KR101411073B1 - 폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 효소 또는 미생물 형태의 생체촉매의 산업적 생산 방법, 이의 사용 방법, 및 이의 생산 장치 - Google Patents
폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 효소 또는 미생물 형태의 생체촉매의 산업적 생산 방법, 이의 사용 방법, 및 이의 생산 장치 Download PDFInfo
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Abstract
폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 고정화 효소 또는 미생물 형태의 생물학적 활성 물질을 이용한 생체촉매의 산업적 생산 방법 및 이의 사용 방법으로서, 본래의 유리형 또는 예비처리(응집)된 효소 촉매, 또는 생산 미생물, 또는 이의 일부와 폴리비닐 알코올 겔의 혼합물에 의해 형성된 활성 생물학적 물질이 상기 촉매의 산업적 생산에 사용되며, 혼합물은 7 ㎜-1 초과로 유지된 표면 대 부피의 생체촉매 기하학적 비율로, 생물학적으로 활성인 물질의 정도를 고려하여 80℃ 내지 15℃의 온도 범위에서, 건조 공기의 스트림 중에서 겔화되고 형상화되며, 궁극적으로 이와 같이 제조된 생체촉매가, 소정의 생물공학적 공정에 대해 높은 생산성, 보다 높은 생산적 및 효소적 안정성, 장기 및 반복 사용성, 또는 궁극적 생체촉매의 용이한 분리를 가져오는 한정가능한 공정 조절을 보장하는 조건 하에 생물공학적 공정에서 배양되거나 저장된 후, 사용될 수 있다는 사실에 기초하는 방법이 개시된다. 연속식 컨베이어 벨트(1)가 통과하여 이동하는, 건조 채널(2)의 앞면에 탑재된 캐스팅 메커니즘(17)을 포함하는, 생물학적 활성 물질 정도에 따라 생물학적 담체 부피 및 표면의 최적화를 제공하는 산업용 생산 장치로서, 압력 조절 탱크(15) 및 압축기(16)에 연결된 2열의 캐스팅 니들 주입기를 갖는 하나 이상의 캐스팅 헤드(17), 컨베이어 벨트(1) 및 건조 시스템인, 가열 소자(5)가 포함된 공기 분배 시스템(6)으로 통풍기에 의해 송풍되어 상부 건조 채널(2)로 이동하는 건조 공기 공급원(4), 및 하부 최종 건조 채널(3), 및 재팽윤 탱크(7), 상기 하부 최종 건조 채널과 재팽윤 탱크 사이에 탑재되어 있으며, 냉각이 수반되는 수집 저장소(8)로 이동하는 일체화된 고압 펌프(10) 및 저압 펌프(11)을 갖는 파이프라인에 연결된, 기계적 와이핑 및 고압 헹굼에 기초하여 설계된 와이핑 및 수집 장치(9), 및 파이프라인에 의해 헹굼 탱크(12)에 연결되어 있는 저압 펌프(14)에 연결된 제트에 의한 연속식 컨베이어 벨트(1) 최종 세정을 위한 추가 헹굼 상자(13)이 장착되어 있는 장치가 개시된다.
고정화, 생체촉매, 폴리비닐 알코올 겔
Description
본 발명은, 폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 고정화 효소 또는 미생물 형태의 생체 활성 물질을 이용한 생체촉매의 산업적 생산 방법 및 이의 사용 방법, 및 생물학적 활성 물질의 정도에 따라 생물학적 담체의 부피 및 면적을 최적화할 수 있도록 하고, 연속식 컨베이어 벨트가 통과하여 이동하는, 건조 채널의 전면에 위치한 캐스팅 메커니즘을 포함하는 산업용 생산 장치에 관한 것이다.
폴리비닐 알코올 담체 또는 폴리우레탄 담체를 사용하는 미세 세균의 캡슐화가 당 분야에 공지되어 있다. 폴리비닐 알코올 겔(이후 본문에서, "PVA-겔"이라 칭해짐)에 배치된 미생물, 효소, 포자 및/또는 세포 형태의 생물학적 활성 물질을 이용하는 생체촉매의 생산 방법이, 체코 특허 제249 179호에 개시되어 있다. 생물학적 활성 물질을 위한 겔 담체로서의 PVA-겔은 화학적 또는 생물학적 촉매의 생산에 매우 적당하다. 본 방법에 따라 제조된 겔 본체(body)는 이전에 공지된 겔 본 체에 비해, 특히 내마모성 및 인장 강도 측면에서 더 높은 기계적 안정성을 나타낸다. 상기 언급된 향상된 기계적 성질로 인해, 반응성이며 운동학적으로 적당한 렌즈 형상 형태의 겔 본체의 생산이 가능하다. 이와 같이 생산된 겔 본체는, 이전에 공지된 것들에 비해, 높은 공전 교반 시에도 수개월 초과 기간 동안, 단단하며, 내마모성이다. 큰 직경 및 적은 높이를 특징으로 하는 렌즈 형상 형태로 인해, 물리학적, 화학적 또는 생물학적 활성 물질은 항상 표면 아래에 근접하게 위치하며, 그 물질의 반응성 및 운동학적으로 유용한 배열을 제공한다. 생물학적 활성 물질의 담체로서 PVA-겔을 이용하는 생물공학적 절차가 당 분야에 공지되어 있다.
폐수로부터 질소를 제거하는 공정에서의 상기 언급된 담체의 이용이 공지되어 있다. 이러한 이용은 예를 들어, 유럽 특허 제0758680호(다공성 셀룰로스 유도체), WO 제09508513호(폴리비닐 알코올, 질석, 폴리우레탄) 및 체코 특허 제1076488호(폴리비닐 알코올)에 기재되어 있다. 상기 언급된 담체는 다양한 방법으로, 특히 질화 세균에 의해(예를 들어, 페가수스(PEGASUS) 또는 페가주르(PEGAZUR) 공정), 또한 순수한 질화 또는 탈질화 세균의 고정화에서 직접적으로 이전에 풍부화된 활성화 슬러지의 고정화에 (통상) 사용된다. 문헌을 참고해 보건대, 담체의 매우 중요한 특성은 반응기의 부피, 또는 보다 정확하게는 현재 처리되고 있는 폐수의 부피에 관한 담체의 비표면적의 정도이다. 즉, 이 매개변수는, 반응기 내에 배치되는 소정의 비표면적을 갖는 담체의 양(더욱 정확하게는, 중량 또는 부피)에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 반응기의 크기 및 반응기 내 폐수의 보유 시간과 직접적으로 관련된다. 예를 들어, 기하학적 치수 S/V=3 및 2를 갖는 정제 형태 의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 담체에 고정화된 세균에 의한 질소 오염 제거 공정으로 인해, 담체 중 활성화 슬러지의 2 %w/v 바이오매스의 함량으로, 1일 당 0.34 ㎏/㎥ 내지 1.14 ㎏/㎥의 질소 제거율을 달성할 수 있다. (문헌 [T. Sumino, H. Nakamura, N. Mori, Y. Kawaguchi: Immobilization of Nitrifying Bacteria by Polyethylene Glycol Prepolymer, Journal of Fermentation and Bioengineering, 73(1), 37-42, 1992]).
그러나, 담체의 부피, 더욱 구체적으로 담체의 형태 및 치수에 대한 담체의 비표면적(기하학적 표면적)의 정도는, 특히 경제적 이유로 동질의 매개변수이다. 그 형상이 바닥 직경(d) 및 높이(h)가 대략 동일한 값인 공 또는 원통형에 근사한 담체가, 고정화 세포에 의해 하수도 물로부터 질소를 제거하는 데 여전히 사용된다. 폐수로부터 질소를 제거하기 위한 담체의 최소 측정값은 1 ㎜이다. 통상적으로 사용되는 담체의 측정값은 3 ㎜이며, 이는 담체의 표면 대 부피 비율(S/V)이 대략 2 ㎜-1 내지 6 ㎜-1의 값임을 의미한다. 만약 렌즈 형상 또는 밴드 형상의 담체가 사용되면, 동일하거나 더 높은 강도의 공정에서도, 음용수, 산업용수 및 폐수로부터의 질소 화합물의 제거를 위해 고정화 세포를 사용하는 현 공정들에 비해 더 적은 생체촉매가 사용될 수 있다.
생물공학적 공정에서 겔 담체의 또 다른 대안적 용도는 락트산 생산을 위한 방법에서의 용도이다. 이 산은 특히 식품, 제약 및 화학 산업에서 광범위하게 사용되고 있다. 락트산은 다수의 미생물에 의해, 단 주로는 섬유상 진균류 및 세균 에 의해 생산된다. 섬유상 진균류 중 리조프수스 아리주즈(Rhizopsus arrhizuz) 또는 오리자에(oryzae)가 우수한 락트산 생산자이다. 세균과 비교되는 이의 명백한 이점은 정확한 산 L(+)을 생성한다는 사실이다. 그러나, 발효 방식은 호기성 (높은 무균 공기 제조 필요 조건)이다. 섬유상 진균류의 호기성 방식은 직접적인 락트산 칼슘 염 제조의 경우에서 유리할 수 있고, 그러한 제조 과정 중 발효의 연장 및 수율의 감소가, 탄산칼슘의 경우에 비효율적인 중화(약한 교반)의 결과로서 일어날 수 있다. (문헌 [Mattey M.: Critical Reviews in Biotechnology 12, 87-132, 1992]).
세균 발효의 이점은 이의 혐기성 방식 및 이에 따른 배양 장치의 단순성 및 낮은 무균 요건에 있다. 30℃ 내지 40℃의 온도에서 수크로스 기질(글루코스, 수크로스, 락토스)을 생산자의 특성에 따라 상이한 L(+)-, D(-)- 및 DL 산 형태 함량을 갖는 락트산으로 전환하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 세균의 산업적 생산에 주로 사용된다.
겔 담체로의 캡슐화에 의한 미생물의 고정화는 완전히 발효된 배지 내 바이오매스 성장 없이 반응기 내에 바이오매스가 농축되도록 하는 방법들 중 하나이다. 이 방법은 천연 또는 합성 겔의 캡슐로 세포를 봉입하는 것으로 이루어진다. 세포는 담체의 세공보다 더 커서, 세포 방출이 일어나지 않아야 하는 동시에, 기질 및 생성물의 캡슐화된 세포로의 자유로운 확산을 보장해야 한다.
