HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
ε-Poly-L-lysin unter Verwendung i!!iiuiiobilisierter
Bakterienzellen.
Beschreibung des Standes der Technik
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Es ist bereits bekannt, ε-Poly-L-lysin durch Kultivierung
von beispielsweise Streptomyces albulus subsp.
lysinopolymerus Nr. 346 zu erhalten (JP 53-72896).
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Die obige Substanz ist ein Homopolymer von L-Lysin, das
heißt eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht, die
durch Bindung einer Aminogruppe in der ε-Stellung von L-
Lysin an die Carboxyl-Gruppe, von L-Lysin benachbart, dazu
an der linearen Kette über Peptidbindung erhalten wird.
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Da die obige Substanz ein Polymer von L-Lysin ist, welches
eine essentielle Aminosäure ist, besitzt es eine hohe
Sicherheit und da es einen hohen Kationengehalt aufweist,
besitzt es spezifische physikalische Eigenschaften. Unter
Ausnutzung dieser Eigenschaften wurden verschiedene
Anwendungsverfahren, beispielsweise bei Toilettenartikeln,
kosmetischen Präparaten, Futterzusatzstoffen, Pestiziden,
Nahrungsmittelzusatzstoffen, elektronischen Materialien
usw., entwickelt.
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Das bekannte Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin
wird wie folgt durchgeführt:
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Bakterienzellen, die zum Streptomyces-Genus gehören, mit
ε-Poly-L-lysin-Produktivität, werden bei aeroben
Bedingungen kultiviert und anschließend wird der pH, nachdem das
Wachstum der Bakterienzellen bestätigt wurde, auf einen
Wert in der Nachbarschaft von 4 eingestellt. Danach wird
die Kultivierung weitergeführt, die Bakterienzellen werden
von der Kulturlösung, die ε-Poly-L-lysin enthält, durch
Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, und die
Bakterienzellen werden mittels z. B. basischer anionischer
Austausch-Harzbehandlung (JP 02-020295) oder kationischer
Austausch-Harzbehandlung (JP 02-092927) gereinigt.
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Jedoch wird bei dem bekannten Verfahren für die
Kultivierung von Bakterienzellen vom Streptomyces-Genus mit 8-
Poly-L-lysin-Produktivität bei aeroben Bedingungen und
Akkumulation des ε-Poly-L-lysins in der Kulturlösung die
Viskosität der Kulturlösung hoch, und die Zellen erleiden
eine Bakteriolyse, und es ist daher unmöglich, die
Bakterienzellen wieder zu verwenden. Wenn eine
Zentrifugentrennung oder eine Filtration durchgeführt wird, um die
Bakterienzellen abzutrennen, haben die Bakterienzellen eine
Bakteriolyse erlitten, und daher ist eine lange Zeit
erforderlich.
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Beispielsweise sind zur Entfernung von Bakterienzellen aus
einer Kulturlösung von 10 m³ unter Verwendung einer
Filtrationsvorrichtung mit einer Filtrationsfläche von 10 m²
ungefähr 32 h erforderlich. Eine solch lange Zeit ist für
die Produktion ein ernstes Hindernis. Da die
Bakterienzellen Bakteriolyse erleiden, ist die Wiedergewinnung von nur
der Kulturlösung schwierig um eine semikontinuierliche
Kultivation zu erreichen, beispielsweise, wenn ein
frisches Medium zugegeben wird. Die obigen Faktoren behindern
die Verringerung der Produktionskosten von ε-Poly-L-lysin.
Wenn es somit möglich wäre, die höhere Viskosität der
Kulturlösung, die auf die Bakterienzellen zurückzuführen ist,
und die Bakteriolyse der Bakterienzellen zu inhibieren,
wäre es möglich, die Herstellungskosten von ε-Poly-L-lysin
zu verringern. Die Erfinder haben ausgedehnte
Untersuchungen bei einem Verfahren zur Lösung der obigen Aufgabe
durchgeführt. Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden,
daß wenn ein Mikroorganismus mit Produktivität für ε-Poly-
L-lysin immobilisiert wird, die obigen Schwierigkeiten auf
einen Streich gelöst werden, und so wurde die vorliegende
Erfindung gemacht.
