DE2723454B2

DE2723454B2 - Beständiger Komplex aus Träger und Aminoacylase

Info

Publication number: DE2723454B2
Application number: DE2723454A
Authority: DE
Inventors: Francois Palaisbeau Meiller; Bernard Fresnes Mirabel
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1976-05-26
Filing date: 1977-05-24
Publication date: 1979-01-11
Also published as: NL180852B; JPS573352B2; SE432266B; NL180852C; GB1547077A; JPS52148682A; US4132596A; IT1079668B; NL7705699A; DE2723454A1; BE855051A; FR2352827B1; SE7706204L; DE2723454C3; CA1080645A; FR2352827A1

Description

—CH,-N —CH-,-

* I

oder

—CH₂~N—(R).,X

in den R gleich oder verschieden ist und jeweils für eine Alkyl- oder Hydroxylalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und X ein mineralisches oder anorganisches Anion bedeutet

4. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die fixierte Aminoacylase tierischer Herkunft oder von Mikroorganismen erzeugt ist

5. Verwendung der Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Auftrennung von recemischen Acetylaminosäuren.

Komplexe besitzen aber ähnlich wie aus der DE-OS 15 17 761 bekannte Komplexe keinerlei mechanische Festigkeit und lassen sich deshalb in Kolonnen nur sehr schwer einsetzen, es sei denn, daß unter sehr speziellen Bedingungen gearbeitet wird, vor allem wenn die Reaktion unter Druck durchgeführt wird. Ihr Volumen ändert sich mit der Ionenstärke oder dem pH-Wert des Mediums. Außerdem sind sie biologisch abbaubar und können nicht thermisch sterilisiert werden.

ίο Mit den erfindungsgemäßen Komplexen aus einem Trägermaterial und Aminoacylase werden diese Nachteile vermieden. Die neuen Komplexe besitzen sehr gute mechanische Eigenschaften; sie können auch unter Druck in Kolonnen eingesetzt werden. Ihr Volumen ändert sich nicht; sie sind nicht biologisch abbaubar und sie können sterilisiert werden. Außerdem zeichnen sie sich durch einen außerordentlich langsamen Aktivitätsverlust aus und können auf sehr einfache Weise regeneriert werden.

Die erfindungsgemäß vorgesehenen Komplexe sind beständige Produkte mit enzymatischer Aktivität und bestehen aus Aminoacylase adsorbiert auf einem Träger; sie sind dadurch gekennzeichnet daß der Träger eine poröse mineralische Substanz mit einer Korngrößenverteilung von 4 μιη bis 5 mm, einer spezifischen Oberfläche im Bereich von 5 bis 150 mVg, einem Porendurchmesser von 50 bis 250 nm und einem Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g ist, der mit einem Film aus vernetztem Polymerisat enthaltend oder tragend

jo tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Ammoniumsalze in einer Menge unter 10 mg/m² überzogen ist

Poröse mineralische Träger im Sinne der Beschreibung sind Metalloxide wie Titanoxid, Tonerden und insbesondere Kieselsäuren. Diese Träger weisen mittle re Porendurchmesser von 50 bis 250 nm, vorzugsweise von 60 bis 15P nm auf, eine spezifische Oberfläche von 5 bis 150m²/g, vorzugsweise von 20 bis 50m²/g, eine Korngrößenverteilung von 4 μιη bis 5 mm und ein Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g.

Die funktionellen Gruppen, tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumsalze, lassen sich durch die allgemeinen Formeln

Die Erfindung betrifft einen Komplex aus einem Trägermaterial und darauf adsorbierter Aminoacylase sowie dessen Anwendung zur Auftrennung von racemischen Acetylaminosäuren.

Zur Durchführung dieser Trennungsreaktion hat man bereits verschiedene Komplexe aus Trägermaterial und Enzym verwendet: So sind aus der DE-OS 15 17 761 Komplexe bekannt, bei denen das Enzym mittels kovalenter Bindung an ein organisches Trägermaterial gebunden ist Als Trägermaterial werden hochmolekulare polymere Stoffe, wie Cellulose, Dextran, Peptide, Proteine oder auch synthetische Polymerisate wie Styrolharz oder Acrylharz genannt. Diese Komplexe verlieren aber beim Gebrauch zunehmend ihre Aktivität und lassen sich nicht oder nur schlecht regenerieren. Zudem sind die natürlichen Hochpolymeren nicht für alle Zwecke ausreichend mechanisch beständig und zudem biologisch abbaubar.

