DE2037646A1

DE2037646A1 - Verfahren zur Gewinnung von Ferment lösungen

Info

Publication number: DE2037646A1
Application number: DE19702037646
Authority: DE
Inventors: Steven H Rockway Township NJ Corwin (VStA) P
Original assignee: Drew Chemical Corp , New York, N Y (VStA)
Priority date: 1969-07-29
Filing date: 1970-07-29
Publication date: 1971-02-11
Also published as: NL7011122A; CH525699A; CA940470A; IT977950B; FR2053256A1; BR7020915D0; FR2053256B1; GB1323902A; BE754018A; NL149227B

Description

DB. ING. E. HOFFMANN DIPL, ING. W. EITLE · DB. BEB. NAT. K HOFFMANN

PATENTANWÄLTE UJ/O

D-8000 MÖNCHEN 81 · ARABELLASTRASSE 4 · TELEFON (0811) 911087

US-Oase 845 870 19 278

Drew Chemical Corporation, New York, 'S.Y., USA

Verfahren zur Gewinnung von Permentlösungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von lermentlösungen· Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Pilz- und Bakterienfermentationslösungen« Die erfindungsgemässen Reinigungsverfahren sind bei der Herstellung von Enzymen, .Antibiotika, organischen Säuren unt anderen wertvollen Materialien nützlich.

Die vorliegende Erfindung liefert ein ?erfahreÄ_f ait dem Enzyme, Antibiotika und Säuren im wesentlichen frei von irgendwelchen nachweisbaren Mengen an Verunreinigungen herstellen kann. Insbesondere liefert di© Erfindung ein Verfahren fur die verbesserte Abtreaniung^ tee gewänaohten-materials* .tee in der flüssigen Phase vorliegt, voa den Venmreinigangen_f die zusaamen mit dem unlöslichen suspendierten Material n@.eh -Beendigung einer .liltratioii®- oder Zentrifugieretufe

Fermentationsvirfahren werden in bafetorienartige raut pilaarti- :g© Verfahren'eingeteilt· Seide - Verfahren sind' Jefiöeh in ihrer' Durchführung im wesentlichea ähnlich. Bakterienf@rmes.tations-> verfahren werden für ■■$.!& Heretellvng von Enaymen verwendet» * ^: .FilsfermentationaTerfehren werden für die Herstellung ves Bn-

- 2 zymen, Antibiotika und organischen Säuren verwendet.

Fermentationsverfahren sind in der Technik gut bekannt. Es gibt sie bereits seit 100 Jahren. lernte beginnen solche Verfahren mit der trockenen Präparation von Zellen, von Organismenteilen bzw. Zellstrukturen» wobei die Organismen durch Gefriertrocknung einer Suspension des Organismus in flüssigem Medium oder einer Dispersion des Organismus erhalten wurden, von Sand oder von Erdboden. Die erste Stuf© "besteht darin, dass man eine Kultur auf Agar oder einem ähnlichen Medium züchtet· Oft verwendet man in Verbindung damit Salslösungen_e Das Agar wird inkubiert, bis ausreichendes Wachstum aufgetreten istο Dann können die Zellen von der Oberfläche entfernt und in einen Schütte.lkolben überführt werden. Schüttelkolben sind konische Kolben mit oder ohne kugelförmigen Ausbuchtungen in den Wänden und sie werden deshalb so genannt, weil sie in eine ScMittelisaschine gegeben werden, die ά®η Kolben entweder durch Drehung oier durch Hin- und Herbewegung schüttelt in @i- nem Raum;, iessea Temperatur kontrolliert wird*, Durch di© Sohüttelbewegung Hiimt die Waciistraasgeselwiadigkait sehr''zu» ".. was wohl hauptsächlich äaxauf. ssurück2%if{ibre£i'ist₉ dass d-er". Sauerstoff- und. KolilemSioxytaastattscfe verbessert ist und dass submerses Wachstum raai niefet w$&~ Wachstum aa der Oberfläche "■ '. auftritt· MancJamal verweafist asa mehr als nur eine Sehüttelkol-" beiLstufe, dajBit aaa geai;g©aä laseialrai ©äer ^wBaat bzw«, Impf-" keime¹¹ für das erst® BaatloiltmE-gsfäs-s sÄält_o Dieses Gefäss :±st so eingei*ieJi"feet₃ dass mss seia© SsapQE^-fei^ k@ati?©llier@i3, kann, dass βε bgllft^aE· igt laai, ia®© esa 1εο1ι©β- ©ataeiaaea kssa uad -■ dass nan siis Eoats?©ll@ i@© pK^UQ^t©® isa€ Sos Schaums Zuästzstoffe si'egeibeB. k©sao la>©M@a o.iiiisg'QieMiiM U&öfos'ttam aufg@treten ist, wire!, die gast ia @ia guQiis©©* §QfIns naf vielleicht in .ein drittes tiberfv&jst ₉ bis i

für das IP^o

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Bei der Saatstufe war es das Ziel, spezifische Zellen zu züchten, bei dem Produktionsfermentgefäss ist es das Ziel, das Substrat auf möglichst wirtschaftliche Weise in das gewünschte Material zu überführen. Bei dieser Betriebsstufe wird die Produktbildung anstelle des Wachstums gewünscht.

Während der Fermentationsstufen schwankt ebenfalls die Geschwindigkeit , wie sich das Produkt ansammelt. Einer Anfangsperiode von langsamer Produktbildung folgt eine Stufe von rascher Ansammlung, wonach wieder eine Abnahme in der Geschwindigkeitsbildung des Produktes folgt.

