CN101509021B - 一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺，将吸附固定化材料固定于发酵罐中，接入ε-聚赖氨酸生产菌株，实现ε-聚赖氨酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定，并利用该生产菌株固定化发酵生产ε-聚赖氨酸。利用本发明公开的吸附固定化生产ε-聚赖氨酸的工艺，能够有效改善ε-聚赖氨酸发酵过程中菌丝体易附着于发酵罐罐壁等问题，此外，该工艺可以有效提高ε-聚赖氨酸生产效率，并具有产物浓度高、批次生产稳定等优点，适用于ε-聚赖氨酸的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺，并将其用于ε-聚赖氨酸的发酵生产。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是L-赖氨酸的同型聚合物，它由α-羧基与ε-氨基形成肽键连接而成，一般ε-PL由20-40个L-赖氨酸残基所构成。ε-PL是一种抗菌谱广(包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均具有良好的抑制作用)、生物安全性高(ε-PL可降解为人体必须氨基酸L-赖氨酸)、热稳定性强(120℃加热20min仍保持抗菌活性)、pH适用范围宽的新型营养型食品防腐剂。ε-PL生产过程中生产效率低、产物浓度低、产物分离难等问题，困扰着ε-PL的工业化生产。目前ε-PL的研究主要处于实验室研究阶段，仅有日本Chisso公司实现了ε-PL的工业化生产。
ε-PL的生产菌株一般为放线菌，主要包括小白链霉菌(Streptomyces)和北里孢菌(Kitasatospora)。放线菌发酵过程中，常伴有菌丝体吸附于发酵罐内壁等问题，这对于ε-PL发酵是极为不利的。研究中我们发现，采用北里孢菌PL6-3(中国发明专利：ZL2005100037774.2，菌种保藏号：CCTCC No.M 205012)生产ε-PL过程中，菌丝结团极为严重，随着发酵的进行，大量的菌丝吸附于发酵罐罐壁且菌丝悬于发酵液上方，难以与发酵液相接触，造成发酵液体积逐渐减少，参与ε-PL合成菌体量降低等问题，限制了ε-PL的发酵生产。
ε-PL的发酵生产主要采用游离细胞发酵，Hiraki等曾尝试利用凝胶包埋、多孔陶瓷包埋等细胞包埋固定化ε-PL生产菌株(美国专利：US005900363A)。经包埋，ε-PL的生产效率基本维持不变，但固定化菌株降低了产物ε-PL从发酵液中分离的难度。但是，ε-PL发酵生产需要消耗大量的氧气，这些包埋方法限制了ε-PL发酵过程的氧气传递，不利于实现ε-PL的高效生产。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺，以避免发酵过程中大量的菌丝吸附于发酵罐罐壁或悬于发酵液上方，难以与发酵液相接触的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺，将吸附固定化材料固定于发酵罐中，接入ε-聚赖氨酸生产菌株，实现ε-聚赖氨酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定，并利用该生产菌株固定化发酵生产ε-聚赖氨酸。
更优选的方案是将吸附固定化材料固定于发酵罐中，加入种子培养基，接入ε-聚赖氨酸生产菌株，培养10～40h，实现ε-聚赖氨酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定，再将发酵罐内的种子液替换为发酵培养基，利用已固定的ε-聚赖氨酸生产菌株单批次固定化发酵生产ε-聚赖氨酸。
在上述ε-聚赖氨酸的单批次发酵生产结束后，将发酵罐内的发酵液全部移出，重新替换新鲜发酵培养基，利用原始已固定的生产菌株，重复单批次发酵生产ε-聚赖氨酸的条件，如此循环，利用吸附于固定化材料上的生产菌株即可实现ε-聚赖氨酸的多批次固定化发酵生产。
上述技术方案中，所述的固定化材料为网状固定化材料或片状固定化材料，优选网状固定化材料。所述的网状固定化材料为富含网状结构的植物纤维(如纱布、丝瓜巾)、富含网状结构的人造纤维(如尼龙纤维)或金属网状材料(如不锈钢丝网)，网状固定化材料表面布满孔隙以保证氧气的正常扩散与底物、产物的正常运输。所述的片状固定化材料为片状结构的植物纤维(如棕榈、甘蔗渣)、片状结构的人造纤维(如塑料板)或片状结构的金属材料(如金属板)，片状固定化材料表面富含突起与沟壑，以保证菌株的吸附。
上述技术方案中，所述的ε-聚赖氨酸生产菌株在吸附固定化材料上的吸附固定是指ε-聚赖氨酸生产菌株依靠菌丝体自身吸附作用吸附固定化材料上，ε-聚赖氨酸生产菌株无需包埋。
上述技术方案中，所述的ε-聚赖氨酸的发酵生产条件为：搅拌转速100～1000r/min，发酵温度25～37℃，pH值为3.8-6.5。
上述技术方案中，所述的吸附固定化材料固定于发酵罐内但不影响搅拌。
为了实现ε-PL的吸附固定化发酵生产，可以通过一种包含有吸附固定化材料的固定化反应器实现(附图1)，但本发明的ε-PL的吸附固定化发酵生产并不局限于本反应器。
该固定化反应器包括发酵罐、搅拌装置、吸附固定化材料、pH自动控制装置和补料装置，吸附固定化材料为细胞固定化载体固定于发酵罐内，pH自动控制装置和补料装置分别通过恒流泵与发酵罐相连，搅拌装置悬于发酵罐中。
其中，所述的pH自动控制装置由pH探头、pH检测器、恒流泵、碱液瓶、空气过滤器及相互连接管路构成，pH探头接于发酵罐上与发酵罐中的发酵液相接触，当发酵罐内pH值低于所控pH值时，通过恒流泵将碱液瓶中的碱液补入发酵罐中，空气过滤器置于碱液瓶密封口处。
其中，所述的补料装置由恒流泵、补料瓶、空气过滤器及相互连接的管路所构成，通过恒流泵将补料瓶中的培养基补入发酵罐中，空气过滤器置于补料瓶密封口处。
其中，发酵罐上部设置一个空气入口和一个尾气出口，空气经空气过滤器过滤以保证通入发酵罐的空气处于无菌状态。
