ES2292795T3 - Produccion de derivados de queratina solubles. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de derivados de la queratina de alto peso molecular que son de tamaño similar, o de mayor tamaño, que la proteína queratina originalmente expresada en la fuente de queratina, incluyendo el procedimiento una primera etapa de fase de digestión de sulfonación de una fuente de queratina mediante sulfitólisis oxidativa seguida de una segunda etapa de extracción acuosa repetitiva mediante un lavado gradual controlado que implica la separación de la queratina soluble de la insoluble y la posterior retroextracción de la queratina insoluble, por lo que se produce un derivado de la queratina S-sulfonada de alto peso molecular.
Description
Producción de derivados de queratina
solubles.
Esta invención se refiere a un procedimiento
para preparar derivados de la queratina a partir de fuentes animales
tales como lana, pelo, cuernos, pezuñas, plumas y escamas mediante
un procedimiento económico y medioambientalmente aceptable, y a una
serie de productos derivados de la queratina producidos mediante
éste. Algunos de los derivados de la queratina son solubles y se
pueden utilizar en la producción de una serie de materiales
biopoliméricos.
Las queratinas son una clase de proteínas
estructurales ampliamente representadas en las estructuras
biológicas, especialmente en los tejidos epiteliales de los
vertebrados superiores. Las queratinas se pueden dividir en dos
clases principales: las queratinas blandas (que se producen en la
piel y en otros pocos tejidos) y las queratinas duras, que forman
el material de uñas, garras, pelo, cuerno, plumas y escamas.
La dureza y la insolubilidad de las queratinas
duras, que les permiten desempeñar una función estructural
fundamental en muchos sistemas biológicos, también son
características deseables en muchos de los materiales para el
consumidor e industriales derivados actualmente a partir de
polímeros sintéticos. Además de poseer unas excelentes propiedades
físicas, la queratina, al ser una proteína, es un material con un
alto grado de funcionalidad química y, en consecuencia, muestra
muchas propiedades que los materiales sintéticos no pueden
alcanzar. Por lo tanto, la queratina es idónea para el desarrollo de
productos con aplicaciones en el mercado específico y de gran
valor. La queratina también es un polímero medioambientalmente
aceptable, producido a partir de una fuente sostenible y, por lo
tanto, posee beneficios medioambientales frente a los materiales
sintéticos. Siguiendo la tendencia global de desarrollar materiales
a partir de fuentes renovables producidas en un procedimiento
sostenible, se han producido una serie de materiales a partir de la
queratina, la mayoría habitualmente en forma de películas de
queratina.
En en centro de una nueva industria que produce
materiales biopoliméricos a partir de la queratina, es esencial
tener un procedimiento para extraer la queratina a partir de una
fuente que sea económicamente viable, sostenible desde una
perspectiva medioambiental y que produzca un producto estable y
versátil. Los métodos utilizados hasta la fecha para extraer la
queratina y que mantienen la integridad de cada una de las proteínas
se han diseñado con el propósito de analizar y caracterizar
proteínas y, por lo tanto, no son viables a escala industrial,
desde un punto de vista económico y medioambiental. Los métodos
utilizados hasta la fecha para disolver económicamente la queratina
tienen unos efectos significativos de degradación de la proteína y,
por lo tanto, la proteína disuelta conserva pocas de las
propiedades fisicoquímicas que marcan la idoneidad de la queratina
como un biopolímero, tales como la capacidad para reconstituir
materiales duros.
Es un objeto de la invención solventar de algún
modo las desventajas con procedimientos conocidos o, al menos, dar
a conocer al público una elección útil.
En al menos una realización, la invención se
esfuerza por proporcionar un procedimiento económico y
medioambientalmente aceptable para diluir proteínas de queratina
que mantiene la integridad estructural y la funcionalidad química
de las proteínas durante el procedimiento de disolución y que
conduce a un producto estable y versátil para el desarrollo de
materiales biopoliméricos derivados de la queratina.
La patente de los EE.UU. US-A
3.644.084 se refiere a un método para ablandar las fibras de
queratina.
Thomas H. et al., "In vitro
reconstitution of wool intermediate filaments" International
Journal of Biological Macromolecules, vol. 8, n.º 5, 1986,
páginas 258-264, se refiere a un método para
reconstituir filamentos intermedios de lana.
Harrap B. S. et al: "Soluble
derivatives of feather keratin", The Biochemical Journal,
vol. 92, n.º 1, 1964, páginas 8-18, se refiere al
aislamiento de derivados solubles de la queratina de las plumas y a
la determinación de la composición de sus aminoácidos.
La patente de los EE.UU.
US-A-3.567.363 y la patente francesa
FR-A-1.503.640 se refieren a
composiciones para la modificación química de la queratina en la
forma S-sulfo.
La patente británica
GB-A-2.115.427 se refiere a un
polímero de queratina obtenido a partir de la queratina, que
contiene grupos de S-sulfocisteína, que se pueden
preparar mediante un procedimiento de digestión enzimática.
