S-sulfoniertes Keratinprotein mit hohem Schwefelgehalt. Das S-sulfonierte Keratinzwischenfilamentprotein, das typischerweise durch das Verfahren hergestellt wird, wurde unter Verwendung von Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE)Analyse unter Verwendung eines Reduktions-/Alkylierungsverfahrens analysiert, die eine Molekulargewichtsverteilung vorwiegend im Bereich von 30–60 kD (Zwischenfilamentproteine) mit einer kleinen Komponente von Protein mit einer Masse von 10 kD (Proteine mit hohem Glycin- und hohem Tyrosingehalt) anzeigte. Die Aminosäurezusammensetzung dieses Produkts ist in Tabelle 1 gegeben und ist für Wollkeratinzwischenfilamentproteine typisch. Das S-sulfonierte Keratinprotein mit hohem Schwefelgehalt wurde unter Verwendung von SDS-PAGE nach einer Reduktions-/Alkylierungsprozedur analysiert, was ein Molekulargewicht vorwiegend im Bereich von 15–20 kD anzeigte. Die Aminosäurezusammensetzung dieses Produkts ist in Tabelle 1 gegeben und ist für Wollkeratinproteine mit hohem Schwefelgehalt typisch.
Cya Asp Glu Ser Gly His Arg Thr Ala Pro Tyr Val Met Lan Ile Leu Phe Lys Cys SIFP 0,4 7,9 1 5,4 1 0,9 8,1 0,9 7,9 6,5 7,5 5,4 1,1 6,5 0,2 0,2 3,7 8,9 2,5 2,1 4,2 S HSP 1,7 2,6 8,6 1 4,3 9,1 0,8 6,8 1 0,4 3,6 1 2,6 1,8 6,3 0,0 0,2 2,9 3,9 1,5 0,4 1 2,4 IFP 0,0 9,6 1 6,9 8,1 5,2 0,6 7,9 4,8 7,7 3,3 2,7 6,4 0,6 0,0 3,8 1 0,2 2,0 4,1 6,0 HSP 0,0 2,3 7,9 1 3,2 6,2 0,7 6,2 1 0,2 2,9 1 2,6 2,1 5,3 0,0 0,0 2,6 3,4 1,6 0,6 2 2,1 - Ein Beispiel des Verfahrens ist schematisch in der beigefügten
1 gezeigt. Ultrafiltration wird als mögliche Komponente in jeder Reinigungsstufe betrachtet. Die Schlüsselkomponenten werden durch die folgenden Beispiele eines Proteinextraktionsverfahrens dargestellt. - Beispiele:
- Beispiel 1 Stufe 1, Verdauung
- Die Verdauungsstufe des Verfahrens beinhaltet die Verwendung von oxidativer Sulfitolyse, um Cystin in S-Sulfocystein innerhalb der Keratinquelle umzuwandeln.
- Beispiel 1a. Stufe 1, Verdauung
- Um das Keratin von 10 kg Wolle zu extrahieren, wurden zuerst 2 kg Kupfersulfatpentahydrat unter Verwendung eines Mischers mit hoher Scherung mit acht Litern von konzentriertem Ammoniak vermischt. Das Gemisch wurde mit Wasser auf 200 l verdünnt und 10 kg Wolle wurden zugegeben. Ungefähr 15 l Schwefelsäure (2 M) wurden zum gerührten Gemisch zugegeben, bis ein pH-Wert von 9,4 erreicht war. Wasserfreies Natriumsulfit (5,04 kg) wurde zugegeben und die Lösung gemischt, bis eine vollständige Auflösung aller Reagenzien stattgefunden hatte und sich der pH-Wert auf 9,5 stabilisierte. Die Endkonzentration des Kupfer(II)-ammoniakkomplexes war 0,04 M. Das Natriumsulfit hatte eine Endkonzentration von 0,2 M. Die Temperatur der Verdauungslösung wurde auf 20°C gehalten. Nach 24 Stunden von sanftem Bewegen wurde die faserförmige gallertartige Masse von erweichter Wolle filtriert. Das Filtrat wurde durch einen frischen Wollfilter geleitet, der den Kupferanteil in der Lösung von 1725 ppm auf 130 ppm verringerte, und weiter unter Verwendung von Purolite S930 IDA Ionenaustauschharz gereinigt, das unter sauren Bedingungen den Kupferanteil weiter auf 12 ppm verringerte. Frisches Wasser wurde zur erweichten Wolle zugegeben und das Gemisch wurde bewegt.
