CN1298733C - 制造可溶性角蛋白衍生物 - Google Patents

Abstract

一种对蛋白质的结构完整性损害极小或无损害的制备高分子量可溶性蛋白质的方法。从所用试剂的费用并可循环使用一些试剂而言，这种方法在经济的和环上是可接受的，且该方法适合大规模制造可溶性蛋白质。所述方法包括使用氧化亚硫酸盐解的第一阶段以及随后使用温和条件提取可溶性蛋白质的第二阶段。以羊毛作为蛋白质原料时，该方法可制得可溶性的角蛋白，它被分级成S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白和S-磺化的角蛋白高硫蛋白。

Description

制造可溶性角蛋白衍生物

发明领域

本发明涉及用一种经济且环境上可接受的方法从动物原料如羊毛、毛发、角、蹄、羽毛和鳞片制造角蛋白衍生物的方法，并涉及由此制得的一系列角蛋白衍生物产品。一些角蛋白衍生物是可溶的并可用于制造许多生物高分子物质。

发明背景

角蛋白是一类广泛出现在生物结构中的结构蛋白，尤其是在高等脊椎动物的上皮组织中。角蛋白可分成两大类，软角蛋白(soft keratin)(出现在皮肤和少数其它组织中)和硬角蛋白(hard keratin)，后者形成甲、爪、毛发、角、羽毛和鳞片。

硬角蛋白的韧性和不溶性使其在许多生物系统中发挥基础性的结构作用，这也是许多目前来自合成聚合物的工业和消费材料所需要的特性。除了具有杰出的物理特性，作为蛋白质，角蛋白是具有高度化学官能性的物质，因而显示出许多合成材料无法获得的特性。因此，角蛋白很适合于发展具有高价值、适当市场需求的产品。角蛋白也是由有持续的资源制造的环境上可接受的聚合物，因此其环境上的得益超过合成物质。顺应从可再生原料开发以可持续的最常见的制造的物质的全球趋势，已经用角蛋白制造了许多物质，其中工艺过程为角蛋白膜的形式。

在从角蛋白制造生物高分子物质的新工业的核心中，必需有一个经济上可行，从环境上看可持续获得的原料中提取角蛋白，并制造出稳定的、多用途的产品的工艺过程。以进行蛋白质分析和特性为目的，设计了可保持各种蛋白质完整性的提取角蛋白迄今为止所用的方法，从经济和环境观点而言，这种方法在工业规模上不可行。而迄今为止所用经济有效地溶解角蛋白的方法对蛋白质有显著的降解作用，因此溶解的蛋白质几乎不具有作为生物高分子的角蛋白所需的理化特性，如重新构成坚韧物质的能力。

本发明的目的是寻求克服已知方法的缺点一些途径，或至少为公众提供一种有用的选择。

在本发明至少一个实施方案中，提供了一种经济且环境上可接受的溶解角蛋白的方法，该方法在溶解过程中保持了蛋白质的结构完整性和化学官能性，从而得到了稳定的、多用途的为开发生物高分子物质的角蛋白衍生物产品。

发明概述

根据本发明的第一个方面，提供了制造高分子量的稳定的可溶性角蛋白衍生物的溶解方法，所述分子量接近或大于作为角蛋白质原料的蛋白质的分子量，这种方法对组成蛋白质的结构完整性很小或没有损害。溶解过程发生在两个阶段。

根据本发明优选的一个方法，提供了制造高分子量的角蛋白衍生物的方法，该方法包括通过氧化亚硫酸盐解使角蛋白质原料S-磺化的第一消化步骤阶段以及随后用水有控制的洗涤以得到高度S-磺化的角蛋白衍生物的第二提取步骤阶段。

高度磺化的角蛋白从固体状态转变成溶液不需要使用离液剂，而只需用水通过有控制的逐步，洗涤磺化的角蛋白以便从提取程序中洗去残留的化学试剂，并改变提取液的离子强度。

第一阶段包括氧化亚硫酸盐解以将蛋白质中的胱氨酸基团转化成S-硫代半胱氨酸，它采用廉价的试剂工业上可接受的浓度进行磺化(如亚硫酸钠)和氧化(如、氢氧化铜铵)。

根据另一方面，本发明提供了从按上述方法制造的S-磺化的角蛋白溶液中分离凝胶状角蛋白产品的方法，其中所述S-磺化的角蛋白衍生物溶液用温和的重力进料过滤系统(gravity fed filtration system)处理，然后分离。优选的分离方法是离心。

