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Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-Penicillansäure
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von 6-Amino-Penicillansäure.
Die verschiedenen Penicilline können sämtlich als Acyl-Derivate eines Grundamins, der 6-Amino- - Penicillansäure folgender Formel
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betrachtet werden. Beim Benzyl-Penicillin (Penicillin G) ist die Acylgruppe, die mit der Aminogruppe verbunden ist, die Phenylacetylgruppe. Schon bei den anfänglichen Entwicklungsstufen der Penicillinherstellung wurde festgestellt, dass sich die Ausbeute an Benzyl-Penicillin erheblich erhöhen lässt, wenn man dem Kulturmedium während des Wachsens des Penicillin bildenden Pilzes Phenylessigsäure zusetzt. Auf diese Weise wirkt Phenylessigsäure als Ausgangsmaterial für Benzyl-Penicillin.
Aus der brit. Patentschrift Nr. 643, 514 ist bekannt, dass eine grosse Anzahl Penicilline hergestellt werden kann, indem dem Kulturmedium Ausgangsstoffe für Seitenketten zugesetzt werden. Diese Ausgangsstoffe sind monosubstituierte Essigsäuren oder Verbindungen, die vom Pilz leicht in monosubstituierte Essigsäuren umgewandelt werden können. Auf diese Weise wird durch Anwendung von Phenoxyessigsäure als Ausgangsstoff Phenoxymethyl-Penicillin (Penicillin V) als hauptsächlicher Bestandteil der gebildeten Mi- schung an Penicillinen erhalten.
In der Zeitschrift"Nature"Nr. 4656, vom 24Jänner 1959, S. 257, wird ausgeführt, dass bei Penicillin-Fermentationen 6-Amino-Penicillansäure gebildet wird, wenn keine Seitenketten-Ausgangsstoffe vorliegen. Das Vorliegen des genannten Amins zeigte sich, wenn eine derartige Fermentations-Flüssigkeit nach dem Entfernen der natürlichen Penicilline durch Lösungsmittel-Extraktion bei niederem pi-Wert mit einem Überschuss an Phenylacetylchlorid in Gegenwart einer schwachen Base, wie Natriumbicarbonat, behandelt wurde. Dabei bildete sich Benzyl-Penicillin ; ebenso entstand bei der Reaktion mit Phenoxyacetylchlorid Phenoxymethyl-Penicillin (Penicillin V).
Es kann an dieser Stelle ferner erwähnt werden, dass schon vor längerer Zeit festgestellt wurde, dass Penicillin G inaktiviert werden kann, wenn es der Einwirkung eines von Penicillium chrysogenum Q 176 produzierten Enzyms unterworfen wird, und dass vermutet wurde, dass diese Inaktivierung auf eine Desacylierung des Penicillins G unter Bildung der antibakteriell weniger wirksamen 6-Amino-Penicillansäure zurückzuführen sei (J. Agric. Soc. Chem.
Japan 29 [1955], S. 400-407). Da der Pilz Penicillium chrysogenum Q 176 einer der Mutterstämme der bei der Penicillin-Fermentation verwendeten penicillinerzeugenden Stämme ist, ist diese Feststellung für die Herstellung von Penicillin insoferne von grosser Bedeutung, als durch sie ein Hinweis auf die Möglichkeit einer gleichzeitig erfolgenden Zersetzung des bei der Fermentation gebildeten Penicillins und die sich dadurch ergebende verminderte Ausbeute an Penicillin
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gegeben wird.
In der belgischen Patentschrift Nr. 569728 ist die Herstellung einer Anzahl von Penicillinen aus 6-Amino-Penicillansäure durch Umsetzung mit Säurechloriden oder Säureanhydriden beschrieben. Mit- tels dieser Methode ist es möglich, eine Anzahl von Penicillinen zu erhalten, die nicht durch Fermen- tation hergestellt werden können.