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Wie aus dem obigen folgt, liegt der vorliegenden Erfindung
die Aufgabe zugrunde, ein neues und effizientes Verfahren
zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin zur Verfügung zu
stellen, bei dem ε-Poly-L-lysin unter Verwendung eines
Mikroorganismus gebildet wird, immobilisierte Bakterienzellen
verwendet werden, wodurch eine höhere Viskosität der
Kulturlösung und eine Bakteriolyse der Bakterienzellen
inhibiert werden, die Gewinnung der Kulturlösung, die c-Poly-
L-lysin enthält, und die Reinigung von ε-Poly-L-lysin aus
der wiedergewonnenen Kulturlösung leicht wird und die
abgetrennten, immobilisierten Bakterienzellen wiederholt
verwendet werden können und semikontinuierlich oder
kontinuierlich als Katalysator für die Herstellung von ε-Poly-
L-lysin verwendet werden können. Die semikontinuierliche
Produktion, die hier beschrieben wird, bedeutet eine
Produktion, bei der ein Medium, das ein Substrat enthält oder
das Materialien enthält, in den Reaktor, der die
immobilisierten Bakterienzellen enthält, gegeben wird, und daß die
Gesamtmenge dieses Mediums durch ein frisches Medium je zu
einer definierten Zeit ausgetauscht wird, wobei
ε-Poly-Llysin wiederholt gebildet wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung umfaßt die folgenden Merkmale
(1), (2), (3) und (4):
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(1) Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin, welches
die Kultivation eines Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin-
Produktivität bei aeroben Bedingungen umfaßt, wobei (i)
der Mikroorganismus gemäß einem Verfahren immobilisiert
wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem
Adsorptionsverfahren, einem Vernetzungsverfahren und einem
Einschluß-/Einfangverfahren, im Folgenden als
Trappingverfahren bezeichnet, (ii) der Immobilisierungsträger anders
ist als saure Gele mit hohem Molekulargewicht und (iii)
der pH zum Zeitpunkt der Kultivation des Mikroorganismus 4
bis 7 beträgt.
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(2) Ein Verfahren zur Herstellung von c-Poly-L-lysin nach
Ausführungsform (1), wobei das Verfahren
semikontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt wird.
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(3) Ein Verfahren zur Herstellung von s-Poly-L-lysin nach
den Ausführungsformen (1) oder (2), wobei der
Mikroorganismus mit ε-Poly-L-Lysin-Produktivität ein Bakterium ist,
das zum Streptomyces-Genus gehört.
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(4) Ein Verfahren zur Herstellung von ε-Poly-L-lysin nach
der Ausführungsform (1) oder (2), wobei der
Mikroorganismus mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität gemäß einer
Kombination von Adsorptionsverfahren mit dem Vernetzungsverfahren
oder eine Kombination aus Adsorptionsverfahren mit dem
Einschluß- bzw. Einfangverfahren immobilisiert ist.
GENAUE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Als Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können, können irgendwelche
Mikroorganismen mit ε-Poly-L-lysin-Produktivität verwendet werden.
Als solche Mikroorganismen können beispielsweise erwähnt
werden:
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Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus Nr. 346 (JP
53-72896); als Varianten, die ε-Poly-L-lysin in
bemerkenswert großer Menge bilden, sind Nr. 11011A-1 (JP 63-49075),
Streptomyces noursei (JP 1-187090), usw. bekannt.
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Die Immobilisierung des erzeugenden Bakteriums, das bei
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann gemäß
einem allgemeinen Verfahren oder durch Anwendung eines
allgemeinen Verfahrens erfolgen. Beispielsweise kann ein
Adsorptionsverfahren, ein Vernetzungsverfahren, ein
Trappingverfahren, ein covalentes Bindungsverfahren verwendet
werden.