根据本发明另一方面，在除去所述凝胶状角蛋白后使剩余的液流通过冲刷过的羊毛(scoured wool)处理，这样可从溶液中除去残余的化学物质并为随后的蛋白质提取过程准备羊毛。

将胱氨酸基团转化后，该方法的第二阶段是用水进行大量稀释从而使固体或凝胶状的高度S-磺化的角蛋白衍生物变成溶液。可通过加热、表面活性剂、轻微搅拌和剧烈切碎或均质来控制溶解的速度和程度。通过控制溶解速度可分离出反应液，例如，如果使用氧化铜就制得了富含铜但含有极少或不含溶解的蛋白质的反应液，或富含蛋白质但含有很少或不含铜的溶液。

根据本发明的另一方面，可用任何一种或多种方法来处理来自第二处理阶段的液流，该液流含有残留的化学物质如硫酸铜和亚硫酸铜以及S-磺化的角蛋白衍生物，这样可循环使用溶液中的试剂并分别分离纯化的S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白(SIFP)和S-磺化的角蛋白高硫蛋白(SHSP)。这是通过使用螯合剂如乙二胺四乙酸，或螯合离子交换树脂如含有亚氨基二乙酸官能团的树脂，并用等电点沉淀以分离各种蛋白质实现的。可在处理的几个阶段使用超滤以提高除去试剂或蛋白质分离的效率。可在沉淀后用稀酸、水或螯合剂洗涤蛋白质衍生物以进一步减少蛋白质产物中的金属杂质。一旦分离，可用各种方法，如流化床、喷雾或冷冻干燥，将蛋白质产物干燥。

本发明的另一方面是通过使用其它试剂，如过氧化氢、硫化钠或蛋白水解酶类，进一步处理经所述两阶段亚硫酸盐解处理后未溶解的剩余的角蛋白，以制造角蛋白肽。

本发明的另一方面是从天然原料中大规模回收蛋白质的方法，包括用一种处理方法处理所述天然蛋白质原料，该方法足以使至少一些蛋白质溶于水，然后分离水溶性蛋白质。

本发明的另一方面是从天然原料中大规模回收蛋白质的装置，容纳并处理大量天然蛋白质原料的处理容器，该处理方法足以使至少一些装在所述进料装置中的蛋白质溶于水，以及随后用来分离水溶性蛋白质的分离装置。

本发明的另一方面是从蛋白质混合物中有选择地溶解含有多个二硫键的蛋白质的方法，所述方法包括将所述蛋白质混合物进行氧化亚硫酸盐解以制得可溶的S-磺化的蛋白质级分。所述氧化亚硫酸盐解在没有离液剂时更好实现，且对蛋白质的结构完整性损害极小或没有损害。

本发明的另一方面是一种对蛋白质的结构完整性损害极小或没有损害的从不纯的蛋白质原料中获得纯化的蛋白质的方法，所述方法包括在没有离液剂时用一种处理方法处理所述蛋白质原料，该方法足以使至少一些蛋白质溶于水，然后分离水溶性蛋白质。

发明详述

以上各个方面构成了整个处理过程，该过程如附图1所示。

所述处理方法用来制备高度磺化的角蛋白衍生物并可用于任何角蛋白原料，如动物的毛、毛发、角、蹄、羽毛或鳞。同时，对不同的角蛋白原料采用该方法可得到结构和性质不同的可溶性角蛋白，溶解过程的基本步骤，其中将胱氨酸转化成s-硫代半胱氨酸，同样很好适用于所有含有角蛋白的物质。

该方法可在两个阶段中表达。

阶段1，包括将胱氨酸转化成S-硫代半胱氨酸，在氧化亚硫酸盐解处理中进行。在可通过使用磺化剂和氧化剂实现，磺化剂如亚硫酸钠或偏亚硫酸氢钠，它将胱氨酸不对称地裂解成半胱氨酸和S-硫代半胱氨酸，氧化剂可将磺化中产生的半胱氨酸转变成胱氨酸。通过胱氨酸进一步磺化可实现将所有的胱氨酸转化成S-硫代半胱氨酸。