Die Optimierung der Bedingungen für das Wachstum und die Produktbildung, wobei derartige Bedingungen beispielsweise die Temperatur, den pH-Wert, die Rührweise und die Säuerstofferfordernisse einschliessen, hängt von der Art des hergestellten Produktes ab. Ss wird angenommen, dass die Fähigkeit, diese Variablen zu kontrollieren, vorhanden ist. Daraus folgt, dass die Kontrolle der Gewinnung des Endprodukte eine enge Zusammenarbeit zwischen den Bjblogen, die die Permentationsverfahren bearbeiten, den Verfahrenstechnikern^ der Reinigungsanlage und den Technikern bei der Produktgewinnung erfordert. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, dass man bei der Produktgewinnung den gesamten Inhalt des Permentiergefässes wiedergewinnt, ohne dass man die Zellen von dem Medium trennen muss, beispielsweise, wenn man die lösungsmittel aus dem Bier bei der Aceton-Bierfermentation abstreift. Gelegentlich kann man ein Produkt aus der Flüssigkeit und ein anderes. Produkt aus den Zellen isolieren. Im allgemeinen ist jedoch das gewünschte Produkt entweder in den Zellen oder in der Flüssigkeit. Daraus folgt, dass die erste Stufe bei der Gewinnung des Produktes darin besteht, dass man die zwei Phasen abtrennen muss. Oft kann die Abtrennung durch Vorbehandlungen, wie Einstellung des pH-Wertes oder Einstellung der Temperatur, erleichtert werden. Bei den Permentati onslösungen, die dem erfindungsgemässen Verfahren unterworfen werden,befindet sich das gewünschte Pro-

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- 4 -dukt in dem Fi It rat (in der Flüssigkeit)«,

Es ist gut bekanntι dass die Wahl der verwendeten Trennverfahren sowohl von dem suspendierten Feststoff als auoh von dem danach verwendeten Crewinnungeverfahren unabhängig ist. Allgemein gesagt, kann die Gewinnung des Endproduktes in ein Zweistufenverfahren geteilt werden. Bei der ersten Stufe erhält man ein rohea Produkt, vorzugsweise einen Feststoff, während bei der zweiten Stufe ein reines Produkt erhalten wird· Sie ■Auswahl-des Verfahrens, das man in dem besonderen Fall anwendet, hängt natürlich von der Art des Produktes, seiner Stabilität unter den verschiedenen Bedingungen und der Selektivität des gewählten Verfahrene ab« unter den Verfahren, die zur Gewinnung von Endprodukten aus Lösungen bekannt sind, sollen die Lösungsmittelextraktion, die Trennung durch Ionenaustausch, Adsorption und Chromatographie erwähnt werden·

Über die wichtige Rolle, die Fermentationsprodukte in der modernen Medizin spielen, muss wenig gesagt werden· Die Öffentlichkeit ist sich der Verwendung der modernen Wunderarzneimittel, wie Penicillin und Tetracyclin wohl bewusst, die beide durch Fermentationsverfahren hergestellt werden.

Während der letzten Jahre wurden viele neue und ausgedehntere Verwendungen für Pilzenzyme entwickelt. Die Verwendung von Pilzenzymen für die Umwandlung von Stärke und Sextrinen in Busse geniessbare Nahrungsprodukte, wie süsse Sirupe, getrocknete Zucker und kristalline Sextrose, ist nur eine der vielen Anwendungen von diastatischen Pilzenzympräparationen.

Zn den letzten Monaten fanden bestimmte Enzyme, nämlich die Proteasen und Amylasen, wegen ihrer Fähigkeit bei der Entfernung von Flecken, wie Blut, Schokolade und Tinte aus verschmutzter Kleidung, nützlich zu sein, besonderes Interesse. Siese Flecken konnten zuvor nicht durch blosse Wirkung eines oberflächenaktiven Mittels entfernt werden.

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Bedingt durch das neue Interesse in den Enzymen wegen ihrer Verwendung als Fleckenentferner, wurde ein schnelleres und billigeres Verfahren "benötigt, um das Filtrat des Fermentationsverfahrens, das das Enzym enthielt , von den Verunreinigungen, die darin suspendiert waren, zu trennen. Es wurden daher Versuche unternommen, um diese Enzymlösungen leichter reinigen zu können. Schliesslioh hat man gefunden, dass das erfindungsgemässe Verfahren nicht nur als Hilfe bei der Herstellung von Pilzenzymen verwendet werden kann, sondern im wesentlichen bei jedem Fermentationsverfahren, bei dem sich das gewünschte Produkt in dem Filtratteil der Fermentationslösung befindet·

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung bzw. Klärung von Enzymen und antibiotischen Fermentationslösungen·

Ein weiterer „Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen und Antibiotika aus diesen Lösungen in hoher Ausbeute.

Bin anderer Gegenstand der Erfindung ist die Entfernung unerwünschter Feststoffe aus Fermentationslösungen, die die gewünschten Produkte enthalten·

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Ausflockungsverfahren für dit Abtrennung von suspendierten_f unlöslichen Verunreinigungen aus Enzym-, Antibiotika- und Säurelösungen.

und andere Ziele und Vorteile werden durch das erfindimgsgemäese Verfahren gelöst, das auf der Feststellung beruht, dass ■an den Pereentationelöeungan bestimmte epesifieoh· Ausflockung·- Mittel luftigen kann. Daduroh werden diese Lösungen »o gereinigt, dass dl· gewünschten Endprodukte in der Endlösung bleiben und frei von Verunreinigungen sind, die durch da· Ausaockungs-

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- 6 mittel agglomeriert werden.