상이한 담체로의 락트산 세균의 고정화가 현재 공지되어 있다. 그 중에서도, 천연 겔의 카라기난, 펙테이트, 알긴산염(문헌 [Norton, S. 등: Enzyme Microbial Technol 16, 457-466, 1994; 문헌 [Richter, K. 등: Acta Biotechnol. 11, 229-341, 1991; 문헌 [Yan, J. 등: Chem. Biochem. Eng. Q; 15(2), 59-63, 2001]), 및 합성 담체의 폴리아크릴아미드(문헌 [Tuli, A. 등: Enzyme Microbial Technol. 7, 164-168, 1985])가 있다. 고정화물은 통상 관련 겔의 경화 용액으로의 적하에 의해, 3 ㎜ 내지 5 ㎜ 직경을 갖는 공 형태로 생성된다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 공 형태의 고정화물이 공 내측의 확산 한계를 유발한다는 것이다. 전체 겔 부피가 사용되지 않으며, 그 결과 미생물은 공의 표면 바로 아래에서만 성장한다.
고정화의 또 다른 적당한 방법은 폴리비닐 알코올 겔 내로의 락트산 세균 캡슐화이다. 이는 다른 담체에 비해 수많은 이점을 갖는다. 무엇보다도 이는 저렴하고, 미생물에 대해 비독성이며, 거의 생분해되지 않으며, 우수한 물리-기계적 특성을 가지며, 미생물에 대한 어떠한 부작용도 없으며, 장기간 안정성을 나타낸다(독일 특허 제198 27 552.8호). 또한, 상기 언급된 발명에 따른 방법에 의한 세포의 고정화는, 매트릭스의 가교결합이 건조 공기의 스트림 중에서 일어나, 동결에 의한 가교결합(독일 특허 제43 27 923호) 또는 붕산을 이용한 시스템에서의 경화(미국 특허 제5 290 693호)의 현재 사용된 절차를 대체하기 때문에, 생산성 미생물에 대해 중요하다(고정화 후 미생물의 높은 생육성 및 고정화 절차 후 높은 미생물 생존율을 보장함). 또한, 렌즈 형상 형태의 고정화물은 미생물의 성장 및 락트산의 생성에 대한 담체의 전체 부피의 최적 로딩을 보장한다. 이 방법으로 제조된 고정화물은 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 작동 방식에 반복적으로 사용될 수 있다.
발효 공정 동안 글루코스 및 기타 당류를 에탄올로 전환할 수 있는, 효모 사 카로마이세스 세레비지아에 ( Saccharomyces cerevisiae ) 또는 기타 효모 미생물이 에탄올의 생성에 종래부터 사용되고 있음이 일반적으로 공지되어 있다. 이 발효는 맥주 및 와인 생산의 기초이며, 또한 산업적인 식품 및 연료 목적을 위한 에탄올 생산의 기반이다. 최근, 에탄올의 생산자로서 세균을 사용하는 기술에 대한 관심이 증가하고 있음이 나타났다. 자이모모나스 모빌리스( Zymomonas mobilis )가 에탄올의 세균 생산자들 중 하나이다. 이는 그램 음성 조건적 혐기성 미생물이다. 이는 효모에 비해 몇가지 이점들, 즉 바이오매스의 보다 빠른 성장(단, 일반적으로 보다 낮은 바이오매스 생성), 기질 이용율 및 비교적 높은 생성물 발생의 특정 특이적 속도를 가지며, 모니터링되는 산소 공급을 요구하지 않으며, 대사 부산물을 덜 생성한다. 이는 혐기성 미생물을 이용하여 통상 일어나는 엔트너-도우도로프(Entner-Doudoroff) 경로에 의해 글루코스 및 프룩토스를 대사한다. 이 대사 경로에서, 1 몰의 글루코스는 2 몰의 에탄올, 2 몰의 CO2 및 1 몰의 ATP로 전환된다. 이 대사 경로는 바이오매스로 변화된 글루코스의 양을 최소화하며, 이러한 방식으로 에탄올 생산이 증가한다. 실제 수율(g 알코올/g 글루코스)은 세균으로는 0.49로 상승하며, 효모로는 통상 0.44이다.
유리 자이모모나스 모빌리스 세포의 보조 하에서의 발효는 회분식, 반연속식 및 연속식 작동 방식으로 일어날 수 있다(Rogers P.L., Tribe D.E.: 미국 특허 제 4403034호; Rogers P.L. 등, 미국 특허 제4443543호; Salzbrunn W. 등, 미국 특허 제4876196호; Bu'lock J.D., 영국 특허 제2075053호).
현재까지, 조사 관심은 미생물 생산성의 증가 및 다양한 개혁, 예를 들어 세포 재생, 응집 미생물의 사용 등으로 발효 장치의 배열 개선에 초점을 맞춰 왔다(Arcuri E.J. 등, 미국 특허 제4413058호; Rogers P.L. 등, 미국 특허 제4443544호).
발효 생산물(에탄올)이 액체 배지에 축적되며, 증류에 의해 거의 전부 분리된다. 생산물 분리 동안, 사용된 배열 및 기술에 관계없이, 침강, 원심분리, 여과 등에 의해 바이오매스 함량을 상당히 감소시키는 것이 바람직하다. 상승된 불용물 함량은 증류 에너지 요건을 증가시키고, 기술적 문제(증류 장치의 오염, 발포 등)를 일으키고, 유지 요건을 증가시키며, 또한 생산물 품질에 영향을 줄 수 있다. 한편, 에탄올 생산의 최대 효율이 달성되어야 한다. 에탄올 생산율은 발효기 중 바이오매스의 양에 직접적으로 비례한다. 이는, 일정한 조건 하에서 증가된 바이오매스 함량이 소정량의 에탄올의 생산에 필요한 시간을 단축시킴을 의미한다. 방법들 중 하나로서, 철저히 발효된 배지 중 바이오매스 성장 없이 반응기 중 바이오매스를 농축시킬 수 있도록 하는 겔 담체 내의 캡슐화에 의한 미생물 고정화이다. 이 방법은 천연 또는 합성 겔 캡슐로의 세포 캡슐화에 기초한다. 세포 크기는, 세포 방출이 일어나지 않아야 하나, 이와 동시에 캡슐화된 세포로의 기질 및 생성물의 자유로운 확산이 보장되도록 담체의 세공 크기보다 커야 한다.
각종 담체 내에서의 세균 자이모모나스 ( Zymomonas ) 속의 고정화가 현재 공지 되어 있다. 그 중에서도, 천연 겔의 알긴산염 및 카라기난(Cheetham P.S.J., 미국 특허 제4393136호; Chibata I., 미국 특허 제4350765호; Kikuta M, 미국 특허 제5990191호; Yamada T. 등, 미국 특허 제4680263호), 및 합성 담체의 폴리아크릴아미드(Yamada T. 등, 미국 특허 제4680263호; Cheetham P.S.J., 미국 특허 제4393136호)가 있다. 고정화물은 통상적으로, 대부분 관련 겔의 경화 용액으로의 적하에 의해, 3 ㎜ 내지 5 ㎜의 직경을 갖는 공 형태로 생성된다. 그러나, 그러한 방법의 단점은, 공 형태의 고정화물이 공 내부의 확산 한계를 유발한다는 것이다. 전체 겔 부피는 세포 로딩에 대해 사용되지 않으며, 결과적으로, 미생물은 담체-공의 표면 바로 아래에서만 성장하며, 매트릭스의 전체 부피를 로딩하지 않는다.
적절한 고정화 방법은 세균 자이모모나스 모빌리스의 폴리비닐 알코올 겔 내로의 캡슐화이다. 이는 다른 담체에 비해 다수의 이점을 갖는다. 무엇보다도, 이 방법은 저렴하고, 미생물에 대해 비독성이며, 거의 생분해되지 않으며, 우수한 물리적-기계적 특성을 가지며, 미생물에 대한 어떠한 부작용도 없으며, 장기간 안정성을 나타낸다(독일 특허 제198 27 552.8호). 또한, 상기 언급된 발명에 따른 방법에 의한 세포의 고정화는, 매트릭스의 가교결합이 건조 공기의 스트림 중에서 일어나, 동결에 의한 가교결합(독일 특허 제43 27 923호) 또는 붕산을 이용한 시스템에서의 경화(미국 특허 제5 290 693호)의 현재 사용된 절차를 대체하기 때문에, 생산성 미생물에 대해 중요하다(고정화 후 미생물의 높은 생육성 및 고정화 후 생존 미생물의 높은 비율을 보장함). 또한, 렌즈 형상 형태의 고정화물은 미생물의 성장 및 락트산의 생성에 대한 담체의 전체 부피의 최적 이용을 보장한다. 이 방법 으로 제조된 고정화물은 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 방식에 반복적으로 사용될 수 있다.
공 형상 형태의 고정화물을 사용하여, 에탄올 생산은 4 ㎜의 고정화물 직경을 갖는 고정화물 20 ㎖로 충전된 500 ㎖ 회분식 반응기에서, 또한 30℃의 온도에서, 글루코스 배지 10 중량%로, 카라기난 내로 고정화된 자이모모나스 모빌리스의 보조 하에, 77 ㎎에탄올/㎖겔/h였다(Chibata I., 미국 특허 제4350765호). 생산자가, 고정화물 내 습윤 세포 중량이 20 중량%w/v(ww-습윤 세포 중량, 건조 세포 중량의 1/5에 상응함)을 포함하는 알긴산나트륨 내로 고정화될 때, 동일한 조건 하의 생산성은 회분식 시스템에서 0.49 g에탄올/gww/h(이는 재계산 후 98 ㎎에탄올/㎖겔/h에 상응함)였으며, 연속식 방식에서는 0.47 g에탄올/gww/h(이는 디지트 재계산 후 94 ㎎에탄올/㎖겔/h에 상응함)였다(Cheetham P.S.J., 미국 특허 제4393136호).
생물공학 공정 중 겔 담체의 대안적 용도는, 고정화 효소 인버타제의 보조 하에, 수크로스로부터 글루코스 및 프룩토스를 생성하는 방법에서의 용도이다. 수크로스는 사탕무 및 사탕수수 중에 주로 존재하는 저장 이당류이다. 이는 식품 산업에서, 또한 발효 공정에서 기질로서 사용된다. 이는 단당류 글루코스 및 프룩토스로 구성된다. 수크로스는 가수분해에 의해, 예를 들어 효소 인버타제를 사용한 효소적 가수분해에 의해 상기 단당류를 제공한다. 그 사용 결과, 글루코스 및 프룩토스(전화당)가 생성되며, 이는 가수분해되지 않은 수크로스에 비해 다수의 이점, 즉 결정 혼탁의 생성 감소, 감도 증가, 및 발효 공정 중 유용성을 가져온다.