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Die immobilisierten Bakterienzellen werden gemäß einem
einfachen Immobilisierungsverfahren hergestellt. Das
Immobilisierungsverfahren kann als Kombination der obigen
beiden Verfahren durchgeführt werden. Unter den obigen
Verfahren werden das Adsorptionsverfahren und das
Trappingverfahren bevorzugt verwendet, da gemäß diesen Verfahren
die Immobilisierung leicht ist und eine stabilisierte
Aktivität erhalten wird, und wenn die Aktivität erniedrigt
wird, kann eine Reaktivierung durchgeführt werden. Das
Trappingverfahren wird im allgemeinen durchgeführt, indem
die Bakterienzellen in einem Polymer-Gel mit hohem
Molekulargewicht, wie einem Polyacrylamid-Gel, Polyurethan-Gel,
photovernetzbarem Harz, eingeschlossen bzw. eingefangen
werden. Da jedoch bei der vorliegenden Erfindung
s-Poly-Llysin als basische Substanz gebildet wird, ist es
bevorzugt, nicht ein saures Gel mit hohem Molekulargewicht,
welches die Substanz absorbiert, wie Carrageenan-Gel,
Alginsäure-Gel, zu verwenden.
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Als Adsorptionsverfahren ist ein Verfahren für die
Immobilisierung auf einer porösen Substanz oder einem nicht
gewebten Tuch bzw. Textilmaterial besonders bevorzugt. Als
poröse Substanz können beispielsweise poröse Keramika,
poröses Glas, Zelluloseschwamm, gesinterte poröse
Metallkör
per, solche Materialien, die aus Polyvinylchlorid,
Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyurethan usw.
hergestellt sind, ebenfalls verwendet werden.
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Für das obige Trappen in Polyacrylamid-Gel werden
beispielsweise Acrylamidmonomer, N,N'-Methylenbisacrylamid
als Vernetzungsmittel und lebende Bakterienzellen in einem
Puffer suspendiert, anschließend werden Ammoniumpersulfat
als Polymerisationsinitiator und
β-Dimethylaminopropionitril als Polymerisationsaktivator zu dem Puffer gegeben
und das Gemisch der Polymerisationsreaktion bei
Raumtemperatur etwa 30 min unterworfen, wobei immobilisierte
Bakterienzellen erhalten werden.
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Allgemein werden, wenn thermoplastische Harze auf eine
Temperatur von 150º bis 250ºC während 0,5 bis 5 h erhitzt
werden, gesinterte Körper erhalten, und wenn zum Zeitpunkt
des Erhitzens eine geeignete Form verwendet wird, werden
gesinterte poröse Körper mit verschiedenen Formen
erhalten. Hinsichtlich der Poren, der Porengröße, der
Festigkeit usw., werden bevorzugte poröse Körper erhalten, wenn
die Bedingungen der Sintertemperatur, der Sinterzeit, das
Packen des Harzes, das Verdickungsmittel und die Menge an
Wasser, die zugegeben wird, variiert werden. Als andere
poröse Substanzen außer den obigen, können irgendwelche
allgemein im Handel erhältlichen Produkte und behandelte
Produkte verwendet werden, solange sie die erfindungsgemä-
ßen produzierenden Bakterien adsorbieren.
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Die porösen Substanzen werden in einen Puffer eingetaucht,
der lebende Bakterienzellen enthält, um den
Mikroorganismus zu adsorbieren oder die poröse Substanz wird mit dem
Mikroorganismus behandelt, wobei die Zeit für den Beginn
der Kultur und die Adhäsion mit dem Fortschreiten der
Kultur erfolgen, wobei immobilisierte Bakterienzellen gemäß
dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
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Die immobilisierten Bakterienzellen mit ε-Poly-L-lysin-
Produktivität, die gemäß dem obigen Verfahren erhalten
werden, werden in einem üblichen
ε-Poly-L-lysin-erzeugenden Medium oder in einem Medium, zu dem Glucose und
Ammoniumsulfat oder L-Lysin zu einer Pufferlösung,
eingestellt auf den geeigneten pH-Wert bei aeroben Bedingungen,
kultiviert, wobei eine Kulturlösung, die ε-Poly-L-lysin
enthält, erhalten wird. Die immobilisierten
Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung entfernt und
ε-Poly-Llysin wird mit einem Ionenaustauschharz gereinigt.
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Der pH zum Zeitpunkt der Kultur kann innerhalb eines
Bereiches fallen, bei dem der verwendete Mikroorganismus mit
ε-Poly-L-lysin-Produktivität ε-Poly-L-lysin bildet.
Bevorzugt beträgt er 4 bis 7.