其中，所述的吸附固定化材料固定于发酵罐内而不影响搅拌。吸附固定化材料为网状固定化材料或片状固定化材料，优选网状固定化材料。所述的网状固定化材料为富含网状结构的植物纤维(如纱布、丝瓜巾)、富含网状结构的人造纤维(如尼龙纤维)或金属网状材料(如不锈钢丝网)，网状固定化材料表面布满孔隙以保证氧气的正常扩散与底物、产物的正常运输。所述的片状固定化材料为片状结构的植物纤维(如棕榈、甘蔗渣)、片状结构的人造纤维(如塑料板)或片状结构的金属材料(如金属板)，片状固定化材料表面富含突起与沟壑，以保证菌株的吸附。网状固定化材料可绕单根棒状物成小圈，或者沿多根棒状物绕成大筒状，棒状物可取任何外界硬质材料固定于发酵罐内，或者借助发酵罐固有的或发酵生产必需的棒状物，如pH电极、溶氧电极、温度电极或取样管等。片状结构固定化材料可借助于pH电极、溶氧电极、温度电极或取样管等直接固定化反应器内部而不影响搅拌。
一种利用上述固定化反应器发酵生产ε-PL的工艺：将ε-PL生产菌株接种于装有种子培养基的发酵罐中培养10～40h，菌株吸附在固定化材料上实现菌株的固定化，将发酵罐内的种子液替换为发酵培养基，利用pH自动控制装置补入碱液控制发酵罐中的发酵液pH值，开动搅拌装置使发酵罐内物质充分接触，发酵生产ε-PL，当固定化反应器中的碳源消耗掉一部分后，打开补料装置补入碳源，实现ε-PL的单批次固定化发酵生产。
ε-PL的单批次固定化发酵生产结束后，可将固定化反应器内的发酵液全部移出，重新替换新鲜发酵培养基，重复单批次发酵生产的操作条件，如此循环，实现ε-PL的多批次固定化发酵生产。
其中，所述的ε-PL的发酵生产条件为：搅拌转速100～1000r/min，发酵温度25～37℃，pH值为3.8-6.5。
其中，所述的碱液为5～25％(v/v)的氨水。
其中，所述的补料装置中的碳源为浓度为200～700g/L的葡萄糖溶液。
其中，所述的ε-PL生产菌株为北里孢菌PL6-3(中国发明专利：ZL2005100037774.2，菌种保藏号：CCTCC No.M 205012)。
与游离细胞及普通的菌体包埋法生产ε-PL方法相比，本发明所示的吸附固定化发酵生产ε-PL的工艺具有如下优点：
(1)避免了菌丝体大量附着于发酵罐罐壁：传统的游离细胞发酵发酵罐菌丝体大量附着于发酵罐罐壁，悬空于发酵液上方，造成实际参与ε-PL发酵过程的菌体减少，发酵液体积减少，这对于ε-PL的高效生产是极为不利的。利用本发明所述的吸附固定化发酵ε-PL工艺，菌丝体大量附着于固定化载体上，发酵罐罐壁上几乎没有菌丝体残留(罐内菌丝体干重可由游离细胞发酵的10g/L提高至20～30g/L)，有利于ε-PL的高效生产。
(2)菌株无需包埋：与传统的包埋固定化不同，吸附固定化ε-PL菌株无需包埋，依靠菌丝体自身吸附作用即可实现菌株在吸附固定化材料上的吸附。
(3)ε-PL生产效率高：利用本发明所述的吸附固定化发酵ε-PL工艺，菌体大量吸附于固定化载体，其可以直接参与下一批次ε-PL的发酵过程，省去了ε-PL发酵过程的种子液，缩短了ε-PL的批次生产时间(发酵过程没有延滞期)，提高了ε-PL的生产效率。
(4)ε-PL生产浓度高：与传统的游离细胞发酵相比，利用吸附固定化发酵ε-PL可以有效提高ε-PL的批次生产浓度，ε-PL浓度由游离细胞发酵的10～30g/L提高至固定化发酵时的35～60g/L。
(5)发酵工艺稳定性高：利用本发明所示的吸附固定化发酵ε-PL工艺，ε-PL批次发酵极为稳定，经1000h发酵(10批次)仍能保持较高的ε-PL生产效率。
附图说明
图1是本发明发酵生产ε-PL的一示例固定化反应器的结构示意图。
其中：1-1.空气过滤器 1-2.空气过滤器 1-3.空气过滤器 2.碱液瓶 3.补料瓶 4.空气入口 5-1.恒流泵 5-2恒流泵 6.pH检测器 7.pH探头 8.温度探头 9.固定化材料 10.发酵罐 11.搅拌装置 12.尾气出口。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
利用附图1所述的固定化反应器实现ε-PL的吸附发酵生产。根据附图1，该发酵罐主要由发酵罐10、固定化材料9、搅拌装置11、pH自动控制装置和补料装置构成，利用该固定化反应器即可实现ε-PL的高效生产。固定化材料9作为细胞固定化载体固定于发酵罐10内，pH自动控制装置和补料装置与发酵罐10相连，搅拌装置11位于发酵罐10内部，并与固定化材料9互不接触。pH自动控制装置由pH探头7、pH检测器6、恒流泵5-1、碱液瓶2、空气过滤器1-1及相互连接管路所构成，pH探头7接于发酵罐10上，当发酵罐10内pH低于所控pH值时，通过恒流泵5-1将碱液瓶2中的碱液补入发酵罐10中自动控制发酵液的pH值。补料装置由恒流泵5-2、补料瓶3、空气过滤器1-2及相互连接的管路所构成，通过恒流泵5-2将补料瓶3中的培养基通过连接于发酵罐10上的管路补入发酵罐10。发酵罐上部设置一个空气入口4和一个尾气出口12，空气经空气过滤器1-3过滤以保证通入发酵罐10中的空气处于无菌状态。
具体生产工艺为：将固定化材料固定于发酵罐内部而不影响搅拌，发酵罐内装入种子培养基，灭菌。将北里孢菌PL6-3(中国发明专利：ZL2005100037774.2，菌种保藏号：CCTCC No.M 205012)菌株在25～37℃，150～250r/min条件下培养10～40h，种子液以5～20％(v/v)的接种量接种于灭菌后的固定化反应器10中，通入一定量无菌空气(通入量1～6L/min)，100～1000r/min，发酵温度25～37℃，pH值3.8～6.5，培养10～40h实现菌株在固定化材料9上的固定。将固定化反应器10中的种子液替换为发酵培养基，发酵条件与种子培养基一致，即可实现ε-PL的单批次固定化发酵。当ε-PL达到一定浓度时(10～60g/L)，利用新鲜发酵培养基重新替换固定化反应器10中的发酵液，利用固定于固定化材料9的菌体即可实现ε-PL多批次固定化发酵。
实施例1：游离细胞发酵制备ε-PL(对照例)。