Weiterhin ist in dieser Patentschrift beschrieben, wie sich 6-Amino-Penicillansäure aus der Fermen- tations-Flüssigkeit isolieren lässt. Dabei wird diese zunächst konzentriert, dann mit einem Ionenaustau- scherharz behandelt, das Harz z. B. mit verdünnter Salzsäure ausgewaschen, hierauf der pH-Wert auf et- wa neutral eingestellt, das Eluat vorzugsweise im Vakuum konzentriert und schliesslich die 6-Amino-Peni- cillansäure durch Einstellung des pH-Wertes auf etwa 4, 3, den isoelektrischen Punkt der 6-Amino-Peni- cillansäure durch Zusatz einer Säure, wie Salzsäure, ausgefällt und der kristalline Niederschlag von der
Lösung abgetrennt.
Bei dem erwähnten Fermentationsverfahren lässt sich jedoch ohne Zugabe von Seitenketten-Ausgangs- stoffen nur eine geringe Ausbeute an 6-Amino-Penicillansäure erhalten und die Isolation dieser Verbin- dung aus der Fermentationsflüssigkeit ist schwierig und kostspielig, da sich eine Extraktion mittels orga- nischer Lösungsmittel, die sonst bei der Herstellung von Penicillin gewöhnlich angewendet wird, wegen ungünstiger Verteilungskoeffizienten und einer damit verbundenen Konzentrierung von grossen Flüssigkeits- volumina nicht eignet.
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von 6-Amino-Penicillansäure, welches in seinem Wesen darin besteht, dass man ein Penicillin oder ein'3 Mischung von Penicillinen, die durch ein
Fermentationsverfahren hergestellt wurden, einem Kulturmedium zusetzt, in welchem man einen Pilz unter Belüftung und vorzugsweise submers züchtet, der aus der Gruppe Monotospora 1703, Stemphylium
1758, Cylindrocarpon tonkinense, Cephalosporium ciferrii Verona.
Cephalosporium acremonium Cda., einem der folgenden Glieder der Art Aspergllus : A. flavus, A. oryzae, A. niger, A. sojae, A. terreus und
A. effesus oder der Art Fusarium ausgewählt ist, und den Pilz in dem Kulturmedium solange züchtet, bis ein wesentlicher Teil des Penicillins in 6-Amino-Penicillansäure umgewandelt worden ist, und hierauf die 6-Amino-Penicillansäure isoliert.
Die beim Verfahren gemäss der Erfindung verwendeten Pilze bilden Enzyme, durch die die Penicilline desacyliert und damit in 6-Amino-Penicillansäure übergeführt werden. Die in Frage stehenden Pilze bilden neben den auf Penicilline desacylierend wirkenden Enzymen noch eine Vielzahl anderer Enzyme und es war deshalb nicht zu erwarten, dass die Desacylierung der Penicilline durch lebende Pilze an Stelle von Enzymzubereitungen, die aus ihnen hergestellt wurden, bewirkt werden könnte. Wenn die Desacylierung des Penicillins durch die Aktivität des lebenden Pilzes bewirkt wird, kann auf die Herstellung der Enzymzubereitung verzichtet werden, wodurch der gesamte Prozess erheblich vereinfacht wird.
Daneben ist durch die Erfindung eine erheblich bessere Umwandlung des Penicillinsin 6-Amino-Penicillansäure zu erhalten als wenn Enzymzubereitungen, die aus Pilzen hergestellt wurden, benutzt werden.
Vorzugsweise wird Penicillin, das als Ausgangsmaterial benutzt wird, einem Kulturmedium zugesetzt, in dem der Pilz schon mindestens 24 h lang, vorzugsweise bei 25 - 300C und einem pH-Wert von 6, 5 bis 8, 0, gezüchtet worden war. Das Kulturmedium soll neben anorganischen Stoffen, die für das Wachstum des Pilzes nötig sind, eine Quelle für Kohlenstoff, beispielsweise Glukose, enthalten.