Weiterhin sind Komplexe bekannt, bei denen das Enzym an ein Trägermaterial adsorbiert ist, das aus einem Polysaccharid besteht, an das tertiäre Amine oder quaternäre Ammoniumverbindungen fixiert sind. Diese oder

-CH₂-N-CH₂-

R —CH₂- N¹—(R)₃X

wiedergeben, in denen R gleich oder verschieden sein kann und jeweils für eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht und X ein mineralisches oder organisches Anion, beispielsweise das Chlorid-, Sulfat-, Nitrat-, Phosphat- oder Citratanion bedeutet.

Diese funktionellen Gruppen sind Teil der Kette des vernetzten Polymerisats oder sind an das vernetzte

bo Polymerisat gebunden, das die gesamte Träger-Oberfläche überzieht

Die vernetzten Polymerisate, die die Oberfläche des mineralischen Trägers überziehen, sind an sich bekannte Produkte, die mit Hilfe beliebiger klassischer Polymeri-

b5 sationsverfahren erhalten werden. Sie werden hergestellt ausgehend von vernetzbaren Monomeren, entweder alleine oder zusammen mit einem anderen Monomer sowie gegebenenfalls in Gegenwart eines

Katalysators. Als Monomere seien genannt: Epoxyverbindungen. die mit Polyaminen als Katalysator vernetzen; Polyamin-Formaldehyd- sowie Phenol-Formaldehydgemische, die ohne Katalysator vernetzen^ die Gemische aus Vinylmonomeren: Vinylpyridin-Äthylenglykoldiacrylat, Vmylpyridin-Vinyltriäthoxysilan, Styrol-Divinylbenzol, Styrol-Vinyltriäthoxysilan, die mit einem freie Radikale bildenden Initiator vernetzen, beispielsweise in Gegenwart organischer Peroxide und Azonitrile.

Besitzt das vernetzte Polymerisat auf der Oberfläche des mineralischen Trägers keine der oben definierten funktionellen Gruppen in seiner Kette, so muß es in an sich bekannter Weise modifiziert werden.

Beim Oberziehen oder Beschichten des mineralischen Trägers soll die Menge des Monomeren oder Monomerengemisches so bemessen sein, daß die auf der Oberfläche des Trägers verteilte Menge an vemetziem Polymerisat mit funktionellen Gruppen weniger als 10 mg/m² ausmacht und vorzugsweise im Bereich von 1 bis 6 mg/m² liegt; unter dieser Bedingung erhält man einen Film, der die Poren des Trägermaterials nicht verstopft.

Die mit einem vernetzten, funktioneile Gruppen aufweisenden Polymerisat überzogenen mineralischen Träger weisen eine Austauscherkapazität unter 2 mÄquVg, vorzugsweise von 0,3 bis 1,2 mÄqJg auf.

Die an das Trägermaterial adsorbierten bzw. fixierten Aminoacylasen sind Enzyme, die tierischer Herkunft sein können, beispielsweise Extrakte von Schweinenieren oder Schweinehoden oder die durch Mikroorganismen wie Aspergillus, Lactobacillus arabinosus, Mikrococus glutamicus, Pseudomonas cruiviae produziert worden sind.

Die Fixierung des Enzyms auf dem Träger wird in an sich bekannter Weise erreicht, in der Kälte in wäßriger, gegebenenfalls gepufferter und auf den mit dem Enzym am besten verträglichen pH-Wert eingestellter Lösung, entweder durch einfache Berührung während der für die Fixierung erforderlichen Zeit oder indem die Enzymlösung auf den in einer Kolonne enthaltenen Träger aufgegeben wird.

Die auf diese Weise fixierten Enzyme sind beständig und aktiv. Ihre relative Aktivität hängt ab von der Beschaffenheit und der Herkunft des Enzyms.

Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Anwendung der Komplexe aus Träger und Aminoacylasen zum Auftrennen von racemischen Acetylaminosäuren.