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Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren findet keine
Bakteriolyse der Bakterienzellen während der Kultivierung
statt, die immobilisierten Bakterienzellen können leicht
entfernt werden und eine ε-Poly-L-lysin-Lösung, die keine
Bakterienzellen enthält, kann in kurzer Zeit gewonnen
werden, wodurch eine wirksame Herstellung von ε-Poly-L-lysin
möglich wird. Da es leicht ist, die immobilisierten
Bakterienzellen aus der Kulturlösung abzutrennen, wird die
Kulturlösung nach der Bildung von ε-Poly-L-lysin
wiedergewonnen und frisches Medium wird zu den iminobilisierten
Bakterienzellen zugegeben, wodurch eine semikontinuierliche
Herstellung von ε-Poly-L-lysin durchgeführt werden kann
oder ein frisches Medium wird zugegeben, während
kontinuierlich Kulturlösung entnommen wird, wodurch eine
kontinuierliche Herstellung von ε-Poly-L-lysin durchgeführt
werden kann. Die Erfindung ist somit sehr nützlich, da ε-
Poly-L-lysin wirksam und kommerziell mit niedrigen Kosten
und während langer Zeiten hergestellt werden kann und auf
den Gebieten der Nahrungsmittelzusatzstoffe, der
Pestizide, der Pharmazeutika etc. verwendet werden kann.
Beispiel 1
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In einen Schüttelkolben mit 500 ml Kapazität wurde
eingefüllt ein Medium (pH 6,8, 50 ml), bestehend aus Glucose
(50 g/l), Anmoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l),
Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat
(0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), anschließend
wurde das Medium auf bekannte Weise sterilisiert,
Streptomyces albulus wurde eingepflanzt, dann wurde unter
Schütteln bei 30ºC während 36 h kultiviert, wobei eine
Präkulturlösung erhalten wurde, die nach der Kultivierung
der Zentrifugentrennung zum Sammeln der Bakterienzellen
unterworfen wurden. Die Bakterienzellen (Naßgewicht der
Bakterienzellen: 4,2 g) wurden mit sterilisiertem Wasser
2 x gewaschen und die entstehenden Zellen wurden für die
Immobilisierung verwendet.
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Die Herstellung der immobilisierten Bakterienzellen
erfolgte wie folgt:
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Acrylamid (1,68 g), N,N'-Methylenbisacrylamid (0,09 g),
Lysinhydrochlorid (0,67 g) und die Bakterienzellen,
erhalten gemäß dem obigen Verfahren, wurden in Tris-
Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 7,2, 4,8 ml) (Tris: 2-
Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) suspendiert und
anschließend wurden zu der Mischlösung eine 5%ige wäßrige
Lösung aus β-Dimethylaminopropionitril (1,1 ml) und eine
1%ige wäßrige Lösung von Kaliumpersulfat (1,1 ml)
zugegeben. Danach wurde das Gemisch bei N&sub2;-gesättigten
Bedingungen bei Raumtemperatur während 30 min stehen gelassen, um
eine Gelbildung zu bewirken. Das Gel wurde in 5 mm Würfel
verformt und das entstehende Gel wurde ausreichend mit
Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer gewaschen, wobei
Bakterienzellen, immobilisiert in Polyacrylamid-Gel, erhalten
wurden (11,2 g). Die entstehenden Bakterienzellen,
immobi
lisiert in dem Polyacrylamid-Gel, wurden in ein Medium (pH
4, 40 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysin (10
g/l) und Zitronensäure (20 g/l) gegeben und anschließend
wurde unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach 2 Tagen
wurde der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung
bestimmt, er betrug 0,23 mg/ml.
Beispiel 2
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Bakterienzellen, immobilisiert an Polyacrylamid-Gel
(75 g), hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1,
wurden zu einem bekannten Medium für die Kultivierung von
einem ε-Poly-L-lysin-erzeugenden Bakterium (pH 4,2,
50 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat
(10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat
(1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l),
Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und
Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), gegeben und anschließend wurde
unter Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach 2 Tagen betrug
der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung 0,20
mg/ml.