以葡萄糖为碳源，利用本实验室已授权专利菌株北里孢菌PL6-3(中国发明专利：ZL2005100037774.2，菌种保藏号：CCTCC No.M 205012)进行游离细胞发酵生产ε-PL。种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用6mol/L溶液调pH7.0。发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO45g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH7.0。将北里孢菌PL6-3在28℃、200r/min的摇床条件下培养24h，将300mL种子液按10％(v/v)的种子液接种于预装有2.7L灭菌后的发酵培养基中，培养条件：28℃，400r/min，通气量3L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值在4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵150h，ε-PL浓度27.45g/L。
实施例2：固定化反应器单批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以网状植物纤维纱布为固定化载体，将长30cm、宽15cm的纱布沿pH电极、温度电极、取样管绕成一圈，固定后不影响搅拌。固定化反应器中装入2.7L种子培养基，灭菌。种子液30℃、250r/min的摇床条件下培养24h。按10％(v/v)的接种量(300mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，300r/min，通气量3.5L/min，利用8％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养15h，实现北里孢菌PL6-3在网状固定化材料上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，400r/min，通气量3.5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用8％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为600g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵150h，ε-PL浓度达51.34g/L。
实施例3：固定化反应器单批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以网状植物纤维丝瓜巾为固定化载体，将去皮、去仔后的丝瓜巾固定于温度电极、溶氧电极、取样管上各1个，固定后不影响搅拌。固定化反应器中装入2.55L种子培养基，灭菌。种子液32℃、180r/min的摇床条件下培养30h。按15％(v/v)的接种量(450mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：32℃，500r/min，通气量3.0L/min，利用15％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养30h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，32℃，500r/min，通气量3.0L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用15％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为400g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵120h，ε-PL浓度达42.76g/L。
实施例4：固定化反应器单批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以网状固定化材料不锈钢丝网为固定化载体，将不锈钢丝网沿pH电极、溶氧电极、温度电极、取样管绕圈，固定后不影响搅拌。固定化反应器中装入2.85L种子培养基，灭菌。种子液30℃、200r/min的摇床条件下培养27h。按5％(v/v)的接种量(150mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，400r/min，通气量3.5L/min，利用10％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养18h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，400r/min，通气量3.5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为400g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵120h，ε-PL浓度达59.21g/L。
实施例5：固定化反应器多批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以网状固定化材料不锈钢丝网为固定化载体，将不锈钢丝网沿pH电极、溶氧电极、温度电极、取样管绕圈，固定后不影响搅拌。固定化反应器中装入2.7L种子培养基，灭菌。种子液30℃、200r/min的摇床条件下培养20h。按10％(v/v)的接种量(300mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，450r/min，通气量3.5L/min，利用10％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养18h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，400r/min，通气量3.5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵100h后，ε-PL浓度达45.32g/L。将固定化反应器内的发酵液移出，重新替换新鲜发酵培养基，培养条件于第一批次发酵相同，发酵100h后再次替换，如此替换新鲜发酵培养基9次，共计发酵1000h后，ε-PL总产量达1376.1g(发酵体积3L)，批次ε-PL浓度达45.87g/L。