Zu diesen Acetylaminosäuren, die sich mit den erfindungsgemäßen Komplexen behandeln lassen, gehören:

N-Acetyl-DL-arginin, N-Acetyl-DL-histidin,
N-Acetyl-DL-valin, N-Acetyl-DL-triptophan,
N-Acetyl-DL-alanin, N-Acetyl-DL-leucin,
N- Acetyl-DL· tyrosin, N-Acetyl-DL-phenylalanin,
N-Acetyl-DLmethionin, N-Acetyl-DL-CH^- dopa.

Die Umwandlung der N-Acetylaminosäure in L-Aminosäure wird erreicht, indem man eine wäßrige Lösung der DL-Aminosäure mit dem Komplex in Berührung bringt, während der für die Umwandlung erforderlichen Zeit oder besser noch, indem man diese Lösung durch eine Kolonne laufen läßt, die den Komplex enthält. Die Konzentration der Lösung an Acetylaminosäure beträgt 0,1 bis 2 Mol/l; der mit dem Enzym verträgliche pH-Wert liegt bei 6 bis 10 und die Temperatur liegt im Bereich von Raumtemperatur bis zu 65° C.

Wird die Umwandlung in der Kolonne vorgenommen, so wird eine lineare Durchflußgeschwindigkeit von 0,1 bis 30 cm/min eingehalten. Eine höhere lineare Geschwindigkeit, d. h. höher als einige cm/min, ermöglicht die Produktivität stark zu erhöhen, erzeugt aber in der Kolonne einen gewissen Druck. Dieser Druck ist kein Nachteil, da er ohne Einfluß auf das Volumen des Komplexes bleibt, im Hinblick auf dessen mechanische Eigenschaften. Bei den Komplexen nach dem Stand der

ι ο Technik ist dies nicht der Fall.

Je nach Herkunft des Enzyms kann es von Vorteil sein, der Aminosäurelösung zur Beschleunigung der Reaktion eine kleine Menge eines Aktivators zuzusetzen, beispielsweise Kobaltion in einem Anteil von 10~² bis 10~⁵ Mol/l in Form eines Salzes wie beispielsweise des Chlorids.

Die erhaltene L-Aminosäure wird mit Hilfe beliebig bekannter Verfahren wie Ausfällen oder Chromatographie abgetrennt und isoliert,

Die Komplexe nach der Erfindung sind ziemlich beständig; jedoch wird nach längerem Gebrauch, beispielsweise nach 30 Tagen eine gewisse Erschöpfung des Komplexes beobachtet. Dies ist ebenfalls kein Nachteil, weil es zur Regenerierung des Komplexes ausreicht, den erschöpften Träger mit einer Enzymlösung in Berührung zu bringen.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.

jo B e i s ρ i e 1 1

Fixierung des Enzyms

Als Träger wurde eine Kieselsäure mit Korngrößenverteilung 40 bis 100 μπι, spezifischer Oberfläche is 37 m²/g, Porendurchmesser HOnm und Porenvolumen 0,97 ml/g eingesetzt, die mit einem vernetzten Polymerisat enthaltend funktionell Gruppen

—CH₂-N-CH₂-

I

C₂H₅

überzogen war. Das Trägermaterial besaß folgende Kennzeichen:

Kohlenstoffgehalt

Stickstoffgehalt

Menge des fixierten Polymerisats

Austauschkapazität

8,8%
2,4%

3,3 nig/m²
1 mÄquVg

W In einer Kolonne mit Durchmesser 1 cm wurden 6 ml Trägermaterial entsprechend 3 g eingefüllt; dann wurden mit einer Geschwindigkeit von 120 ml/h 40 ml einer 0,5gew.-%igen Lösung aus L-Aminoacylase (extrahiert aus Schweinenieren) in destilliertem Wasser aufgegeben.

Der Träger mit adsorbiertem Enzym wurde mit 50 ml destilliertem Wasser gewaschen, die man mit einer Geschwindigkeit von 120 ml/h durchlaufen ließ.
Der erhaltene Komplex aus Träger und Enzym wies

bo eine Aktivität von 40 E/g Komplex auf. E (Einheit) bezeichnet die Anzahl Mikromol L-Aminosäure, die je Minute bei 55°C erhalten werden.

Abtrennung von L-Methionin

b5 Durch die Kolonne wurde mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h eine wäßrigen, O.lmolare N-Acetyl-DL-methioninlösung gegeben, die 5 χ 10~⁴ Mol Co ⁺ + Ionen enthielt, pH-Wert 7, Temperatur 55° C.