산업적 실무에서, 재순환가능하지 않은 인버타제의 효소 제조가 수크로스 가수분해에 사용된다. 이는, 효소가 글루코스-프룩토스 시럽의 제조에 있어 가장 큰 경제적 항목들 중 하나가 되는지의 이유이다. 이 효소의 적당한 고정화 방법은 이의 다중 용도를 제공하며, 또한 전체 제조 공정이 연속적으로 되도록 함으로써, 그 효과능이 현저히 증가한다. 가장 빈번히 사용된 기법은 가교결합이다. 가장 통상적으로 사용된 가교결합제는 폴리아미드(Sou M. 등, 일본 특허 제58086085호, Rohrbach R.P. 등, 미국 특허 제426842호), 글루타르알데히드(Lee D.M. 등, 미국 특허 제4749653호), 비조합 카르복실기를 갖는 중합체(Mauz O., 미국 특허 제4767620호), 에폭시드기를 갖는 중합체(Mauz O., 미국 특허 제4931476호), 광가교결합 역청 내로의 고정화(Kunihiro I., 일본 특허 제55023941호) 및 가교결합제의 보조에 의한 각종 매트릭스 상에의 매립, 예컨대 글루타르알데히드의 보조에 의한 유리 공 상에의 고정화(Toshiyuki Y. 등, 일본 특허 제58179494호)이다. 기타 방법은 글루타르알데히드의 보조에 의한 실리카 겔 입자 상에의 인버타제의 공유 부착(Thibault P.A. 유럽 특허 제0231668호), 유기 및 무기 담체 상에의 디술피드 결합의 보조에 의한 공유 결합(Cormier R.A. 등, 미국 특허 제4176006호), 오르가노실란의 보조에 의한 공유 결합(Ho G.H. 등, 미국 특허 제4384045호), 셀룰로스 및 리그닌 물질 상에의 디알데히드의 보조에 의한 공유 결합(Monsan P., 미국 특허 제4405715호) 및 디알킬아미노알킬 셀룰로스 상에의 공유 결합(Lapins Ch. D. 등, 미국 특허 제4933284호)이다. 인버타제는 또한 예를 들어 동물 뼈로부터의 매트릭스 상의 흡착에 의해 고정화되었다(Findlay Ch. J., 미국 특허 제5037749호). 또 다 른 방법은 알긴산염 겔(Obana H. 등, 일본 특허 제57163484호, Chang H.N. 등, 미국 특허 제5766907호) 또는 폴리우레탄 중합체(Hartdegen F.J. 등, 미국 특허 제4098645호)로의 고 인버타제 활성을 갖는 세포 분해물의 캡슐화이다. 조합 기술, 예를 들어 폴리에틸렌이민에 의해 처리된 면 상에 효소의 흡착, 및 이에 이은 글루타르알데히드에 의한 후속 가교결합(Yamazaki H. 등, 캐나다 특허 제1203187호)도 또한 실질적 유용성을 갖는다.
PVA(폴리비닐 알코올 겔)의 사용은 매우 우수한 대안인 것으로 나타난다. 인버타제는 PVA 겔에 의해 덮혀진 고체 중심을 갖는 담체 내로 성공적으로 고정화되었다(Yamamoto H. 및 koet 등, 일본 특허 제2005042037호). 폴리에틸렌 글리콜과 혼합된 광가교결합 PVA가 또한 공유 결합 및 인버타제 봉입에 사용되었다(Ichimura K., 일본 특허 제58152483호, Suehiro T. 등, 일본 특허 제1252285호, Izumida H. 등, 일본 특허 제1071491호). PVA 매트릭스는 또한 붕산에 의해 가교결합될 수 있는 반면, 인버타제는 겔 상으로(Guocheng Ch. 등, 체코 특허 제1076488호), 또는 건조에 의해(Ishimura F 등, 미국 특허 제4727030호) 캡슐화된다. 기타 방법이 또한 가교결합(Tsutsumi S. 등, 일본 특허 제2046288호), 또는 아세트산비닐의 첨가(Moriya T. 등, 일본 특허 제56113290호), 비닐 아민의 첨가(Moriya T. 등, 일본 특허 제56113292호) 또는 아미노아세탈화 PVA의 첨가(Yamauchi A. 등, 미국 특허 제4307151호)와 조합하여 사용되었다.
생물공학적 공정에서 겔 담체의 대안적 용도는 고정화 글루코아밀라제 효소의 보조에 의한 전분으로부터 글루코스 생성의 방법에서의 용도이다. 식물의 영양 저장 물질인 전분은 식품 산업 및 발효 산업에서 글루코스의 주요 공급원들 중 하나이다. 전분은 2가지 유형의 분자, 즉 아밀라제 및 아밀로펙틴을 포함한다. 아밀라제는 예를 들어 옥수수 내에서는, 전체 전분의 10%를 나타낸다. 이는 α-1,4-글리코시드 결합에 의해 연결된 1000개 이하의 글루코스 단위를 구성한다. 나머지 90%는 α-1,4-글리코시드 결합과 별도로 α-1,6-글리코시드 결합이 또한 포함된 아밀로펙틴을 나타낸다. 사슬 내 글루코스 단위의 수는 10000 이하이다.
발효 공정에 사용하기 위한 전분 원료 물질의 예비 처리 공정은 2단계로 이루어진다. 제1 단계에서, 세포내 효소 α-아밀라제의 보조에 의한 전분 액화가 일어나며, 이는 고온에서 α-1,4-글리코시드 결합을 무작위적으로 해리한다. 이 반응은 덱스트린의 형성 및 상이한 사슬 길이들을 갖는 저급 올리고당의 형성을 유발한다.
제2 단계에서, 덱스트린 및 올리고당이 세포외 효소 글루코아밀라제에 의해 비환원 말단으로부터 글루코스 단위로 해리된다. 글루코아밀라제는 α-1,4- 및 α-1,6-글리코시드 결합 모두를 해리한다. 그러나, α-1,6-글리코시드 결합이 훨씬 낮은 속도로 가수분해된다. 가수분해의 속도도 또한 사슬 길이에 의존한다.
산업적 실무에서, 전분 1톤 당, 재순환가능하지 않은 글루코아밀라제 효소 제제의 1 ℓ 내지 1.2 ℓ가 사용된다. 상기 효소의 적당한 고정화는, 전체 공정을 연속적으로 만드는 가능성과 함께 그 효소의 다중 사용을 허용할 것이다. 폴리아민(Symon 등, 미국 특허 제4415663호, Lantero 등, 미국 특허 제5472861호, DeFilippi 미국 특허 제4343901호, Rohrbach 등, 미국 특허 제4268423호), 글루타 르알데히드(Lee 등, 미국 특허 제4749653호, Nishimura 등, 미국 특허 제4888285호, Rorvah 등, K.R. 제8601229호), 아크릴 또는 알릴 제제(Boross 등, 미국 특허 제4794083호, Selemenev 등, RU 제2204600호)와 같은 제제를 이용한 가교결합에 의한 효소의 고정화로 상당한 개선이 달성되었으며, 이에 의해 효소가 무기 또는 유기 매트릭스 상에 놓이게 된다. 흡착 방법(Abdullah 등, 미국 특허 제4226937호, Kumakura 등, 일본 특허 제61060700호, Motai 등, 일본 특허 제59232092호, Selemenev 등, R.U. 제2181770호, Kimura 등, 일본 특허 제63056297호), 및 고정화 글루코아밀라제를 이용한 막 반응기(Thomas 등, 미국 특허 제5130237호)의 사용이 적당한 것으로 보인다. 생물학적 물질이 겔 구조 내로 캡슐화하며 미생물 고정화에 주로 사용되는 캡슐화는, 글루코아밀라제 고정화 과정 동안 전적으로 부재이다. 그러나, 더 큰 구조로의 가교결합 없이, 효소는 매트릭스 세공으로부터 쉽게 세정 제거된다.
생물공학 공정에서 겔 담체의 대안적 용도는 락토스 용액 가수분해, 및 고정화 β-갈락토시다제의 보조에 의한 락토스 용액으로부터 D-갈락토스, D-글루코스 및 갈락토올리고당류의 생성 방법에서의 용도이다.
이당류 락토스는 대부분의 포유류의 유선에서 합성된다. 이는 유장으로부터의 추출에 의해 소의 우유(락토스 함량 4.5% 내지 5 중량%)로부터 상업적으로 생산된다(Baldrick 및 Bamford, 1997). 우유 및 유제품 중에 존재하는 락토스는 중요한 영양분이다. 그것은 비피도박테리움 ( Bifidobacterium ) 종의 성장을 지지하고, 갈락토리피드 및 갈락토올리고당류의 생성에 필요한 갈락토스의 공급원이며, 칼슘 흡수를 돕는 등의 기능을 한다(Maldonado 등, 1998). 그것은 낮은 용해도를 가지며, 18 중량% 초과의 농도에서 결정화한다. 이는, 락토스 결정이 유제품, 예컨대 연유 및 아이스크림의 생산 시에 불쾌한 모래같은 감촉을 일으키기 때문에(Zadow, 1992) 문제가 있는 것으로 보인다. 이는 이들 제품에 락토스 가수분해가 매우 요망되는 이유이다. 또한, 락토스 가수분해는 건조 유제품의 흡습성의 상당한 감소 및 감도의 증가를 유발하며, 마이얄 반응의 공정이 감소된다(Curda 등, 2001, Zadow, 1992, Rosenberg 등, 1995).