Beispiel 3
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Bakterienzellen, immobilisiert an Polyacrylamid-Gel (100
g), hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1,
wurden zu einem Medium (pH 4,1 l), bestehend aus Glucose (50
g/l), L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20 g/l),
gegeben, anschließend wurde eine Kultivierung bei 30ºC unter
Strömungsrühren, mittels eines Fermenters mit einer 1,5 l
Kapazität mit kleinem Kolben, durchgeführt, wobei der pH
auf 4 eingestellt wurde. Der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in
der Kulturlösung nach der Kultivierung während 48 h betrug
1,5 g/l.
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Danach wurde die Kultivierung weitergeführt, während
nacheinander Glucose und L-Lysin zugegeben wurden. Der Gehalt
an ε-Poly-L-lysin nach 125 h betrug 10 g/l. Die
Kulturlösung wurde der Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min) zur
Entfernung der Bakterienzellen unterworfen, anschließend
wurde die Absorption des Überstands nach der
Zentrifugentrennung bei 660 nm gemessen. Die Absorption betrug 0,008
und die Bakterienzellen waren vollständig entfernt.
Vergleichsbeispiel 1
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In einen Schüttelkolben mit 500 ml Kapazität wurde ein
Medium (pH 6,8, 50 ml) gegeben, bestehend aus Glucose
(50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l),
Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l),
Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l),
anschließend wurde das Gemisch in an sich bekannter Weise
sterilisiert, mit Streptomyces albulus inokuliert und dann
unter Schütteln bei 30ºC während 36 h unter Herstellung
einer Präkulturlösung kultiviert.
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Die Präkulturlösung wurde in einen Minikolben-Fermenter
mit einer Kapazität von 1,5 l gegeben, der das gleiche
Medium wie oben (1 l) enthielt, und anschließend erfolgte
eine Kultivierung bei 30ºC mittels Rührendurchströmen.
Nach der Kultivierung wurde, nachdem der pH der
Kulturlösung auf etwa 4,2 erniedrigt wurde, Glucose portionsweise
zugegeben, so daß eine Konzentration von 50 g/l erhalten
wurde, wobei der pH auf 4,2 durch wäßrige NaOH-Lösung
eingestellt wurde, und die Kultivierung weitergeführt wurde.
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Der Gehalt an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung nach
125 h betrug 12 g/l. Diese Kulturlösung wurde der
Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min) zur Entfernung der
Bakterienzellen unterworfen und dann wurde die Absorption des
Überstands bei 660 nm gemessen. Die Absorption betrug
0,282, so daß die Entfernung der Bakterienzellen
ungenügend war.
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Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, daß es möglich
ist, die Bakterienzellen unter Verwendung der
erfindungsgemäßen immobilisierten Bakterienzellen leicht zu
entfernen.
Beispiel 4
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Bakterienzellen (Naßgewicht 2,0 g), auf gleiche Weise wie
in Beispiel 1 kultiviert und wiedergewonnen, wurden in
0,1 M Phosphorsäurepuffer (2 ml) suspendiert und anschlie-
Bend wurde ein Urethanpräpolymer (3 g, M. G.: ca. 3.000)
mit der in der Formel 1 dargestellten Struktur zugegeben
und unter Rühren vermischt, um eine Gelbildung zu
erhalten, wobei inimobilisierte Bakterienzellen an einem
Polyurethan-Gel erhalten wurden, das zu 5 mm Würfel verformt
wurde.
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Die an dem Polyurethan-Gel immobilisierten Bakterienzellen
wurden zu einem Medium (pH 4, 40 ml) gegeben, welches
Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20
g/l) enthielt. Anschließend wurde das Gemisch unter
Schütteln bei 30ºC kultiviert und die Menge an s-Poly-L-lysin
in der Kulturlösung wurde nach 2 Tagen und nach 3 Tagen
bestimmt. Die Menge an ε-Poly-L-lysin betrug in der
Kulturlösung nach 2 Tagen 0,31 g/l und nach 3 Tagen 0,47 g/l.
Beispiel 5
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Es erfolgte eine gleiche Kultivierung wie bei Beispiel 4
während 3 Tagen und anschließend wurde der erhaltene
Über
stand durch Zentrifugentrennung (3.000 G, 20 min)
entfernt. Es wurde frisches Medium (pH 4, 40 ml), bestehend
aus Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und Citronensäure
(20 g/l) zugegeben und dann wurde das Gemisch unter
Schütteln bei 30ºC kultiviert. Nach dem Verlauf von 2 Tagen
nach der Zugabe von frischem Medium betrug die Menge an s-
Poly-L-lysin in der Kulturlösung 0,75 mg/ml.
