RU2039819C1 - Способ получения коллагеназы - Google Patents
Способ получения коллагеназы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2039819C1 RU2039819C1 SU4806987A RU2039819C1 RU 2039819 C1 RU2039819 C1 RU 2039819C1 SU 4806987 A SU4806987 A SU 4806987A RU 2039819 C1 RU2039819 C1 RU 2039819C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- membrane
- collagenase
- kda
- prepared
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, а именно препаративная биохимия, изобретение может быть использовано в меховой и кожевенной промышленности, в ветеринарии и медицине. Сущность изобретения: в качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас крабов. Выделение проводят при смешивании гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз при температуре 0 30°С в течение 2 8 с, с раствором хитозана, pH 2,0 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01 0,4 мас. а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с мол. м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 кДа и ниже, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800 11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и используется для получения очищенной коллагеназы животного происхождения, которая находит применение в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии, ветеринарии и медицине, в научно-исследовательской работе.
Известен способ получения коллагеназы, который заключается в выделении фермента из гепатопанкреаса краба Uca pugilator с помощью гомогенизации ткани в 10 объемах ацетона при -20оС, обработке осадка 10 объемами н-бутанола, затем 10 объемами ацетона при -20оС, после чего проводились сушка, растворение порошкообразного препарата, центрифугирование, осаждение из раствора фермента сульфатом аммония (70% от насыщения) при 0оС, гельфильтрация на сефадексе G 150, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на гидроксилапатите и повторная гель-фильтрация на сефадексе G75. Все хроматографические операции проводились при 4оС. В результате получен гомогенный препарат коллагеназы с удельной активностью 4020 единиц на 1 мг белка [1]
Недостатком данного метода является его многостадийность, применение в больших количествах органических растворителей, являющихся взрывоопасными (например ацетон, температура вспышки которого равна -18оС) и экологически грязными, а также необходимость создания низких температур на первых стадиях выделения коллагеназы.
Недостатком данного метода является его многостадийность, применение в больших количествах органических растворителей, являющихся взрывоопасными (например ацетон, температура вспышки которого равна -18оС) и экологически грязными, а также необходимость создания низких температур на первых стадиях выделения коллагеназы.
Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов с помощью гомогенизации ткани в буферных водных растворах с рН 6-9,5, содержащих неионный детергент в количестве 0,1-5% и 0,1-2,0 М хлорида щелочного металла, после чего последовательно проводились микрофильтрация и ультрафильтрация с лимитом пропускания 5000 Да. В результате получен препарат коллагеназы с удельной активностью не ниже 10000 единиц на 1 мг белка [2]
Известный способ позволяет получать коллагеназу краба без применения органических растворителей, что является большим биотехнологическим достижением, все же и он не лишен серьезных недостатков. Так, в способе используются высокие концентрации поверхностно-активных веществ (неионный детергент) и солей (хлориды щелочных металлов), веществ, способных разрушить экологическое равновесие окружающей среды. Применение же очистных сооружений приведет к резкому удорожанию процесса выделения колагеназы. Другим серьезным недостатком является отсутствие стадии удаления липидов, содержание которых в гепатопанкреасе крабов очень высокое. Это существенно сказывается на стабильности конечного продукта из-за окисления липидов и эффективности проведения ультрафильтрации, так как рабочие мембраны быстро выходят из строя. Кроме того, последовательное проведение микрофильтрации и ультрафильтрации с лимитом пропускания 5 кДа позволяет отделять коллагеназу лишь от надмолекулярных высокомолекулярных агрегатов и низкомолекулярных веществ. Невелика и скорость ультрафильтрации на мембранах с пределом пропускания 5 кДа.
Известный способ позволяет получать коллагеназу краба без применения органических растворителей, что является большим биотехнологическим достижением, все же и он не лишен серьезных недостатков. Так, в способе используются высокие концентрации поверхностно-активных веществ (неионный детергент) и солей (хлориды щелочных металлов), веществ, способных разрушить экологическое равновесие окружающей среды. Применение же очистных сооружений приведет к резкому удорожанию процесса выделения колагеназы. Другим серьезным недостатком является отсутствие стадии удаления липидов, содержание которых в гепатопанкреасе крабов очень высокое. Это существенно сказывается на стабильности конечного продукта из-за окисления липидов и эффективности проведения ультрафильтрации, так как рабочие мембраны быстро выходят из строя. Кроме того, последовательное проведение микрофильтрации и ультрафильтрации с лимитом пропускания 5 кДа позволяет отделять коллагеназу лишь от надмолекулярных высокомолекулярных агрегатов и низкомолекулярных веществ. Невелика и скорость ультрафильтрации на мембранах с пределом пропускания 5 кДа.