Swan, J.M: "The reacction of protein thiol and
disulphide groups with cupric sulphite solutions", Australian
Journal of Chemistry, vol. 14, 1960, páginas
69-83, se refiere a la reacción de grupos tiol y
disulfuro con disoluciones de sulfito cúprico.
De acuerdo con un primer aspecto, la invención
proporciona un procedimiento de disolución para producir una serie
de derivados de la queratina estables y solubles de alto peso
molecular, siendo la masa molecular similar o mayor que la de las
proteínas expresadas originalmente en la fuente de queratina, con
poco o ningún daño sobre la integridad estructural de las proteínas
constituyentes. La disolución se produce en un procedimiento de dos
etapas, que incluye una primera etapa de fase de digestión por
S-sulfonación de una fuente de queratina mediante
sulfitólisis oxidativa seguida de una segunda etapa de fase de
extracción que utiliza el lavado controlado con agua para, así,
obtener un derivado de queratina S-sulfonada de alto
peso molecular.
La conversión de la queratina muy
S-sulfonada a partir de un estado sólido en una
disolución se realiza sin el uso de agentes caotrópicos, mediante
el lavado gradual y controlado de la queratina sulfonada con agua
para lavar los reactivos químicos residuales del procedimiento de
extracción y alterar la fuerza iónica de la disolución de
extracción.
La primera etapa implica una sulfitólisis
oxidativa para convertir en S-sulfocisteína los
grupos de cistina presentes en la proteína, utilizando
concentraciones industrialmente aceptables de reactivos baratos con
el objetivo de sulfonar (por ejemplo, sulfito de sodio) y oxidar
(por ejemplo, hidróxido de cuproamonio).
De acuerdo con otro aspecto, la invención
proporciona un procedimiento para separar un producto de queratina
gelatinoso a partir de una disolución de queratina
S-sulfonada producida por el procedimiento anterior,
en el que la disolución del derivado de la queratina
S-sulfonada se trata con la utilización de un
sistema de filtración suave alimentado por la gravedad seguido de
la separación. Preferiblemente, la separación es mediante
centrifugación.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, una
corriente líquida que permanece después de retirar la gelatina
gelatinosa se procesa haciéndola pasar por lana lavada, por lo que
se retiran las sustancias químicas residuales de la disolución y se
prepara la lana para los posteriores procedimientos de extracción de
la proteína.
Después de la conversión de los grupos cistina,
la segunda etapa del procedimiento es una en la que el derivado de
queratina muy S-sulfonada se lleva desde un estado
sólido o gelatinoso a disolución mediante la dilución exhaustiva
con agua. La velocidad y el alcance de la disolución se pueden
controlar mediante el uso de calor, surfactantes, agitación suave y
picado enérgico u homogeneización. Controlando la velocidad de la
disolución se pueden aislar las disoluciones de la reacción, por
ejemplo, si se utiliza un oxidante de cobre, se produce una
disolución de reacción rica en cobre pero que contiene pocas o
ninguna proteína disuelta, o que son ricas en proteínas pero que
contienen poco o nada de cobre.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, una
corriente líquida que es producto de la segunda etapa del
procedimiento, que contiene sustancias químicas residuales tales
como sulfato y sulfito de cobre, así como derivados de queratina
S-sulfonada, se procesa utilizando uno cualquiera o
más de una serie de métodos que permiten el reciclaje de los
reactivos de la disolución y el aislamiento por separado de
la(s) proteína(s) filamentosa(s)
intermedia(s) de queratina S-sulfonada (SIFP
por sus siglas en inglés) purificada y la(s)
proteína(s) ricas en azufre de la queratina
S-sulfonada (SHSP por sus siglas en inglés). Esto se
consigue mediante el uso de agentes quelantes, tales como ácido
etilenodiamino-tetraacético, o quelando resinas de
intercambio iónico, tales como las que contienen el grupo funcional
iminodiacético, y el uso de la precipitación isoeléctrica para
separar los tipos de proteínas. Se puede utilizar la ultrafiltración
en varias etapas del procedimiento para mejorar la eficacia de la
retirada de los reactivos o la separación de las proteínas. Además,
las impurezas metálicas en los productos proteicos se pueden
reducir lavando el(los) derivado(s) de la proteína y
después precipitando con ácidos diluidos, agua o agentes quelantes.
Una vez separados, los productos proteicos se pueden secar mediante
una serie de métodos tales como el secado en lecho fluido, por
pulverización o por liofilización.
Otro aspecto de la invención es procesar
adicionalmente la queratina residual no disuelta por el
procedimiento de sulfitólisis de dos etapas, mediante el uso de
otros reactivos, tales como peróxido de hidrógeno, sulfuro de sodio
o enzimas proteolíticas, para producir péptidos de queratina.
Otro aspecto de la invención es proporcionar un
método para la recuperación de proteínas a gran escala desde una
fuente natural, que incluye someter dicha fuente natural de
proteínas a un tratamiento suficiente para proporcionar, al menos,
alguna de la(s) proteína(s) hidrosoluble(s) y,
posteriormente, separar la(s) proteína(s)
hidrosoluble(s).
