SU1699350A3

SU1699350A3 - Способ очистки коллагеназы

Info

Publication number: SU1699350A3
Application number: SU904806988A
Authority: SU
Inventors: Иван Юрьевич Сахаров; Александр Алексеевич Артюков; Василий Ильич Березин
Original assignee: И.Ю. Сахаров, А.А, Артюков и В.И. Березин
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1990-03-29
Publication date: 1991-12-15

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , препаративной биохимии, к очистке коллагеназы животного происхождени дл клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине. Гепатопанкреас крабов гомогенизируют в водных растворах, отдел ют нерастворенные вещества центрифугированием . Экстракцию липидов осуществл ют добавлением к супернатанту трет-бутилово- го спирта до его конечной концентрации 30-50% при 0-35&deg;С. Перемешивают, осаждение фермента провод т сульфатом аммони , довод его концентрацию до 15-20%. Осадок раствор ют в буфере, очищают ультрафильтрацией , диализом, хроматографией . Удельна активность коллагеназы 3500-4000 ед. на 1 мг белка.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , а именно к препаративной биохимии и используетс дл получени очищенной коллагеназы животного происхождени , котора находит применение в клеточной биотехнологии , меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии и медицине , в научно-исследовательской работе.

Известен способ получени коллагеназы , который заключаетс в выделении фермента иг гепатопанкреаса краба Ucapugllatorc помощью гомогенизации тка- „ни в 10 объемах ацетона при -20°С, обработки осадка 10 объемами н-бутанола, затем 10 объемами ацетона при -20°С, после чего проводилась сушка, растворение порошкообразного препарата центрифугирование, осаждение из раствора фермента сульфатом аммони (70% от насыщенного) при О С, гельфильтраци на сефадексе G 150, ионообменна хроматографи на ДЭАЭ-целлю- лозе, хроматографи на гидроксилапатите и повторна гельфильтраци на сефадексе G 75. Все хроматографические операции

проводились при 4°С. В результате получен гомогенный препарат коллагеназы с удельной активностью 4020 единиц на мг белка.

Недостатком данного метода вл етс его многостадийность, применение в больших количествах органических растворителей , вл ющихс взрывоопасными (например, ацетон, температура вспышки которого равна -18°С) и экологически гр зными, а также необходимость создани низких температур на первых стади х выделени коллагеназы.

Цель изобретени - упрощение способа получени коллагеназы краба, а также повышение его технологичности за счет изъ ти из процесса взрывоопасных и экологически гр зных органических соединений и повышени температуры процесса выделени фермента.

Поставленна цель достигаетс тем, что гепатопанкреас крабов гомогенизируют в водных растворах, центрифугированием отдел ют нерастворенные вещества, добавл ют к супернатанту трет-бутиловый спирт до

Os

ю ч

СА) СЛ О

ы

его конечной концентрации 30-50% при 0- 35°С, перемешивают и добавл ют сульфат аммони до его концентрации 15-20%. Образовавшийс на разделе фаз осадок раствор ют в буферном растворе и после ультрафильтрации или диализа последующую очистку провод т на ДЭАЭ-сефарозе, десорбиру фермент повышением ионной силы. Все операции провод т при температуре выше 0°С. Удельна активность колла- геназы достигает 3500-4000 ед на 1 мг белка.

В предложенном способе упрощаетс метод очистки коллагеназы крабов за счет сокращени числа стадий процесса, а также вследствие удалени из процесса такого огнеопасного и экологически гр зного реагента как ацетон. В предложенном способе отсутствует необходимость создани низких температур (-20°С) и весь процесс проводитс при 0-35°С.