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Aus den obigen Ergebnissen wurde bestätigt, daß die
erfindungsgemäßen immobilisierten Bakterienzellen für die
semikontinuierliche Kultivierung verwendet werden konnten.
Beispiel 6
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Bakterienzellen (Naßgewicht 2,0 g), kultiviert und
wiedergewonnen auf gleiche Weise wie in Beispiel 1, wurden in
sterilisiertem Wasser (5 ml) suspendiert und anschließend
wurde eine 15%ige wäßrige Lösung (40 ml) aus
photovernetzbarem Harz ENT-2000 (Warenzeichen eines Produkts,
hergestellt von Kansai Paint Co., Ltd.) zugegeben und
vermischt. Dann wurde in einem Autoklaven sterilisiert und
ein Polymerisationsinitiator (0,008 g) wurde zugegeben. Es
erfolgte eine Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen (365
nm) der entstehenden Suspension unter Rühren während 30
min. wobei ein Gel mit immobilisierten Bakterienzellen
erhalten wurde. Dieses Gel wurde zu 5 mm Würfeln verformt,
wobei fixierte Bakterienzellen erhalten wurden (53 g).
Die immobilisierten Bakterienzellen in dem
photovernetzbaren Harz wurden zu einem Medium (pH 4, 100 ml) gegeben,
welches Glucose (50 g/l), L-Lysin (10 g/l) und
Citronensäure (20 g/l) enthielt. Anschließend wurden die Zellen
unter Schütteln bei 30ºC kultiviert und die Mengen an ε-
Poly-L-lysin in der Kulturlösung wurde nach 2 und 3 Tagen
gemessen, wobei 0,44 g/l nach 2 Tagen und 0,57 g/l nach 3
Tagen erhalten wurden.
Beispiel 7
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Bakterienzellen, präkultiviert auf gleiche Weise wie in
Beispiel 1, wurden mittels Zentrifugentrennung gewonnen
und mit sterilisiertem Wasser (Naßbakteriengewicht: 4,0 g)
gewaschen. In ein Medium (pH 6,8, 30 ml), bestehend aus
Glucose (50 g/l), Anmoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt
(5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat 0,5 g/l),
Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l),
wurden die obigen Bakterienzellen gegeben und dann wurden
gesinterte poröse Polyurethanperlen (Größe: 5 mm, 2 g)
zugegeben und anschließend wurde unter langsamen Schütteln
bei 30ºC kultiviert. Nach 30 h wurden Bakterienzellen
immobilisiert an porösem, gesinterten Poly- urethankörper
gewonnen. Die immobilisierten Bakterienzellen wurden in
einem Medium (pH 4, 50 ml), enthaltend Glucose (50 g/l),
L-Lysin (10 g/l) und Zitronensäure (20 g/l), suspendiert
und anschließend erfolgte eine Kultivierung unter
Schütteln bei 30ºC. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der
Kulturlösung nach 2 Tagen der Kultivierung betrug 0,62 mg/ml.
Die Kulturlösung wurde der Zentrifugentrennung (3.000 G,
20 min) unterworfen und die Absorption des entstehenden
Überstandes wurde bei 660 nm gemessen. Die Absorption
betrug 0,009 und die Bakterienzellen waren vollständig
entfernt.
Beispiel 8
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In einen Reaktor mit einer Kapazität von 400 ml, durch den
Luftblasen geblasen werden konnten, wurde ein Medium (pH
6,8, 100 ml), bestehend aus Glucose (50 g/l),
Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l),
Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l),
Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und
Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), gegeben, dann wurde ein
Kera
mikmaterial in Blockform (hergestellt von Nihon Gaishi
Co., Ltd.) (30 g) zugegeben. Anschließend wurde in an sich
bekannter Weise sterilisiert, dann wurde mit Streptomyces
albulus, entnommen aus einer Schrägkultur für die
Konservierung von Bakterienzellen, in einer Menge von einer
Platinschleife inkubiert, und es erfolgte eine
Belüftungskultivierung mit einer Belüftungsmenge von 0,5 l/min bei 30ºC
während 50 Stunden. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der
Kulturlösung betrug nach 50 Stunden 0,3 g/l. Danach wurde
nur die Kulturlösung gewonnen und anschließend wurde zu
den immobilisierten Bakterienzellen in dem Reaktor ein
frisches Medium (pH 4, 100 ml), bestehend aus Glucose (50
g/l), L-Lysinhydrochlorid (10 g/l), Citronensäure (20
g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5
g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03
g/l), zugegeben und es erfolgte eine
Belüftungskultivierung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an
e-Poly-Llysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 3, 7 g/l.
