DE1075799B

DE1075799B - Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure

Info

Publication number: DE1075799B
Application number: DENDAT1075799D
Authority: DE
Inventors: Betchworth Surrey John Herbert Charles Nayler London und George Newbolt Rolinson Betchworth Surrey Frank Peter Doyle (Großbritannien)
Original assignee: Beecham Research Laboratories Limited, Betchworth Surrey (Großbntan men)
Publication date: 1960-02-18

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus dem Nährmedium eines Penicillin erzeugenden Schimmelpilzes.

Es ist wohlbekannt, daß man Substanzen von antibiotischer Wirksamkeit erhalten kann, wenn, man gewisse Schimmelarten, so z. B. solche der Gattung Penicillium, wie Penicillium chrysogenum, auf einem geeigneten Nährmedium züchtet. Eine Gruppe dieser antibiotischen Substanzen bilden die bekannten Penicilline; sie haben die allgemeine Formel

R-Pn-COOH

(D

in welcher Pn eine Molekülgruppierung von der Bruttoformel C₈H₁₀O₂N₂S darstellt. Nach allgemeiner Ansicht hat diese Gruppierung die folgende Strukturformel

— CO — NH- CH- CH
CO—Ν—

(Π)

-CH

CH₃
³

Verfahren zur Gewinnung
von 6-Aminopenicillansäure

Anmelder:

Beecham Research Laboratories Limited,
Betchworth, Surrey (Großbritannien)

Vertreter: Dr. K. Schwarzhans, Patentanwalt,
München 19, Romanplatz 9

Beanspruchte Priorität;
Großbritannien vom 2. August 1957

Frank Peter Doyle, Betchworth, Surrey,
John Herbert Charles Nayler, London,

und George Newbolt Rolinson,

Betchworth, Surrey (Großbritannien),

sind als Erfinder genannt worden

Frühere Arbeiten über die Penicilline haben dargelegt, daß die Menge des antibiotischen Materials, das man als Stoffwechselprodukt bzw. als das des Penicillin erzeugenden Schimmels erhielt, nur ein kleinerer Teil des Gesamtproduktes war. Späterhin hat man festgestellt, daß die Ausbeute an Penicillinen ganz beträchtlich erhöht werden konnte, wenn man den Schimmel in Gegenwart gewisser chemischer Verbindungen züchtete, welch letztere als sogenannte »Präkursoren« bekannt wurden. Die Wirkungsweise dieser Verbindungen scheint darin zu bestehen, daß sie die Einführung der Gruppe R nach Formel I in das Penicillin-Molekül erleichtern. Bei allen Penicillinen, die zur Zeit in fabrikatorischem Maßstabe hergestellt werden, wird ein »Präkursor« in dieser Weise verwendet.

Es wurde nun der Erfindung zufolge festgestellt, daß man Substanzen von antibiotischer Wirksamkeit erhalten kann, wenn man die bei der Züchtung eines das Penicillin erzeugenden Schimmels·, vorzugsweise bei Fehlen eines sonst hinzugesetzten »Präkursors«, erhaltene Gärungsflüssigkeit mit einer geeigneten chemischen Substanz zur Reaktion bringt.

Unter dem Ausdruck »Gärungsflüssigkeit«, wie er hierin verwendet wird, soll das bei einem Gärungsprozeß erhaltene flüssige Nährmedium verstanden werden.

Es wurde festgestellt, daß diese Flüssigkeit eine Verbindung der Strukturformel

XH,

H₂N-CH-CH

CO-N

(III)

-CH-

XH,

COOH

enthält, welche 6-Aminopenicillinsäure genannt werden soll unter Anpassung an die Nomenklatur, die von anderen Forschungsarbeitern auf ähnlichen Gebieten angenommen wurde.

Die 6-Aminopenicillinsäure ist eine neue nichtzerfließliche Verbindung, welche in praktisch reiner Form einen Schmelzpunkt von 209 bis 210° C hat. Die Analyse ergab 44,6<7o C, 5,7°/o H, 13,1% N und 14,1% S, während die Bruttoformel C₈H₁₂O₃N₂S 44,4% C, 5,6% H, 13,0% N und 14,8°/₀ S erfordert. Die Verbindung kann mit Phenylacetylchlorid zur Reaktion gebracht werden, wobei man Benzylpenicillin erhält; sie verhält sich negativ beim Bratten-Marshall-Test und ebenso beim Ninhydrin-Test.