β-갈락토시다제는 우유 중 락토스 가수분해에서 중요할 뿐 아니라, 유장 가공에서 또한 중요하다. 유장은 치즈, 부드러운 백색 치즈 및 카제인의 생산 과정 동안 낙농 산업의 부산물로서 매우 다량 제조된다. 치즈 생산 동안, 연간 세계적으로 1.5억톤의 유장이 제조되며(평균 유장 10 ℓ/치즈 ㎏), 전세계 치즈 생산이 꾸준히 증가해오고 있다. 유장은 여전히 광위적으로 가공되지 않으며, 이는 경제적 및 환경적 문제를 나타낸다(Novalin 등, 2005). 또한, 이의 취급은 많은 제한을 수반하며, 환경으로 자유롭게 방출하는 것이 가능하지 않다. 생성된 폐 생성물의 반이 유장 단백질 농축물(WPC)의 생산에 사용되나, 주로는 주로 농장 동물 급식에 사용된다(Rudolfova 및 Curda, 2005). 유장은 또한 에탄올 생산을 위한 원료 물질로서 사용될 수 있다. 이 사실을 고려해 볼 때, 이는 미래 발효 공정에 대해 매력적인 물질일 수 있다(Cote 등, 2004). 예를 들어, 에탄올 생산 동안, 락토스를 이용하는 클루이베로 마이세스(Kluyveromyces) 효모를 사용하는 것이 가능하다. 락토스 가수분해는 기질로서 더 높은 농도의 C-공급원을 갖는 농후 유장의 사용을 가능하게 함으로써 발효 수율을 상당히 증가시킨다(Rosenberg 등, 1995). 일부 경우에, 생산성 미생물이 존재하는 글루코스만을 이용하는 방식으로 발효 공정을 수행하는 것이 가능한 한편, 잔여 갈락토스는 이후에 분리되거나, 정제되거나, 화학적으로 개질될 수 있다(Rosenberg, 2000).
식품 산업에서 β-갈락토시다제의 또 다른 유의적인 용도는 갈락토올리고당류(GOS)의 생성에서의 용도이다. 그것은 β-갈락토시다제의 트랜스글리코자일레이트 활성으로 인한 락토스 가수분해 과정 동안 동시에 형성된다. β-갈락토시다제 트랜스글리코자일레이트 활성은 1950년대에 처음 기재되었다(Aronson, 1952). 첫 번째로 공개된 연구는 GOS의 바람직한 효과의 모니터링 및 최적으로 그것의 생산 방법의 검색에 초점을 맞추었다(Mahoney, 1998).
GOS는 소위 프로비오틱, 즉 인간 소화관 내 프로비오틱 배양액의 성장, 또는 더욱 구체적으로는 활성을 선택적으로 자극하는 비소화성 식품 성분의 군에 속한다. GOS는 그것의 β-배열로 인해, β-글리코시드 결합을 선택적으로 가수분해하는 침 및 소화액 효소에 의한 가수분해에 대해 내성이 있다(Sako 등, 1999). GOS는 대장으로 들어가, 거기에서 많은 중요한 공정에 관여한다. 비피도속 미세 식물군은 GOS를 단쇄 지방산(아세트산, 프로피온산, 락트산 및 부티르산) 및 가스로 대사한다(Johnson 등, 1993). 초기 산은 장의 연동 운동을 자극하며, pH를 감소시킴으로써 칼슘 및 철의 흡수를 돕는다. GOS는 또한 그들의 이로운 건강 효과로 인해 인식되어진 비피도박테리아 성장 인자로서 공지되어 있다. 또한, 비피도박테리아는 소화관 내 바람직하지 못한 미생물의 성장을 억제하는 선택적으로 갈락토올리고 당류를 이용한다(Pennisin, 1997). GOS는 또한 구내 미세식물군(스트렙토코커스 돌연변이( Streptococcus mutants ))에 의해 이용되지 않을 때 구강 건강에 유리하며, 따라서 충치의 형성을 방지한다(Szilagyi, 1999).
개별 β-갈락토시다제는 생성된 GOS의 전체 양 및 구조에 있어 상이하다. 예를 들어, 비피도박테리움 속의 상이한 균주로부터 β-갈락토시다제를 단리하고, 후속하여 30% 락토스 용액으로부터 GOS 합성 과정 동안 이들을 사용한 후, 생성된 양에 명백한 차이가 있었다. 비피도박테리움 안굴라툼( Bifidobacterium angulatum)의 경우, β-갈락토시다제는 용액 중에 존재하는 모든 당류의 43.8%를 형성한 반면, 비피도박테리움 슈도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum)의 경우에는, 단지 26.8%였다(Rabiu 등, 2001). 구조에 관하여, 바실러스 서큘란스( Bacillus circulans ) 중의 β(1-4)(Mozaffar 등, 1984), 및 스트렙토코커스 써모필러스( Streptococcus thermophilus ) 중의 β(1-6)(Matsumoto, 1990)과 반대로, 비피도박테리움 비피둠 ( Bifidobacterium bifidum ) β(1-3)(Dumortier 등, 1994)의 경우에서는, 2개의 단당류 단위 (갈락토스-갈락토스, 갈락토스-글루코스)의 새로이 형성된 글리코시드 결합의 유형이 있다.
효소인 β-갈락토시다제는 하기 방법으로 고정화되었다: 포획(Mammarella 및 Rubiolo, 2005, Rodriguez-Nogales 및 Delgadillo, 2005), 가교결합(Sungur 및 Akbulut, 1994), 흡착(Carpio 등, 2000), 공유 결합(Hu 등, 1993, Findlay, 1991, Di Serio 등, 2003), 막 내 봉입(Novalin 등, 2005), 또는 이들 방법의 조합(1.2.1부에서 더욱 상세히 설명됨).
β-갈락토시다제 고정화 공정은, 고정화 후 효소 활성의 손실과 같은 특정 단점과 결부된다. 고정화 후 β-갈락토시다제 활성의 감소는 5% 내지 90% 범위이며, 사용된 고정화 방법에 의존한다. 이 단점은 고정화물의 재사용 가능성에 의해 상쇄된다. 반복 사용 중의 고정화물의 안정성 및 효소 활성을 유지하는 능력은, 산업적 규모로 고정화물을 적용하기 위한 결정적인 매개변수이다(Tanaka 및 Kawamoto, 1999).
폴리아크릴아미드 및 폴리비닐 알코올 겔이 종종 포획의 방법에 사용된다. PVA 매트릭스는 또한 섬유상 진균류로부터 단리된 β-갈락토시다제의 캡슐화에 사용됨으로써, 그 온도 안정성이 증가하였다. 효소는 50℃에서 24시간 후 그 이전 활성의 70%, 및 60℃에서 그 이전 활성의 5%를 보유하였다(Batsalova 등, 1987). Khare 및 Gupta(1988)는 두 방법, 즉 가교결합 및 폴리아크릴아미드 겔 내로의 연속적인 캡슐화의 조합을 사용하여 E. 콜라이(E. coli )으로부터의 β-갈락토시다제를 고정화하였다. 가교결합제로서 디메틸아디피미데이트 및 효소 방해 물질인 소 혈청 알부민, 시스테인 및 락토스를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 절차에서, 활성이 이전의 고정화제 활성의 190%로 측정되었다. 호열성 세균인 써무스 아쿠아티쿠 스( Thermus aquaticus)로부터의 β-갈락토시다제 고정화의 상이한 방법들의 비교는, 가교결합 및 이에 후속되는 아가로스 과립으로의 연속적인 포획이 높은 효소 활성의 이익을 갖는 고농도의 효소의 고정화에 바람직한 공정임을 나타냈다(Berger 등, 1995). 고정화 공정은 상이한 반응 조건들 하에 효소 안정성 증가를 가능하게 한다. A. 오리자에(A. oryzae)로부터 다공성 PVA 크리오겔 내로의 β-갈락토시다 제의 포획은 효소의 온도 내성, pH 값 및 이온 강도를 증가시켰다(Rossi 등, 1999).
흡착은 기술적으로 힘들지 않은 고정화 방법이다. 소수성 면 섬유가, 예를 들어 위에서 이의 이전 활성의 50%를 보존하는 효소가 그 위에 있는 담체로서 작용할 수 있다(Sharma 및 Yamazaki, 1984). Bakken 등은 축 유동 반응기 내에서, 우유 중 락토스 가수분해 과정 동안 막의 형태의 실리카겔 및 폴리비닐클로라이드 상에 A. 오리자에로부터의 β-갈락토시다제를 흡착함으로써(1990), 그 효소를 사용하였다. 뼈 분말 상에서 흡착에 의해 고정화된 β-갈락토시다제는 그 이전 활성의 83%를 보존하였으나, 4개 회분식 가수분해 과정 동안, 고정화물은 점차 그 활성을 소실하였다. 4 번째 가수분해 후, 고정화물의 활성은 본래 활성의 단지 24%였다(Carpio 등, 2000). 이 실험은 그 과정 동안에 약간의 탈착이 일어나는 고정화 방법의 단점을 나타냈다. 이 효과는 적당한 가교결합제의 첨가제 의해 제거될 수 있다(Szczodrak, 2000).
Piettaa 등(1989)은 공유 결합을 사용하여 A. 오리자에로부터 단리된 β-갈락토시다제를 2개의 상이한 담체에 고정화하였다. 첫 번째는 제올라이트였으나, 이는 적은 양의 효소를 결합할 뿐이므로 편리하지 않았다. 이와 대조적으로, 분말 나일론-6은 다량의 효소를 공유적으로 결합하여, 안정적인 복합체를 생성하였다. Peters 및 Rehm(2006)은 폴리히드록시알카노에이트 과립 상에 공유 결합에 의해 β-갈락토시다제를 고정화하였다. 얻어진 고정화물은 상이한 조건들 하에서 그 저장 중에 장기 안정적이며, 이는 담체와 고정화된 효소 간의 강한 결합의 증거를 제공 한다.
2개의 반응성 작용기를 갖는 글루타르디알데히드가 β-갈락토시다제 고정화에서 가장 빈번히 사용되는 가교결합제이다(Guisan 등, 1997, Szczodrak, 2000, Zhou 및 Chen 2, 2001). 그러나, 가교결합 고정화 방법은 특히 다른 방법, 예컨대 흡착 또는 포획과 조합하여 사용된다(상기 언급된 Panesar 등, 발행물). 예를 들어, 알긴산염 및 젤라틴으로부터 구성된 섬유 형태로 포획 방법을 사용하여 고정화된 A. 오리자에로부터의 β-갈락토시다제가, 이어서 글루타르알데히드에 의해 가교결합되어, 효소의 세정 제거를 방지하였다(Tanriseven 및 Dogan, 2002). 이러한 유형의 가교결합은 또한 코발트-알긴산염 겔 내로의 β-갈락토시다제 고정화에 사용되었다. 그러나, 락토스 가수분해 과정 동안 코발트 방출은 식품 산업에서 고정화물의 사용을 불가능하게 하였다(Ates 및 Mehmetoglu, 1997).
