DE1966428C3 - Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslicher Penicillinacylase - Google Patents

Description

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f werden, um eine maximale Freigabe des Enzyms zu Eine Reinigung des Enzyms kann man nach dem

;| erreichen. Bei solchen Drücken jedoch wurden auch Rühren des Zellmaterials auch durch Ansäuern der

die Zellwände zerstört und große Mengen des Zeil- wäßrigen Enzym-Lösung auf pH 3,0 bis 6,0, beispiels-

materials in Lösung gebracht. In »Nature«, 167 weise auf 4,0 bis 5,0, Entfernung des ausgefällten in-

ΐ (1951), Seite 33 ist beschrieben, daß E. coli-Zellen 5 aktiven Materials durch Filtration und erneute Ein-

in kleinem Maßstab zersprengt werden konnten, wenn stellung auf den ursprünglichen pH-Wert erreichen.

sie aus einer Bombe durch einen Gasdruck von 34 Die Penicillinacylase, die in den oben beschriebe-

bis 61 at ausgetrieben wurden. nen zellfreien und gegebenenfalls teilweise gereinig-

- Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe be- ten wäßrigen Lösungen enthalten ist, kann auch da-

ϊ stand nun darin, wasserunlösliche Penicillinacylase ¹⁰ durch gereinigt werden, daß man die Enzymlösung

S herzustellen, die beispielsweise in Säulen für die kon- bei einem pH 4 bis 6, zweckmäßigerweise bei pH 4,5

tinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure bis 5,5, mit Tannin bis zu einer Endkonzentration von

verwendet werden kann. 300 bis 900 ppm in Gegenwart eines chelatbildenden

-f Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung Mittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure, das mit

: von wasserunlöslicher Penicillinacylase, wobei man '5 Eisenionen Komplexe bildet, behandelt. Der ge-

% einen Penicillinacylase bildenden Stamm von E coli bildete Enzym-Tanninkomplex kann in üblicher

fermentiert, ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Weise, wie beispielsweise durch Filtration oder Zen-

■■■ einer selbstreinigenden Zentrifugeii-Trennvorrich- trifugieren, isoliert werden. Er kann gewaschen und

J tung, die bei einer Temperatur zwischen 0 bis 50° C, getrocknet und von Wasser befreit werden, wie bei-

vorzugsweise bei 15 bis 40° C, arbeitet, und in der *° spielsweise durch Trocknen, besonders durch Be-

das abgetrennte Zellmaterial intermittierend inner- handlung mit organischen Lösungsmitteln, die mit

;;· halb von 0,05 bis 1,0 Sekunden, vorzugsweise inner- Wasser mischbar sind, wie Aceton.

halb von 0,1 bis 0,5 Sekunden, durch einen ringsum- Die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penilaufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 bis 1,5 mm, cillinacylase kann durch Auflösen des Komplexes in vorzugsweise 0,3 bis 0,7 mm, durch Aufbringungeines ^l5 Wasser bei pH 7 bis 9, beispielsweise 7,5 bis 8,5, in Ζ; Druckes von 34 bis 136 at, vorzugsweise 61 bis 75 wäßrige Lösung gebracht werden. Wechselweise kann '-: at, ausgestoßen wird, gleichzeitig die Fermentations- der Komplex auch mit einem Gemisch von Wasser : flüssigkeit entfernt und das Zellmaterial ausstößt, daß und n-Butanol, bei pH 4 bis 7, beispielsweise 4,5 bis ■'■■ man das ausgestoßene Zellmaterial unter Lösen des 5,5, behandelt werden. Eine dritte Methode zur AufEnzyms 0,10 bis 5,0 Stunden in Wasser von 10 bis 3° trennung des Tanninkomplexes besteht in der Be-50° C oder in Wasser unter Zugabe eines organischen handlung des in Wasser suspendierten Enzym-Tan-Lösungsmittels oder in Wasser unter Zugabe eines or- ninkomplexes mit einem anionischen Ionenaustauganischen Lösungsmittels sowie einer Base oder in scher, wie Diäthylaminoäthyl-Cellulose, welcher das Wasser unter Zugabe einer Base rührt, daß man die Tannin bindet und das Enzym an das Wasser abgibt, so erhaltene Enzymlösung von zurückgebliebenem 35 Die für diese Methoden notwendigen Wassermengen Zclimaterial und anderen festen Verunreinigungen sind wesentlich kleiner als jene in den ursprünglichen nach üblichen Verfahren befreit und daß man das so Enzymlösungen, und auf diese Weise erreicht man gereinigte Enzym mit einem aktivierten Polymerma- eine beachtliche Konzentrierung der enzymatischen terial umsetzt. Aktivität.