Otro aspecto de la invención es proporcionar una
instalación para la recuperación a gran escala de proteínas de una
fuente natural, un recipiente de tratamiento para contener y someter
una gran cantidad de fuentes naturales de proteínas a un
tratamiento suficiente para proporcionar, al menos, alguna de
la(s) proteína(s) contenidas en dicho alimento,
hidrosoluble(s), y un aparato de separación para separar
posteriormente la(s) proteína(s)
hidrosoluble(s).
Otro aspecto de la invención es un método para
solubilizar selectivamente una proteína que tiene numerosos enlaces
disulfuro a partir de una mezcla de proteínas que incluye someter
dicha mezcla de proteínas a una sulfitólisis oxidativa para
producir una fracción de proteínas S-sulfonadas
solubles. La sulfitólisis oxidativa se efectúa preferiblemente en
ausencia de agentes caotrópicos con poco o ningún daño a la
integridad estructural de la proteína.
\newpage
Otro aspecto de la invención es un método para
obtener una proteína purificada a partir de una fuente impura de
proteínas con poco o ningún daño sobre la integridad estructural de
la proteína que incluye someter dicha fuente de proteínas a un
tratamiento suficiente para proporcionar, al menos, alguna de
la(s) proteína(s) hidrosoluble(s) y,
posteriormente, separar la(s) proteína(s)
hidrosoluble(s) en ausencia de agentes caotrópicos.
La combinación de aspectos que componen el
procedimiento como un conjunto se resumen en forma de diagrama en
la figura 1 adjunta.
Este método de procedimiento es para la
preparación de derivados de queratina muy sulfonados y se pueden
aplicar a cualquier fuente de queratina, tales como lana, pelo,
cuernos, pezuñas, plumas o escamas de animales. Mientras que la
aplicación del método a diferentes fuentes de queratina puede dar
queratinas solubles con diferentes estructuras y propiedades, la
etapa fundamental del procedimiento de disolución, en la que la
cistina se convierte en S-sulfocisteína, se aplica
igualmente bien a todas las sustancias que contienen queratina.
Se puede concebir que el procedimiento se
produce en dos etapas.
La primera etapa, que implica la conversión de
la cistina a S-sulfocisteína, se produce mediante un
procedimiento de sulfitólisis oxidativa. Esto se puede conseguir
mediante el uso de un agente sulfonante, tal como sulfito de sodio
o metabisulfito de sodio, que escinde asimétricamente la cistina en
cisteína y S-sulfocisteína, y un oxidante, que
convierte la cisteína producida por la sulfonación en cistina.
Mediante la sulfonación adicional de la cistina se consigue la
conversión completa de todas las cistinas en
S-sulfocisteínas.
Los oxidantes que se pueden utilizar incluyen
tetrationato de sodio, benzoato yodoso e hidróxido de cuproamonio.
En una realización preferida de esta invención, el reactivo
sulfonante utilizado es sulfito de sodio en el intervalo de
concentración de 0,02 M a 0,2 M y el oxidante utilizado es hidróxido
de cuproamonio en el intervalo de concentración de 0,02 M a 0,08 M,
generado mediante la combinación de sulfato de cobre y amoníaco. La
primera etapa del procedimiento para solubilizar la queratina es
empapar, durante un tiempo de permanencia tal como 24 horas, la
fuente de queratina en una disolución o secuencia de disoluciones
para convertir la cistina en S-sulfocisteína, con
una proporción de disolución acuosa:lana (volumen:masa) en el
intervalo de 5:1 a 50:1.
En otra realización de la invención, el agente
sulfonante utilizado es metabisulfito de sodio en el intervalo de
concentración de 0,1 M a 0,5 M, mantenido a un pH ácido. En esta
realización, se retira la lana de la disolución que contiene
metabisulfito de sodio antes de añadirla a una disolución que
contiene un complejo de cuproamonio en el intervalo de
concentración de 0,02 M a 0,08 M.
El trabajo previo en relación con el uso del
procedimiento de sulfitólisis oxidativa ha requerido el uso de
grandes concentraciones de agentes caotrópicos, tales como urea o
clorhidrato de guanidinio, para hinchar la fuente de queratina y
facilitar la disolución de la queratina. Este procedimiento es caro
e impracticable a escala industrial. El trabajo previo en relación
con el uso de la sulfitólisis oxidativa utilizando el cobre como
oxidante se ha realizado en condiciones de temperatura y pH que son
perjudiciales para la integridad de la proteína, lo que causa una
elevada tasa de conversión de la cistina a lantionina.
La segunda etapa del procedimiento implica la
conversión de la queratina muy sulfonada desde un estado sólido a
disolución sin utilizar agentes caotrópicos y en condiciones de
temperatura y pH que mantienen la integridad estructural de la
proteína, mediante el lavado gradual y controlado de la queratina
sulfonada con agua para lavar los reactivos químicos residuales del
procedimiento de extracción y alterar la fuerza iónica de la
disolución de extracción. Esta combinación de efectos da lugar a la
conversión de la queratina muy sulfonada desde el estado sólido a
disolución acuosa. En el procedimiento preferido, el volumen de
reacción se reemplaza cada 12 a 48 horas, tanto en un procedimiento
por lotes como en uno continuo.