可以使用的氧化剂包括连四硫酸钠、亚碘酰苯甲酸盐和氢氧化铜铵。在本发明优选的实施方案中，所用磺化剂是浓度为0.02M-0.2M的亚硫酸钠，所用氧化剂为浓度为0.02M-0.08M的氢氧化铜铵，后者由硫酸铜和氨水混合产生。

用来溶解角蛋白方法的第一阶段是将角蛋白原料在一种溶液或一连串溶液中浸泡，如浸泡24小时，以将胱氨酸转化成S-硫代半胱氨酸，浸液与羊毛的比例(体积：重量)为5∶1至50∶1。

在本发明另一个实施方案中，所用磺化剂是浓度为0.1M-0.5M的偏亚硫酸氢钠，保持酸性pH。在该实施方案中，将羊毛从含有偏亚硫酸氢钠的溶液中取出，然后加到含有浓度为0.02M-0.08M的铜铵复合物的溶液中。

上述与使用氧化亚硫酸盐解步骤有关的工作需要使用高浓度的离液剂，如尿素或盐酸胍，以使所述角蛋白原料膨胀和促进溶解角蛋白。这一步骤是昂贵的且无法用于工业领域。上述与使用以铜作为氧化剂的氧化亚硫酸盐解有关的工作是在对蛋白质的完整性有损害的温度和pH条件下进行的，这会使胱氨酸大量转化成羊毛硫氨酸。

上述处理方法的第二阶段包括将高度磺化的角蛋白从固体状态转变成溶液，它不使用离液剂并在能保持蛋白质结构完整性的温度和pH条件下进行，用水通过有控制的逐渐洗涤磺化的角蛋白以洗去提取过程的残余化学试剂并改变提取液的离子强度。这种作用的组合导致将高度磺化的角蛋白从固体状态转化成水溶液。在优选的方法中，反应体积每12-48小时更换一次，无论在间歇过程还是连续过程中。

可通过使用表面活性剂以及加热、搅拌和均质磺化的角蛋白等操作来控制溶解速度和程度。本发明的一个特点是使用这些因素来控制提取速度。因此，高度S-磺化的角蛋白可被保留在固体状态并从用于磺化步骤的含有大量化学物质的提取液中分离。优选的处理方法使用了非离子表面活性剂，如重量比为0.1％-5％的Triton X 100，并将温度保持在15℃-50℃。

当使用铜基氧化物时，本发明的一个优点是可将这种富含铜的提取液重复用于以后的提取过程，这可大大降低该方法的费用和对环境的影响。重复使用这种富含铜的溶液可能部分是因为活性铜物质通过空气氧化的再生。一种方法，其中富含铜的溶液可有效地重复使用，是使溶液流过羊毛。羊毛结合溶液中的铜，如果将此羊毛用于以后的提取步骤，随后的提取步骤中对铜的需求就会减少。用这种方法，在处理富含铜的提取液时“羊毛滤器(羊毛滤器)”可作为关键步骤使用，它减少了随后对流出液处理的需要以及对随后的处理中需加入的铜的需求。在典型的处理方法中，来自阶段1的液流大约含有1800-1500ppm(百万分之一)铜，通过羊毛滤器后这一值被降低至约400-300ppm。

该方法的第一阶段以及用于该法对试剂的回收如附图1所示。

在S-磺化和均质后所述角蛋白原料变成了一种凝胶状的膨松的纤维物质。

本发明的另一个优点是从溶液中分离出固体状态的高度S-磺化的角蛋白衍生物，所述溶液或者含有提取过程所用的化学物质或者含有溶于溶液的角蛋白。这种分离通过采用温和的、经细网筛的重力过滤，然后用滤液与微粒离心分离可有效地实现。

对于金属离子，尤其是作为提取加工一部分的铜离子，可用离子交换介质，尤其是含有已知对二价金属离子具有高度亲和力的亚氨基二乙酸官能性的那些介质，来纯化高度S-磺化的角蛋白衍生物溶液。这种离子交换介质可以是以装填的树脂柱的形式存在使蛋白质溶液从其中通过，或者可以另外形成电化学电池的一部分，其中通过使用施加的电压和包含可通透性膜的系统从离子交换介质中回收铜。