Nach der Erfindung werden 6-Aminopenicillansäure oder ihre Salze aus dem Nährmedium eines Penicillin erzeugenden Schimmelpilzes dadurch hergestellt, daß die Gärungsflüssigkeit des Schimmelpilzes konzentriert und dann" mit einem Ionenaustauscherharz behandelt wird, daß das Eluat des Harzes konzentriert wird und die 6-Aminopenicillansäure daraus durch Zusatz einer Säure kristallin ausgefällt wird. Als

909 730/448

Säure kann ζ. Β. Salzsäure verwendet werden. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Eluat aus dem Ionenaustauscherharz vor dem Ausfällen der 6-Aminopenicillansäure auf chromatographischem Wege mittels einer Cellulosesäule gereinigt. Falls es gewünscht wird, können irgendwelche Penicilline aus der Gärungsflüssigkeit vor Behandlung derselben mit dem Ionenaustauscherharz entfernt werden.

Das verwendete Ionenaustauscherharz kann ein hochbasisches Anionenaustäuschharz sein, wie z. B. ein Harz vom Typ des vernetzten Polystyrols mit quaternären funktionellen Ammoniumgruppen, welches im Handel unter der Bezeichnung »Dowex 1« und »DeAcidite FF« zu haben ist. Wahlweise kann das Ionenaustauscherharz ein saures Kationenaustauschharz sein, z. B. ein solches vom Typ des vernetzten Polystyrols mit Sulfonsäure-Gruppen, das unter der Bezeichnung s>Amberlite IR 120« verkauft wird.

Zu den geeigneten, das Penicillin erzeugenden Schimmelpilzen gehören die Penicilliumarten, beispielsweise der Stamm Penicillium chrysogenum 5120C. Vorzugsweise wird der Schimmelpilz unter den Verhältnissen einer aeroben Submers- bzw. Tieftank-Kultur gezüchtet.

Das Nährmedium, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, um die Gärungsflüssigkeit zu erhalten, kann eines derjenigen sein, wie sie ganz allgemein bei der Herstellung von Penicillinen verwendet werden. Das Kulturmedium besteht gewöhnlich im wesentlichen aus einem Kohlehydrat, wie z. B. Traubenzucker und Milchzucker, ferner aus Calciumcarbonat, Natriumsulfat und aus einem assimilierbaren stickstoffhaltigen Stoff, welcher für das Wachstum des Schimmelpilzes notwendig ist. Das stickstoffhaltige Material kann dabei entweder ein in der Natur vorkommender Stoff sein, z. B. Erdnußschrot, oder eine bzw. mehrere Stickstoff enthaltende chemische Verbindungen, so z. B. Ammoniumsalze, wie Ammoniumlactat oder Ammoniumacetat. Wenn als der Stickstoff abgebende Stoff eine oder mehrere chemische Verbindungen verwendet werden, dann ist es üblich, dem Kulturmedium sehr geringe Mengen einer Anzahl von Metallen, wie z. B. Calcium, Eisen, Zink, Kupfer, Magnesium tmd Mangan, einzuverleiben, und zwar normalerweise in der Form wässeriger Lösungen ihrer Salze. Ein geeignetes Kulturmedium, welches Ammoniumsalze als den Stickstoff abgebenden Stoff enthält, ist von Jarvis und Tohnson in den Zeitschriften J. A. C. S., 69, 3010 (1947), und J. Bact. 59, 51 (1950), beschrieben. Die natürlichen stickstoffhaltigen Stoffe, wie z. B. Erdnußschrot, enthalten in der Regel ausreichende Mengen geeigneter anorgansicher Salze. Werden also solche Stoffe in dem Kulturmedium verwendet, dann ist es gewöhnlich nicht notwendig, einen besonderen Zusatz von anorganischen Salzen zu machen.

Die Fermentierungsbedingungen, wie sie bei der Herstellung der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Gärungsflüssigkeit zur Anwendung gelangen, können innerhalb weiter Grenzen schwanken, jedoch hat man es als vorteilhaft befunden, Verhältnisse zu wählen ähnlich denjenigen, wie sie ganz allgemein bei der Herstellung von Pencillin G verwendet werden. Die dabei angewandte Temperatur liegt vorzugsweise bei 20 bis 35° C; sehr zufriedenstellende Ergebnisse erhielt man bei einer Temperatur von 25 bis 27° C. Die für die Gärung erforderliche Zeit hängt von dem verwendeten Kulturmedium, von dem betreffenden Schimmelpilz sowie von der Gärungstemperatur ab. Normalerweise beläuft sich dieser Zeitraum auf 48 bis 120 Stunden. Der Fortschritt der Gärung kann durch Probeentnahmen in gewissen Zeitabständen verfolgt werden.

Die Gärungsflüssigkeit erhält man in äußerst zufriedenstellender Weise, wenn die Gärung unter hoch aeroben Bedingungen durchgeführt wird. Bei den in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Vorgängen in kleinem Maß stäbe erreichte man aerobe Verhältnisse durch Schütteln des Fermentierungsgemisches auf einer rotierenden Schüttelmaschine. Arbeitet man in größerem Maßstabe, dann erhält man aerobe Verhältnisse zweckmäßig in der Weise, daß man durch das Fermentierungsgemisch entweder Luft oder Sauerstoff durchbläst oder daß man es rasch durchrührt. Falls es gewünscht wird, kann man sich auch einer Kombination von Rühren und Durchblasen von Luft oder Sauerstoff bedienen.