Целью изобретения является повышение качества целевого продукта и упрощение процесса.
Это достигается тем, что замороженный гепатопанкреас крабов помещают в слабощелочной забуференный раствор и инкубируют при перемешивании в течение 2-8 ч при температуре 0-30оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. Для удаления липидов к полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана, рН 2,0-6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01-0,4% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол. м. 100 КДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 КДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Все операции проводят при температуре выше 0оС. Удельная активность коллагеназы достигает 9800-11200 ед. на 1 мг белка. Целевой продукт не содержит липидов.
В предложенном способе удается отделить раствор от сопутствующих липидов и белков с мол. весом выше 100000 и ниже 30000, что приводит к более полному удалению примесных белков, а также изъять из процесса экологически грязные органические и неорганические соединения. Упрощение также достигается применением серийно выпускаемого оборудования для ультрафильтрации, что позволяет полностью автоматизировать весь технологический процесс.
Нижняя граница концентрации хитозана обусловлена тем, что при концентрации ниже 0,01% резко падает его флокулирующая способность, и в результате этого происходит лишь незначительное удаление примесных соединений из раствора фермента.
Верхняя граница концентрации хитозана обусловлена тем, что при концентрации выше 0,4% наблюдается агрегация молекул хитозана, которые не обладают флокулирующими свойствами и, соответственно их применение не приводит к очистке колагеназы.
Нижняя граница рН раствора хитозана обусловлена тем, что после добавления в раствор фермента хитозана с рН ниже 2,0 наблюдается инактивация коллагеназы.
Верхняя граница рН раствора хитозана обусловлена тем, что хитозан при рН выше 6,5 слаборастворим.
Нижняя граница температуры процесса гомогенизации определяется тем, что при температуре ниже 0оС водные растворы замерзают.
Верхняя граница температуры процесса гомогенизации определяется тем, что при температуре выше 30оС в данных условиях начинается наблюдаться инактивация коллагеназы краба.
Указанное время гомогенизации (2-8 ч) является минимальным временем, необходимым для полного растворения ткани, которое в свою очередь зависит от температуры процесса (при более низкой температуре необходимо вести дольше процесс, а при более высокой температуре гомогенизация заканчивается раньше). Сокращение времени гомогенизации приводит к неполному переходу фермента в раствор.
Выбор мембраны для ультрафильтрации на первой стадии, отсекающей вещества с мол. м. 100 кДа и выше, обусловлен тем, что эта мембрана, задерживая примесные соединения, совершенно не задерживает коллагеназу краба, в то время как доступные в настоящее время мембраны с меньшим диаметром пор (отсекают вещества с мол.м. 50 или 40 кДа) частично задерживают коллагеназу краба. Мембраны с промежуточными диаметрами пор не выпускаются.
Выбор мембраны для ультрафильтрации на второй стадии, отсекающей вещества с мол.м. 30 КДа и ниже, обусловлен тем, что эта мембрана, не задерживая примесные соединения, полностью задерживает коллагеназу краба, в то время как доступные в настоящее время мембраны с большим диаметром пор (отсекают вещества с мол.м. 50 или 40 кДа) часть коллагеназы задерживают, а часть пропускают. Мембраны с промежуточными диаметрами пор не выпускаются.
П р и м е р 1. 10 кг гепатопанкреаса камчатского краба помещают в 30 л забуференного трисом раствора рН 8,0 и инкубируют при перемешивании в течение 2 ч при температуре 30оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 5,5, доводя его конечную концентрацию до 0,2% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. выше 100 кДа, а затем примесные вещества с мол.м. ниже 30 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 11200 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.