Über die Ausflockungsreaktion bei der Trennung von Feststoff-Flüssigkeit wurde viel geschrieben. Das Gebiet der Trennung von Feststoff-Flüssigkeit gilt als sehr schwierig, trotzdem wurde viel geschrieben, das für leute, die sioh mit diesem Gebiet beschäftigen von Nutzen ist· Hier soll beispielsweise nur auf die Publikationen von La Her, Black und Biddick hingewiesen werden.

fc Die Ausdrücke Koagulation und Ausflockung werden oft miteinander im Wechsel verwendet, man sollte dies abe-r nicht tun. Der Ausdruck Ausflockung sollte auf seineursprüngliche Bedeutung innerhalb der Definition des lateinischen Wortes flocculus, was ein kleines Büschel Wolle oder ein loses faserartiges Gefüge bedeutet, beschränkt sein. Ausflockung gemäas La Her tritt im allgemeinen durch die Wirkung von Materialien mit hohem Molekulargewicht auf, wie Polyelektrolyten, die eine Brücke bil-

den und dadurch zwei oder mehrere feste Teilchen zu einem Eandomgefüge vereinigen, welches dreidimensional und von loser und poröser Art ist·

Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sollen solche Gebiete, P wie Adsorptionsisothermen, die Kinetik der Adsorption und Desorption und die Thermodynamik der Umsetzung nicht diskutiert werden·

Es ist ausreichend zu sagen, dass ein® kolloidale Dispersion, der man ein Ausflockungsmittel zufügt, von dem dlepergierten Zustand in den ausgeflockten Zustand übergeht mg eventuell zurück in den dispergiertem. Zustand genäse der BseimflusBung * die durch die verschiedenen Tari&blemr al® al® Wasetsraag "be- : ~ wirken, hervorgerufen wird. Is ist somit ereieiitlien, dass eine graphisch· Darstellung der FiltratioiiffigescliwimiigteltsTerlei- serung (bestimmt durch die Zeit, die erforderlich lot, um ein bestimmtes Yolumenfiltrat su sammeln) aufgetragen gegen die Konzentration des Aueflockungsmittels in der Zeichnung eine tiefe

Hulde

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zeigt· Saraus ist ersichtlich, dass es möglich ist, eine optimale Konzentration des Ausflockungsmittels zu bestimmen, um eine maximale Filtrationsgeschwindigkeit zu erhalten. Andere Variablen, die die Ausflockungsumsetzung beeinflussen, schliessen das Molekulargewicht des Ausflockungsmittel, die Stärke des Rührens und die Bührzeit des dispergieren Materials ein. Man nimmt an, dass die Kontrolle aller dieser Variablen, die auf dem Gebiet der Flüssigkeits-Feststofftrennung auftreten, möglich ist.

Es ist bekannt, dass quaternäre Ammoniumhalogenide als Ausflockungsmittel bei der Herstellung von 6-Aminopenicillansäure verwendet wurden. In diesem Zusammenhang soll auf die US-Patentschrift Nr. 3 278 59¹ hingewiesen werden. Das Verfahren dieser Patentschrift ist jedoch nur sehr spezifisch, d.h. es bezieht sich nur auf die Herstellung einer Verbindung, wohingegen das hierin beschriebene Verfahren allgemein und auf jede Fermentationslösung anwendbar ist. Während in der erwähnten Patentschrift das gewünschte Endprodukt zusammen mit dem Ausflockungsmittel agglomerierte, entfernt im vorliegenden Fall das Ausflockungsmittel nur Verunreinigungen und das gewünschte Produkt bleibt in der Flüssigkeit, aus der es durch Ausfällen, Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschadsorption oder Verdampfung gewonnen werden kann.

Die Verbindungen, die das erfindungsgemässe Ausflockungsmittel enthalten, werden ausgewählt unter der Klasse von (A) PoIyaminkondensationspolymeren und (B) Polyvinylimidazolinen, wie auch Mischungen von (A) und (B).

Insbesondere sind Verbindungen der Klasse (A) Umsetzungsprodukte von einem oder mehreren bifunktionellen oder polyfunktionellen Aminen, die mindestens zwei Amingruppen enthalten und die Formel:

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(I) H₂Ii £~ (CHQ)_x - HH J- H

besitzen, worin Q H, eine Alky !gruppe mit 1'bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Aminoalky!gruppe bedeutet, worin der Alkylteil .1 Mb 4 Kohlenstoff atome enthält» χ eine ganze Zahl von 2 bis einschliesslich 8 und y eine ganze Zahl von 1 bis einschliesslich 4 bedeuten, mit einer Verbindung der formel.%

(II) I - C CH₂ J_% - H

worin I und M," die gleich oder verschieden sein können, Chlor _t Brom, Jod und -CH - CH₀ bedeuten und ζ eine ganze Zahl von

1 bis 4 bedeutet.

Verbindungen der Klasse (A) besitzen ein Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 10 000 bis ungefähr 1 000 000_$ wobei 40 000 bis 150 000 bevorzugt ist«

Bei der Herstellung der Verbindungen der Klasse (A) können viele Verbindungen der Formel (i) verwendet werden« Unter diesen sollen Butylendiamin, Pentamethylendiamin, Propylendiamin, Hexamethylendiamin, Octyldiamin, Bishexamethylentriamin, Eiste tr ame thylentriamin, Bisäthylentriamin, !Eetramethylenpentamin, Diäthylentriamin etc. erwähnt werden«.