Es wurde festgestellt, dass für die Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung Arten der Gattung Fusarium besonders geeignet sind, da mit ihnen hohe Ausbeuten und hohe Geschwindigkeiten der Umwandlung der Penicilline in 6-Amino-Penicillansäure erhalten werden. Unter den geeigneten Arten von Fusarium sind folgende zu erwähnen : F. anguioides, F. argillaceum, F. avenaceum, F. bulbigenum, F. coeruleum, F. culmorum, F. equiseti, F. lateritium, F. minimum, F. monoliforme, F. oxysporum, F. sambucinum, F. semisectum, F. solani und F. sulphureum.
Verglichen mit den in der erwähnten belgischen Patentschriftbeschriebenen Verfahren bietet das Verfahren gemäss der Erfindung den Vorteil, dass als Ausgangsmaterialien Penicilline verwendet werden, die mit geringen Kosten durch den gewöhnlichen Fermentationsprozess hergestellt werden können, wobei das zur Bildung des in Frage kommenden Penicillins entsprechende Ausgangsmaterial benutzt wird und wobei sich höhere Konzentrationen an 6-Amino-Penicillansäure erhalten lassen und die Isolierung leicht durchzuführen ist.
Jede Art von Penicillin oder eine Mischung von Penicillinen, die durch Fermentation erhalten wird, lässt sich als Ausgangsmaterial benutzen, vorzugsweise in Form eines wasserlöslichen anorganischen Salzes, wie dem Natrium-, Kalium-, Kalzium- oder dem Ammoniumsalz. Das verwendete Penicillinsalz braucht nicht den Reinheitsgrad aufzuweisen, der für therapeutische Zwecke erforderlich ist. Es kann dem
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Kulturmedium in fester Form oder als entsprechend konzentrierte wässerige Lösung zugesetzt werden. Benzyl-Penicillin ist weniger geeignet als Phenoxymethyl-Penicillin, weil es durch Pilze rascher desacyliert wird. n-Heptyl-Penicillin (Penicillin K) wird ebenfalls rascher desacyliert als Benzyl-Penicillin.
Jedoch sind die Herstellungskosten für n-Heptyl-Penicillin höher als für Phenoxymethyl-Penicillin, da kein Ausgangsstoff bekannt ist, der die Bildung von n-Heptyl-Penicillin mittels des penicillinbildenden Pilzes zu fördern vermag.
Die Lösung, die sich durch Desacylierung von Penicillin erhalten lässt, wird durch Adsorption und nachfolgende Eluierung gereinigt und konzentriert. Als Adsorptionsmittel kann ein lonenaustauscherharz oder Aktivkohle verwendet werden und in beiden Fällen wird eine verdünnte Säurelösung in geeigneter Weise zur Eluierung benutzt. Vor und/oder nach diesen Operationen kann eine Konzentrierung durch Verdampfen im Vakuum erfolgen. Vor einer derartigen Konzentrierung soll der pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen 3 und 7 eingestellt werden. Aus der gereinigten und konzentrierten Lösung wird 6-Amino- - Penicillansäure in kristalliner Form durch Einstellen des pH-Wertes auf etwa 4, 3 ausgefällt.
Enthält die Lösung, die durch Desacylierung von Penicillin erhalten wird, noch eine erhebliche Menge an nichtumgewandeltem Penicillin, kann gegebenenfalls vor der Gewinnung der 6-Amino-Penicillansäure mindestens die Hauptmenge des zurückbleibenden Penicillins durch Ansäuern der Lösung und durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das gewöhnlich zur Extraktion von Penicillinen verwendet wird, wie Butylacetat, abgetrennt werden. Das Mycel des Pilzes sollte aus der Flüssigkeit entfernt werden, bevor die 6-Amino-Penicillansäure aus derselben gewonnen oder bevor das zurückbleibende Penicillin aus der Flüssigkeit entfernt wird.