实施例6：固定化反应器单批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以片状固定化材料棕榈为固定化载体，将棕榈沿pH电极、溶氧电极、温度电极、取样管绕成一大圈，固定后不影响搅拌。固定化反应器中装入2.7L种子培养基，灭菌。种子液30℃、200r/min的摇床条件下培养24h。按10％(v/v)的接种量(300mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，400r/min，通气量3.5L/min，利用10％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养18h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，400r/min，通气量3.5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为400g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵120h，ε-PL浓度达43.21g/L。
实施例7：固定化反应器单批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以片状材料塑料板为固定化载体，将四块相同大小的塑料板(单块尺寸：高15cm，长2.5cm，宽0.5m)分别固定于pH电极、溶氧电极、温度电极、取样管而不影响搅拌。固定化反应器中装入2.7L种子培养基，灭菌。种子液30℃、200r/min的摇床条件下培养24h。按10％(v/v)的接种量(300mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，500r/min，通气量3.5L/min，利用10％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养18h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，500r/min，通气量5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵120h，ε-PL浓度达36.55g/L。
实施例8：固定化反应器多批次发酵制备ε-PL。
菌株、种子培养基、发酵培养基同实施例1。以片状固定化材料棕榈为固定化载体，将棕榈沿pH电极、溶氧电极、温度电极、取样管绕成一大圈，固定后不影响搅拌。固定化反应器中装入2.7L种子培养基，灭菌。种子液30℃、200r/min的摇床条件下培养20h。按10％(v/v)的接种量(300mL)将种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，450r/min，通气量3.5L/min，利用10％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养18h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定。将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，400r/min，通气量3.5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵100h后，ε-PL浓度达40.67g/L。将固定化反应器内的发酵液移出，重新替换新鲜发酵培养基，培养条件于第一批次发酵相同，发酵100h后再次替换，如此替换新鲜发酵培养基9次，共计发酵1000h后，ε-PL总产量达1136.7g(发酵体积3L)，批次ε-PL浓度达37.89g/L。
Claims (1)
1.一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺，其特征在于：
菌株：北里孢菌PL6-3 CCTCC No.M 205012；
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用6mol/L溶液调pH7.0；
发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO45g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH 7.0；
以网状固定化材料不锈钢丝网为固定化载体，将不锈钢丝网沿pH电极、溶氧电极、温度电极、取样管绕圈，固定后不影响搅拌；固定化反应器中装入2.85L种子培养基，灭菌；种子液30℃、200r/min的摇床条件下培养27h；按5％(v/v)的接种量将150mL种子液接种于灭菌后的固定化反应器中，培养条件：30℃，400r/min，通气量3.5L/min，利用10％(v/v)的氨水控制种子培养基pH值6.0，培养18h，实现北里孢菌PL6-3在固定化载体上的固定；将固定化反应器中的种子液移出，补入3L新鲜发酵培养基，30℃，400r/min，通气量3.5L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当发酵液pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值4.0～4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为400g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵120h。
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