Mittels Ninhydrin wurde in der auslaufenden Lösung die Konzentration an L-Methionin bestimmt Hieraus ergab sich eine Umwandlung von 92 Mol-%, nach 3stündigem Betrieb.

Beispiel 2
Fixierung des Enzyms

Es wurde ein Kieselsäure-Träger eingesetzt mit Korngrößenverteilung 100 bis 200 μπι, spezifischer Oberfläche 24m²/g, mittlerem Porendurchmesser 140 nm und Porenvolumen 1,1 ml/g, der mit einem vernetzten Polymerisat auf Styrolbasis enthaltend funktionell Gruppen, entsprechend der Formel

CH,
CH₂-N-CH₃Cl

CH₃

versehen war.

Die weiteren Merkmale dieses Trägers lauteten:

Kohlenstoffgehalt
Chlorgehalt
Stickstoffgehalt
fixiertes Polymerisat
Austauschkapazität

4,8%

2%

0,9%

3,3 mg/m²

0,5 mÄquVg

3 g des erhaltenen Trägers wurden während 1 h mit 100 ml einer Lösung in Berührung gebracht, die 0,5 Gew.-% der gleichen L-Aminoacylase wie in Beispiel 1 in destilliertem Wasser enthielt und auf pH 7 eingestellt war. Der gebildete Komplex aus Träger und Enzym wurde abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Seine Aktivität betrug 45 E/g.

Abtrennung von L-Methionin

Der Komplex wurde in eine gleichartige Kolonne wie in Beispiel 1 gegeben und eine Lösung aus N-Acetyl-DL-methionin unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchlaufen gelassen.

Der Umwandlungsgrad betrug 100 Mol-%.

Beispiel 3
Fixierung des Enzyms

In eine Kolonne mit Durchmesser 2,5 cm wurden 20 ml entsprechend 10 g gleiches Trägermaterial wie in Beispiel 2 gegeben; dann wurden im Verlauf von 1 h 150 ml einer l%igen L-Aminoacylase-Lösung, die ausgehend von Aspergillus erhalten worden war, in destilliertem Wasser gegeben. Der Komplex aus Träger und Enzym wurde mit destilliertem Wasser gewaschen; seine Aktivität lag bei 20 E/g.

Kontinuierliche Abtrennung von L-Methionin

Man ließ durch die Kolonne kontinuierlich eine 0,1 m Lösung aus N-Acetyl-DL-methionin in destilliertem Wasser, pH 7. enthaltend 5xlO"⁴ Mol/l Co + + -Ionen, Temperatur 55°C, mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h laufen.

Der Umwandlungsgrad für L-Methionin wurde nach 3 h und dann alle 5 Tage bestimmt:

Nach 3 h betrug die Umwandlung 100 Mol-%

nach 5d betrug die Umwandlung 100 Mol-%

nach 1Od betrug die Umwandlung 93 Mol-%

nach 15 d betrug die Umwandlung 85 Mol-%

nach 20 d betrug die Umwandlung 83 Mol-%
nach 25 d betrug die Umwandlung 80 Mol-%
nach 30 d betrug die Umwandlung 30 Mol-%

■-, Die Zuspeisung von N-Acetyl-DL-methioninlösung

wurde unterbrochen und durch die gleiche L-Aminoacylaselösung wie oben ersetzt 50 ml dieser Lösung wurden in 20 min aufgegeben.

Der Durchlauf der N-Acetyl-DL-methioninlösung

ι ο wurde wieder aufgenommen.

Nach 30 Tagen und 3 h betrug die Umwandlung 92% nach 35 Tagen betrug die Umwandlung 87%

nach 40 Tagen betrug die Umwandlung 75%

I^ Bemerkenswert ist die gute Arbeitsweise der Kolonne und die einfache Reaktivierung des Trägers.

Beispiel 4
Kontinuierliche Abtrennung von L-Phenylaianin

In der Kolonne gemäß Beispiel 3 wurde das Durchlaufenlassen der N-Acetyl-DL-methioninlösung unterbrochen und kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h eine 0,1 m Lösung aus N-Acetyl-DL-

><; phenylalanin in destilliertem Wasser, pH 7, enthaltend 5 χ 10-⁴ Mol/I Co⁺+-Ionen, Temperatur 55°C aufgegeben.