Unter den Verbindungen der Formel (II), die bei der Umsetzung verwendet werden können, sollen lthylendichlorid_9i Propylendibromid, Hexamethylendijodid, Epichlorhydrin₉ Brom-propylenoxyd, Bromäthylenoxyd, 1-Chlor-epoxybutan, 1 _i)2_j)3D4--Diepoxy~ butan und 1,2,5,6-Diepoxyhexan erwähnt werden®

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Verbindungen der Klasse (B), die γοη Interesse sind, sind PoIyvinylimidazolinpolymere, d.h. solche, deren Kohlenstoffpolymerisatgrundgerüst cyclische Seitenstrukturen der Formel:

(III) -C=N

R- Ii CH-T_n, N/ ^m

^GH2
besitzt, worin T Γ (CH₂)_V CH₅ 1

bedeutet, R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen,

ν eine ganze Zahl von 1 bis 3, m 1 oder 0
w 1 oder 2

bedeuten, wobei die Polymerisate, die cyclische Seitenstrukturen besitzen, durch Umsetzung einer Aminoverbindung der Formels

(IV) H

-ir -

worin R, m und w die oben gegebene Definition besitzen und q. 1 oder Q bedeutet, mit einem Polymerisat hergestellt wurden, das ein Kohlenstoffatomgrundgerüst und eine Vielzahl von Seittnnitrilgruppen enthält, wobei daa Polymerisat, das die Seitennitrilgruppen enthält, durch Polymerisation eines ungesättigten Nitrile allein oder xusamraen mit einem äthylenisoh ungesättigten Monomeren erhalten wurde.

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Als Beispiele von Verbindungen der Formel (IV) seien~erwähnt Äthylenamin, Xthylendiamin, Propylendiamin, Diäthylentriamin, Hexamethylendiamin, N-Butyläthylendiamin.

Als Beispiele für nicht-gesättigte nitrile seien erwähnt Acrylnitril, Methacrylnitril, Cyanostyrol, Vinylidendicyanid«

Typische äthylenisch ungesättigte Monomeren, die mit den Nitrilen mischpolymerisiert können, schliessen ein Butadien, 2-Penten, Vinylchlorid und Acrylamid.

Der Mechanismus für die unerwartete Wirksamkeit dieser besonderen Ausflockungsmittel ist nicht ganz bekannt· Man nimmt an, dass das polymere Material !covalent bzw. semipolar an dem Kohlenstoff atomgrundgerüst gebunden ist, so dass, wenn zwei oder mehr Seuchen des suspendierten Materials, von denen jedes eine negative Ladung trägt, an das kationische Polymerisat durch die positiven Ladungen angezogen werden, die Teilchen "wirksam" kovalent gebunden werden« Somit kann man sagen, dass die zwei Teilchen, die jeweils an das Polymerisat ionisch gebunden sind, als semipolar gebunden betrachtet werden können, durch die kovalenten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen in dem Polymerisat* grundgerüst. Man nimmt an, dass weitere !Feilchen innerhalb der Grenzen.der stereogeometrischen Hohlräume, die zwischen den zuvor erwähnten neutralisierten Teilchen verhandln sind_t eingeschlossen werden.

Ss ist ersichtlich, dass man diese Theorie der kovalenten Bindung und ans Sinschliessens nicht auf quaternär® AiBmoiiiuiisysteile anwenden kann, da diese Moleküle nur eine einfach© positive Ladung besitzen.

Obgleich diese Theorie in der Tat dasm ai@23.sm kaasa, di® Wirkung der erfindungsgemäasen Ausflockungsmittel zu erklären, erklärt sie nicht, warum ander© polymers Affiefloe&ungsBitt®! gefunden wurden, die bei der Reinigung von Paraentationslö-

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- 11 sungen nicht wirksam sind.

Gemäss dem vorliegenden Verfahren wird eine Fermentationslösung nach üblichen Verfahren hergestellt. Diese Lösung kann von der Pilzart oder der Bakterienart sein·

Typische Bakterienlösungen, die gereinigt werden können, schliessen ein Proteasen, Amylasen und Lipasen. Typische PiIzlösungendie nach diesem Verfahren gereinigt werden können, schliessen solche für Antibiotika, wie Penicillin und Tetracyclin ein und Lösungen, aus denen man organische Säuren, wie Zitronensäure, gewinnt.

Obgleich das Reinigungsverfahren in dem Fermentationstank ausgeführt werden kann, ist es aus wirtschaftlichen Gründen das Beste, dass man die Lösung in ein Aufbewahrungsgefäss pumpt oder sonstwie überleitet, bevor man das erfindungsgemässe Verfahren anwendet. In das Aufbewahrungsgefäss werden ein oder mehrere der zuvor erwähnten Ausflockungsmittel in einer Menge von 0,05 Gew.-56 bis ungefähr 5,0 Gew.-$> der gesamten Lösung zugefügt. Oft ist es wünschenswert, zu dem Material, das ausgeflockt werden soll, eine Filterhilfe zuzufügen, wie eine, die unter dem Namen Supercell verkauft wird.

Genau wie das Ausflockungsmittel, wird die Filterhilfe entweder kontinuierlich oder chargenweise in den Tank oder ein entsprechendes Äquivalent, wie einen Trog, gegebene

Die suspendierten Teilchen, im allgemeinen in einer Randomverteilung, sind von I/IO Mikron bis mehreren Mikron lang und werden durch das Polymerisat agglomeriert und akkumulieren in diskreten Teilchen in einem engen Grossenbereich, nämlich mehreren Millimetereinheiten bis ungefähr 1 bis 2 cm in ihrer grössten Dimension und sie können daher sehr leicht durch Zentrifugieren oder durch Filtration abgetrennt werden.

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Die Lösung wird nach bekannten Verfahren ein oder mehrere Male filtriert oder zentrifugiert, so dass die Verunreinigungen bei der Trennung bei dem Ausflockungsmittel verbleiben und sich das gewünschte Produkt in dem Filtrat oder in der zentrifugieren lösung befindet, woraus es beispielsweise im Falle des Terramycine durch Ausfällung abgetrennt werden kann. Andere Abtrennverfahren schliessen Ionenaustausch und !lösungsmittelextraktion ein·

Die FermentationslÖeung kann entweder kontinuierlich oder ansatzweise auf gleiche leichte Weise ausgeflockt werden.

Die Möglichkeit, nach dem erfindungsgemässen Ausflockungsverfahren das Piltrat, das das gewünschte Produkt enthält, von den suspendierten Teilchen abzutrennen, liefert höhere Ausbeuten und grössere Reinheit der Endprodukte als es zuvor mit anderen Trennverfahren für Fermentationslösungen möglich war.