La velocidad y el grado de disolución se pueden
controlar mediante el uso de tensioactivos, la acción del calor,
agitación y homogeneización de la queratina sulfonada. Una
característica de la invención es utilizar estos factores para
controlar la de extracción. Por lo tanto, la queratina muy
S-sulfonada se puede mantener en el estado sólido y
separarla de la disolución de extracción que contiene la mayor parte
de las sustancias químicas utilizadas para el procedimiento de
sulfonación. El procedimiento preferido utiliza un surfactante no
iónico, tal como Triton X 100 en el intervalo del 0,1% al 5% en
masa, y una temperatura mantenida en el intervalo de 15ºC a
50ºC.
Una ventaja de la invención cuando se utiliza un
oxidante a base de cobre es la reutilización de esta disolución de
extracción rica en cobre para los posteriores procedimientos de
extracción, lo que reduce considerablemente el coste y el impacto
medioambiental del procedimiento. La posibilidad de reutilización de
la disolución rica en cobre se debe, en parte, a la regeneración de
las especies de cobre activas mediante la oxidación aérea. Un
método en el que se puede reutilizar eficazmente la disolución rica
en cobre es el que hace pasar la disolución por lana. La lana une
el cobre de la disolución y, si luego se utiliza esta lana para los
posteriores procedimientos de extracción, se reduce la demanda de
cobre en las posteriores extracciones. De este modo, se puede
utilizar un "filtro de lana" como una etapa clave en el
procesamiento de la disolución de extracción rica en cobre, lo que
reduce la posterior necesidad de un tratamiento de los vertidos y
también la necesidad de añadir el cobre a los procedimientos
posteriores. En un procedimiento típico, la corriente de líquido de
la etapa 1 contenía aproximadamente de 1800 a 1500 ppm (partes por
millón) de cobre y, después de pasarla por el filtro de lana, se
redujo a aproximadamente 400 a 300 ppm.
La primera etapa del procedimiento, y la
recuperación de los reactivos para su uso en el procedimiento, se
indican en la figura 1 adjunta.
Después de S-sulfonación y de la
homogeneización, el material de queratina se convierte en una masa
fibrosa hinchada gelatinosa.
Una ventaja más de la invención es la separación
de los derivados de la queratina muy S-sulfonada en
el estado sólido a partir de disoluciones que contienen o bien
sustancias químicas utilizadas en el procedimiento de extracción o
bien la proteína queratina en disolución. Esta separación se
consigue eficazmente mediante el uso de una filtración suave basada
en la gravedad a través de un tamiz de malla fina, y después una
separación del filtrado y de las partículas finas por
centrifugación.
Las disoluciones de derivados de la queratina
muy S-sulfonada se pueden purificar de los iones
metálicos, especialmente los iones de cobre utilizados como parte
del procedimiento de extracción, mediante el uso de medios de
intercambio iónico, en particular los que contienen la funcionalidad
del ácido iminodiacético conocida por poseer una gran afinidad por
los iones metálicos divalentes. Este medio de intercambio iónico
puede estar presente en forma de una columna de resina empaquetada,
sobre la que se pasa la disolución de proteínas, o,
alternativamente, puede formar parte de una célula electroquímica,
en la que el cobre se recubre del medio de intercambio iónico
mediante la aplicación de un voltaje y la utilización de un sistema
que contiene membranas permeables.
Una vez que los derivados de la queratina muy
S-sulfonada se encuentran en disolución,
determinadas proteínas, por ejemplo, la proteína filamentosa
intermedia de la queratina S-sulfonada, se puede
aislar fácilmente mediante precipitación isoeléctrica, en torno a
pH 4 o por debajo de él, utilizando ácidos tales como ácido
sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido acético, siendo
la utilización de ácido sulfúrico el procedimiento preferido. Una
ventaja de la invención es la minimización de la unión del cobre y
otras impurezas metálicas a la proteína antes de la precipitación
isoeléctrica mediante el uso de medios de intercambio iónico tal y
como se describe, o mediante la adición de un agente quelante, tal
como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), a la disolución de la
proteína. En el ejemplo preferido, se añade EDTA (0,2 M) a la
corriente líquida de la etapa 2 a razón de 25 ml por litro, o a una
proporción adecuada para secuestrar todos los iones de cobre
presentes en la disolución tal y como se indica mediante el
análisis de la disolución. Las impurezas metálicas se pueden
reducir más mediante el lavado de la proteína, una vez aislada
mediante precipitación, con una disolución de ácido diluido, o una
disolución de un agente quelante tal como EDTA, o agua.
Después de la precipitación y del lavado, se
puede aislar la proteína separada en un estado seco y estable
utilizando métodos de secado que implican que el aire fluya a una
temperatura cercana a la ambiental, por ejemplo con el uso de un
secador en lecho fluido. Alternativamente, el producto se puede
secar utilizando un liofilizador. El producto proteico secado
contiene grupos cistina en forma de ácido
S-sulfónico y, en consecuencia, la proteína es sólo
soluble en presencia de una base, tal como hidróxido de sodio o
hidróxido de amonio. Estos procedimientos se representan como
secados en la figura 1 adjunta.