一旦高度S-磺化的角蛋白衍生物溶于溶液，特定的蛋白质，例如S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白就可以容易地通过等电点沉淀分离，所述等电点沉淀在pH4或以下进行，采用酸如硫酸、盐酸、柠檬酸或醋酸，优选使用硫酸。本发明的一个优点是，在等电点沉淀之前通过使用上述离子交换介质或在蛋白质溶液中加入螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)将铜和其它金属杂质与蛋白质的结合最小化。在优选的实施例中，于阶段2的液流中加入EDTA(0.2M)以每升25ml的速度，或以合适的速度加入，以螯合在溶液中所有存在的经溶液分析确定的铜离子，一旦经沉淀分离后，还可用稀酸溶液或螯合剂(如EDTA)溶液或水洗涤蛋白质以进一步减少金属杂质。

沉淀和洗涤后，可用干燥法，包括室温下的空气流，如使用流化床干燥器，分离出稳定的干燥的分离的蛋白质。或者，可用冷冻干燥器将产品干燥。干燥的蛋白质产品含有S-磺酸形式的胱氨酸基团，因此蛋白质只在碱如氢氧化钠或氢氧化铵存在时可溶。这些过程以干燥列在附图1中。

等电点沉淀后对留在溶液中的高度可溶的角蛋白衍生物，就羊毛而论主要是来自羊毛纤维中的高硫基质蛋白(matrix protein)(？)，通过超滤它可以稳定的形式从溶液中分离，以除去非蛋白质类的物质如残余的铜或EDTA，然后进行喷雾干燥。

本发明的一个特点是根据它们在溶液中的特性联合使用等电点沉淀和超滤然后进行喷雾干燥以分离高度S-磺化的角蛋白。如果是羊毛角蛋白，这可从高硫基质蛋白类中有效地分离出低硫中间体丝状蛋白类，这样就得到了具有不同化学性质的两种产品。

本发明的一个特点是通过在碱存在时溶解S-磺酸形式的角蛋白并将所得溶液喷雾干燥以制造稳定的水溶性的高度S-磺化的角蛋白衍生物。

本发明的一个特点是在连续、半连续或间歇式加工过程中联合使用工程元件以溶解角蛋白并从溶液中分离S-磺化的角蛋白。工程元件的联合和操作单元详见图1。

本发明的一个优点是从加工过程的反应混合物和流出液中回收并重复使用铜。可用电化学方法回收铜，包括使用选择性透性膜以便在电化学沉淀之前从EDTA中分离铜离子。或者，可使用铜-特定离子交换树脂形式的固定化的结合剂以从流出液中除去铜。用这些方法除去的铜可重复使用，因此可降低该方法对环境的影响。

使用交换介质和/或螯合剂的过程以纯化列在附图1中。

本发明的另一个优点是对提取步骤后仍为固体状态的残余角蛋白的进一步处理。这种功能化的角蛋白是高度S-磺化的，因此天然角蛋白中存在的使其可抵抗化学或酶攻击的二硫键已被打断，所以用其它提取方法就容易消化这种角蛋白。例如，可通过处理这种强氧化剂如过氧化氢的碱性溶液中对残余角蛋白作用制备富含角蛋白肽的溶液，碱性条件下每千克角蛋白残余物中有10-100ml 50％的过氧化氢。所述角蛋白残余物中约含5％固体物质。或者，可在角蛋白残余物中加入浓度为0.5％-15％的强还原剂如硫化钠溶液以制备富含角蛋白肽的溶液。或者可使用蛋白水解酶类，如枯草菌素蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，使用量为每克角蛋白残余物用0.1mg-20mg酶，在温度和pH适合于专一酶条件下很容易消化残余的角蛋白和制造富含角蛋白肽的溶液。所有这些方法都可制得富含角蛋白肽的溶液，可用对来自上述阶段2的液流类似的方法进行处理，即使用离子交换介质，调节pH并干燥(如图1所示的纯化和干燥)，以制造角蛋白肽固体。用这种方法消化角蛋白残余物可使整个过程造成的角蛋白浪费最小，并可确保最大限度地利用角蛋白原料中的角蛋白。