Der Grund dafür, dass man höhere Ausbeuten des Enzyms aus den flüssigen Präparationen erhält, steht in Beziehung zu der Natur der Enzyme und der Antibiotika selbst· In wäßrigen Lösungen sind sie unstabil und neigen dazu, sich zu zersetzen. Es ist daher ersichtlich, dass bei den üblichen Filtrationssystemen in technischem Maßstab, die von 10 bis 12 Stunden pro Ansatz erfordern können, eine grosse Menge des Produktes wegen Zersetzung verlorengeht. Verwendet man jedoch die hierin beschriebene Ausflockungszusammensetzung, so wurdt gefunden, dass für einen Ansatz ähnlicher Grosse die Filtrationszeit auf 6 bis β Stunden erniedrigt werden kann. Nach Beendigung dieser Filtrationsstufe kann das gewünschte Produkt aus der Lösung isoliert werden, beispielsweise durch Trocknen. Da sich weniger Produkt zersetzt hat, ist es ersichtlich, dass die Endauebeute höher sein wird.

f\ f\ Λ η λ η ι'» λ #» λ

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Yon Bedeutung ist noch, daara die verwendeten Ausflockungsmittel die gewonnenen Produkte nicht nachteilig beeinfluaaan*

Durch. Verwendung des erfindungsgemässen Auafloekungaverfahrens erhält man vor der Trennung der llüsaigkeit,- die daa gewünachte Produkt enthält, τοη den ungewünschten Feststoffen* verachie— dene Vorteile.

Obgleich Geschwindigkeitsuntersuahungen für die Trennverfahren durch Zentrifugieren und Ionenaustausch nicht vorhanden sind, wurde gefunden, dass die Piltrationsgeschwindigkeiten bis zu 500 $> zugenommen haben. Weiterhin wurde gefunden, dass die Trübung de» EndlöBung verbessert war, waa ein Anzeichen für die Reinheit des Endproduktes darstellt wegen der Entfernung der überschüssigen unlöslichen Stoffe, wie der Nährstoffe, durch die hierin verwendeten Ausflockungsmittel.

Ea wurde gefunden, dass man oft die Menge an Entfärbungsmittel, die man verwendet, um die gewünschte Farbe zu erhalten, vermindern kann· Weiterhin wurde gefunden, dass die Zahl der lebensfähigen Keime um soviel wie 50 £ erniedrigt wurde, wenn man die Lösung der Ausflockungsbehandlung unterwirft· Es ist bekannt, daas lebensfähige Keime, wenn sie nicht kontrolliert werden, wachsen und schliesslich zu der Zersetzung des gewünsch« ten Produktes beitragen.

Die Herstellung dieser Enzyme durch die Kultivierung von Mikroorganismen in einem flüssigen Nährsubstrat ist in der ^?ermen-■fc*tion*indu$trie ein gut bekanntes Verfahren, und es wird in einem geeigneten Kulturmedium ausgeführt, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für verdaubaren Stickstoff und andere notwendige Nährstoffe für da« Wachstum von Pilsen oder Bakterien enthält, und in dtm man das gewünscht« aus der tntstehenden Lösung gewinnt.

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Pur die Inkubation kann man allgemeine^ Verf^Sshren,, dl e> flirr ede Inkubation von Enzymen amenable ailndC» verwendien^ hedLs)pi,eills>« weise feste Eulturen unter? Verwendung von Wäizenklealei,, sehe Kulturen unter Verwendung: flüaaiger¹ Kmltuiimedien^ geschüttelte Kulturen, und in Wasser eingetauchte) KuOLtuifen.,

Hs Quelle für aasimiliaieriiaren. KMtlenatoff; kanni man· Stärke, Glucose, Maltose, Sucrose; und andere geeignete: Kohlenhydrate und deren Mischungen verwenden undl als Quelle für verdaubaren Stickstoff kamt man organische; VerMndungen; odter? Materialien, wie MaiBwasser* WeiZenkleia,; Hefteeactrafefe,) MLedls:eiir extrakt, Pepton, Kasein und Harnstoff und/oder' anorganische) Stickstoffverbindungen, wie beispielsweise) anorganische) BMrStB wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat oder anorganische Ammoniumsalze, wie Aampniumsulfat, AmmoniumcarbOnat, Ammoniumphosphat; und Ammoniumnitrat, verwenden. Anorganische: Salze), beispielsweise Hatriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze, Magnesiumsalze und Phosphate, können gewünschtenfalls ebenfalls verwendet werden.

Das folgende Beispiel erläutert die Herstellung einer Fermen— tationslÖBung, die durch das: erfindungsgemässe Verfahren gereinigt bzw. geklärt werden kann·

Der ausgewählte Organ!aaua bzw. das; Struktur;eiEement-,> der wendet werden soll, wird in einem Wachstumsmedium· »lsi Bakterien-— suspension gehalten. Wenn es gewünscht ist, das ausgewählte Enzymsyßtem zu verwenden, werden die Bakterien t& ein; steriles _ Medium überführt und bei einer T_emp;eratur voit 2B bis: 55⁰C unxt vorzugsweise b#i einer TeMperatur von 2^'M.m ^⁰C wälirjini ner Dauer von 24 bis 120 Stunden inkubiertv Dief Ijösimgl dann aseptisch in ein Permentationsgefäss überführt, das ein«) grössere Menge des sterilen Wachstumemediuas enthält. Die Inkubation wird erneut während einer Dauer von 20 bis 50 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 55⁰C unter gleichaäsaigem Hüh-

■■...': - 15 - ■ ■

wobei

ren und ausreichender Belüftung^während der ganzen Zeit gelöster Sauerstoff vorhanden ist, ausgeführt. Diese Belüftung kann zweckdienlich dadurch erreicht werden, dass man Luft oder Sauerstoff durch die Fermentationsmischung leitet. Wird eine grosse Menge der Bakterienzellen gefordert) so kann es wünschenswert sein, erneut die Endlösung in ein grösseres Fermentiergefäss zu überführen, das das gleiche Medium enthält, ausreichend in einer Menge, beispielsweise um 7_f5 $> Inoculum, zu repräsentieren. Sie Fermentation wird unter den gleichen Bedingungen, die vorher beschrieben wurden, erneut ausgeführt· Die Endlösung, die das Produkt enthält, wird dann in ein Aufbewahrungstank umgepumpt·

Das oben beschriebene Wachstumsverfahren ist ähnlich dem, das man zur Herstellung von Pilzfermentationslösung verwendet.