Предлагаемый способ иллюстрируетс следующими примерами,

Пример 1.26г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл 50 мМ трис- HCI, рН 8,0 и центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин. К супернатанту, охлажденному до 4°С, добавл ют 80 мл трет-бутило- вого спирта, а затем сульфат аммони до концентрации 20%. После полного растворени соли раствор центрифугируют при 2000 g в течение 15 мин. Образовавшийс осадок раствор ют в 12 мл 50 мМ трис-HCI, рН 7,0 и удал ют сульфат аммони с помощью ультрафильтрации. Раствор коллагеназы нанос т на колонку с ДЭАЭ-сефарозой CL 6В (1.6x230 мм), уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создава градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагеноли- тическую активность, объедин ют, дианизу- ют против дистиллированной воды и лиофилизуют, Удельна активность коллагеназы равна 4000 ед. на 1 мг белка.

Пример 2. 26 г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,0 и центрифугируют при 9000 g в течение 25 мин. К супернатанту, охлажденному до 0°С, добавл ют 80 мл трет- бутилового спирта, а затем сульфат аммони до концентрации 20%. После полного растворени соли раствор центрифугируют при 8000 g в течение 5 мин Образовавшийс осадок раствор ют в 12 мл 50 мМ трис- HCI, рН 7,0 и удал ют сульфат аммони диализом против того же буфера Раствор коллагеназы нанос т на колонку с ДЭАЭ- сефарозой CL 6B (1,6x230 мм), уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создава градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагенолитическую активность, объедин ют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Удельна активность коллагеназы равна 4000 ед. на 1 мг белка.

П р и м е р 3. 22 г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл 50 мМ трис- HCI, рН 8,0 и центрифугируют при 150QO g в течение 20 мин. К супернатанту, температура которого равна 25°С, добавл ют 80 мл

трет-бутилового спирта, а затем сульфат аммони до концентрации 15%. После полного растворени соли образовавшийс осадок через 30 мин фильтруют, а затем его раствор ют в 12 мл 50 мМ трис-HCI, рН 7,0 и

удал ют сульфат аммони с помощью ультрафильтрации . Раствор коллагеназы нанос т на колонку с ДЭАЭ-сефарозой CL 6B (1,6x230 мм), уравновешенной 50 мМ -фис- HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создава

градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагенолитическую активность, объедин ют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют . Удельна активность коллагеназы равна 3900 ед. на 1 мг белка.

Пример 4. 23 г гепатопанкреаса крабов гомогенизируют в 80 мл и 50 мМ трис-HCI. рН 8,0 и центрифугируют при

10000 g в течение 20 мин. К супернатанту, нагретому до 35°С, добавл ют40 мл трет-бутилового спирта, а затем сульфат аммони до концентрации 20%. После полного растворени соли раствор центрифугируют при

4000 g в течение 10 мин. Образовавшийс осадок раствор ют в 12 мл 50 мМ трис-HCI, рН 7,0 и удал ют сульфат аммони с помощью ультрафильтрации. Раствор коллагеназы нанос т на колонку с ДЭАЭ-сефарозой

CL 6В (1,6x230 мм), уравновешенной 50 мМ трис-HCI, рН 7,0. Фермент элюируют, создава градиент при смешении стартового буфера с тем же буфером, содержащим 1 М NaCI. Фракции, содержащие коллагенолитическую активность, обьедин ют, диализуют против дистиллированной воды и лиофилизуют. Удельна активность коллагеназы равна 3500 единиц на 1 мг белка

Таким образом, изобретение позвол ет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделени и очистки коллагеназы крабов при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырь

Claims

Формула изобретени упрощени процесса, сырье гомогенизируют в буферном растворе, экстракцию

Способ очистки коллагеназы, предус-липидов осуществл ют смешиванием гоматривающий гомогенизацию гепатопанк-могената с трет-бутиловым спиртом до кореаса крабов, экстракцию липидов из5 нечной концентрации 30-50 об.% при

гомогената, осаждение сульфатом аммо-0-35°С, а осаждение фермента провод т

ни и очистку ионообменной хроматогра-сульфатом аммони , довод его концентфией , отличающийс тем, что, с цельюрацию в растворе до 15-20 мас.%.