加工过程所得的两种完整的蛋白质产品是S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白和S-磺化的角蛋白高硫蛋白。采用还原/烷化法，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析法来分析通常用这种方法制得的S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白，结果表明分子量分布主要在30-60kD(中间体丝状蛋白)，含有少量10kD的蛋白质(高甘氨酸高酪氨酸的蛋白质)。表1给出了该产品的氨基酸组成，它典型的表示为羊毛角蛋白中间体丝状蛋白。在还原/烷化过程后用SDS-PAGE分析S-磺化的角蛋白高硫蛋白，结果表明分子量主要分布在15-20kD。表1给出了该产品的氨基酸组成，它典型的表示为羊毛角蛋白高硫蛋白。

	Cya	Asp	Glu	Ser	Gly	His	Arg	Thr	Ala	Pro	Tyr	Val	Met	Lan	Ile	Leu	Phe	Lys	Cys
																				SIFP	0.4	7.9	15.4	10.9	8.1	0.9	7.9	6.5	7.5	5.4	1.1	6.5	0.2	0.2	3.7	8.9	2.5	2.1	4.2
SHSP	1.9	2.6	8.6	14.3	9.1	0.8	6.8	10.4	3.6	12.6	1.8	6.3	0.0	0.2	2.9	3.9	1.5	0.4	12.4
																				IFP	0.0	9.6	16.9	8.1	5.2	0.6	7.9	4.8	7.7	3.3	2.7	6.4	0.6	0.0	3.8	10.2	2.0	4.1	6.0
HSP	0.0	2.3	7.9	13.2	6.2	0.7	6.2	10.2	2.9	12.6	2.1	5.3	0.0	0.0	2.6	3.4	1.6	0.6	22.1

表1：S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白(SIFP)、S-磺化的角蛋白高硫蛋白(SHSP)、中间体丝状蛋白(IFP)就高硫蛋白(HSP)的氨基酸组成(后两者由Gillespie和Marshall提供，羊毛和毛发蛋白质的差异(Variability in theproteins of wool and hair)，Proc.Sixth Int.Wool Text.Res.Conf.，Pretoria，2，67-77，1980)。所有残基以mol％表示。在还原和烷化后，将S-硫代半胱氨酸、胱氨酸和半胱氨酸作为S-羧甲基半胱氨酸测量。

附图1显示了该方法的一个例子。超滤且在各个纯化阶段都可用的构件。以下蛋白质提取过程的实施例叙述了关键步骤。

实施例：

实施例1阶段1，消化

该方法的消化阶段包括采用氧化亚硫酸盐解以在角蛋白原料中将胱氨酸转化成S-硫代半胱氨酸。

实施例1a.阶段1，消化

为从10kg羊毛中提取角蛋白，首先用高剪切混合机(high shear mixer)将2kg五水硫酸铜与8升浓缩的氨水混合。用水将混合物稀释到200升并加入10kg羊毛。在混合物中边搅拌边加入约15升硫酸(2M)直到pH为9.4。加入无水亚硫酸钠(5.04kg)并将溶液混合直到所有的试剂完全溶解且pH稳定在9.5。铜氨复合物的最终浓度为0.04M。亚硫酸钠的最终浓度为0.2M。消化溶液的温度保持在20℃。轻微搅拌24小时后过滤出软化的羊毛的纤维凝胶状物质。使滤液流过新鲜的羊毛滤器，这使溶液中的铜水平从1725ppm降至130ppm，并用Purolite S930 IDA离子交换树脂，在酸性条件下进一步纯化将铜水平降至12ppm。在软化的羊毛中加入新鲜的水并搅拌混合物。

实施例1b.阶段1，用表面活性剂进行消化

在实施例1a的变动上，在消化液中加入了1％的非离子表面活性剂Triton X100。加入这种表面活性剂延迟了可溶性蛋白质从纤维中的释放，这样可更加有效地将蛋白质与残余试剂(如提取液中的铜盐)分离。

实施例[1C.]阶段1，消化

在实施例1a的变动上，消化阶段分两部分完成。在第一部分中，用浓度为0.2MpH4.2的偏亚硫酸氢钠预处理羊毛。然后从此溶液中除去羊毛，无需从羊毛中除去残余的硫化物，将羊毛在20℃的氢氧化铜铵溶液中再浸泡24小时，该溶液的浓度和pH如实施例1a所示。