Unter den Arten von Organismen, die gemass solchen Verfahren gezüchtet werden können, sollen Aspergillus, Penicillinum, Bacillus, Coliform und Clostridium erwähnt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken. Bei der Herstellung der Ausflockungsmittel, die bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, sind, wenn nicht anders angegeben, alle Teile und Prozentgehalte in Gewicht angegeben.

Beispiel 1

674- g Polyhezamethvlenpolyamin technischer Qualität wurden zu 721 g Yasser gegeben und dann wurde die Mischung auf 75⁰C erwärmt. 135 g Epichlorhydrin wurden zu der Mischung tropfenweise zugefügt, während die Mischung gerührt wurde. Nachdem man 70 i» des Epichlorhydrins zugegeben hatte, wurde mit der gleichzeitigen Zugabe von 117 g iatriumhydroxyd (SOjtige Konzentration) angefangen· Hachdem die Zugabe des Epichlorhydrins beendigt war, mussten ungefähr noch weitere 53 g Hatriumhydroxyd zugegeben werden· Während dieser zwei Zugaben wurde die lern-

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peratur bei ungefähr 75° gehalten und der pH-Wert betrug ungefähr 917. Eine ausreichende Menge 5O#ige Schwefelsäurelösung wurde zugefügt, um den pH-Wert auf 5,0 zu erniedrigen. Ausreichend Wasser wurde zugefügt, um das Gesamtvolumen auf 3500 ecm zu erhöhen·

Beispiel 2

Reines Bis-hexamethyltriamin wurde mit Wasser verdünnt, wobei man ein Produkt erhielt_r das ein Aminäquivalent von 11,5 besass. Zu 100 g dieser Amin-Wassermischung fügte man weitere 146 g Wasser. 53 g Epichlorhydrin wurden während einer Zeitdauer von 90 Minuten zugefügt. Der pH-Wert wurde bei 9,5 durch gelegentliches Zufügen von ffatriumhydroxyd gehalten. Die Temperatur wurde im Bereich von 60 bis 65⁰C gehalten. Nach Beendigung der Epichlorhydrinzugabe wurden 75 g Wasser und ausreichend konzentrierte Schwefelsäure zugefügt, um den pH-Wert auf 5,0 zu erniedrigen. Die Mischung wurde auf ein Volumen von 900 ecm verdünnt. Die Viskosität dieses Endprodukts beträgt 100 ops bei 25⁰C₀

Beispiel 3

465 g 1,6-Hexandiamin wurden auf 90⁰C erwärmt und während man die Temperatur bei 9O⁰C hielt, fügte man während eines Zeitraums von 2 Stunden 146 g Äthylendichlorid dazu. Ausreichend Wasser wurde zu dem System zugegeben, um die Viskosität unterhalb von 500 cps zu halten. Nachdem die Zugabe von Äthylendichlorids beendigt war, wurde die umsetzung weitere 2 Stunden fortgeführt. Bei der gleichen Temperatur wurde,Schwefelsäure in der Menge zugegeben, die erforderlich war, um den pH-Wert auf 4,5 zu senken«, Das Endgewicht des Produkts wurde mit Wasser auf 3 330 g eingestellt.

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Beispiel 4

Reines Bis-hexamethylentriamin wurde mit Wasser verdünnt, wobei man ein Produkt erhielt_s das ein Aminäquivalent von 11,5 besass. Zu 10Og dieser Jünin-Wassermischung fügte man weitere 146 g Wasser. 53 g Epichlorhydrin wurden während 90 Minuten zugegeben. Der pH-Wert wurde durch gelegentliche Zugabe von Natriumhydroxyd bei 9,5 gehalten. Die !Temperatur wurde im Bereich von 60 bis 65⁰O bei atmosphärischem Druck gehalten. Nach Beendigung der Epichlorhy.drinzugabe wurden 75 g Wasser und konzentrierte Chlorwasserstoffsäure in einer Menge, die ausreichte, um den pH-Wert auf 5,0 zu senken, zugegeben. Die Mischung wurde auf ein Volumen von 900 com verdünnt. Die Viskosität dieses Endproduktes betrug bei 25⁰C 100 cps, bestimmt mit dem Brookfield-System.

Beispiel 5

Reines Tetraäthylenpentamin wurde mit Wasser verdünnt, wobei man ein Produkt erhielt, das ein iminäquivalent von 6,0 besass · Zu 100 g dieses Amins gab man während 90 Minuten 38 g 4-Brom-1,2-epoxybutan bei einer Temperatur von 60 bis 7O⁰C. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde bei 9,5 durch periodische Zugabe von Natriumhydroxyd gehalten. Nachdem das gesamte 4-Brom-1,2-epoxybutan zugefügt worden war, wurden 100 g Wasser und ausreichend Schwefelsäure, um den pH-Wert auf 5,0 einzustellen, zugefügt· Das Endprodukt wurde auf 1000 ecm verdünnt und es hatte eine Viskosität von 100 cps bei 25⁰C.