Die Kulturlösung wurde gewonnen und anschließend wurde
frisches Medium zugegeben. Das Verfahren zur Durchführung
der Belüftungskultivierung bei 30ºC während 48 Stunden
wurde 3 x wiederholt. Als Ergebnis wurden die folgenden
Mengen an ε-Poly-L-lysin zu den entsprechenden
wiederholten Zeiten wie folgt erhalten:
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4,5 g/l (zum ersten Mal), 4,0 g/l (zum zweiten Mal)
und 5,2 g/l (zum dritten Mal).
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Aus dem Vorhergehenden wurde bestätigt, daß wenn ein
Mediumaustausch wiederholt wurde, unter Verwendung der
erfindungsgemäß immobilisierten Bakterienzellen, die
semikontinuierliche Herstellung von ε-Poly-L-lysin erfolgte.
Beispiel 9
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In einen Reaktor mit 400 ml Kapazität des Luftblasen-Typs
wurde ein Medium (pH 6,8, 100 ml) gegeben, bestehend aus
Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt
(5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat 0,5 g/l),
Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l). Es
wurde ein Celluloseschwamm (Mikrocube FN-SO&sub3; (Warenzeichen
für ein Produkt, hergestellt von Sakai Engineering Co.,
Ltd.)) zugegeben und dann wurde das Medium in an sich
bekannter Weise sterilisiert. Es wurde mit Streptomyces
albulus, entnommen aus einem Schrägmedium für die
Konservierung von Bakterienzellen, in einer Menge von einer
Platinschleife, inkubiert, und dann wurde eine
Belüftungskultivierung bei 30ºC während 50 Stunden mit einer
Belüftungsmenge von 0,5 l/min durchgeführt. Die Menge an
ε-Poly-Llysin in der Kulturlösung betrug nach 50 Stunden 0,33 g/l.
Danach wurde nur die Kulturlösung wiedergewonnen und es
wurden fixierte Bakterienzellen in den Reaktor zugegeben.
Es wurde weiterhin ein frisches Medium (pH 4, 100 ml),
bestehend aus Glucose (50 g/l), L-Lysinhydro--chlorid (10
g/l), Citronensäure (20 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat
(1,36 g/l), Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l),
Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-
sulfat (0,03 g/l), zugegeben und dann erfolgte die
Belüftung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an
s-Poly-Llysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 2,9 g/l).
Die Kulturlösung wurde wiedergewonnen und anschließend
wurde frisches Medium zugegeben und das Verfahren zur
Durchführung der Belüftungskultivierung bei 30ºC während
48 Stunden wurde 3 x wiederholt. Die Mengen an gebildetem
ε-Poly-L-lysin bei den entsprechenden Wiederholungszeiten
waren wie folgt:
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3,0 g/l (zum ersten Mal), 2,5 g/l (zum zweiten Mal)
und 2,0 g/l (zum dritten Mal).
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Aus dem Obigen wurde bestätigt, daß wenn der
Mediumaustausch wiederholt unter Verwendung immobilisierter
Bakterienzellen gemäß der Erfindung durchgeführt wurde, eine
semikontinuierliche Herstellung von s-Poly-L-lysin möglich
war.