实施例2.阶段2，提取

实施例2a.阶段2，分批提取

按实施例1所述完成阶段1后，将混合物再搅拌16小时，然后均质。再搅拌4小时后用两阶段过滤法将固体和溶液分离，其中包括楔形丝织筛(wedge wirescreen)，然后是澄清槽和转盘式离心。将固相返回反应容器并加入水以使最终液体与羊毛的比例为20∶1(以开始的羊毛固体为基础)。搅拌或连续均质24小时后重复两阶段过滤法以将混合物分离。将固相返回提取容器并进一步稀释。该循环重复7-12次。将含有可溶性蛋白质的液相按以下实施例3所述的方法进一步处理。

实施例2b.阶段2，连续提取

完成阶段1后，按实施例2a所述处理混合物，不同之处在于上述两阶段过滤法以连续处理进行，并以一定的速度在反应容器中加入固体和新鲜的水，该速度等于容器体积除以24小时。该过程持续120小时。

实施例3.处理蛋白质溶液

在处理蛋白质溶液时可在几个时刻使用超滤以浓缩溶液并使干燥和离子交换更加有效。可在以下实施例列出的任何处理步骤之前使用超滤。

实施例3a.用EDTA处理溶液

如实施例2所述，进一步处理阶段2所得溶液以分离纯化的可溶性角蛋白。以每升25ml的速度或适合螯合溶液中所有铜离子的速度在液相中加入EDTA(0.2M)，所述铜离子的量通过溶液分析确定。混合1小时后，用硫酸将滤液的pH降至3.5。

用筛子分离蛋白质沉淀，然后依次用稀硫酸和水洗涤。用以下三种途径之一将蛋白质-S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白干燥：冻干、流化床干燥或喷雾干燥，然后用稀释的氢氧化钠溶解。进行蛋白质沉淀后将滤液超滤，将蛋白质成分与残余的试剂分离。将保留物喷雾干燥以进一步分离可溶性蛋白质-S-磺化的角蛋白高硫蛋白。进一步进行渗透处理以用离子交换介质从流出液中回收铜和EDTA。

实施例3b.用离子交换介质处理蛋白质溶液

如实施例2所述，进一步处理阶段2制得的溶液以分离纯化的可溶性角蛋白。使液相通过离子交换树脂，如含有亚氨基二乙酸官能团的螯合树脂Purolite S930IDA离子交换树脂，以除去溶液中的铜离子。离子交换后，用硫酸将滤液的pH降至3.5，然后用与实施例3a所述同样的方法进行处理。

3c.在离子交换之前调节pH以处理蛋白质溶液

如实施例2所述，进一步处理阶段2制得的溶液以分离纯化的可溶性角蛋白。用硫酸将液相的pH降至3.5。用筛子分离蛋白质沉淀，用稀释的氢氧化钠重溶，并加入EDTA或通过离子交换柱进一步纯化。进一步纯化后，用硫酸将溶液的pH降至3.5并按上述实施例的描述分离蛋白质。最初降低pH后所得的滤液，其中仍含有大量可溶性蛋白质和其它试剂，被通过离子交换介质纯化并喷雾干燥以进一步分离可溶性蛋白质-S-磺化的角蛋白高硫蛋白。

实施例4.溶解阶段2的残余物

可用许多方法进一步处理阶段2分离的固体流以制造角蛋白肽。将残余物高水平地磺化将利于化学消化和酶消化，这是因为原始角蛋白原料中可抵抗化学和酶攻击的二硫键被大部分断裂。

实施例4a用硫化钠溶解残余物

在得自处理阶段2的含有约5％的固体，固体流中加入等体积的硫化钠溶液(5％，按重量计)。

将混合物搅拌12小时，然后通过过滤和离心除去固体，并在蛋白质溶液中加入硫酸以将pH降至2-3.5。用筛子收集沉淀并用水充分地洗涤。

实施例4b用过氧化氢溶解残余物

以每千克角蛋白残余物(角蛋白残余物含有约5％固体)25-30ml的水平在来自阶段2的固体流中加入过氧化氢(50％)。将其混合并加入1M氢氧化钠以使pH变成10-13。将混合物轻微搅拌24小时，用实施例2所述两阶段过滤法分离蛋白质和固体并用实施例4a所述酸化法分离蛋白质。或者，使蛋白质溶液通过离子交换树脂，然后进行酸化并收集固体沉淀。然后使酸化溶液通过离子交换柱，然后冻干或喷雾干燥以进一步收集富含蛋白质的产品。