Beispiel 6

Während eines Zeitraums von 2 Stunden wurden 100 g 1,4-Dibrombutan langsam zu 150 g 1,6-Hexandiamin bei einer Reaktionstemperatur von 90⁰C gegeben. Die Viskosität der Reaktionsmasse wurde bei etwas weniger als 700 cps durch gelegentliche Zugabe von Wasser gehalten. Nachdem das gesamte 1,4-Dibrombutan zugefügt worden war, wurde die Reaktionstemperatur weitere 2 Stunden bei 90⁰O gehalten. Naoh Beendigung der Umsetzung wurde

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der pH-Wert Mit Schwefelsäure auf 5,0 eingestellt und das Produkt mit Wasser auf 1000 g verdünnt.

Die Beispiele 7 bis 9 beschreiben die Herstellung von Verbindungen der Klasse (B).

Beispiel 7

In einen Kolben, der mit einem Einleitungsrohr für Stickstoff ausgerüstet war und der 4-00 g Toluol, 27 g eines Homopolymerisate von Acrylnitril mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 000, bestimmt durch Viskosität, enthielt, fügt man bei 60 bis 70⁰C langsam während eines Zeitraums von, 2 Stunden 65 g reines Hexandiamin. Me Reaktion wird bei 60 bis 7O⁰G durchgeführt, bis die Entwicklung von Ammoniak aufhört. Das Produkt wird zur Trockne eingedampft.

Beispiel 8

In einen Kolben, der 800 g Benzol, 185 g eines Polymerisats, das durch Polymerisation von Cyanostyrol mit Butadien in einem Verhältnis von 1,4 hergestellt worden war, enthielt, fügte man in einer inerten Atmosphäre 15g Ethylendiamin unter im wesentlichen den gleichen Heaktionsbedingungen wie in Beispiel 7.

Beispiel 9

Auf ähnliche Weise kann man ein Produkt durch Umsetzung von Diäthylentriamin und einem Polymerisat, das durch Polymerisation von Methacrylnitril gebildet wurde, herstellen.

Diese Beispiele erläutern einige der Vorteile, die man erreicht, wenn man die erfindungsgemässe Ausflockungebehandlung anwendet.

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Beispiel 10

Zu einer Standard-Proteasefermentationslösung fügt man 5 Gew.-# Diatomeenerde als Filterhilfe. Diese Mischung wird filtriert, wobei man ein Vakuumfilter verwendet, das zuerst mit einer Filterhilfe bedeckt worden war. Es wird gefunden, dass die Filtriergesehwindigkeit 12,2 cm⁵ pro 1 cm² Filterfläche (0,5 gallons per sqare foot) pro Minute beträgt. Man findet, dass das Filtrat so trübe ist, dass das obige Verfahren wiederholt werden muss. Das Verfahren wird wiederholt, wobei man einen frischen Ansatz Von Filterhilfe verwendet. Man

•ζ ρ

findet, dass die Geschwindigkeit 11,8 er pro 1 cm Filterfläche (0,28 gallons per square foot) pro Minute beträgt. Das Endprodukt ist, wie man mit dem blossen Auge beobachten kann, noch trübe·

Wird das obige Verfahren wiederholt, wobei man 1 bis 1/2 # eines polymeren Ausflockungsmittels verwendet, das durch Umsetzung des Polyhexanäthylenpolyamins mit Epichlorhydrin auf die zuvor beschriebene Weise erhalten wurde, und was zu der Lösung zugefügt wird, so findet man, dass die FiItriergeschwindigkeit 16,7 cnr pro 1 cm Filterfläche (0,4 gallons per square foot) beträgt. Die Flüssigkeit ist im we östlichen frei von Trübung und eine zweite Filtrationsstufe ist nicht erforderlich.

Beispiel 11

Eine 100 g Probe einer Tetracyclinlösung, die mit 5 g Filterhilfe behandelt worden war, wird durch einen Büchner-Trichter, der mit 2 g Diatomeenerdefilterhilfe bedeckt worden war, mit einer Filtrationsgeschwindigkeit von 31 ml pro Minute filtriert. Das Filtrat ist trübe und enthält noch Beste an suspendiertem Materialo Bei einem Versuch, das Produkt zu klären, wird eine zweite Filtration mit einer Geschwindigkeit von 40 ml pro Minute über frische Filterhilfe durchgeführt. Dieses Filtrat ist weniger trübe.

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Werden 2 Gew._$ eines Ausflockungsmittels, das durch Umsetzung von Po^hexamethylendiamin und Epichlorhydrin erhalten worden war, zugefügt, so findet man, dass die Filtrationsgesehwindigkeit bei dem ersten Versuch ungefähr 40 ml pro Minute beträgt· Da das Filtrat kristallklar ist, ist keine weitere Filtration erforderlich.

Im Vergleich mit den Kontrollversuchen ist es ersichtlich, dass man ein klares Produkt erhält, das im wesentlichen frei von Verunreinigungen ist und dass dies mit schnellerer Geschwindigkeit und mit weniger Filtrationstrennungen erhalten wird, wenn man vor der Trennung das Ausflockungsmittel zu der Lösung gibt.

Beispiel 12

Eine Probe des Produktes, die gemäss dem Verfahren von Beispiel 7 hergestellt wurde, wird in einer verdünnten Schwefelsäurelösung gelöst, so dass 10 Gew.-# Polymerisat darin gelöst sind.