- Beispiel 1b. Stufe 1, Verdauung mit der Verwendung eines Tensids.
- In einer Variation von Beispiel 1a wurde die Verdauungslösung mit der Zugabe von 1% eines nicht-ionischen Tensids Triton X 100 hergestellt. Die Zugabe dieses Tensids führte zu einer Verzögerung der Freisetzung von löslichem Protein aus der Faser, was eine wirksamere Trennung des Proteins von den restlichen Reagenzien wie z. B. Kupfersalzen in der Extraktionslösung ermöglichte.
- Beispiel 1c. Stufe 1, Verdauung
- In einer Variation von Beispiel 1a geschieht die Verdauungsstufe in zwei Teilen. Im ersten Teil wird die Wolle mit Natriummetabisulfit bei einer Konzentration von 0,2 M bei pH 4,2 vorbehandelt. Nach der Entfernung der Wolle aus dieser Lösung und ohne Versuch, restliches Sulfit aus der Wolle zu entfernen, wurde die Wolle in eine Kupfertetramminhydroxid-Lösung bei der Konzentration und dem pH-Wert, die in Beispiel 1a beschrieben sind, für weitere 24 Stunden bei 20°C eingetaucht.
- Beispiel 2. Stufe 2, Extraktion.
- Beispiel 2a. Stufe 2, Serienextraktion.
- Nach der Vollendung von Stufe 1, die in den Beispielen 1 beschrieben ist, wurde das Gemisch für einen Zeitraum von 16 Stunden bewegt, bevor es homogenisiert wurde. Nach weiteren 4 Stunden Bewegen wurden die Feststoffe und die Lösung unter Verwendung eines zweistufigen Filtrationsprozesses, der ein Keildrahtsieb beinhaltete, gefolgt von einem Absetztank und einer Schleuderscheibenzentrifuge, getrennt. Die festen Phasen wurden in das Reaktionsgefäß zurückgeführt und Wasser wurde zugegeben, um ein Lauge-Wolle-Endverhältnis von 20:1 auf der Basis von ursprünglichen Wollfeststoffen zu ergeben. Nach 24 Stunden Bewegung oder kontinuierlicher Homogenisierung wurde das Gemisch durch Wiederholen des zweistufigen Filtrationsprozesses getrennt. Die festen Phasen wurden in das Extraktionsgefäß zurückgeführt und weiter verdünnt. Dieser Zyklus wurde 7 bis 12 mal wiederholt. Die flüssigen Phasen, die lösliche Proteine enthielten, wurden weiterverarbeitet, wie nachstehend in Beispiel 3 detailliert dargestellt.
- Beispiel 2b. Stufe 2, kontinuierliche Extraktion.
- Nach der Vollendung von Stufe 1 wurde das Gemisch verarbeitet, wie in Beispiel 2a beschrieben, außer dass der zweistufige Filtrationsprozess in einem kontinuierlichen Prozess stattfand, und Feststoffe und frisches Wasser wurden zum Reaktionstank mit einer Rate äquivalent zum Volumen des Tanks, das in 24 Stunden ersetzt wurde, zugegeben. Dieser Prozess wurde für 120 Stunden fortgesetzt.
- Beispiel 3. Verarbeitung von Proteinlösungen.
- Ultrafiltration kann an verschiedenen Punkten während der Verarbeitung von Proteinlösungen verwendet werden, um Lösungen zu konzentrieren und die Prozesse des Trocknens und Ionenaustauschs effizienter zu machen. Die Ultrafiltration kann vor irgendeinem in den folgenden Beispielen umrissenen Verarbeitungsschritt verwendet werden.