": Das ausgestoßene Zellmaterial wird bei 10 bis 4» Weiterhin kann die in irgendeiner oben beschriebe-

50° C, vorzugsweise bei 20 bis 40° C, während 0,10 nen Lösung enthaltene Penicillinacylase mit Hilfe ei-

bis 5,0 Stunden, zweckmäCIgerweise während 0,25 bis nes Ionenaustauschers konzentriert und weitergerei-

3,0 Stunden oder während 0,25 bis 1,0 Stunden, mit nigt werden. Hierzu wird das Enzym auf einem

einem wirksamen Rührer gerührt, um das Enzym zu kationischen Ionenaustauscher mit einer offenen

lösen, wobei gegebenenfalls in einer Konzentration 45 Struktur durch Überleiten der auf pH 3,5 bis 6, bei-

νοηΙ,Ο bis 5,0% ein mit Wasser unmischbares organi- spielsweise 4,0 bis 5,0, eingestellten Lösung des En-

sches Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Butyl- zyms durch eine Säule adsorbiert,

acetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol Wechselweise kann auch der Austauscher zu der

oder Chloroform, zugesetzt wird. Um die Extraktion gerührten Enzymlösung zugegeben werden. Die Acy-

des Enzyms aus dem ausgestoßenen Zellmaterial zu 50 läse wird danach aus dem Ionenaustauscher durch

erleichtern, kann zu dem Gemisch eine organische Eluieren bei pH 6,0 bis 8,0 mit schwachen Pufferlö-

Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder sungen, wie 0,2 M Ammoniumacetat oder Trishydro-

Ammoniak, oder eine tertiäre organische Base, wie xyammoniumacetat, freigesetzt.

Triäthylamin oder N-Äthylpiperidin, zugesetzt wer- Um reinere Präparate des Enzyms zu erhalten,

den, um den pH-Wert zwischen 6,5 und 9,0, beispiels- 55 können anorganische Ionen und niedermolekulare

weise zwischen 7,0 und 8,5, einzustellen und zu halten. Verunreinigungen aus den Enzymlösungen selbstver-

Die so erhaltene Enzymlösung wird, gegebenenfalls ständlich durch Dialysieren gegen Wasser entfernt

nach Verdünnung mit Wasser, von zurückgebliebe- werden. Stattdessen können die Lösungen, wenn nötig

nem Zellmaterial und anderen festen Verunreinigun- nach Konzentrierung durch Verdampfen bei einer

gen nach üblichen Verfahren, wie Filtration und/oder 60 Temperatur unterhalb 50° C auf eine geeignete Kon-

Zentrifugieren, und möglicherweise unter Zusatz von zentration von 25 bis 100 mg Trockengewicht je MiIIi-

entfärbenden Mitteln, klärenden Mitteln und Filter- liter, der Gelfiltration unterzogen werden.

Hilfsmitteln, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Cellu- Die so erhaltenen gereinigten Enzympräparate

losepulver, Diatomeenerde oder anderen festen, werden mit einem aktivierten Polymermaterial, wie

schwach adsorbierenden Mittein, befreit. Eine weitere 65 beispielsweise mit Bromcyan behandelten Polysac-

Methode ist die, das meiste Zellmaterial durch Zentri- chariden, umgesetzt, um ein trägergebundenes Enzym

fugieren zu entfernen und die darüberstehende Flüs- zu ergeben. Das Enzym kann in dieser Form mit einfa-

sigkeit zu filtrieren. chen Mitteln, wie beispielsweise durch Filtration, aus

der Reaktionslösung gewonnen werden. Die trägergebundenen Enzyme können auch in Säulen für die kontinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure benutzt werden.