Los derivados de la queratina muy solubles que
permanecen en disolución después de la precipitación isoeléctrica,
que en el caso de la lana son principalmente proteínas matriciales
ricas en azufre desde dentro de la fibra de lana, se pueden aislar
en una forma estable a partir de la disolución mediante un
procedimiento de ultrafiltración, para retirar las especies no
proteínicas tales como cobre o EDTA residuales, seguido del secado
por pulverización.
Una característica de la invención es el uso de
una combinación de precipitación isoeléctrica y ultrafiltración
seguida del secado por pulverización para separar las queratinas muy
S-sulfonadas de acuerdo con sus propiedades en
disolución. En el caso de la queratina de la lana, esto separa de
manera eficaz la clase de proteínas filamentosas intermedias con
poco azufre de la clase de proteínas matriciales ricas en azufre, y
proporciona dos corrientes de productos con diferentes propiedades
químicas.
Se menciona además la preparación de una forma
soluble en agua y estable del derivado de la queratina muy
S-sulfonada al disolver la forma de ácido
S-sulfónico de la queratina en presencia de una base
y secando por pulverización la disolución resultante.
Una característica de la invención es la
combinación de componentes diseñados específicamente para permitir
la solubilización de la queratina y el aislamiento de la queratina
S-sulfonada de la disolución en un procedimiento
continuo, semicontinuo o por lotes. Esta combinación de componentes
diseñados específicamente y unidades operativas se detalla en la
figura 1.
Una ventaja de la invención es la recuperación y
la reutilización del cobre de las mezclas de reacción y de las
corrientes de vertido del procedimiento. Se puede recuperar el cobre
utilizando métodos electroquímicos, incluido el uso de membranas
permeables selectivas para separar los iones de cobre del EDTA antes
de la deposición electroquímica. Alternativamente, los agentes de
unión inmovilizados, en forma de resinas de intercambio de iones
específicos, se pueden utilizar para retirar el cobre de la
corriente de vertido. El cobre retirado utilizando estos métodos se
puede reutilizar, por lo que se minimiza el impacto medioambiental
del procedimiento.
El uso de medios de intercambio iónico y/o de
agentes quelantes se representan como purificación en la figura 1
adjunta.
Otra ventaja de la invención es el procesamiento
adicional de la queratina residual que permanece en el estado
sólido después del procedimiento de extracción. Esta queratina
funcionalizada está muy S-sulfonada, por lo que se
han escindido los enlaces disulfuro presentes en la queratina nativa
que la hacen resistente al ataque químico y enzimático, y la
queratina se puede digerir fácilmente utilizando otros métodos de
extracción. Por ejemplo, se puede preparar una disolución rica en
péptidos de queratina a través de la acción, sobre esta queratina
residual, de disoluciones alcalinas de un oxidante fuerte tal como
el peróxido de hidrógeno, en un intervalo de concentración de 10 a
100 ml de peróxido de hidrógeno al 50% por kilogramo del residuo de
queratina en condiciones alcalinas. El residuo de queratina contiene
un 5% de sólidos. Alternativamente, las disoluciones de reductores
fuertes tales como sulfuro de sodio en el intervalo de concentración
del 0,5% al 15% añadidas al residuo de queratina se pueden utilizar
para preparar una disolución rica en péptidos de queratina.
Alternativamente, las enzimas proteolíticas, tales como las de los
grupos de la subtilisina, la papaína o la tripsina, se pueden
emplear a una cantidad en el intervalo de 0,1 mg a 20 mg de enzima
por gramo de residuo de queratina a unas condiciones de temperatura
y pH adecuadas para que la enzima específica digiera fácilmente la
queratina residual y para preparar una disolución rica en péptidos
de queratina. Todos estos métodos dan lugar a la formación de una
disolución rica en péptidos de queratina que se pueden procesar de
una forma similar a la corriente líquida que es resultado de la
etapa 2 descrita más arriba, que es mediante el uso de medios de
intercambio iónico, ajuste del pH y secado (mostrado como
purificación y secado en la figura 1), para producir sólidos de
péptidos de queratina. La digestión del residuo de queratina de este
modo minimiza el gasto de queratina producido por el procedimiento
en su conjunto y asegura que se utilice al máximo la proteína de
queratina presente en la fuente de queratina.
Los dos productos proteicos intactos del
procedimiento son la proteína filamentosa intermedia de la queratina
S-sulfonada y la proteína rica en azufre de la
queratina S-sulfonada. La proteína filamentosa
intermedia de queratina S-sulfonada típicamente
producida por el procedimiento se analizó utilizando análisis por
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE por sus siglas en inglés) utilizando un
procedimiento de reducción/alquilación, que indicó una distribución
de masas moleculares predominantemente en el intervalo de 30 a 60
kDa (proteínas filamentosas intermedias), con un componente pequeño
de proteína de 10 kDa de masa (proteínas ricas en tirosina y
glicina). La composición de aminoácidos de este producto se ofrece
en la tabla 1 y es típica de las proteínas filamentosas intermedias
de la queratina de la lana. La proteína rica en azufre de la
queratina S-sulfonada se analizó utilizando el
SDS-PAGE después de un procedimiento de
reducción/alquilación, que indicó una masa molecular
predominantemente en el intervalo de 15 a 20 kDa. La composición de
aminoácidos de este producto se ofrece en la tabla 1 y es típica de
las proteínas ricas en azufre de la queratina de la lana.