Es wurde festgestellt, dass, wenn der Gehalt an wachstumsfördernden biologischen Stoffen, wie Maisquellwasser oder Sojabohnenmehl, im Kulturmedium in einem solchen Masse vermindert wird, dass die Gesamtmenge dieser Stoffe, berechnet als Trockensubstanz, dividiert durch die ursprüngliche Menge an
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werden können, falls ein Pilz verwendet wird, der eine verhältnismässig schnelle Desacylierung des Penicillins zu bewirken vermag. Es wurde festgestellt, dass z. B. die Arten, die zum Genus Fusarium gehören, eine sehr schnelle Desacylierung bewirken und dass sich mit einer Anzahl von Arten der andern schon angeführten Klassen, wie bestimmten Arten des Genus Cephalosporium, eine zufriedenstellend schnelle Des- acylierung'durchführen lässt.
Vorzugsweise soll die Anfangskonzentration des Penicillins im Kulturmedium
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Wenn die Desacylierung unter den erwähnten Bedingungen durchgeführt wird, besteht das Isolierungsverfahren der 6-Amino-Penicillansäure aus dem Kulturmedium in der Hauptsache in der Entfernung des Mycels des Pilzes aus dem Kulturmedium und in der Konzentrierung der Lösung, die durch Abdampfen im Vakuum erhalten wird, wobei der pH-Wert der konzentrierten Lösung auf einen Wert von etwa 4, 3 eingestellt wird. Die 6-Amino-Penicillansäure wird dadurch aus der Lösung ausgefällt und dann abgetrennt.
Die Erfindung wird nun durch folgende Beispiele verdeutlicht : Beispiel l : Aspergillus oryzae wurde in 5 l eines Kulturmediums folgender Zusammensetzung ge- züchtet :
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<tb>
<tb> Gew <SEP> 0 <SEP> -Teile <SEP>
<tb> Wasser <SEP> 1000
<tb> Maisquellwasser <SEP> 20
<tb> Glukose <SEP> 20
<tb> MgsO, <SEP> o7H2O <SEP> 2
<tb> KNOTS <SEP> 5
<tb>
Nach einem Wachstum von 36 h wurden 10, 0 g Natriumbenzyl-penicillat, das in 100 ml Wasser gelöst worden war, zugefügt und dann die Kultur in einem 10 l Fermentationsgefäss bei 27 - 290C gerührt und mit Luft behandelt, wobei der pH-Wert zwischen 5, 5 und 6, 5 gehalten wurde. 32 h nach der Zugabe des Penicillins hatte die antibiotische Wirksamkeit, die durch ein Verfahren (cup plate method), das von N. G. Heatly in Biochem.
J.. Vol. 38 [1944], S. 61 beschrieben wurde, bestimmt worden war, auf 250 internationale Einheiten Penicillin je ml, d. h. auf weniger als 10% der ursprünglichen Wirksamkeit, abgenommen. Das Mycel wurde dann abfiltriert und zwei 5 Mikroliter-Proben des Filtrats wurden auf einem Whatman-PapierNr. lchromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem verwendet wurde, das in dem
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Text unter der Fig. l in dem schon erwähnten Artikel "Nature" beschrieben worden war. Einer der beiden Papierstreifen wurde mit einer geigen wässerigen Lösung von NaHCOs und dann mit einer 5% gen Lösung von Phenylacetylchlorid in Aceton besprüht.
Die beiden Streifen wurden hierauf auf eine Agar-Platte, die mit Staphylococcus aureus besät worden war, gebracht, darauf wurde die Platte bei 370C 20 h lang aufbewahrt. Um die beiden Streifen zeigten kleinere Flecken etwa in halber Höhe der Streifen Verzögerungszonen auf der Agar-Platte auf Grund des nichtumgewandelten. Benzyl-Penicillins. Ein grösserer ovaler Flecken um einen Punkt des besprühten Streifens in der Nähe der Ausgangslinie wies auf die Anwesenheit einer grösseren Menge von Benzyl-Penicillin hin, das aus 6-Amino-Penicillansäure durch Besprühen mit Phenylacetylchlorid entwickelt wurde. Der Rf-Wert dieses Fleckens stimmte mit dem des Streifens 3 in Fig. l des erwähnten Artikels in"Natureu überein.