고정화 효소의 활성 및 안정성은 pH 값, 온도 및 이온 강도에 의해 영향을 받는다(Roy 및 Gupta, 2003). 유리 효소에 비해, 고정화 효소는 대부분의 공개된 연구에서 언급된 것에 비해 더 넓은 최적 pH 및 온도 범위를 갖는다. 더 낮은 pH 값 및 더 높은 온도에서 고정화 β-갈락토시다제의 더 높은 안정성은 락토스 가수분해에 유리하며, 또한 pH 값을 감소시키고 온도를 증가시킴으로써 오염의 위험이 감소한다. 반면, 최적의 pH 이동 및 안정성 증가는, 이들 조건 하에, 그 pH가 5.5 내지 6.0 구간 내에 있는 유청(sweet whey)에서 락토스 가수분해 과정 동안 유리하다(Szczodrak, 2000).
상이한 미생물 공급원으로부터의 β-갈락토시다제가 또한 연속식 작동 방식 뿐만 아니라 회분식 작동 방식으로 갈락토올리고당류를 생산하기 위한 목적으로 고정화되었다(Chockchaisawasdee 등, 2005). 유리 효소에 비해, 고정화 효소는 보다 낮은 GOS 농도를 생성하였다. 이 감소는 고정화 시스템 내 효소에 대한 기질 접근의 제한에 의해 유발되었다(Mahoney, 1998). 발생하는 GOS의 농도 및 구조는 초기 기질 농도 및 효소의 기원에 상당한 정도로 의존하였다. 14%에서 23%로의 초기 락토스 농도의 증가는 GOS 생성을 2배화하였다(Foda 및 Lopez-Leiva, 2000, Chockchaisawasdee 등, 2005).
Shin 등(1998)은 불레라 신굴라리스 ( Bullera singularis) ATCC 24193으로부터 단리한 효소를 키토잔 과립으로 고정화하였다. 이들은 이와 같이 고정화된 효소를 GOS 생성에 사용하였다. 실험은 15일 동안 지속되었으며, 그 동안 이들은 모든 당류의 GOS 55 중량%(초기 기질 농도는 100 g.ℓ-1임) 및 4.4 g/ℓ-1.h-1의 부피 생산율을 기록하였다. 올리고당류 생산에서의 고정화 β-갈락토시다제 용도의 또 다른 예가 또한 Albayrak 및 Yang(2002)의 연구에 기재되었다. 그들은 면 섬유 상에 고정화된 A. 오리자에로부터의 효소를 사용함으로써 모든 당류 중량의 26% 최대 생산(기질 농도 400 g.ℓ-1임) 및 부피 생산율 106 g.ℓ-1.h-1에 도달하였다. Foda 및 Lopez-Leiva(2000)는 GOS 제조를 위해 고정화 β-갈락토시다제를 이용하는 막 유동 반응기를 시험하였다. 그들은 20 중량%의 초기 락토스 농도로 초여과에 의해 처리된 유장을 사용함으로써 최고 생산(31 중량%)에 도달하였다. 유장은 풍부한 락토스 공급원이며, GOS 생산에서의 이의 용도는 매우 선호적인 것으로 나타난다.
고정화물의 생산에 사용되며, 렌즈 형상 형태 또는 소형 벨트로 통상적으로 제조된 생산물(폴리비닐 알코올 담체 기재의 생체촉매)인 고정화물의 생산에 사용되는 캐스팅 장치가 공지되어 있다. 폴리비닐 알코올 겔 및 바이오매스의 혼합물은 정확하고 미리 정해진 투여량으로 적하 캐스팅 메커니즘을 사용하여 연속식 컨베이어 벨트에 적용되며, 여기에서 생산 공정 동안 건조 및 물리적 겔화에 의해 접착성 덩어리로 변화한다. 현재, 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물의 생산을 위한 캐스팅 장치는, (예를 들어 폴리에틸렌으로 제조된) 연속식 컨베이어 벨트가 내부에 이동하는, 건조 채널의 전면에 배열된 캐스팅 메커니즘으로 이루어진다. 캐스팅 해드로서 공지된 캐스팅 메커니즘에는 0.1 ㎜ 내지 2.00 ㎜ 내에서 다양한 직경을 갖는 캐스팅 니들 주입기들로 된 한 열이 장착되어 있고, 이들은 상이한 주파수 및 상이한 펄스 길이를 갖는 전자석의 보조에 의해 진동하며, 연속식 컨베이어 벨트 상에서 바이오매스 및 폴리비닐 알코올의 혼합물을 전달하거나 주입한다. 캐스팅 장치는 또한 건조 채널의 상부 부분에 배치된 재팽윤 구획을 포함하는데, 이는 건조 제품을 습윤(재팽윤)시키는 저압 분무 제트의 시스템에 의해 형성된다. 또한, 캐스팅 장치에는 압력 스테인레스강 와이퍼 위에 배치되고 벨트의 구동 실린더 위의 캐스팅 장치의 운반 프레임 상에 탑재된 분무 제트에 의해 헹구어지는 스테인레스강 플레이트로 제조된 압력 와이퍼를 포함하는 수집 부분이 장착되어 있다. 주위 또는 제습 공기가 연속적 대기 제습 또는 연속 동결을 사용하여 건조 배지의 공급원으로서 사용되는데, 이는 건조 채널에 들어가기 전에 가열 소자에 의해 가온되며, 폴리비닐 알코올 담체를 기재로 하여 생산된 고정화물의 건조에 의한 겔 화를 보장한다. 이러한 방식으로 배열된 캐스팅 장치는, 특히 컨베이어 벨트로부터 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물 제거의 곤란성으로 인해, 장기 경제적 생산이 불가능하다. 기계적 스테인레스강 와이퍼는 와이핑, 및 이에 이어지는 수집에 사용된다. 와이퍼는 컨베이어 벨트의 표면에 대항하여, 즉 탄성에 기초하여 견고히 압착되며, 후속하여 덩어리가 와이퍼에 의해 와이핑되어, 수집 저장소로 떨어진다. 벨트로부터 생성물의 이러한 기계적 제거는, 특히 큰 군집물, 폴리비닐 알코올 담체의 응집물, 및 낮거나 0인 활성을 갖는 생성물의 연속 생산을 고려해볼 때, 매우 미흡하였다. 추가 단점은 또한, 캐스팅 장치의 연속식 컨베이어 벨트의 상당한 기계적 마모이다. 캐스팅 장치의 재팽윤 부분 내 염 용액의 사용이 염을 연속식 벨트의 표면에 부착시키고, 결과적으로 캐스팅 장치의 컨베이어 벨트의 표면 장력에 변화를 주므로, 제품의 형상에 변화를 야기함이 또한 알게 되었다. 이 변화는, 컨베이어 벨트로부터 고정화물의 제거 및 탈착 과정 동안, 대형 클러스터 또는 응집물의 손상 및 형성이 대부분의 경우에 피할 수 없음을 의미한다.
발명의 개요
상기 언급된 약점은, 생체촉매의 산업적 생산을 위해 본래의 유리형 또는 예비처리(응집)된 효소 촉매, 또는 생산성 미생물, 또는 이의 일부 및 폴리비닐 알코올 겔을 함유하는 혼합물로 이루어진 활성 생물학적 물질이 사용되며, 이후 혼합물을 생물학적 활성 물질의 정도를 고려하고 표면 대 부피에 대한 기하학적 비율을 7 ㎜-1 초과로 유지하면서, 80℃ 내지 15℃의 온도에서, 건조 공기의 스트림 중에서 형상화하고 겔화한 후, 이와 같이 제조된 생체촉매는 제시된 생물공학적 공정에 대해 더 높은 생산성, 더 높은 생산적 및 효소적 안정성, 장기 및 반복적 사용, 또는 연속적인 용이한 생체촉매 분리에 의한 공정의 한정가능한 조절을 유지하는 조건 하에 생물공학적 공정에서 배양된 후 사용될 수 있다는 사실에 기초한, 폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 고정화 효소 또는 미생물 형태의 생물학적 활성 물질을 이용한 생체촉매의 산업적 생산 방법 및 이의 사용 방법에 의해 해소된다.
고정화 세포를 이용한 기술의 주요 이점은 생체촉매를 반복적으로 사용하고 공정을 연속적으로 하여 시스템 내 고정된 바이오매스의 높은 농도를 유지하는 가능성, 및 바이오매스 분리 및 생성물 단리의 낮은 비용과 관련된 제공된 공정 조작 비용의 상당한 감소이다. 공정이 연속식이면, 담체 매트릭스로부터 어떠한 바이오매스 세정 제거도 일어나지 않으며, 비생산성 성장 단계가 감소되고, 수율이 증가하고, 더 높은 반응 속도가 달성된다. 또한, 본 발명에 따른 생물공학적 공정 조절 방법은, 필요한 반응 부피 및 반응 기간의 감소를 가져오며, 이는 작동 비용 및 투자의 감소를 의미하는 점에서 유리하다.
고정화 세포에 의해 기체상 질소의 형태로 음용수, 산업용수 및 폐수로부터 질소 화합물을 제거하는 현 공정들의 강화를 위해서는, 담체의 표면 대 부피의 (기하학적) 비율(S/V)이 7 ㎜-1 초과가 되도록, 담체의 렌즈 형상 형태, 또는 더욱 정확하게는 그 높이가 바닥 반경보다 4배 이상 내지 20배 이하인 원통 형상의 담체, 또는 소형 벨트 형상의 담체, 또는 더욱 정확하게는 그 치수들 중 하나가 다른 두 치수보다 4배 이상 내지 20배 이하인 블록을 사용하는 것이 바람직하다.
음용수, 산업용수 및 폐수로부터 질소 오염을 제거하기 위한 생체촉매의 제조는, 질화 및 탈질화 세균을 폴리비닐 알코올 겔 내로 캡슐화한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 렌즈 형상 또는 소형 벨트 형태가 되도록 건조함으로써, 폴리비닐 알코올 담체 및 세균 세포의 혼합물을 겔화하고 형상화하여, 생체촉매의 표면 대 부피 비율이 최소 7.0 ㎜-1이 되도록 한 후, 적당한 황산나트륨 용액 중에서 고정화물을 경화하는 것이 유용하다. 이어서, 고정화물을 N-NH4 10 ㎎/ℓ 내지 1000 ㎎/ℓ 및 질소함유 기질 N-NO3 10 ㎎/ℓ 내지 1500 ㎎/ℓ를 함유하는 수 영양 배지 중에서, 20℃ 내지 35℃의 온도 및 6.0 내지 9.5의 pH 값에서 배양한다.
질화 세균 함유의 생체촉매는 탈질화 세균 함유의 생체촉매와 별도로 제조된다. 이어지는 생체촉매 양자 모두를 함유하는 바이오매스의 배양은 질화 및 탈질화를 위한 산업적 장치에서 직접적으로 행해질 수 있다.