Eine konzentrierte Lösung der 6-Aminopenicillansäure kann hergestellt werden durch Eindampfen des geklärten Mycelfiltrats bei verminderter Temperatur und herabgesetztem Druck auf ein kleines Volumen. Falls es gewünscht wird, können die in dem Filtrat vorhandenen Penicilline in weitem Maße entfernt werden, und zwar durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Butylacetat, bei einem p_H-Wert unter 7.

Nach Neutralisieren der Flüssigkeit können erhebliche Mengen von Verunreinigungen durch den Zusatz von Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton, Methanol oder Äthanol, ausgefällt werden. Nach Ausscheidung derartiger Verunreinigungen kann dann die klare Flüssigkeit noch weiter konzentriert werden, um ein konzentriertes Präparat zu ergeben.

Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung
sowie Isolierung der 6-Aminopenicillansäure

a) Ein Stamm von Penicillium chrysogenum 5120C (erhalten durch Professor E. B. Chain, Istituto Superiore di Sanita, Rom) wurde zunächst im Verlauf von 7 Tagen bei einer Temperatur von 26° C auf einer Glyzerin-Melasse-Agarplatte gezüchtet. Es wurde sodann keimfreies destilliertes Wasser hinzugesetzt und die Sporen von der Oberfläche der Kultur abgespült, um eine Sporensitspension zu erhalten. Ungefähr 10 ml dieser Suspension wurden verwendet, um 51 Saatmedium in einem Fermenter aus rostfreiem Stahl von 10 1 Inhalt mit Rührwerk zu beimpfen. Das Saatmedium enthielt 8 Gewichtsprozent/ Vol. Maiseinweichwasser, 6 Gewichtsprozent/Vol. Dextrin sowie Leitungswasser, wobei der p_H-Wert vor Sterilisieren des Fermenters und seines Inhalts auf 6,1 eingestellt wurde. Das Rührwerk lief mit einer Drehzahl von η = 500 auf die Dauer von 48 Stunden, wobei der Inhalt des Fermenters auf 27° C gehalten und Luft in einer Menge von 1 Volumen je Volumen und Minute des Inhalts durchgeblasen wurde. Ein Volumen von 3,2 1 des Inhalts dieses Fermenters wurde dann unter aseptischem Verhältnissen umgefüllt in einen 901 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl, welcher 501 des Fermentierungsmediums enthielt, letzteres bestehend aus 3,0 Gewichtsprozent/Vol. Erdnußschrot, 4,0 Gewichtsprozent/Vol. Milchzucker, 0,1 Gewichtsprozent/Vol. Na₂SO₄, 1,0 Gewichtsprozent/Vol. CaCO₃ sowie

Leitungswasser. Vor dem Sterilisieren des Fermenters und seines Inhalt wurde der p_H-Wert auf 7,2 eingestellt. Naoh Beimpfen des Behälterinhalts hielt man denselben 4 Tage lang auf einer Temperatur von 26 Ins 28° C und rührte mittels eines Propellers von 12,5 cm Durchmesser bei einer Drehzahl von n—600. Durch den Behälter wurde Luft geblasen, und zwar in einer Menge von 1 Volumen je Volumen Behälterinhalt je Minute. Das Aufschäumen wurde verhindert durch den periodischen Zusatz von Lard- bzw. Schmalzöl, das 2% Octadecanol enthielt.

Das vergorene Nährmedium wurde geklärt und 40 1 davon im Vakuum auf ein Volumen von 4 1 konzentriert. Der pjj-Wert wurde dann auf 3,0 eingestellt, der gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und die klare Flüssigkeit einmal mit der Hälfte ihres Volumens Butylacetat extrahiert. Die wässerige Phase wurde abgetrennt und der p_H-Wert auf 7,5 eingestellt. Es wurden dann 3 Volumina Aceton unter Rühren hinzugesetzt und der dabei gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt. Die klare Flüssigkeit wurde dann auf 2280 ml konzentriert und der p_H-Wert auf 7,0 eingestellt; sie hatte eine Potenz von 54 Mikron/mg, die wie es weiter unten beschrieben werden wird, bestimmt wird.

Die 6-Aminopenicillansäure wurde bestimmt durch die Reaktion eines Musters mit Phenylacetylchlorid und Bestimmung des gefundenen Penicillins nach der Becherschalenmethode, wie sie von N. G. Heatly in der Zeitschrift Biochem. J. 38, 61 (1944), beschrieben ist, und zwar unter Verwendung des Bacillus subtilis (Heubazillus) als Bakterium. Die Reinheit des Präparats kann dann in Einheiten je mg Trockensubstanz (Mikron/mg) ausgedrückt werden.