Zu 100 g einer Standard-Amylasefermentationslösung, die suspendierte Verunreinigungen in fester Form enthält, fügt man 3 g DiatomeenerdefilterMlfe. Dazu fügt man 20 g 10#ige Schwefelsäurepolymerisatlösung. Diese Gesamtmischung wird durch ein Vakuumfilter filtriert, das man zuvor mit einer Filterhilfe bedeckt hatte. Die Menge des Filtrats, die während einer bestimmten Zeitperiode gesammelt wird, ist grosser, wenn man zu der Lösung die Ausflockungspolymerisatlösung zufügt, als bei der Kontrolle_t wo man ohne Polymerisat arbeitet. Bei dem ersten Filtrierversuch, bei dem man das Polymerisat zu der Lösung zugegeben hatte, erhält man eine klare Lösung, die nicht ein zweites Mal filtriert werden muss. Bei dem Kontrollversuch ist dies nicht der Fall.

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Beispiel 13

Ähnliche Beobachtungen werden gemacht, wenn das polymere Produkt des Beispiels 8 als Ausflockungsmittel bei Fermentationelösungen verwendet wird.

Aus diesen Ausführungen ist ersichtlich, dass die Terwendung der angegebenen, hierin beschriebenen Ausflockungsmittel eine wirkungsvolle !Trennung des Filtrats, der Lösung usw. von den ungewünschten festen Verunreinigungen liefert. Diese leichtere und wirkungsvollere Trennung läuft auf erhöhte Ausbeuten und niedrigere Aufwendungen an Zeit und Geld hinaus, da, wie gezeigt werden konnte, die Anzahl der aufeinander folgenden Trennungen vermindert werden kann. Weiterhin werden die Endprodukte, wie die Säure, das Enzym oder das Antibiotikum, nicht nachteilig beeinflusst und die Menge an Produkt, die verloren geht, beträgt im wesentlichen O. Hieraus ist ersichtlich, dass die Entwicklung eines Verfahrens zum Ausflocken von Permentationslösungen von grosser Bedeutung ist·

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Claims

1. Verfahren,um den gewünschten flüssigen Anteil einer 3?ermentationslösung von suspendierten Verunreinigungen abzutrennen, dadurch gekennzeichnet, dass man zu der Lösung vor der Trennung ein Ausflockungsmittel zufügt·

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausflockungsmittel mindestens eins der Polyaminkondensationspolymerisate enthält, die durch Umsetzung von mindestens einem polyfunktionellen Amin, das mindestens zwei Amingruppen enthält, wobei die polyfunktionellen Amine die· Formel:

H₂N C (^CHQ)_X -^NH-7y - H

besitzen, worin Q Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Aminoalkylgruppe^bedeutet, worin der Alkylanteil 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, χ eine ganze Zahl von 2 bis einschliesslich 8 und y eine ganze Zahl von 1 bis einschliesslich 4 bedeuten, mit einer Verbindung der Formels

ι - C CH₂ _7_Z -μ

worin L und M gleiche oder verschiedene Reste bedeuten und Chlor, Brom, Jod oder - CH - CH₀ bedeuten und ζ eine

ganze Zahl von 1 bis einschliesslieh 4 bedeutet, hergestellt werdenο

3. Verfahren gemäss Anspruch.H^oder -2 _g dadurch gekennzeichnet, dass das Ausflockungsmittel, das zugefügt wird, das Umsetzungsprodukt ist, das durch Polymerisation von 3?oly» hexamethylendiamin mit"Bpichlorhydrin. ohne IthylendiChlorid erhalten ward®,,

8 7 / 1' 8 8 0

4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass man, um das Trennverfahren durchzuführen, filtriert oder zentrifugiert«,

5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, dass eine Filterhilfe zusammen mit dem Ausflockungsmittel verwendet wird·

6ο Verfahren zum Trennen des flüssigen Anteils einer Fermentationslösung von suspendierten Verunreinigungen in fester Form, die darin gefunden werden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung ausflockt und dann die Lösung von den Verunreinigungen abtrennt.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Ausflockungsstufe zu der Fermentationslösung mindestens ein Polyaminkondensationspolymerisat, hergestellt durch Umsetzung von mindestens einem polyfunktionellen Amin, das mindestens zwei Aminogruppen enthält, wobei das polyfunktionelle Amin die Formel:

H₂IT C (CHQ)_x - NH J^ - H

besitzt, worin Q Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis Kohlenstoffatomen oder eine Aminoalkylgruppe bedeutet, worin der Alkylteil 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, χ eine ganze Zahl von 2 bis einschliesslieh ,8, y eine ganze Zahl von 1 bis einschliesslich 4 bedeuten, mit einer Verbindung der Formel:

> - C CH₂ Λ - ^M

worin I und M gleiche oder verschiedene Reste bedeuten und Chlor, Brom, Jod oder -GH - CH₂ bedeuten und ζ eine

ganze Zahl von 1 bis einschliesslich 4 bedeutet, zufügt.

0 0 9 ft ft 7 / 1 P R !3

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θ. Verfahren gemäse Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Ausflockungsstufe zu der Fermentationslösung das Reaktionsprodukt zufügt, das durch Polymerisation von Polyhexamethylendiamin mit Epichlorhydrin und Äthylendichlorid gebildet wurde.

9. Verfahren gemäes einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man vor dem Ausflocken zu der lösung . eine Filterhilfe zufügt.

10. Verfahren gemäes einem der Ansprüche 6 bis 9» dadurch gekennzeichnet, dass man durch Filtrieren abtrennt·

11· Verfahren gemäse Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausflockungsmittel mindestens ein Polyvinylimidazolin enthält, das als Seitenkette eine cyclische Struktur der Formelt

R-I CH-T.

besitzt, worin T

bedeutet und R eine Alkylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoff-P atomen,

τ eine ganze Zahl von 1 bis 3, m 0 oder 1, w O oder 1

bedeuten.

* 12. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausflockungsmittel hergestellt wird, indem man polymerisiertes Acrylnitril und Hexandlamin umsetzt.

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13. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausflockungsmittel eine Mischung von mindestens einem Polyaminkondensationspolymeren und mindestens einem Polyvinylimidazolin ist.

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