Beispiel 2: 150 ml eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung:
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<tb>
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Asparagin <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> g <SEP>
<tb> (NH4)sq <SEP> 2, <SEP> 64g <SEP>
<tb> KH2P04 <SEP> 2, <SEP> 38 <SEP> g <SEP>
<tb> K2HPO <SEP> 4 <SEP> 5, <SEP> 56 <SEP> g <SEP>
<tb> MgSO. <SEP> TH <SEP> O <SEP> 1, <SEP> 00g <SEP>
<tb> CuS04. <SEP> 5HO <SEP> 6, <SEP> 4 <SEP> mg
<tb> FeSO4. <SEP> 7H2O <SEP> 1,1 <SEP> mg
<tb> MncL2. <SEP> 7H2O <SEP> 7,9 <SEP> mg
<tb> ZnSO4.'7HO <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> konz. <SEP> Hefe-Extrakt <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser, <SEP> 50% <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> ml <SEP>
<tb> CaCO3 <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
wurden mit 1 1 einer sterilen Suspension von Fusarium avenaceum-Sporen (Stamm L. P.
P. 1102) geimpft und das Kulturmedium-wurde 24 h bei 27 C unter Lufteinfluss gerührt. Dann wurde die Kultur zu 5 l eines sterilen Kulturmediums derselben Zusammensetzung gefügt, die anschliessend weitere 72 h in einem 10 l Glasfermenter bei 270C unter Lufteinfluss gerührt wurde.
DarÅaufhin wurden 20,00 g Kalium-Phenoxymethylpenicillin der Kultur zugesetzt und das Wachstum des Pilzes wurde unter den gleichen Bedingungen weitere 48 h lang fortgesetzt. Das Mycel wurde dann abfiltriert und die 6-Amino-Penicillansäure vom Filtrat wie folgt isoliert :
Der pH-Wert des Filtrats wurde auf 7,5 eingestellt und das Filtrat dann im Laufe von 2 h durch eine Kolonne geleitet, die 1 l der Chloridform des Ionenaustauscherharzes vom Typ "Amberlite IRA-401 S" enthielt. Dann wurde die Kolonne mit Wasser gewaschen und das feuchte Harz zusammen mit 500 ml Wasser in ein 3 l Becherglas gebracht. Dann wurde konzentrierte Salzsäure, zugesetzt bis ein pH-Wert von 1, 8 erreicht worden war. Das Harz wurde abgefiltert und auf dem Filter mit 500 ml Wasser gewaschen.
Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und mit 2n-wässeriger NaOH auf einen pH-Wert von 6,5 neutralisiert und dann durch Verdampfen im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. Der PH-Wert der konzentrierten Lösung wurde durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf einen Wert von 4, 3 eingestellt, die ausgefallene 6-Amino-Penicillansäure abfiltriert, mit Wasser und nachfolgend mit Aceton gewaschen und schliesslich getrocknet. Dabei wurden 8,5 g Rohprodukt erhalten. Dieses Produkt wurde in 75 ml Wasser suspendiert und durch Zugabe einer verdünnten wässerigen Lösung von Natriumhydroxyd in Lösung gebracht. Aus dieser Lösung wurde dann durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung mit Salzsäure auf einen Wert von 4, 3 wieder 6-Amino-Penicillansäure ausgefällt.
Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen und getrocknet. Hiebei wurden 7,7 g 6-Amino-Penicillansäure vom Schmelzpunkt 198 - 2000C erhalten.
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Beispiel3 :800leinessterilenkulturmediumsfolgenderZusammensetzung
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<tb>
<tb> Maisquellwasser, <SEP> 50gO <SEP> 24,0 <SEP> kg
<tb> Lactose <SEP> 24, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP>
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> kg
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 900 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
wurden in einen Fermenter aus rostfreiem Stahl gebracht und mit 2 l einer Kultur von Fusarium culmorum
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66 h lang gerührt und mit Luft behandelt. Hiebei wurde ein übermässiges Wachstum des Pilzes bewirkt.