Die Potenz der reinen 6-Aminopenicillansäure wurde nach dieser Methode zu 2750 Mikron/mg festgestellt.

b) 1200 ml des Konzentrats mit der Potenz von 54 Mikron/mg wurden durch 200 g mit Salzsäure aufbereiteten Dowex I-Harzes perkoliert. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen, und das Waschwasser wurde mit dem Perkolat kombiniert. Es erwies sich, daß diese Lösung 15% der angewandten 6-Aminopenicillansäure enthielt. Die Kolonne wurde dann mit 0,05 η-Salzsäure eluiert. Die zusammengegosisenen aktiven Fraktionen des Eluats enthielten 81% der ursprünglichen 6-Aminopenicillansäure, wobei die Potenz der Lösung zu 900 Mikron/mg bestimmt wurde. Das Eluat wurde dann auf einen p_H-Wert von 6,0 eingestellt und im Vakuum auf 25 ml konzentriert; konzentrierte Salzsäure wurde unter Rühren hinzugesetzt, um den p_H-Wert auf 4,3 zu bringen, worauf die kristalline 6-Aminopenicillansäure abfiltriert, mit Wasser und anschließend mit. Aceton gewaschen und dann im Vakuum getrocknet wurde. Die Ausbeute belief sich auf 1,0 g mit einer Potenz von 2200 Mikron/mg (80% der reinen Säure). Die wiederholte Ausfällung des kristallinen Materials aus neutralen wässerigen Lösungen durch den Zusatz von Salzsäure ergab einen weißen kristallinen festen Körper mit einem Schmelzpunkt von 209 bis 210° C und einer Potenz von 2740 Mikron/mg. Die Analyse ergab 44,6% C, 5,7% H, 13,1% N, 14,1 »/0 S, während die Bruttoformel C₈H₁₀O₃N₂S 44,4% C, 5,6% H, 13,0% N und 14,8% S "erfordert.

Beispiel 2

Das Beispiel 1, a) wurde wiederholt und 81 des Konzentrats durch eine Kolonne von 700 g mit Essigsäure aufbereiteten DeAcidite FF-Harze perkoliert. Die Kolonne maß 5 X 87,5 cm. Sie wurde mit Wasser ausgewaschen, worauf Perkolat ixnd Waschwasser miteinander kombiniert wurden. Die Kolonne wurde mit η-Essigsäure eluiert und das Eluat in Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und ergaben dabei 2710 ml einer Lösung mit einer Potenz von 388 Mikro/mg. Diese 2710 ml Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockne eingedampft und mit 50 ml Wasser gewaschen, was zweimal wiederholt wurde. Nach dem endgültigen Auflösen in 50 ml Wasser wurde der p_H-Wert mit 4 η-Ammoniaklösung auf 7,0 eingestellt, wobei man ein Volumen von 85 ml erhielt. Dieser Lösung setzte man 85 ml Aceton, 85 ml Isopropanol und 25 ml Wasser hinzu und behandelte dann chromatographisch auf einer Cellulosekolonne von 10 X 40 cm, welche 1,5 kg Cellulose enthielt, und entwickelte mit einem Gemisch aus Wasser, Aceton und Isopropanol zu gleichen Teilen. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt; die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und im Vakuum auf 15 ml eingedampft. Konzentrierte Salzsäure wurde unter Rühren hinzugesetzt, um den p_H-Wert auf 5,0 zu bringen; die Kristalle der 6-Aminopenicillansäure wurden abfiltriert, einmal mit Wasser und zweimal mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute belief sich auf 1,9 g mit einer Potenz von 2060 Mikron/mg (75% der reinen Säure). Das Produkt wurde wie im Beispiel 1 durch Umkristallisieren gereinigt und ergab dabei eine reine 6-Aminopenicillansäure mit den gleichen Eigenschaften wie das Endprodukt nach Beispiel 1.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure mit der Formel

H₂N-CH-CH

CO-N-

CH₃
CH -COOH

sowie deren Salzen aus dem Nährmedium eines Penicillin, erzeugenden Schimmelpilzes, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärungsflüssigkeit des Schimmelpilzes konzentriert und dann mit einem lonenaustauscherharz behandelt, das Eluat des Harzes konzentriert und die 6-Aminopenicillansäure daraus durch Zusatz einer Säure kristallin ausgefällt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluat aus dem lonenaustauscherharz vor dem Ausfällen der 6-Aminopenicillansäure durch Chromatographie mittels einer Cellulosekolonne gereinigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Penicilline vor der Behandlung der Gärungsflüssigkeit mit dem lonenaustauscherharz aus derselben entfernt werden.