- Beispiel 3a. Verarbeitung von Proteinlösungen unter Verwendung von EDTA
- Die als Ergebnis der Stufe 2 hergestellte Lösung, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde weiterverarbeitet, um gereinigte lösliche Keratine zu isolieren. EDTA (0,2 M) wurde zur flüssigen Phase mit einer Rate von 25 ml pro Liter oder mit einer Rate, die geeignet ist, um alle in Lösung vorhandenen Kupferionen zu maskieren, wie durch Analyse der Lösung angegeben, zugegeben. Nach 1 Stunde Mischen wurde der pH-Wert des Filtrats unter Verwendung von Schwefelsäure auf 3,5 verringert.
- Der Proteinniederschlag wurde unter Verwendung eines Siebs isoliert und nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen. Das Protein, S-sulfoniertes Keratinzwischenfilamentprotein, wurde durch einen von drei Wegen, Gefriertrocknen, Wirbelschichttrocknen oder Sprühtrocknen, getrocknet, gefolgt von Auflösung mit verdünntem Natriumhydroxid. Das Filtrat nach der Proteinfällungsprozedur wurde unter Verwendung von Ultrafiltration weiterverarbeitet, um die Proteinkomponenten von den restlichen Reagenzien zu trennen. Das Retentat wurde sprühgetrocknet, um weiteres lösliches Protein, S-sulfoniertes Keratinprotein mit hohem Schwefelgehalt, zu isolieren. Das Permeat wurde, um Kupfer und EDTA aus dem Eluatstrom wiederzugewinnen, unter Verwendung von Ionenaustauschmedien weiterverarbeitet.
- Beispiel 3b. Verarbeitung der Proteinlösung unter Verwendung von Ionenaustauschmedien
- Die als Ergebnis von Stufe 2 hergestellte Lösung, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde weiterverarbeitet, um gereinigte lösliche Keratine zu isolieren. Die flüssige Phase wurde über Ionenaustauschharz wie z. B. das Chelatbildnerharz Purolite S930 IDA Ionenaustauschharz, das die Iminodiessigsäure-Funktionsgruppe enthielt, geleitet, um Kupferionen aus der Lösung zu entfernen. Nach dem Ionenaustausch wurde der pH-Wert des Filtrats unter Verwendung von Schwefelsäure auf 3,5 verringert und in einer identischen Weise zu der für Beispiel 3a beschriebenen weiterverarbeitet.
- 3c. Verarbeitung der Proteinlösung unter Verwendung von pH-Einstellung vor dem Ionenaustausch.
- Die als Ergebnis von Stufe 2 hergestellte Lösung, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde weiterverarbeitet, um gereinigte lösliche Keratine zu isolieren. Der pH-Wert der flüssigen Phase wurde unter Verwendung von Schwefelsäure auf 3,5 verringert. Der Proteinniederschlag wurde unter Verwendung eines Siebs isoliert, unter Verwendung von verdünntem Natriumhydroxid erneut gelöst und weiter mit entweder Zugabe von EDTA oder durch Leiten über eine Ionenaustauschsäule gereinigt. Nach der weiteren Reinigung wurde der pH-Wert der Lösung unter Verwendung von Schwefelsäure auf 3,5 verringert und das Protein wurde isoliert, wie in den früheren Beispielen beschrieben. Das Filtrat aus dem anfänglichen pH-Verringerungsschritt, das immer noch signifikante Mengen an löslichem Protein und anderen Reagenzien enthält, wurde durch Leiten über Ionenaustauschmedien gereinigt und sprühgetrocknet, um weiters lösliches Protein, S-sulfoniertes Keratinprotein mit hohem Schwefelgehalt, zu isolieren.
- Beispiel 4. Auflösung von Rückständen aus Stufe 2
- Der als Ergebnis von Stufe 2 isolierte Feststoffstrom kann durch einen Bereich von Verfahren weiterverarbeitet werden, um Keratinpeptide zu erzeugen. Der hohe Anteil an Sulfonierung des Rückstands macht es leicht für chemische und enzymatische Verdauung zugänglich, da die in der ursprünglichen Keratinquelle vorhandenen Disulfidbindungen, die gegen chemischen und enzymatischen Angriff beständig sind, weitgehend gespalten wurden.