Nach dieser Wachstumsperiode wurde eine sterile Lösung von 18,0 kg rohem (99% Reinheit) Kalium-Phen- oxymethyl-Penicillat in 90 1 Leitungswasser zugesetzt und das Rühren und die Luftbehandlung weitere 48 h bei 270C fortgesetzt. Der pH-Wert von 6 bis 7 wurde durch fortgesetzte Zugabe einer wässerigen Natriumhydroxydlösung aufrechterhalten. Nach dieser Zeit betrug der Gehalt an 6-Amino-Penicillansäure im Kulturmedium 6 mg je ml, was einem Umwandlungsgrad von 6ffJ/o entspricht. Weiterhin enthielt das fermentierte Kulturmedium nicht umgewandeltes Phenoxymethyl-Penicillin mit 4000 internationalen Einleiten je ml, was 15% der zugefügten Menge an Phenoxymethyl-Penicillin entspricht.
Der pH-Wert des fermentierten Kulturmediums wurde auf 7,5 eingestellt, 40 kg Diatomeen-Erde als Filterhilfe zugesetzt und das Mycel im Kulturmedium durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Laufe von 8 h durch eine Kolonne geleitet, die 300 1 eines stark basischen, anionenaustauschenden, synthetischen Harzes"Amberlite IRA-401 S" (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa. USA), das einen niederen Grad einer Quervernetzung aufweist, enthielt. Dann wurde die Kolonne mit Wasser gewaschen und das feuchte Harz in ein 800 l Gefäss aus rostfreiem Stahl, das mit einem Rührer versehen war, übergeführt.
Zunächst wurden 200 l enthärtetes Wasser zugesetzt und dann wurde im Laufe von 3 h unter Rühren so lange 20% ige
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7,0 eingestellt, worauf die Lösung durch Verdampfen im Vakuum auf 75 l eingeengt wurde. Die konzentrierte Lösung wurde abfiltriert und der pH-Wert des Filtrats durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 4, 05 eingestellt. Die dadurch gefällte 6-Amino-Penicillansäure wurde abfiltriert, mit Wasser und dann mit Aceton gewaschen und schliesslich getrocknet. Dabei wurden 3, 1 kg eines Produktes mit dem Schmelzpunkt 199 - 2010C und einem Reinheitsgrad von 93% erhalten.
Das Rohprodukt wurde in 12 l Wasser suspendiert und zu der Suspension wurde dann so lange eine 33% igue wässerige Lösung von Natriumhydroxyd zugesetzt, bis eine klare Lösung erhalten worden war. Der pH-Wert dieser Lösung war dann 7, 3. Die Lösung wurde hierauf 15 min lang mit 30 g Aktivkohle behandelt und schliesslich abfiltriert. Der pH-Wert des Filtrats wurde dann durch Zugabe konzentrierter Salzsäure auf 4, 05 eingestellt. Die gefällte 6-Amino-Penicillansäure wurde abfiltriert und mit Wasser und hierauf mit Aceton gewaschen. Dabei wurden 2,8 kg 6-Amino-Penicillansäure mit einem Schmelzpunkt von 202 bis 204 C (Zersetzung) und einem Reinheitsgrad von 98% erhalten.
Beispiel 4 : 100 ml eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung
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<tb>
<tb> Diammoniumphosphat <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1, <SEP> 01
<tb>
wurden auf einen pH-Wert von 6, 5 eingestellt und in einem 300 ml Kolben mit einer Suspension von Sporen der Fusarium-Art geimpft, die hier provisorisch als L. P. P. 1571 bezeichnet wird. Dann wurde der Kolben 72 h lang bei 270C geschüttelt und danach wurden 2,0 g Kalium-Phenoxymethyl-Penicillin hinzugefügt und der Kolben wurde weitere 72 h lang geschüttelt. Nach dieser Zeit war der Gehalt an Phenoxymethyl-Penicillin, der durch die Agar-Näpfchen-Methode (agar cup method) bestimmt wurde, auf unter 300 internationale Einheiten Penicillin je ml gesunken.