4c用蛋白水解酶类溶解残余物

在来自阶段2的固体流中加入工业用枯草杆菌蛋白酶制剂(含有2.5％活性酶的溶液)，其量为每克角蛋白残余物10mg活性酶。加入氢氧化钠将pH保持在9.5并将反应物在60℃加热2小时。将所得蛋白质溶液与固体分离并按实施例4a所述进行处理，或如实施例4b所述在酸化前和/或酸化后使其通过离子交换树脂。

因此，本发明提供了制造可溶性角蛋白衍生物的方法，该方法不仅经济而且是环境上可接受的。

已经描述了本发明特定的实施例，可在不背离所附权利要求的范围的情况下进行改进和修饰。

Claims (26)

1.制造高分子量的角蛋白衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括通过氧化亚硫酸盐解使角蛋白质原料磺化的第一消化步骤阶段以及随后重复含水提取的第二阶段，包括分离可溶和不可溶的角蛋白及其后再提取不可溶的角蛋白，由此可制得高度S-磺化的角蛋白衍生物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一阶段是在不使用离液剂时进行的。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一阶段是在保持蛋白质结构完整性pH的条件下进行的。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化亚硫酸盐解用氢氧化铜铵或硫代硫酸盐作为氧化剂和亚硫酸盐。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两个阶段使用表面活性剂、加热、搅拌和均质以控制第一阶段的消化速度和第二阶段的提取。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用表面活性剂、加热、搅拌和均质以控制残余试剂和可溶性蛋白质的释放速度从而提供分离高度S-磺化的角蛋白衍生物。

7.从用权利要求1-6中任一项所述方法制得的S-磺化的角蛋白溶液中分离凝胶状角蛋白物质的方法，其特征在于，所述S-磺化的角蛋白衍生物溶液用用温和的重力进料过滤系统处理，然后离心分离。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，它联合使用工程溶液以提供连续制造S-磺化的角蛋白衍生物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S-磺化的角蛋白溶液用螯合剂纯化以螯合金属离子。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述螯合剂是EDTA，所述金属离子是铜。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有S-磺化的角蛋白衍生物的溶液用离子交换介质纯化以除去残余试剂。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述试剂是铜。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述溶液在离子交换处理之前通过使用超滤膜或类似方法被浓缩。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述试剂在随后的处理中被分离和重新使用。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述试剂是铜。

16.用权利要求1-15中任一项所述方法制得的高度S-磺化的角蛋白衍生物溶液。

17.从权利要求16所述的角蛋白溶液中分离高度S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白的方法，其特征在于，所述高度S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白在酸性pH下通过等电点沉淀分离。

18.如权利要求17所述的分离高度S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白的方法，其特征在于，它通过在EDTA存在时S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白的溶解在碱中，随后在酸性pH下沉淀而纯化。

19.用权利要求17所述方法制得的高度纯化的蛋白质样产品。

20.将权利要求19所述聚合产品的水溶液喷雾干燥而制得的水溶形式的S-磺化的角蛋白中间体丝状蛋白。

21.制造高度S-磺化的角蛋白高硫蛋白质的方法，所述蛋白质是通过喷雾干燥按权利要求9或11所述方法纯化的S-磺化的角蛋白衍生物溶液，然后按权利要求17所述方法除去中间体丝状蛋白后而制得的。

22.用权利要求21所述方法制得的蛋白质样产品。

23.通过使过氧化氢溶液、硫化钠溶液、或枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶类作用于凝胶状残余物来制造可溶性角蛋白肽的方法，所述凝胶状残余物是用权利要求1-7中任一项所述方法制造的。

24.用权利要求23所述方法制得的蛋白质样产品。

25.处理用权利要求4所述方法制得的富含铜的溶液的方法，其特征在于，羊毛被用作过滤介质以结合铜并从溶液中将其除去。

26.用来处理用权利要求25所述方法制得的吸满铜的羊毛的随后的蛋白质提取方法。