Un ejemplo del procedimiento se muestra en forma
de diagrama en la figura 1 adjunta. Se considera que la
ultrafiltración es un componente posible en cada etapa de
purificación. Los componentes clave se ilustran mediante los
ejemplos siguientes de un procedimiento de extracción de
proteínas.
Ejemplo 1, Etapa
1
La etapa de digestión del procedimiento implica
el uso de sulfitólisis oxidativa para convertir la cistina en
S-sulfocisteína dentro de la fuente de
queratina.
Ejemplo 1a, Etapa
1
Para extraer la queratina de 10 kg de lana, se
mezclaron primero 2 kg de sulfato de cobre pentahidratado utilizando
un mezclador de gran cizalla con 8 l de amoníaco concentrado. Se
diluyó esta mezcla hasta 200 l con agua y se añadieron 10 kg de
lana. Se añadieron unos 15 l de ácido sulfúrico (2 M) a la mezcla en
agitación hasta que se alcanzó un pH de 9,4. Se añadió sulfito de
sodio anhidro (5,04 kg) y se mezcló la disolución hasta que se
produjo la disolución completa de todos los reactivos y se
estabilizó el pH a 9,5. La concentración final del complejo de
cuproamonio fue de 0,04 M. El sulfito de sodio tenía una
concentración final de 0,2 M. Se mantuvo la temperatura de la
disolución de digestión a 20ºC. Después de 24 horas de agitación
suave, se filtró la masa gelatinosa fibrosa de lana macerada. Se
pasó el filtrado por un filtro de lana nueva, lo que redujo el
nivel de cobre en la disolución de 1725 ppm a 130 ppm, y se purificó
adicionalmente con una resina de intercambio iónico Purolite S930
IDA, la cual, en condiciones ácidas, reducía adicionalmente la
cantidad de cobre a 12 ppm. Se añadió agua nueva a la lana macerada
y se agitó la mezcla.
Ejemplo 1b, Etapa
1
En una variación del ejemplo 1a, se preparó la
disolución de la digestión con la adición de 1% de un tensioactivo
no iónico: el Triton X 100. La adición de este tensioactivo dio
lugar a un retraso en la liberación de proteína soluble desde la
fibra, lo que permitió una separación más eficaz de la proteína a
partir de los reactivos residuales tales como sales de cobre en la
disolución de extracción.
Ejemplo 1c, Etapa
1
En una variación del ejemplo 1a, la etapa de
digestión se produce en dos partes. En la primera parte, se trata
previamente la lana con metabisulfito de sodio a una concentración
de 0,2 M, a pH 4,2. Después de la retirada de la lana de esta
disolución, y sin ningún intento de retirar el sulfito residual de
la lana, se introdujo la lana en una disolución de hidróxido de
cuproamonio, a la concentración y el pH descritos en el ejemplo 1a
durante más de 24 horas a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2, Etapa
2
Ejemplo 2a, etapa
2
Después de terminar la etapa 1, descrita en los
ejemplos 1, se agitó la mezcla durante un periodo de 16 horas,
después de haberse homogeneizado. Después de 4 horas más de
agitación, se separaron los sólidos y la disolución utilizando un
procedimiento de filtración de dos etapas que implica un tamiz de
alambre encajado seguida de un tanque de asentamiento y una
centrifugadora de disco giratorio. Las fases sólidas se devolvieron
al recipiente de reacción y se añadió agua para dar una proporción
final de disolución acuosa a lana de 20:1 basada en los sólidos de
la lana original. Después de 24 horas de agitación u homogeneización
continua, se separó la mezcla repitiendo el procedimiento de
filtración de dos etapas. Se devolvieron las fases sólidas al
recipiente de extracción y se diluyeron adicionalmente. Se repitió
este ciclo de 7 a 12 veces. Las fases líquidas, que contienen las
proteínas solubles, se procesaron adicionalmente tal y como se
detalla más abajo en el ejemplo 3.
Ejemplo 2b, etapa
2
Después de terminar la etapa 1, se procesó la
mezcla tal y como se describe en el ejemplo 2a, excepto que el
procedimiento de filtración de dos etapas tuvo lugar en un proceso
continuo, y se añadieron los sólidos y agua nueva al tanque de
reacción a una velocidad equivalente a reemplazar el volumen del
tanque en 24 horas. Este procedimiento se continuó durante 120
horas.
Se puede utilizar la ultrafiltración en varios
puntos durante el procesamiento de las disoluciones de proteínas
para concentrar las disoluciones y hacer que los procesamientos de
secado y de intercambio de iones sean más eficaces. Se puede
utilizar la ultrafiltración antes de cualquier etapa del
procesamiento esbozado en los ejemplos siguientes.