질화 세균(니트로소모나스 유로페아에(Nitrosomonas europeae) 및 니트로박터 위노그라드스키(Nitrobacter winogradskiy))의 순수 혼합 배양액이, PVA 매트릭스로의 캡슐화의 보조에 의해 고정화물 제조에 사용된다. 사용된 무기영양 세균(서서히 성장하는 유기체)은 니트로소모나스 유로페아에(Nitrosomonas europeae) 세균의 경우에는 암모니아(N-NH3) 산화로부터, 또한 니트로박터 위노그라드스키(Nitrobacter winogradskiy)의 경우에는 아질산염(N-NO2) 산화로부터의 질소로부터의 그 세균의 존재에 대해 에너지를 얻는다.
산소 대신에 전자 수용체로서 질산염(N-NO3)으로부터의 질소를 사용하는 탈질화 세균[파라코쿠스 데니트리피칸스(Paraccocus denitrificans)]이 PVA 매트릭스로의 캡슐화의 보조 하에서의 고정화물 제조에 사용될 수 있다. 탈질화 세균은 그 성장에 유기 탄소를 필요로 하는 유기영양 세균이다. 사용된 배양 용액 및 일부 실제 산업 폐수는 어떠한 유기 제제도 함유하지 않으며, 따라서 유기 탄소-알코올, 당류 등, 바람직하게는 메탄올을 첨가할 필요가 있는데, 이는 가격이 싸지만 비교적 적은 양의 바이오매스를 생성하기 때문이다.
또한, 고정화물의 렌즈 형상 형태가 미생물의 성장을 위해 전체 겔 담체 부피(셀 로딩)의 최적 사용을 유지함으로써, 미생물 및 효소의 생산성 효소 성질의 최적 사용을 유지하는 것이 유용하며, 이는 폴리비닐 알코올(PVA) 고정화물을 사용한 생물공학적 공정의 증가된 비생산성(specific productivity)에서 알 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 생체촉매는 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 작동 방식에서 반복적으로 사용될 수 있다.
당류 기질로부터 에탄올을 생산하기 위한 생체촉매의 제조는, 혐기성 세균 자이모모나스 모빌리스를 폴리비닐 알코올 겔 내로 캡슐화한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 건조함으로써 폴리비닐 알코올 담체 및 세균 자이모모나스 세포의 혼합물을 겔화하고 형상화한 후, 20℃ 내지 40℃의 온도 및 3.5 내지 7.0의 pH에서, 1 중량% 내지 15 중량%의 에탄올의 존재 하에 당류 기질 2 중량% 내지 25 중량%를 함유하는 수 배양 배지 중에서 고정화물을 배양하는 것이 유용하다. 또한 이 공정에서, 제조가 완료된 후 고정화 세포를 액체 부분으로부터 분리하여, 에탄올 생산을 위해 반복적으로 사용하는 것이 유용하다. 이와 같이 제조된 생체촉매는 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 작동 방식으로 반복적으로 사용될 수 있다.
당류 기질로부터 락트산을 생산하기 위한 생체촉매의 제조는, 호열성 세균 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)를 폴리비닐 알코올 겔 내로 캡슐화한 후, 7.0 ㎜-1 초과의 고정화물의 표면 대 부피 비율로, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 건조에 의해 바실러스 코아굴란스 세균 세포 및 폴리비닐 알코올 담체의 혼합물을 겔화하고 형상화한 후, 30℃ 내지 60℃의 온도 및 5.0 내지 7.5의 pH 값에서 1 중량% 내지 12 중량%의 락트산 또는 이의 염의 존재 하에 당류 기질 2 중량% 내지 14 중량%를 함유하는 수 배양 배지 중에서 고정화 세포를 배양하는 것이 유용하다. 또한 제조가 완료된 후, 고정화 세포를 액체 부분으로부터 분리하여, 락트산 제조를 위해 반복적으로 사용하는 것이 유용하다. 이와 같이 제조된 생체촉매는 회분식, 반연속식 및 연속식 발효 작동 방식으로 반복적으로 사용될 수 있다.
락트산 생산의 생산성의 증가를 위해 바실러스 코아굴란스 CCM 4318 균주를 사용하는 것이 유용하다. 상기 세균 균주 그 자체는 락트산 생산의 높은 생산성을 특징으로 하며, 이의 부피 대 표면의 비율을 최소 7.0 ㎜-1로 유지하면서 한편 생체촉매의 정도를 고려해 볼 때, 이의 락트산 생산의 생산성은 더욱 높다.
당류 용액으로부터 전화 당류를 제조하기 위한 생체촉매의 제조는, 효소 인버타제를 폴리비닐 알코올 겔 내로 캡슐화한 후, 최소 7.0 ㎜-1의 고정화물의 표면 대 부피 비율로, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 건조에 의해 폴리비닐 알코올 담체 및 효소의 혼합물을 겔화하고 형상화하고, 이와 같이 제조된 효소를 20℃ 내지 50℃의 온도 및 3.5 내지 7.0의 pH 값에서 당류 기질 2 중량% 내지 50 중량%를 함유하는 당류 용액의 가수분해에 사용하는 것이 유용하다.
가수분해가 완료된 후, 고정화 인버타제를 액체 부분으로부터 분리하여, 그것을 전화 수크로스 생산에 반복적으로 사용하는 것이 유용하며, 고정화 인버타제에 의한 수크로스 가수분해는 회분식, 반연속식 및 연속식 방식으로 수행된다.
폴리비닐 알코올 겔(PVA)로의 인버타제 고정화를 위한 본 방법은, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 건조 공기의 스트림 중 건조하는 겔에 기초하는 한편, 겔 및 인버타제 작용기 간의 상호작용이 발생할 수 있다. 고정화물의 표면 대 부피의 비율이 최소 7.0 ㎜-1인 경우, 고정화물의 렌즈 형상 형태는 전체 겔 부피의 최적 사용 및 인버타제의 높은 비활성의 달성을 보장한다. 이와 같이 고정화된 효소는 매트릭스로부터 세정 제거되지 않으며, 회분식, 반연속식 및 연속식 작동 방식으로 사용될 수 있다. 고급 당류로부터 D-글루코스를 생산하기 위한 생체촉매의 제조는, 글루코아밀라제 효소를 폴리비닐 알코올 겔 내로 캡슐화한 후, 최소 7.0 ㎜-1의 고정화물의 표면 대 부피 비율로, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 건조에 의해 폴리비닐 알코올 담체 및 효소의 혼합물을 겔화하고 형상화하고, 이와 같이 제조된 효소를 20℃ 내지 45℃의 온도 및 3.5 내지 7의 pH 값에서 당류 기질 2 중량% 내지 40 중량%를 함유하는 전분의 부분적 가수분해에 의해 제조된 고급 당류 용액의 가수분해에 사용하는 것이 유용하다.
글루코아밀라제의 세정 제거를 방지하기 위해, 겔 작용기 및 글루코아밀라제 간의 상호작용이 발생할 수 있을 때, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 공기 기류 중 건조하는 동안, 폴리비닐 알코올 겔(PVA)로 효소 고정화를 수행하는 것이 유용하다. 이 방법에 의해 고정화된 효소는 매트릭스로부터 세정 제거되지 않으며, 회분식, 반연속식 및 연속식 방식으로 사용될 수 있다. 이와 같이 제조된, 글루코스를 함유하는 당류 기질이 발효 및 식품 산업에 사용될 수 있다.
가수분해가 완료된 후, 고정화 글루코아밀라제를 액체 부분으로부터 분리하여 글루코스 제조에 반복적으로 사용하는 것이 또한 유용하다.
고정화 글루코아밀라제에 의한 가수분해가 회분식, 유가배양(fed-batch) 및 연속식 작동 방식으로 수행되는 것이 또한 유용하다.
고정화 글루코아밀라제를 에탄올 발효 생산 공정에서 전분 기질의 당화에 사용하는 것이 또한 유용하다.
고정화 글루코아밀라제를 락트산 발효 생산 공정에서 전분 기질의 당화에 사용하는 것이 또한 유용하다.
락토스 용액 가수분해와 락토스 용액으로부터 D-갈락토스, D-글루코스 및 갈락토올리고당류를 생산하기 위한 생체촉매의 제조는, 효소 β-갈락토시다제를 폴리비닐 알코올 겔 내에 봉입한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도, 및 최소 7.0 ㎜-1의 고정화물의 표면 대 부피 비율로, 건조에 의해 폴리비닐 알코올 담체 및 효소의 혼합물을 겔화하고 형상화하여, 이와 같이 제조된 효소를 20℃ 내지 60℃의 온도 및 3.0 내지 7.0의 pH 값에서 당류 기질 2% 내지 50 중량%를 함유하는 락토스 용액의 가수분해에 사용하는 것이 유용하다.
가수분해가 완료된 후, 고정화 β-갈락토시다제를 액체 부분으로부터 분리하여, D-갈락토스, D-글루코스 및 갈락토올리고당류 생산에 반복 사용하는 것이 유용하며, 고정화 β-갈락토시다제에 의한 락토스 가수분해는 회분식, 유가배양 및 연속식 작동 방식으로 행해진다.
고정화 생체촉매의 제조를 위한 장치는, 연속식 컨베이어 벨트가 통과하여 이동하는, 건조 채널의 전면에 탑재된 적하 캐스팅 메커니즘을 포함하는, 생물학적 활성 물질의 정도에 따른 생물학적 담체의 부피 및 표면의 최적화를 제공하는 산업용 제조 장치이며, 여기에서 장치에는 조절된 압력 탱크 및 압축기에 연결된 2열의 캐스팅 니들 주입기를 갖는 하나 이상의 캐스팅 헤드, 컨베이어 벨트, 및 건조 시스템인, 가열 소자가 포함된 공기 분배 시스템으로 통풍기에 의해 송풍되어 상부 건조 채널로 이동하는 건조 공기의 공급원, 및 하부 최종 건조 채널, 및 재팽윤 탱크, 상기 하부 최종 건조 채널과 재팽윤 탱크 사이에 탑재되어 있으며, 냉각이 수반되는 수집 저장소로 이동하는 일체화된 고압 펌프 및 저압 펌프를 갖는 파이프라인에 연결된, 기계적 와이핑 및 고압 헹굼에 기초하여 설계된 와이핑 및 수집 장치, 및 파이프라인에 의해 헹굼 탱크에 연결되어 있는 저압 펌프에 연결된 제트에 의해 연속식 컨베이어 벨트 최종 세정을 위한 추가 헹굼 상자가 장착되어 있다.