Vergleichsbeispiel 2
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Bakterienzellen wurden kultiviert, ohne daß der
Keramikträger wie im Beispiel 8 zugegeben wurde. In einen Reaktor
mit 400 ml Kapazität des Luftblasen-Typs wurde ein Medium
(pH 6,8, 100 ml) gegeben, bestehend aus Glucose (50 g/l),
Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt (5 g/l),
Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l), Dinatriummonohydrogenphosphat
(1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat (0,04
g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l). Danach wurde das
Medium in an sich bekannter Weise sterilisiert. Es wurde mit
Streptomyces albulus, entnommen aus einer Schrägkultur,
für die Konservierung von Bakterienzellen in einer Menge
von einer Platinschleife inokuliert, und dann erfolgte
eine Belüftungskultivierung bei 30ºC mit einer
Belüftungsmenge von 0,5 l/min während 50 Stunden. Die Menge an s-
Poly-L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 50 Stunden
0,25 g/l, Danach wurden die Bakterienzellen aus der
Kulturlösung durch Zentrifugieren wiedergewonnen (6.000 G, 15
min), dann wurde zu den wiedergewonnenen Bakterienzellen
frisches Medium (pH 4, 100 ml), bestehend aus Glucose (50
g/l), L-Lysinhydrochlorid (10 g/l), Citronensäure (20
g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l),
Zinksulfat (0, 04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0, 03 g/l),
zugegeben und es erfolgte die Belüftung bei 30ºC während 48
Stunden. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der Kulturlösung
betrug nach 48 Stunden 1,3 g/l. Bakterienzellen wurden aus
der Kulturlösung durch Zentrifugieren (6.000 G, 15 min)
wiedergewonnen und anschließend wurde das obige frische
Medium hinzugegeben und es erfolgte eine
Belüftungskulti
vierung bei 30ºC während 48 Stunden. Die Menge an ε-Poly-
L-lysin in der Kulturlösung betrug nach 48 Stunden 0,7
g/l.
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Aus den obigen Ergebnissen wird bestätigt, daß gemäß der
semikontinuierlichen Herstellung von ε-Poly-L-lysin, wobei
Bakterienzellen ohne Verwendung immobilisierter
Bakterienzellen wiedergewonnen und kultiviert wurden, die
Produktivität an ε-Poly-L-lysin bei jedem wiederholten Mal
erniedrigt wurde. Somit ist eine semikontinuierliche
Herstellung schwierig.
Beispiel 10
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In einen Reaktor mit 400 ml Kapazität des Luftblasen-Typs
wurde ein Medium (pH 6,8, 100 ml) zugegeben, bestehend aus
Glucose (50 g/l), Ammoniumsulfat (10 g/l), Hefeextrakt
(5 g/l), Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Dinatriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat
(0,5 g/l), Zinksulfat (0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat
(0,03 g/l). Es wurde ein Keramikmaterial in Blockform
(hergestellt von Nihon Gaishi Co., Ltd.) (30 g) zugegeben,
und anschließend wurde in an sich bekannter Weise
sterilisiert. Es wurde dann mit Streptomyces albulus, entnommen
aus einer Schrägkultur, in einer Menge von einer
Platinschleife inokuliert, und dann erfolgte eine
Belüftungskultivierung bei 30ºC mit einer Belüftungsmenge von 0,5 l/min
für 50 Stunden. Die Menge an ε-Poly-L-lysin in der
Kulturlösung betrug nach 50 h 0, 3 g/ 1. Danach wurde eine
kontinuierliche Herstellung von s-Poly-L-lysin im Verlauf von
300 Stunden durchgeführt, wobei in den Reaktor jeweils ein
frisches Medium (pH 4), bestehend aus Glucose (50 g/l), L-
Lysinhydrochlorid (10 g/l), Citronensäure (20 g/l),
Kaliumdihydrogenphosphat (1,36 g/l),
Natriummonohydrogenphosphat (1,58 g/l), Magnesiumsulfat (0,5 g/l), Zinksulfat
(0,04 g/l) und Eisen(II)-sulfat (0,03 g/l), zugegeben
wurde und die Entnahme der Kulturlösung aus dem Reaktor in
einer Rate von 2 ml/h erfolgte. Die Gesamtmenge an im
Verlauf von 300 Stunden gebildetem ε-Poly-L-lysin betrug
2,2 g.
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Aus dem Vorhergehenden wird bestätigt, daß wenn ein
Mediumaustausch kontinuierlich unter Verwendung immobilisierter
Bakterienzellen durchgeführt wird, es möglich ist, eine
kontinuierliche Herstellung von g-Poly-L-lysin leicht
durchzuführen.