П р и м е р 2. 10 кг гепатопанкреаса краба-стригуна помещают в 30 л забуференного боратом раствора рН 7,8 и инкубируют при перемешивании в течение 8 ч при температуре 0оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 2,0, доводя его конечную концентрацию до 0,4% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. 100 КДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 КДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 10800 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.
П р и м е р 3. 10 кг гепатопанкреаса синего краба помещают в 30 л забуференного карбонатом раствора рН 8,3 и инкубируют при перемешивании в течение 3 ч при температуре 20оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. 100 кДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 кДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 9800 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют. Таким образом, изобретение позволяет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделения и очистки коллагеназы крабов при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья.
Claims (1)
- СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ, предусматривающий гомогенизацию гепатонкреаса промысловых крабов в забуференных водных растворах с последующей ультрафильтрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта и упрощения процесса, гомогенизацию осуществляют путем автолиза, проводимого при перемешивании в течение 2 8 ч при температуре 0 - 30oС, к полученному раствору при перемешивании добавляют раствор хитозана с pH 2,0 6,5 до достижения концентрации 0,01 0,4 мас. и отделяют нерастворимый материал, а ультрафильтрацию ведут последовательно на мембране, отсекающей примесные вещества с мол.м. 100 КДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, и затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 КДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4806987 RU2039819C1 (ru) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | Способ получения коллагеназы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4806987 RU2039819C1 (ru) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | Способ получения коллагеназы |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2039819C1 true RU2039819C1 (ru) | 1995-07-20 |
Family
ID=21504333
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4806987 RU2039819C1 (ru) | 1990-03-29 | 1990-03-29 | Способ получения коллагеназы |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2039819C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009154502A1 (ru) * | 2008-06-09 | 2009-12-23 | Shmoilov Alexandr Mikhailovich | Способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью |
-
1990
- 1990-03-29 RU SU4806987 patent/RU2039819C1/ru active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
1. Biochemistmy, 1973, 12, p. 1814-1822. * |
2. Европейский патент N 0402321, кл. C 12N 9/64, 1989. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009154502A1 (ru) * | 2008-06-09 | 2009-12-23 | Shmoilov Alexandr Mikhailovich | Способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20170023065A (ko) | 미세조류 바이오매스로부터의 가용성 단백질의 추출 방법 | |
JP3278629B2 (ja) | コンドロイチン硫酸の分離精製方法 | |
CN101603038A (zh) | 一种溶菌酶的制备方法 | |
CN101089021A (zh) | 从微生物发酵液中分离提取透明质酸的方法 | |
AU637584B2 (en) | Method for the preparation of a biologically active substance | |
RU2039819C1 (ru) | Способ получения коллагеназы | |
US4552845A (en) | Method for separating lysozyme from egg-white | |
SU472491A3 (ru) | Способ получени жира и протеина из растительного материала | |
CN110256602B (zh) | 一种可得然胶纯化方法及应用 | |
US3794562A (en) | Process for the enrichment of proteins using polyethylene-imine | |
EP0065286B1 (de) | Verfahren zum Reinigen bzw. Anreichern von biologisch aktiven Proteinen und hierzu geeignetes Mittel | |
CN115368486A (zh) | 一种三元低共熔溶剂及其在克氏原螯虾壳甲壳素提取中的应用 | |
CA1221046A (en) | Method for separating lysozyme from egg-white | |
FR2600654A1 (fr) | Procede pour la filtration de gluten humide avec addition d'enzymes avant ou pendant la filtration | |
DE1966428C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslicher Penicillinacylase | |
RU2265052C2 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
RU2088112C1 (ru) | Способ получения свекловичного пектина | |
CN114107265B (zh) | 一种提取菠萝蛋白酶的工艺 | |
RU2765951C1 (ru) | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов | |
CS248011B2 (en) | Preparation method of water extracts of permanent composition with low content of fat and other contaminating components with high content of heparin | |
RU2096456C1 (ru) | Способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью | |
RU2352634C1 (ru) | Способ получения ферментного препарата из рыбного сырья | |
RU2269913C1 (ru) | Способ получения хитина | |
RU2160311C1 (ru) | Способ получения уриказы | |
RU2017496C1 (ru) | Способ выделения натриевой соли днк |