Es wurde auch gefunden, daß mit erfindungsgemäß S hergestellter trägergebundener Penicillinacylase gewonnene 6-Aminopenicillansäure sehr wenig, wenn überhaupt, proteinhaltige Verunreinigungen mit Allergie erzeugenden Eigenschaften enthält. Dies ist von großer technischer Wichtigkeit, da es so möglich ist, Penicilline mit hypoallergenischen Eigenschaften direkt aus solchermaßen hergestellter 6-Aminopenicillansäure ohne zusätzliche Reinigungsverfahren zu gewinnen.

Die trägergebundene Penicillinacylase kann auch ^J5 zur Entfernung der Seitenkette von Penicillinestern, besonders von Estern von Benzylpenicillin verwendet werden. Außerdem wurde gefunden, daß die trägergebundenen Enzyme besser als die bisher benutzten Zellsuspensionen bei der enzymatischen Synthese von Penicillinen aus 6-Aminopenicillansäure und Vorläufern mit Seitenketten sind.

Beispiele
A) Fermentierung von Escherichia coli

Maiseinweichflüssigkeit (3 kg), Sojabohnenöl (135 ml), Paraffin (12 ml) und Cetanol (3 ml) in Wasser (150 I) wurden auf pH 6,0 mit 45%iger Natronlauge (165 ml) eingestellt und dann bei 124° C 30 Minuten in einem Fermentationsbehälter sterilisiert. Die Lösung wurde mit 100 ml einer 20 bis 24 Stunden fermentierten Kultur von E. coli geimpft und bei 25° C unter Belüftung und Rühren 18 Stunden inkubiert.

Maiseinweichflüssigkeit (300 kg), Sojabohnenöl (13,8 kg), Paraffin (1,22 kg), Cetanol (0,3 kg). Phenylessigsäure (21 kg) und Natriumchlorid (112 kg) in Wasser (140001) wurden mit 45%iger Natronlauge (40 kg) auf pH 6,6 eingestellt, und die Lösung wurde in einem Fermentationsbehälter bei 124° C30Minuten sterilisiert. Die Lösung wurde gekühlt und mit der oben gewonnenen Kultur geimpft und anschließend bei 25° C unter Rühren und Belüftung inkubiert. 24 Stunden nach der Impfung, nachdem der pH-Wert auf 8,2 angestiegen war, wurden die Bakterienzellen durch Zugabe von 180 1 Butylacetat abgetötet, und das Gemisch wurde anschließend gekühlt.

B) Reinigung der Penicillinacylasc-Lösung

a) Zur Isolierung des Zellmaterials wurde das Gemisch in einer selbstreinigenden Zentrifugentrennvorrichtung, wie sie in der Erfindungsdefinition angegeben ist, getrennt. Die ausgestoßene Bakterienzellenpaste wurde in 100 bis 120 kg-Anteilen gesammelt. Zu jedem Anteil wurden 3,0% Methylisobutylketon zugesetzt, und das Gemisch wurde dann mit Hilfe eines Rührers 25 Minuten homogenisiert. Die Gesamtausbeute an Zellmaterial betrug 325 kg.
Analyse des Enzmys in den verschiedenen Produktionsstufen ergab die folgenden Werte in Acylase-Einheiten, die entscheidend für die während der betreffenden Stufe zurückbleibende Enzymmenge sind (eine Acylase-Einheit entspricht der Enzymmenge, die in der Lage ist, in 1,5 Stunden bei pH 8,5 und 37° C eine Menge an Benzylpenicillin aufzuspalten, die 1 mg 6-Aminopenicillansäure äquivalent ist):

Fermentationskultur 5 E/ml

darüberstehende Flüssigkeit 0,33 E/ml

flüssiger Auslauf der Zentrifugentrennvorrichtung 0,28 E/ml

Bakterienzcllmaterial 212 E/g

darüberstehende Flüssigkeit in der Paste vor der Homogenisierung 75 E/g darüberstehende Flüssigkeit in der Paste nach der Homogenisierung 123 E/g

b) Homogenisierte Bakterienpaste (175 kg, Aktivität 190 E/g)wurde mit 175 kg Wasser verdünnt, und unter Rühren des Gemisches wurde ein Gemisch von Filterhilfsmitteln (55,6 kg) zugesetzt. Die Wasserphase wurde durch Filtration abgetrennt, und der Filterkuchen wurde mit 50 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen (290 kg) besaßen eine Aktivität von 48 E/g.