- Beispiel 4a Auflösung von Rückständen unter Verwendung von Natriumsulfid
- Eine Natriumsulfidlösung (5 Gewichts-%) wird zu einem gleichen Volumen des festen Stroms aus Stufe 2 des Verfahrens zugegeben, welcher ungefähr 5% Feststoffe umfasst. Das Gemisch wird für 12 Stunden bewegt, nach welcher Zeit die Feststoffe durch Filtern und Zentrifugation entfernt werden und Schwefelsäure zur Proteinlösung zugegeben wird, um den pH-Wert auf den Bereich von 2 bis 3,5 zu senken. Der Niederschlag wird auf einem Sieb gesammelt und gründlich mit Wasser gewaschen.
- Beispiel 4b Auflösung von Rückständen unter Verwendung von Wasserstoffperoxid
- Wasserstoffperoxid (50%) wird zum Feststoffstrom von Stufe 2 in einem Anteil von 25–30 ml pro kg Keratinrückstand (der Keratinrückstand enthält ungefähr 5% Feststoffe) zugegeben. Dieser wird gemischt und 1 M Natriumhydroxid wird zugegeben, um einen pH-Wert im Bereich von 10 bis 13 zu erhalten. Das Gemisch wird für 24 Stunden sanft bewegt und das Protein und die Feststoffe durch den in Beispiel 2 beschriebenen zweistufigen Filtrationsprozess abgetrennt und das Protein durch Ansäuerung isoliert, wie in Beispiel 4a beschrieben. Alternativ wird die Proteinlösung über ein Ionenaustauschharz geleitet, dann angesäuert und der gefällte Feststoff gesammelt. Die angesäuerte Lösung kann dann vor dem Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen durch eine Ionenaustauschsäule geleitet werden, um ein weiteres proteinreiches Produkt zu sammeln.
- 4c Auflösung von Rückständen unter Verwendung von proteolytischen Enzymen
- Eine industrielle Subtilisin-Enzymzubereitung (eine Lösung, die 2,5% aktives Enzym enthält) wurde zum Feststoffstrom aus Stufe 2 in der Menge von 10 mg aktivem Enzym pro Gramm Keratinrückstand zugegeben. Der pH-Wert wurde mit Zugabe von Natriumhydroxid auf 9,5 gehalten und die Reaktion auf 60°C für 2 Stunden erhitzt. Die resultierende Proteinlösung wird aus Feststoffen isoliert und verarbeitet, wie in 4a beschrieben, oder vor und/oder nach Ansäuerung, wie in 4b beschrieben, durch Ionenaustauschharz geleitet.
- Folglich wird durch die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von löslichen Keratinderivaten bereitgestellt, das sowohl wirtschaftlich als auch umweltverträglich ist.
Claims (19)
- Verfahren zur Herstellung von Keratinderivaten mit hohem Molekulargewicht, welche eine ähnliche Größe aufweisen wie oder welche eine größere Größe aufweisen als das Keratinprotein, welches ursprünglich in der Keratinquelle exprimiert wurde, wobei das Verfahren eine erste Stufe eines Verdauungsschritts von Sulfonieren einer Keratinquelle durch oxidative Sulfitolyse, gefolgt von einer zweiten Stufe einer sich wiederholenden wässrigen Extraktion durch kontrolliertes schrittweises Waschen, welches die Trennung von löslichem und unlöslichem Keratin einbezieht, und einer anschließenden Rückextraktion des unlöslichen Keratins, einschließt, wobei ein S-sulfoniertes Keratinderivat mit hohem Molekulargewicht hergestellt wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste Stufe ohne die Verwendung eines chaotropen Mittels durchgeführt wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die erste Stufe unter pH-Wert-Bedingungen, welche die strukturelle Integrität des Proteins erhalten, durchgeführt wird.
- Verfahren wie in einem vorhergehenden Anspruch angegeben, wobei die oxidative Sulfitolyse ammoniakalische Kupferhydroxidlösung oder ein Thionat als das Oxidationsmittel und Sulfit verwendet.
- Verfahren wie in einem vorhergehenden Anspruch angegeben, wobei die zwei Stufen grenzflächenaktive Mittel, Wärme, Bewegung und Homogenisierung zur Kontrolle der Verdauungsgeschwindigkeit in der ersten Stufe und der Extraktion in der zweiten Stufe verwenden.