Ejemplo
3a
La disolución producida como resultado de la
etapa 2, tal y como se describió en el ejemplo 2, se procesó
adicionalmente para aislar las queratinas solubles purificadas. Se
añadió EDTA (0,2 M) a la fase líquida a razón de 25 ml por litro, o
a una proporción adecuada para secuestrar todos los iones de cobre
presentes en la disolución tal y como se indicó mediante el
análisis de la disolución. Después de 1 hora de mezcla, se redujo
el pH del filtrado a 3,5 utilizando ácido sulfúrico.
Se aisló el precipitado de proteínas utilizando
un tamiz, y se lavó secuencialmente con ácido sulfúrico diluido y
agua. La proteína, la proteína filamentosa intermedia de la
queratina S-sulfonada, se secó mediante una de las
tres rutas, liofilización, secado en lecho fluido o secado por
pulverización, y después se disolvió con hidróxido de sodio
diluido. El filtrado después del procedimiento de precipitación de
la proteína se procesó adicionalmente utilizando la ultrafiltración
para separar los componentes proteicos de los reactivos residuales.
Lo retenido se secó por pulverización para aislar más la proteína
soluble: la proteína rica en azufre de la queratina
S-sulfonada. Lo que atravesó el filtro se procesó
adicionalmente para recuperar el cobre y el EDTA de la corriente de
vertido utilizando medios de intercambio iónico.
Ejemplo
3b
La disolución producida como resultado de la
etapa 2, tal y como se describió en el ejemplo 2, se procesó
adicionalmente para aislar las queratinas solubles purificadas. Se
pasó la fase líquida por una resina de intercambio iónico, tal como
la resina quelante de resina de intercambio iónico Purolite S930
IDA, que contiene el grupo funcional ácido iminodiacético, para
retirar los iones de cobre de la disolución. Después del intercambio
iónico, se disminuyó el pH del filtrado hasta 3,5 con ácido
sulfúrico y se procesó adicionalmente de una manera idéntica a la
descrita en el ejemplo 3a.
Ejemplo
3c
La disolución producida como resultado de la
etapa 2, tal y como se describió en el ejemplo 2, se procesó
adicionalmente para aislar las queratinas solubles purificadas. El
pH de la fase líquida se redujo a 3,5 con ácido sulfúrico. Se aisló
el precipitado de la proteína utilizando un tamiz, se volvió a
disolver utilizando hidróxido de sodio diluido y se purificó
adicionalmente con la adición de EDTA o pasándolo por una columna
de intercambio iónico. Tras la purificación adicional, se redujo el
pH de la disolución a 3,5 con ácido sulfúrico y se aisló la
proteína tal y como se describió en los ejemplos anteriores. El
filtrado de la etapa de reducción del pH inicial, que todavía
contiene cantidades significativas de proteína soluble y otros
reactivos, se purificó haciéndolo pasar por medios de intercambio
iónico y se secó por pulverización para aislar más proteína soluble:
la proteína rica en azufre de la queratina
S-sulfonada.
\vskip1.000000\baselineskip
La corriente de sólidos aislada como resultado
de la etapa 2 se puede procesar adicionalmente para producir
péptidos de queratina mediante una serie de métodos. El gran nivel
de sulfonación del residuo lo hace idóneo para la digestión química
y enzimática, ya que los enlaces disulfuro presentes en la fuente de
la queratina original resistente al ataque químico y enzimático se
han escindido en su mayoría.
\newpage
Ejemplo
4a
Se añade una disolución de sulfuro de sodio (5%
en masa) a un volumen igual de la corriente de sólidos de la etapa
2 del procedimiento, que comprende sólidos a aproximadamente el 5%.
Se agita la mezcla durante 12 horas tras las cuales se retiran los
sólidos mediante filtración y centrifugación, y se añade ácido
sulfúrico a la disolución de proteínas para disminuir el pH hasta
el margen de 2 a 3,5. Se recoge el precipitado sobre un tamiz y se
lava a conciencia con agua.
Ejemplo
4b
Se añade peróxido de hidrógeno (50%) a la
corriente de sólidos de la etapa 2 a un nivel de 25 a 30 ml por
kilogramo de residuo de queratina (el residuo de queratina contiene
sólidos a aproximadamente el 5%). Esto se mezcla y le se añade
hidróxido de sodio a 1 M para obtener un pH en el margen de 10 a 13.
Se agita con suavidad la mezcla durante 24 horas y se separan la
proteína y los sólidos mediante el procedimiento de filtración de
dos etapas descrito en el ejemplo 2, y se aísla la proteína mediante
acidificación tal y como se describe en el ejemplo 4a.
Alternativamente, se pasa la disolución de la proteína por una
resina de intercambio iónico, luego se acidifica y se recoge el
sólido precipitado. A continuación, la disolución acidificada se
puede pasar a través de una columna de intercambio iónico antes de
la liofilización o del secado por pulverización para recoger un
producto adicional más rico en proteínas.