본 발명에 따른 장치는 그 직경이 0.1 내지 2.00 ㎜인 2열의 캐스팅 니들 주입기가 장착된, 상이한 주파수 및 펄스 길이를 갖는 전자석에 의해 진동하는 1 또는 2개의 캐스팅 헤드, 구동 조절되는 컨베이어 벨트, 역류 건조를 이용하는 건조 채널, 재팽윤 탱크, 독립적인 수집 저압 헹굼 시스템, 및 캐스팅 장치의 하부 부분의 역류 건조를 이용하는 하부 건조 채널로 이루어진 산업적 캐스팅 장치의 완전히 새로운 조립체를 형성한다. 또한, 고압 제트에 대한 압력 물 운반을 위한 고압 펌프를 포함하는, 수집 저장소 내 염 수용액에 의한 고압 헹굼의 독립적인 시스템이 장치의 일부인 것이 유용하다. 컨베이어 벨트로부터 덩어리의 기계적 와이핑의 증진된 효능은 이러한 방식으로 달성된다.
본 조정의 장치, 즉 이러한 유형의 수집 및 헹굼 장치는 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물의 비저해 경제적 산업적 생산을 보장할 수 있는 것이 또한 중요하다.
측면 프레임에 의해 형성된 경우에, 45°내지 80°의 각으로 헹굼을 제공하는, 기계적 중합체 와이퍼가, 스프링 압력 메커니즘과 함께 스테인레스 압력 메커니즘 상에 위치하는 캐스팅 장치의 일부인 와이핑가능한 수집 장치의 오류가 없는 작용, 및 프레임에 고정된, 지지 스테인레스 파이프 분배 시스템 상에 고정된 고압 제트 시스템에 의한 헹굼이 유용하고, 컨베이어 벨트의 내부 및 외부 면의 세정을 위해, 스프링 메커니즘과 함께 기계적 중합체 와이퍼 뒤에 고정된 중합체 브러쉬를 갖는 하부 및 상부 와이퍼가 있으며, 프레임의 밖으로 이동하는 위치에 생성물로부터 컨베이어 벨트의 최종 세정을 위한 하부 및 상부 와이퍼가 추가로 제공된다. 와이핑가능한 수집 장치의 설계된 메커니즘은 또한 이의 내부 표면이 균일하지 않거나, 주름지거나, 거친 경우에서도, 연속식 컨베이어 벨트의 다른 면을 세정하는 것이 또한 유리하다.
본 발명에 따른 장치는 또한 기타 접착성 물질의 제조 시에, 컨베이어 벨트로부터 다른 접착성 물질을 와이핑하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 도면에 의해 더욱 상세히 예시될 것이다.
도 1은 캐스팅 기계의 개략도를 예시한다.
도 2는 재팽윤 탱크의 개략도이다.
도 3은 수집 장치의 부분적 구획이다.
도 4는 헹굼 상자의 개략도이다.
폴리비닐 알코올 겔 내로 고정화된 질화 및 탈질화 세균에 의해 폐수로부터 질소를 제거하는 공정에서의 상기 언급된 담체의 생산 및 사용 방법이 하기 실시예에서 설명될 것이다.
실시예 1
고정화물로서 질화 세균[니트로소모나스 유로페아에 ( Nitrosomonas europeae ) 및 니트로박터 위노그라드스키( Nitrobacter winogradskiy )] 순수 혼합 배양액의 PVA-히드로겔 내로의 캡슐화에 의해 질화를 위한 생체촉매를 제조하였다.
고정화물로서 탈질화 세균[파라코쿠스 데니트리피칸스( Paraccocus denitrificans)]의 캡슐화에 의해 탈질화를 위한 생체촉매를 제조하였다.
고정화는 하기 방법으로 수행하였다: PVA(폴리비닐 알코올) 100 g, PEG(폴리에틸렌글리콜) 60 g, 증류수 790 g을 함유하는 PVA 용액을 제조하였다. 바이오매스의 균질 현탁액 50 ㎖를 상기와 같이 제조된 용액에 첨가하여, 생성된 세포 농도가 겔 1 dm3 당 세포 0.60 g이 되도록 하였다. 이와 같이 제조된 PVA 용액 내 세포 혼합물을 경질 플레이트 위로 적하한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도에서 건조 공기의 스트림 중에서 가교결합하고 형상화하였다. 이어서, 그 표면 대 부피 비율이 최소 7 ㎜-1인 고정화물을 황산나트륨(0.01 몰/ℓ) 및 염화암모늄(0.1 몰/ℓ)의 용액으로 60분간 이동하였다. 여과 후 고정화물을 4℃ 온도의 저장 배지 중에서 배양하거나 저장하였다.
질화 미생물의 경우, 질소 기질 N-NH4의 함량을 50 ㎎/ℓ 내지 500 ㎎/ℓ로 점차 증가시키면서, 수 배양 배지에서 회분식 배양을 수행하였으며, 그 동안 세균의 배양은 pH 7.0 및 1.5 ㎎/ℓ 초과의 용존 산소 농도에서 일어났다.
탈질화 미생물의 경우, 질소 기질 N-NO3 200 ㎎/ℓ 및 기타 영양분의 함량으로, 20℃ 내지 35℃의 온도 및 pH 7.8에서, C-기질로서의 메탄올의 존재 하에 수 배양 배지 중에서 회분식 배양을 수행하였다. 양 생체촉매 모두 중에서의 바이오 매스의 함량은 배양 후, PVA 1000 ㎖ 당 바이오매스 건조물 약 60 ㎎ 내지 80 ㎎이었다.
이와 같이 제조된 고정화물에 반복 회분식 발효를 수행하였다. N-NH4 약 800 ㎎/ℓ 및 캡슐화된 질화 세균을 갖는 생체촉매 2000 g을 함유하는 합성 폐수(WW) 15 ℓ의 함량으로, 17 ℓ의 유효 부피를 갖는 반응기 내에서 질화(암모니아로부터 질소 제거)를 4시간 후 완료하였으며, 이는 질화 속도 N-NH4 약 1500 ㎎/hr×생체촉매 ㎏(각각 N-NH4 약 4.8 ㎏/WW ㎥×일 및 N-NH4 36 ㎏/생체촉매 ㎥×일)을 제시한다.
N-NO3 800 ㎎/ℓ의 농도 및 캡슐화된 질화 세균을 갖는 생체촉매 800 g를 갖는 합성 폐수 15 ℓ의 함량으로, 15.8 ℓ의 유효 부피를 갖는 반응기 내에서 탈질화(질산염으로부터 질소 제거)를 C-기질로서의 메탄올의 존재 하에 3시간 후 완료하였으며, 이는 N-NO3 약 2000 ㎎/hr×생체촉매 ㎏(각각 N-NO3 약 6 ㎏/WW ㎥×일 및 N-NO3 45 ㎏/생체촉매 ㎥×일)을 나타냈다.
실시예 2
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고 배양한 고정화물을, 질화 및 탈질화의 연속적인 조정에서, N-NH4 200 ㎎/ℓ 내지 1000 ㎎/ℓ의 높은 질소 오염 농도 및 사실상 0의 중크롬산염 값을 갖는 실제 폐수로부터 질소 오염 제거에 사용하였다.
연속식 모델의 장치를 동시 질화 및 탈질화 시험에 사용하였으며, 여기서 교반 질화 반응기의 유효 부피는 17 ℓ였으며, 교반 탈질화 반응기의 유효 부피는 3.8 ℓ였다. N-NH4 약 1600 ㎎/ℓ의 함량에서의 실제 산업용 폐수의 유속은 35 ℓ/일이었다.
캡슐화된 질화 세균을 갖는 생체촉매 2000 g을 질화 반응기에 첨가하였다. 캡슐화된 탈질화 세균을 갖는 생체촉매 800 g을 탈질화 반응기에 첨가하였다.
95% 질화 효율에서 N-NH4 약 1000 ㎎/hr×생체촉매 ㎏의 평균 질화 속도, 및 C-기질로서의 메탄올의 존재 하에 N-NO3 약 1600 ㎎/hr×생체촉매 ㎏의 평균 탈질화 속도가 몇주간의 실험 동안 달성되었다. 질소 오염 제거율은 약 1.5 ㎏/WW ㎥ ×일이었다.
실시예 3
상기 실시예 1에 기재된 것과 같이 제조되고 배양된 고정화물을, 연속적인 질화 및 탈질화 조정으로, 높은 중크롬산염 값(>1000 ㎎/ℓ) 및 N-NH4 200 ㎎/ℓ 내지 1000 ㎎/ℓ 질소 오염의 높은 함량을 갖는 실제 폐수로부터의 질소 오염 제거에 사용하였다.
이와 같이 제조된 고정화물에 회분식 발효를 수행하였다. N-NH4 약 800 ㎎/ℓ 및 캡슐화된 질화 세균을 갖는 생체촉매 2000 g을 함유하는 합성 폐수(WW) 15 ℓ의 함량으로, 17 ℓ의 유효 부피를 갖는 반응기 내에서 질화(암모니아로부터 질 소 제거)를 12시간 후 완료하였고, 이는 N-NH4 약 500 ㎎/hr×생체촉매 ㎏(각각 N-NH4 1.6 ㎏/WW ㎥×일 및 N-NH4 12 ㎏/생체촉매 ㎥×일)을 제시한다.
N-NO3 800 ㎎/ℓ의 농도 및 질화 세균으로 캡슐화된 생체촉매 800 g를 합성 폐수 15 ℓ의 함량으로, 15.8 ℓ의 유효 부피를 갖는 반응기 내 탈질화(질화 질소 제거)를 C-기질로서의 메탄올의 존재 하에 6시간 후 완료하였으며, 이는 N-NO3 약 1000 ㎎/hod×생체촉매 ㎏(각각 N-NO3 약 3 ㎏/WW ㎥×일 및 N-NO3 22.5 ㎏/생체촉매 ㎥×일)을 나타냈다.
폴리비닐 알코올 겔 내로 고정화된 바실러스 코아굴란스 세포에 의한, 당류 기질로부터 락트산을 생산함에 있어 상기 언급된 담체의 생산 및 사용 방법이 하기 실시예에서 예시될 것이다.