Das Mycel wurde dann abfiltriert, der pH-Wert des Filtrats auf 6,5 eingestellt und das Filtrat durch Verdampfen in Vakuum auf ein Volumen von 15 ml eingeengt. Nachdem die konzentrierte Lösungabge-
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filtert worden war, wurde ihr pH-Wert durch Zugabe konzentrierter Salzsäure auf 4, 3 eingestellt. Der dadurch ausgefallene'Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und anschliessend mit Aceton gewaschen und dann getrocknet. Es wurden 710 mg 6-Amino-Penicillansäure mit einem Schmelzpunkt von 199 bis 2010C (Zersetzung) erhalten.
Beispiel 5 : 51 eines sterilen Kulturmediums folgender Zusammensetzung
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (50% <SEP> Trockensubstanz) <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Kalziumcarbonat <SEP> 5. <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1, <SEP> 01
<tb>
wurden auf einen pH-Wert von 6, 5 eingestellt und in einem 10 l Glasfermenter mit 200 ml einer Kultur des schon erwähnten Fusarium L. P. P. 1571, die 24 h lang gewachsen war, geimpft. Daraufhin wurde das geimpfte Kulturmedium unter Luftbehandlung 48 h lang gerührt, während der pH-Wert auf 6, 5 gehalten worden ar 0 Dann wurden 100 g Kalium- Phenoxymethyl-Penicillin hinzugefügt und das Rühren und die Luftbehandlung weitere 72 h lang bei 270C und einem pH-Wert von 6,5 fortgesetzt.
Das Mycel wurde dann abfiltriert, der pH-Wert des Filtrats auf 6, 5 eingestellt und das Filtrat durch Verdampfen im Vakuum auf 500 ml konzentriert. Nachdem die konzentrierte Lösung abfiltriert worden war, wurde ihr pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 4,3 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und dann mit Wasser und Aceton gewaschen und schliesslich getrocknet.
Hiebei wurden 37 g 6-Amino-Penicillansäure mit 93%piger Reinheit und einem Schmelzpunkt von 196 bis 1990C erhalten.
Das Produkt wurde in 150 ml Wasser suspendiert und in eine Lösung gebracht, deren pH-Wert durch Zugabe einer 30% gen wässerigen Natriumhydroxydlösung 7, 5 betrug. Eine wässerige Lösung von 1, 0 g Aluminiumsulfat wurde zugesetzt, der gebildete Niederschlag abfiltriert und das Filtrat mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,3 eingestellt. Der ausgefällte Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser und mit Aceton gewaschen und schliesslich getrocknet. Hiebei wurden 32 g gereinigter 6-Amino- - Penicillansäure mit einem Schmelzpunkt von 205 bis 2070C erhalten.
Beispiel 6 : Die Fähigkeit einer grossen Anzahl von Pilzen, 6-Amino-Penicillansäure durch Desacylierung von Phenoxymethyl-Penicillin herzustellen, wurde bestimmt, indem folgendes Verfahren angewendet wurde :
100 ml eines sterilen Kulturmediums, das eine Zusammensetzung gemäss Beispiel 2 besass, wurden auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und in einem 300 ml Schüttelkolben mit einer Suspension von Sporen des zu testenden Pilzes geimpft. Der Kolben wurde dann bei 270C 48 h lang geschüttelt. Hierauf wurden 2, d g des Kaliumsalzes von Phenoxymethyl-Penicillin zugesetzt und der Kolben wurde unter Luftzufuhr bei 270C weitere 48 h lang geschüttelt.
Das Mycel wurde abfiltriert, das Filtrat auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert und zweimal zur Entfernung von nicht umgewandeltem Phenoxymethyl-Penicillin mit Butylacetat extrahiert, worauf der Gehalt an 6-Amino-Penicillansäure in der wässerigen Phase jodometrisch bestimmt wurde. Die Ergebnisse, die mit einer Anzahl von den geeigneten Pilzen erhalten worden waren, werden in der folgenden Tabelle aufgeführt, wobei die Zahl in der rechten Spalte den Umwandlungsgrad des Phenoxymethyl-Penicillins in 6-Amino-Penicillansäure darstellt.