c) Bakterienpaste (1 kg, Aktivität 212 E/g) wurde mit Wasser (2,0 1) verdünnt, mit Hilfe von 0,5 η Natronlauge (220 ml) auf pH 8,5 eingestellt und dann 30 Minuten bei 20° C gerührt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0° C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen, durch Filtration geklärt und ergab 2,7 kg Lösung mit einer Aktivität von 50 E/g. Erneutes zweimaliges Suspendieren des Sedimentes in Wasser (1 I) während 5 Minuten bei pH 8,5 und nachfolgendes Zentrifugieren ergab eine zusätzliche Enzymlösung (2 kg, Aktivität 11 E/ g). Dies entspricht einer gesamten Aktivitätsausbeute von 74% wasserlöslicher Acylase.

d) Klare Acylase (1 kg, Aktivität 52 E/ml), die gemäß c) erhalten worden war, wurde 8 Stunden gegen strömendes Leitungswasser dialysiert. Die dialysierte Lösung ergab 20,5 g Acylase mit einer Aktivität von 2400 E/g (angegebene als Aktivität der festen Acylase nach Lyophilisierung).

e) Klare Acylaselösung (245 kg, Aktivität 48 E/g), die gemäß c) erhalten worden war, wurde gerührt und mit Hilfe von 9 M Essigsäure (2,2 kg) gemäß Anspruch 3 auf pH 4,5 eingestellt. Das Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt, und danch wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung mit 7 M Ammoniak (4,5 kg) unter Bewegen auf pH 8,0 eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch filtriert und die Lösung mit Hilfe von 9 M Essigsäure (2,0 kg) auf pH 5 eingestellt.Die Aktivität der Lösung (220 kg) betrug 47,5 E/g.

f) Gemäß c) erhaltene Acylaselösung (500 g, Aktivität 52 E/g) wurde gemäß Anspruch 3 auf pH 4 eingestellt und 15 Minuten bei O⁰C gerührt, um Proteinverunreinigungen auszufällen. Nach dem Zentrifugieren und Einstellen auf pH 7,5 wurde die erhaltene klare Lösung (500 g, Aktivität 40 E/g) gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert. Das gefriergetrocknete Produkt ergab 4 g mit einerAktivität von 4900 E/g.

C) Reinigung der Acylase mit Tannin

Gemäß Be) gewonnene Acylaselösung (185 kg, Aktivität 47,5 E/g) wurde gerührt und gemäß Anspruch 4 mit Äthylendiamintetraessigsäure (50 g) und anschließend mit einer Tanninlösung (166 g) und Natriutnsulfit (55 g) in Wasser (5,5 I) behandelt. Nach einstündigem Rühren wurde Kieselgur-Filterhilfsmittcl (1,5 kg) und Natriumsulfit (700 g) zugesetzt und

die Suspension filtriert, wobei man 3950 g feuchten festen Tanninacylaseniederschlag mit einer Aktivität von 1930 E/g erhielt.

a) Wie oben hergestellter feuchter Tanninacylaseniederschlag (3750 g, Aktivität 1930 E/g) wurde in 0,1 molarem Ammoniumacetat mit pH 5,0 (5,0 1) und Butanol (2,5 I) suspendiert. Natriumsulfit (50 g) wurde zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit Hilfe von Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Das Rühren wurde 20 Minuten fortgesetzt und das Gemisch filtriert. Die Wasserphase (6650 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde abgetrennt.

b) Der wie oben hergestellte Tanninacylaseniederschlag wurde filtriert und gemäß Anspruch 4 un- ¹S ter Rühren in 0,1 M Ammoniumacetatpuffer mit pH 8,0 (100 ml) suspendiert. Das Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt. Das Gemisch wurde filtriert und ergab 100 ml Acylaselösung mit 220 E/ml.

c) In Pufferlösung mit pH 8 (100 ml) suspendierter wie oben hergestellter feuchter Tanninacylaseniederschlag wurde gemäß Anspruch 4 mit 2-Diäthylaminoäthylcellulose (2 g, Kapazität 1,0

M Äquivalent/g) behandelt. Das Gemisch wurde ^a5 15 Minuten gerührt und filtriert und ergab eine Acylase'iösung (90 ml) mit 494 E/ml.