Der Umwandlungsgrad für L-Phenylanilin wurde durch Titrieren mit Ninhydrin nach 3 h und dann alle 5

jo Tage bestimmt

Nach 40 Tagen und 3 h betrug die Umwandlung

62 Mol-%
nach 45 Tagen betrug die Umwandlung

50 Mol-%
^!l nach 50 Tagen betrug die Umwandlung

40 Mol-%
nach 55 Tagen betrug die Umwandlung

30 Mol-%

κι Die Zuspeisung an N-Acetyl-DL-phenylalaninlösung

wurde unterbrochen und durch die gleiche L-Aminoacylaselösung v/ie in Beispiel 3 ersetzt. 50 ml dieser Lösung wurden in 20 min aufgegeben.

Darauf wurde die Zuspeisung der N-Acetyl-DL-phe-

4) nylalaninlösung wieder aufgenommen.

Nach 55 Tagen und 3 h betrug die Umwandlung

83 Mol-°/o
nach 60 Tagen betrug die Umwandlung

80 Mol-%

¹⁽¹ nach 65 Tagen betrug die Umwandlung

80 Mol-%

Dies zeigt daß der Aktivitätsverlust langsam ist und mit dem Komplex als Träger und Aminoacylase ohne r> Unterschied verschiedene N-Acetyl-DL-aminosäuren behandelt werden können.

Beispiel 5

In einer Kolonne mit Durchmesser 0,7 cm und Höhe 34 cm, die 13 ml gleichen Träger wie in Beispiel 2 enthielt, ließ man im geschlossenen Kreislauf während 1 h 100 ml einer 1gew.-%igen Lösung aus L-Aminoacylase in destilliertem Wasser umlaufen; die L-Aminoacylase war ausgehend von Aspergillus erhalten worden. Die Umlaufmenge bzw. Geschwindigkeit betrug 700 ml/h, wodurch ein Druck von 8 bar in der Kolonne erzeugt wurde. Die Aktivität des Komplexes betrug 20 E/g.

Kontinuierliche Abtrennung von L-Methionin unter Druck

Man ließ in der Kolonne kontinuierlich unter den gleichen Bedingungen wie oben (700 ml/h, Druck 8 bar) -, eine 0,1 m Lösung aus N-Acetyl-DL-methionin in destilliertem Wasser, pH 7, enthaltend 5 χ 10-⁴ Mol/l Co⁺+-Ionen, von Raumtemperatur umlaufen. Dann wurde die Umwandlung zu L-Methionin bestimmt.

Nach 3 h betrug die Umwandlung 20 Mol-% '"

nach 24 h betrug die Umwandlung 20 Mol-%
nach 48 h betrug die Umwandlung 20 Mol-%

Dies zeigt, daß der Komplex seine Aktivität beibehält,

daß er wenig altert und daß der Träger in keiner Weise durch den Druck beeinträchtigt wird.

Zum Vergleich wurde der Versuch wiederholt, jedoch als lonenaustauscherträger ein handelsübliches poröses, vernetztes Dextrangel verwendet.

Während der Fixierung des Enzyms wurde ein Druckanstieg bis zu 20 bar und ein Verstopfen der Kolonne beobachtet. Infolgedessen fand keinerlei Durchsatz statt.

Im Gegensatz hierzu ermöglichen es die guten mechanischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Trägers die Trennung der Aminosäuren unter sehr einfachen Bedingungen und ohne Schwierigkeiten vorzunehmen.

Claims

Patentansprüche:

1. Beständiger Komplex aus Träger und Aminoacylase mit Enzymaktivität bestehend aus Aminoacylase adsorbiert auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine mineralische poröse Substanz mit einer Korngrößenverteilung von 4 um bis 5 mm, einer spezifischen Oberfläche von 5 bis 150m²/g, einem Porendurchmesser von 50 bis 250 nm und einem Porenvolumen von 0,4 bis 2 ml/g ist, die mit einem Film in einer Menge von weniger als 10 mg/m² überzogen ist, der aus einem vernetzten Polymerisat besteht, das tertiäre Aminogruppen oder quaternäre Ammoniumsalzgruppen enthält oder trägt

2. Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Metalloxid wie Titanoxid, Tonerde oder Kieselsäure ist

3. Komplex nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen des Oberzugs auf dem Träger den Formeln