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<tb>
<tb>
Gattung <SEP> Stamm
<tb> Fusarium <SEP> anguioides <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1567 <SEP> 92'go
<tb> Fusarium <SEP> avenaceum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> n <SEP> 33 <SEP> 82%
<tb> Fusarium <SEP> avenaceum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1248, <SEP> B <SEP> 86%
<tb> Fusarium <SEP> avenaceum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1255 <SEP> 83%
<tb> Fusarium <SEP> avenaceum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1428 <SEP> 79%
<tb> Fusarium <SEP> avenaceum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1677 <SEP> 82%
<tb> Fusarium <SEP> avenaceum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1681 <SEP> 80%
<tb>
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<tb>
<tb> Gattung <SEP> Stamm <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> bulbigenum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> n <SEP> 10 <SEP> 52%
<tb> Fusarium <SEP> culmorum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> n <SEP> 32 <SEP> 77%
<tb> Fusarium <SEP> culmorum <SEP> L. <SEP> P.P.
<SEP> 1248,A <SEP> 81%
<tb> Fusarium <SEP> culmorum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1489 <SEP> 68%
<tb> Fusarium <SEP> culmorum <SEP> v. <SEP> cereale <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1501 <SEP> 93%
<tb> Fusarium <SEP> culmorum <SEP> v. <SEP> cereale <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1504 <SEP> 89%
<tb> Fusarium <SEP> equiseti <SEP> v. <SEP> bullatum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1454 <SEP> 92%
<tb> Fusarium <SEP> equiseti <SEP> v.bullatum <SEP> L.P.P. <SEP> 1508 <SEP> 84%
<tb> Fusarium <SEP> lateritium <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1687 <SEP> 76%
<tb> Fusarium <SEP> minimum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> n <SEP> 34 <SEP> 72% <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> monoliforme <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> n <SEP> 12 <SEP> 787o
<tb> Fusarium <SEP> monoliforme <SEP> C, <SEP> B. <SEP> S. <SEP> 917 <SEP> 48%
<tb> Fusarium <SEP> monoliforme <SEP> v. <SEP> subglutinans <SEP> L. <SEP> P.
<SEP> P. <SEP> 1682 <SEP> 75%
<tb> Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 9 <SEP> 84%
<tb> Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1637 <SEP> 807.
<tb>
Fusarium <SEP> semitectum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1493 <SEP> 93%
<tb> Fusarium <SEP> semitectum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1540 <SEP> 82%
<tb> Fusarium <SEP> semitectum <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1546 <SEP> 66%
<tb> Monotospora <SEP> sp. <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1703 <SEP> 51%
<tb> Stemphylium <SEP> sp. <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1758 <SEP> 64%
<tb> Cylindrocarpon <SEP> tonkinense <SEP> L. <SEP> P.P. <SEP> ZU <SEP> 4 <SEP> 68%
<tb> Cephalosporium <SEP> sp. <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1748 <SEP> 78%
<tb> Cephalosporium <SEP> sp. <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1753 <SEP> 71%
<tb> Cephalosporium <SEP> sp. <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1770 <SEP> 71%
<tb> Cephalosporium <SEP> sp. <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> 1779 <SEP> 80%
<tb> Aspergillus <SEP> flavus <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P.
<SEP> ZM <SEP> 3 <SEP> 60%
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> ZM <SEP> 4 <SEP> 41% <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> ZM <SEP> 9 <SEP> 58%
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P. <SEP> ZM <SEP> 10 <SEP> 55%
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 7252 <SEP> 48%
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 11601 <SEP> 34%
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 11866 <SEP> 51%
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 10254 <SEP> 38%
<tb> Aspergillus <SEP> sojae <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 11906 <SEP> 54%
<tb> Aspergillus <SEP> terreus <SEP> A. <SEP> T. <SEP> C. <SEP> C. <SEP> 10029 <SEP> 487o
<tb> Aspergillus <SEP> effesus <SEP> L. <SEP> P. <SEP> P.
<SEP> ZM <SEP> 5 <SEP> 48%
<tb>