Ejemplo
4c
Se añadió una preparación industrial de la
enzima subtilisina (una disolución que contiene enzima activa al
2,5%) a la corriente de sólidos de la etapa 2 en la cantidad de 10
mg de enzima activa por gramo de residuo de queratina. Se mantuvo
el pH a 9,5 con la adición de hidróxido de sodio y se calentó la
reacción a 60ºC durante 2 horas. Se aísla la disolución de proteína
resultante a partir de los sólidos y se procesa como se describe en
el ejemplo 4a o se pasa a través de una resina de intercambio iónico
antes y/o después de la acidificación tal y como se describe en el
ejemplo 4b.
Así, mediante la invención, se proporciona un
método para la producción de derivados solubles de la queratina que
es económica y medioambientalmente aceptable.
Claims (19)
1. Un procedimiento para la preparación de
derivados de la queratina de alto peso molecular que son de tamaño
similar, o de mayor tamaño, que la proteína queratina originalmente
expresada en la fuente de queratina, incluyendo el procedimiento
una primera etapa de fase de digestión de sulfonación de una fuente
de queratina mediante sulfitólisis oxidativa seguida de una segunda
etapa de extracción acuosa repetitiva mediante un lavado gradual
controlado que implica la separación de la queratina soluble de la
insoluble y la posterior retroextracción de la queratina insoluble,
por lo que se produce un derivado de la queratina
S-sulfonada de alto peso molecular.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la primera etapa se lleva a cabo sin el
uso de un agente caotrópico.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la primera etapa
se lleva a cabo bajo unas condiciones del pH que mantiene la
integridad estructural de la proteína.
4. Un procedimiento como el narrado en una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la
sulfitólisis oxidativa utiliza hidróxido de cuproamonio, o un
tionato, como el oxidante, y sulfito.
5. Un procedimiento como el narrado en una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las dos
etapas utilizan tensioactivos, calor, agitación y homogeneización
para controlar la tasa de digestión en la primera etapa y la
extracción en la segunda etapa.
6. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 4, que utiliza tensioactivos, calor, agitación y
homogeneización para controlar la tasa de liberación de reactivos
residuales y proteína soluble, lo que permite la separación del
derivado de la queratina S-sulfonada.
7. Un procedimiento como el narrado en una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un sustrato
de queratina gelatinosa se separa de la disolución de la queratina
S-sulfonada producida mediante el procedimiento
como el narrado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y
en el que la disolución del derivado de la queratina
S-sulfonada se trata mediante el uso de un sistema
de filtración alimentado por la gravedad y suave seguido de la
separación mediante centrifugación.
8. Un procedimiento como el narrado en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que utiliza una
combinación de disoluciones diseñadas para permitir la preparación
continua de los derivados S-sulfonados de la
queratina.
9. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 1, en el que la disolución de la queratina
S-sulfonada se purifica utilizando agentes
quelantes, tales como EDTA, para secuestrar iones de metales, tales
como el cobre.
10. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 1, en el que la disolución que contiene derivados de
la queratina S-sulfonada se purifica utilizando
medios de intercambio iónico para retirar los reactivos residuales,
que incluye metales tales como cobre.
11. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 10, en el que la disolución se concentra antes de un
tratamiento de intercambio de iones mediante el uso de membranas de
ultrafiltración, o similar.
12. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 11, en el que reactivos tales como el cobre se aíslan
y se reutilizan en procedimientos posteriores.
13. Un procedimiento como el narrado en una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las
proteínas filamentosas intermedias de la queratina
S-sulfonada se aíslan de la disolución de los
derivados de la queratina producidos por el procedimiento según una
reivindicación cualquiera anterior mediante precipitación
isoeléctrica a pH ácido.
14. Un procedimiento como el narrado en las
reivindicaciones 9 ó 10, en el que se producen las proteínas ricas
en azufre de la queratina S-sulfonada mediante el
secado por pulverización de la disolución de los derivados de la
queratina S-sulfonada purificada según las
reivindicaciones 9 ó 10, después de haber retirado las proteínas
filamentosas intermedias mediante el procedimiento según la
reivindicación 13.
15. Un procedimiento como el narrado en las
reivindicaciones 1 a 7, en el que se producen péptidos de queratina
solubles mediante la acción de disoluciones de peróxido de hidrógeno
sobre el residuo gelatinoso producido por el procedimiento como el
narrado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
16. Un procedimiento como el narrado en las
reivindicaciones 1 a 7, en el que se producen péptidos de queratina
solubles mediante la acción de disoluciones de sulfuro de sodio
sobre el residuo gelatinoso producido por el procedimiento como el
narrado en las reivindicaciones 1 a 7.
\newpage
17. Un procedimiento como el narrado en las
reivindicaciones 1 a 7, en el que se producen péptidos de queratina
solubles mediante la acción de enzimas proteolíticas, tales como las
de las familias de la subtilisina, la papaína o la tripsina, sobre
el resto gelatinoso producido mediante el procedimiento como el
narrado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
18. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 4, en el que las disoluciones ricas en cobre
producidas mediante el procedimiento se tratan mediante la
utilización de lana como medio de filtro para unir el cobre y
retirarlo de la disolución.
19. Un procedimiento como el narrado en la
reivindicación 18, en el que la lana cargada de cobre producida
mediante el procedimiento narrado en la reivindicación 18 se trata
en un procedimiento posterior de extracción de proteína.
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