D) Reinigung der Acylase mit Ionenaustauschern

a) Die gemäß Bb) erhaltene Acylaselösung (5000 3< > ml, Aktivität 48 E/ml) wurde mit Hilfe von 9 M Essigsäure auf pH 4,6 eingestellt. Nach Stehen über Nacht in der Kälte wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung gemäß Anspruch 5 durch eine Ionenaustauschersäule geschickt (durch Vernetzung von Dextran erhaltenes Polysaccharid mit Sulfoäthylgruppen, Säulendurchmesser 8 cm, Säulenlänge 15 cm in 0,1 M Ammoniumacetat, pH 4,6). Die Säule wurde mit dem Ammoniumacetatpuffer von pH 4,6 (650 ml) gewaschen. Die Acylase wurde mit 0,2 M Ammoniumacetatpuffer von pH 8,0 eluiert. Die erhaltenen 640 ml besaßen eine Aktivität von 326 E/ml.

b) Eine gemäß Ca) erhaltene gereinigte Acylaselösung (5550 ml, Aktivität 800 E/m!) wurde auf pH 4,6 eingestellt und in gleicher Weise wie unter

a) behandelt. Man erhielt 2350 ml mit einer Aktivität von 1610 E/ml.

c) Die unter b) gereinigte Acylaselösung (230 ml, Aktivität 1610 E/ml) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von 24 ml konzentriert. 15 ml des Konzentrates mit einer Aktivität von 15000 E/ml wurden gemäß Anspruch 5 durch eine Ionenaustauschersäule (Durchmesser 2,5 cm, Länge 100 cm) geschickt. Die Acylase wurde mit entionisiertem Wasser eluiert. Man erhielt die Acylase in 108 ml, Aktivität 1710 E/ ml. Gefriertrocknung dieser Lösung ergab 1,8 g mit einer Aktivität von 92500 E/g.

d) Eine gemäß Bb) erhaltene Lösung (100 ml)

wurde Dialyse gegen destilliertes Wasser während 1 Stunde teilweise entsalzt und sodann mit Carboxymethylcellulose in der H ^-Form (kleine lonenkapazität, 1 mÄqu/g, etwa 40 mg/ml) gemaß Anspruch 5 behandelt. Der pH-Wert wurde auf 4,0 bis 4,5 eingestellt. Der Ionenaustauscher wurde abgetrennt und die adsorbierte Acylase durch Erhöhung des pH-Wertes auf etwa 6 und Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Phosphatpuffer eluiert.

E) Reinigung der Acylase durch Gelfiltration

Gemäß Ca) erhaltene Acylaselösung (150 g, Aktivität 166 E/g) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von 9 mm konzentriert, einer GeIfU tration auf Dextran-Ionenaustauscher in einer Säule von 3 x 80 cm zugeführt und mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Aktivität (21 200 E) wurde in 80 ml erhalten, die 15,2% des zugeführten Materials enthielten, wie auf der Grundlage der Adsorption bei 280 πιμ bestimmt wurde.