- Verfahren wie in Anspruch 4 angegeben unter Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln, Wärme, Bewegung und Homogensierung zur Kontrolle der Freisetzungsgeschwindigkeit der restlichen Reagenzien und des löslichen Proteins, wobei eine Abtrennung des S-sulfonierten Keratinderivats ermöglicht wird.
- Verfahren wie in einem vorhergehenden Anspruch angegeben, wobei ein gallertartiges Keratinsubstrat von der Lösung des S-sulfonierten Keratins, welches durch das wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 angegebene Verfahren hergestellt wurde, abgetrennt wird und wobei die Lösung des S-sulfonierten Keratinderivats durch die Verwendung eines sanften Schwerkraftfiltrationssystems, gefolgt von Fliehkraftabtrennung behandelt wird.
- Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 angegeben, welches eine Kombination von technischen Lösungen verwendet, um eine kontinuierliche Herstellung der S-sulfonierten Keratinderivate zu ermöglichen.
- Verfahren wie in Anspruch 1 angegeben, wobei die Lösung des S-sulfonierten Keratins unter Verwendung von Chelatbildnern, wie EDTA, gereinigt wird, um Metallionen, wie Kupfer, zu maskieren.
- Verfahren wie in Anspruch 1 angegeben, wobei die Lösung, welche S-sulfonierte Keratinderivate enthält, unter Verwendung von Ionenaustauschmedien gereinigt wird, um restliche Reagenzien, einschließlich Metalle wie Kupfer, zu entfernen.
- Verfahren wie in Anspruch 10 angegeben, wobei die Lösung vor einer Ionenaustauschbehandlung durch die Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen oder dergleichen konzentriert wird.
- Verfahren wie in Anspruch 11 angegeben, wobei die Reagenzien wie Kupfer isoliert und in anschließenden Verfahren wiederverwendet werden.
- Verfahren wie in einem vorhergehenden Anspruch angegeben, wobei S-sulfonierte Keratinzwischenfilamentproteine aus der Lösung der durch das Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch hergestellten Keratinderivate durch isoelektrische Fällung bei saurem pH-Wert isoliert werden.
- Verfahren wie in Anspruch 9 oder 10 angegeben, wobei S-sulfonierte Keratinproteine mit hohem Schwefelgehalt durch Sprühtrocknen der Lösung der S-sulfonierten Keratinderivate, welche wie in den Ansprüchen 9 oder 10 beansprucht gereinigt wurden, nachdem die Zwischenfilamentproteine durch das Verfahren wie in Anspruch 13 beansprucht entfernt worden waren, hergestellt werden.
- Verfahren wie in den Ansprüchen 1 bis 7 angegeben, wobei lösliche Keratinpeptide durch die Einwirkung von Wasserstoffperoxidlösungen auf den gallertartigen Rückstand, der durch das Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 angegeben hergestellt wurde, hergestellt werden.
- Verfahren wie in den Ansprüchen 1 bis 7 angegeben, wobei lösliche Keratinpeptide durch die Einwirkung von Natriumsulfidlösungen auf den gallertartigen Rückstand, der durch das Verfahren wie in den Ansprüchen 1 bis 7 angegeben hergestellt wurde, hergestellt werden.
- Verfahren wie in den Ansprüchen 1 bis 7 angegeben, wobei lösliche Keratinpeptide durch die Einwirkung von proteolytischen Enzymen, wie jene der Subtilisin-, Papain- oder Trypsinfamilien, auf den gallertartigen Rückstand, der durch das Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 angegeben hergestellt wurde, hergestellt werden.
- Verfahren wie in Anspruch 4 angegeben, wobei durch das Verfahren hergestellte, an Kupfer reiche Lösungen unter Verwendung von Wolle als ein Filtermedium behandelt werden, um Kupfer zu binden und es aus der Lösung zu entfernen.
- Verfahren wie in Anspruch 18 angegeben, wobei die durch das in Anspruch 18 angegebene Verfahren hergestellte, mit Kupfer beladene Wolle in einem anschließenden Proteinextraktionsverfahren behandelt wird.
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