F) Bindung der Acylase an Polymermaterialien

a) Eine Agaroselösung (4%ig, 2,5 ml) wurde filtriert, und der isolierte feuchte Feststoff wurde 1 Minute bei pH 11,5 bis 12,0 in einer eiskalten wäßrigen Bromcyanlösung (5%ig, 2 ml) gerührt. Das feste Gel wurde durch Filtration gewonnen und auf dem Filter gut mit Eiswasser und eiskalter 1 ,Omolarer Boraxlösung gewaschen. Das Gel wurde dann in 0,1 M Borax (4 ml) suspendiert und mit E. coli-Acylase (Aktivität 159000 E/g; 0,106 g), erhalten gemäß Dd), 24 Stunden bei + 4⁰C gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das gewonnene feste Material sorgfältig auf dem Filter mit Wasser gewaschen und ergab 1,2 g festes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 679 E/g.

b) 25 dreidimensional vernetztes Dextran (0,100 g) wurde 8 Minuten bei pH 11,5 bis 12 mit einer eiskalten wäßrigen Lösung von Bromcyan (5%ig, 2 ml) gerührt und filtriert. Das gewonnene Gel wurde gut mit Eiswasser und eiskalter 0,1 M Boraxlösung (4 ml) gewaschen. Gemäß Dc) erhaltene E. coli-Acylase (Aktivität 159 000 E/g, 0,106 g) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei +4⁰C gerührt. Dann wurde das Gemisch auf pH 7,5 eingestellt und filtriert. Das feste Material wurde auf dem Filter mit Wasser gut gewaschen und ergab 0,3 g Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 212 E/g.

c) Das Experiment b) wurde mit dreidimensional vernetztem Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen (0,1 g) anstelle des obigen vernetzten Dextrans wiederholt. Die Ausbeute betrug 1,25 g feuchtes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 435 E/g.

d) Das Experiment b) wurde mit Cellulosepulver anstelle des obigen vernetzten Dextrans wiederholt. Die Ausbeute betrug 0,35 g Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 261 E/g.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslicher Penicillinacylase, wobei man einen Penicillinacylase bildenden S'amm von Escherichia coli fermentiert, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer selbstreinigenden Zentrifugen-Trennvorrichtung, die bei einer Temperatur zwischen 0 bis 50° C, vorzugsweise bei 15 bis 40° C, arbeitet, und in der das abgetrennte Zellmaterial intermittierend innerhalb von 0,05 bis 1,0 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 0,1 bis 0,5 Sekunden, durch einen ringsumlaufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 bis 1,5 mm, vorzugsweise 0,3 bis 0,7 mm, durch Aufbringung eines Druckes von 34 bis 136 Atmosphären, vorzugsweise 61 bis 75 Atmosphären, ausgestoßen wird, gleichzeitig die Fermentationsflüssigkeit entfernt und das Zellmaterial ausstößt, daß man das ausgestoßene Zellmaterial unter Lösen des Enzyms 0,10 bis 5,0 Stunden in Wasser von 10 bis 50° C oder in Wasser unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder in Wasser unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels sowie einer Base oder in Wasser unter Zugabe einer Base rührt, daß man die so erhaltene Enzymlösung von zurückgebliebenem Zellmaterial und anderen festen Verunreinigungen nach üblichen Verfahren befreit und daß man das so gereinigte Enzym mit einem aktivierten Polymermaterial umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktiviertes Polymermaterial ein mit Bromzyan behandeltes Polysaccharid verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinacylase in der Weise reinigt, daß man die wäßrige Penicillinacylaselösung nach dem Rühren des Zellmaterials in Wasser auf pH 3,0 bis 6,0 ansäuert, sodann das Zellmaterial abfiltriert und schließlich den pH-Wert des Filtrates wieder auf seinen ursprünglichen Wert einstellt.

4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinacylase in der Weise reinigt, daß man die extrahierte Penicillinacylase bei pH 4 bis 6 mit Tannin in Gegenwart eines chelatbildenden, mit Eisenionen Komplexe bildenden Mittels ausfällt, den Enzym-Tanninkomplex durch Filtration oder Zentrifugieren isoliert und sodann unter Freisetzung der Penicillinacylase in Wasser bei pH 7 bis 9 oder in einem Gemisch von Wasser und n-ButanoI bei pH 4 bis 7 auflöst oder die Penicillinacylase durch Behandlung des in Wasser suspendierten Enzym-Tanninkomplexes mit Diäthylaminoäthylcellulose, die das Tannin bindet, freisetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinacylase in der Weise reinigt, daß man eine auf pH 3,5 bis 6 eingestellte Lösung des Enzyms durch eine Säule eines kationischen Ionentaustauschers mit einer offenen Struktur schickt oder den Ionenaustauscher zu der gerührten Enzymlösung zusetzt und danach die Penicillinacylase aus dem Ionenaustauscher bei pH 6,0 bis 8,0 mit schwachen Pufferlösungen eluiert.

Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterien und Pilze Enzyme produzieren, die die Amidbindung in der 6-Stellung von Penicillinen hydrolysieren und allgemein als Penicillinacylasen oder -amidasen bezeichnet wer-

S den (siehe Bacteriological Reviews, 30, 1966, Seite 761). Bei der großtechnischen Produktion von 6-Aminopenicillansäure werden derzeit gewöhnlich Zellsuspensionen von Escherichia coli, die eine Acylase oder Amidase enthalten, verwendet. Da das En- zym aber weitgehend intracellulär vorliegt, muß das Penicillin notwendigerweise zuerst in die Zellkörper eindringen, um mit dem Enzym zu reagieren, was zu einer langsameren Reaktion führt. Der Zellstamm kann auch andere Enzyme enthalten, die das Penicillin

¹S oder die gebildete 6-Aminopenicillansäure durch Aufspaltung der /3-Laclambindung inaktivieren oder die die Zellkultur mit den Organismen, die solche Enzyme bilden, verunreinigen. Außerdem ist das Verfahren mit verfahrenstechnischen Nachteilen und Ausbeuteverlusten durch Adsorption an Zellmaterial verbunden, und unter Verwendung ganzer Zellen erhaltene 6-Aminopenicillansäure kann proteinhaltige Verunreinigungen enthalten, die in der Lage sind, gefährliche Allergien bei Menschen und Tieren hervor-

^a5 zurufen.

Alle diese Nachteile werden vermieden, wenn man ein zellfreies oder gereinigtes Enzympräparat verwendet. In der Literatur finden sich verschiedene Methoden, die gereinigte Enzympräparate aus Escheri- chia coli-Stämmen herzustellen versuchten. Gemäß »Hindustan Antibiotics Bull.«, 4 (1961), Seiten 48, 152 wurden in einem Phosphatpuffer suspendierte Zellen mit Ultraschallwellen behandelt, wobei eine 25fache Reinigung durch fraktionierte Ausfällung und mit einer Chromatographiersäule erreicht wurde. Gemäß »Nature«, 201 (1964), Seite 824 wird ein Enzympräparat geringer Reinheit durch Gefriertrocknung und Dialyse der filtrierten Kulturbrühe erhalten. Gemäß »Actd Microb. Acad. Scient. Hung.«, 12 (1966), Seite 395 erhielt man eine 40fache Reinigung eines E. coli-Enzyms durch Ammoniumsulfatausfällung und nachfolgende Calciumphosphatgeladsorption und Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Chromatographie eines Phosphatpufferextraktes von E. coli-Zel- len, die mit Ultraschallwellen behandelt waren.

Nach der JA-PS 26050/64 erhält man eine mäßige Ausbeute an gereinigtem Enzympräparat von E. coli durch Extrahieren der Zellen mit Boratpuffer über längere Zeitdauer oder über kürzere Zeit in Kombi nation mit Ultraschallwellenbehandlung. Aus dem Extrakt konnte das Enzym in fester Form nach Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und Gefriertrocknung erhalten werden.

Nach der US-PS 3 297 546 bekommt man eine Lö-

sung eines Enzyms aus E. coli durch Behandlung der Zellkultur mit einer Verbindung wie Ca(NO₃J₂ und quaternären Ammoniumverbindungen, Abfiltrieren der Zellen und Suspendieren derselben in Wasser während einiger Stunden sowie anschließende Entfer nung der Zellen durch Filtration mit nachfolgender Behandlung des Filtrates mit Aktivkohle.

Es ist außerdem bekannt, daß in Bakterienzellen enthaltene Enzyme beim Extrudieren von Zellsuspensionen unter hohem Druck durch ein enges Mund- stück freigegeben werden. Gemäß »Appl. Microbio!.«, 11 (1964), Seite 467, wo Untersuchungen mit anderen Enzymtypen als Penicillinamidasen beschrieben sind, muß Hochdruck über 1000 at angewendet