실시예 4
페트리디쉬(φ 9 ㎝) 내에 무균 CaCO3를 갖는 MRS 아가의 표면 상에서 저장 배양액(3 h, 160℃)으로부터의 0.2 ㎤를 접종함으로써 바실러스 코아굴란스 CCM 4318 포자 현탁액을 제조하였다. 항온배양은 항온 실험실에서 50℃의 온도에서 72시간 동안 수행하였다. 이어서, 포자 형성된 배양액을 무균 증류수 5 ㎤로 덮고, 엘렌마이어 플라스크로 옮겼다. 이와 같이 수득한 현탁액을 70℃의 온도에서 25분 동안 항온배양한 후, 폴리비닐 알코올(PVA) 겔 내로의 고정화에 사용하였다.
PVA(폴리비닐 알코올) 100 g, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 60 g 및 증류수 790 g 을 함유하는 PVA 용액을 제조하였다. 균질한 바이오매스 현탁액 50 ㎖를 상기와 같이 제조된 용액에 첨가하고, 최종 세포 농도가 0.67 g 세포(건조물)/1 dm3 겔이 되도록 하였다. 이와 같이 제조된 PVA 용액 내 세포 혼합물을 경질 플레이트에 적하한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도 구배로 건조 공기의 스트림 중에서 가교결합하고 형상화하였다. 이어서, 표면 대 부피의 비율이 최소 7 ㎜-1인 고정화물을 60분 동안 황산나트륨 용액(0.1 몰/ℓ)으로 옮겼다. 고정화물은 여과 후, 회분식 발효에 사용하거나, 4℃ 온도에서 무균 수돗물 중에 저장하였다.
바이오매스 증식을 생산 배지 2.6 ℓ를 갖는 5 ℓ 실험실 발효기 내에서 반복 회분식 발효로 수행하였다.
생산 배지는 증류수 1 ℓ 중에 사카로스 60 g, 효모 추출액 10 g, (NH4)2HPO4 1 g, MgSO4×7H2O 0.2 g, MnSO4×4H2O 0.05 g, FeSO4×7H2O 0.01 g을 함유하였다. 생산 배지를 단시간 동안 끓이고, 60℃의 온도로 냉각한 후, 습윤 고정화물 400 g을 첨가하였다. 온도를 1시간 동안 점차 45℃로 낮추고, pH를 자발적으로 6.9에서 5.0으로 낮춘 다음, 26% 암모니아 수용액을 첨가함으로써 하기 발효 동안 pH를 5.8로 유지하였다. 발효는 회분식 방식으로 수행하였으며, 연속해서 교반하였다(200 rpm). 당류 기질 소비 후, 고정화물을 발효 배지로부터 분리하여, 새로운 발효에 사용하였다. 일련의 9회 회분식 발효를 하기 조건 하에 유사한 방식으로 수행하였다: 두 번째 내지 다섯 번째 전환은 50℃의 온도 및 pH 6.0에서 일어났으며, 여섯 번째 내지 열 번째 전환은 52℃의 온도 및 pH 6.3에서 일어났다. 총 발효 지속 시간은 반복적인 발효 동안, 91% 내지 93%의 락트산 수율에서 48시간(제1 전환)으로부터 12시간(제10 전환)으로 단축되었다. PVA 겔 중 바이오매스 농도는 열 번째 전환 후 0.065 g세포/g고정화물로 증가하였다.
실시예 5
사카로스 대신에 글루코스를 생산 배지에 사용한 것을 제외하고는 (60 g/ℓ), 배지 조성, 고정화물 제조 및 회분식 발효는 상기 실시예 4에 기재된 것들과 동일하였다. 발효 14시간 후, 열 번째 전환에서 락트산 55.2 g/ℓ 및 글루코스 1.2 g/ℓ가 있었다.
실시예
6
상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 습윤 고정화물 350 g을 6 ℓ 발효기에 옮기고, 증류수 1 ℓ 중에 사카로스 60 g, 효모 추출액 5.0 g, (NH4)2HPO4 0.8 g, MgSO4×7H2O 0.2 g, MnSO4×4H2O 0.05 g, FeSO4×7H2O 0.01 g을 함유한 생산 배지 2 dm3을 첨가하였다. 발효는 회분식으로 수행하였고, 52℃의 온도에서 영구히 교반하였으며(200 rpm), pH는 암모니아 용액(26%)의 첨가에 의해 6.3의 값으로 유지하였다. 이어서, 발효기 중 사카로스 농도가 15 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 범위로 유지될 수 있는 속도에서, 사카로스 농도가 20 g×dm-3으로 감소한 후, 사카로스 140 g/ℓ의 함량을 갖는 동일한 조성의 생산 배지 2 ℓ를 점차 배합하였다. 배지 중 락트 산 함량은 15시간 후 93.5 g×dm-3이었으며, 잔여 사카로스는 2.6 g/ℓ였다.
실시예
7
배지 조성 및 고정화물의 제조는 상기 실시예 5에 언급된 것과 동일하였다. 고정화물 350 g을 열 번째 전환 후에 6 ℓ 발효기에 옮겼고, 증류수 1 ℓ 중에 글루코스 60 g, 효모 추출액 5.0 g, (NH4)2HPO4 0.8 g, MgSO4×7H2O 0.2 g, MnSO4×4H2O 0.05 g, FeSO4×7H2O 0.01 g을 함유한 생산 배지 2.5 dm3을 첨가하였다. 발효액을 52℃의 온도에서 영구히 교반하였으며(200 rpm), pH는 6.3의 값으로 유지하였다. 글루코스 농도가 20 g×dm-3으로 감소한 후 생산 배지를 점차적으로 배합하고, 동일한 조성의 발효된 배지를, 반응기 중 잔여 사카로스 농도를 15 g/ℓ 내지 30 g/ℓ의 범위로 유지하고, 잔여 글루코스 농도를 10 g/dm3 내지 15 g/dm3으로 유지하고, 실제 락트산 농도를 40 g.dm-3 내지 48 g.dm-3으로 유지하도록 하는 방식으로 소거하였다. 발효를 40일 동안 연속해서 수행하였으며, 평균 장치 부피 생산성은 공정 중 13.5 내지 17.0(g락트산×dm-3×h-1)이었다.
폴리비닐 알코올 겔 내로 고정화된 자이모모나스 모빌리스 세포에 의한 당류 기질로부터 에탄올 생산의 공정에서의 상기 언급된 담체의 생산 및 사용 방법이 하기 실시예에 의해 예시될 것이다.
실시예 8
250 ㎖ 배양 플라스크 중 배양 배지 100 ㎖(121℃의 온도에서 20분 동안 무균화됨)을 제조하였다. 배양 배지는 증류수 1 ℓ 중에 효모 추출액 5 g, (NH4)2SO4 1 g, MgSO4×7H2O 0.5 g, KH2PO4 1 g, 글루코스(pH 5 내지 5.5) 100 g을 함유하였다. 이와 같이 제조된 배지를, 고체 배양 배지에서 성장한 자이모모나스 모빌리스 CCM 2770 배양액으로 접종한 후, 이를 30℃의 온도에서 24 내지 48시간 동안 정적으로 배양하였다. 이와 같이 제조된 바이오매스를 250 ㎖ 배양 플라스크 중에서 상기 기재된 조성의 배양 배지 100 ㎖에 접종원(10 체적%)으로서 사용하였다. 30℃ 온도에서 12시간 정적 배양 후, 미생물을 다시 배양 배지(5 체적%)에 옮겼다. 배양은 바이오매스 건조물 값이 1.2 g×dm-3이 될 때까지 30℃의 온도에서 수행하였으며, 배지를 약간 교반하는 것이 유용하다. 배양이 완료된 후 바이오매스를 원심분리(5500 rpm, 25분)에 의해 분리하여 고정화에 사용하였다.
PVA(폴리비닐 알코올) 100 g, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 60 g 및 증류수 790 g을 함유하는 PVA 용액을 제조하였다. 균질한 바이오매스 현탁액 50 ㎖를, 생성 세포 농도가 세포 0.56 g/겔 1 dm3이 되도록 하는 방식으로, 상기와 같이 제조된 용액에 첨가하였다. 이와 같이 제조된 PVA 용액 내 세포 혼합물을 경질 플레이트 위로 적하한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도 구배에서 건조 공기의 스트림 중에서 가교결합하고 형상화하였다. 이어서, 그 표면 대 부피 비율이 최소 7 ㎜-1인 고정화물을 30 내지 60분 동안 황산나트륨 용액(0.1 몰/ℓ)으로 옮겼다.
고정화물 중 세균 바이오매스를, 매번 발효 공정 중 무균 배양 배지 3 dm3으로 하여, 6 dm3 실험실 발효기 내에서 증식시킨 후, 배양 배지 내 고정화물 23 체적%가 꾸준히 교반(80 rpm) 하의 회분식 방법으로 배양되어, 배양 배지 pH가 6.5로 조정되며, 25℃의 온도에서 자발적으로 pH 4.0으로 감소하도록 하였다. 유체상을 제거하고, 새로운 배지를 고정화물에 첨가하여 공정을 1회 반복하였다. 이어서, 유체상을 제거하고, 새로운 배지를 고정화물에 첨가하고, pH 값을 (1 M NaOH 용액에 의해) 6.5로 조정하였다. 이어서, 영구적으로 교반하면서(80 rpm) 자발적인 발효에 의해 pH=5로 감소시킨 다음, 글루코스가 고갈될 때까지 발효를 수행하였다. 유체상을 제거하고, 새로운 배지를 고정화 세포에 첨가하고, 공정을 6회 반복하였다. 이와 같이 제조된 고정화물 중 세포 건조물은 세포 65.8 g/겔 dm3로 증가하였다.
글루코스 함량 150 g×dm-3 및 pH=5.5를 갖는 무균 생산 배지 2.2 dm3을 상기와 같이 제조된 고정화 세포(습윤 생체촉매 450 g)에 첨가하였다. 발효는 영구적으로 교반된(80 rpm) 5 ℓ 생체반응기 내에서 일어났으며, pH는 30℃의 온도에서 NaOH(2 몰/dm3) 용액을 첨가함으로써 5.0으로 유지하였다. 이 배지는 발효 11시간 후, 에탄올 73.8 g.dm-3을 함유한 한편, 잔여 글루코스 농도는 1.8 g.dm-3이었다. PVA 담체에 고정화된 자이모모나스 모빌리스 에탄올의 비생산성은 202 ㎎에탄올/㎖겔 /h를 달성하였다.
실시예 9
상기 실시예 8에 기재된 것과 같이 제조된 습윤 고정화물 450 g을, 200 g.dm-3의 글루코스 함량을 갖는 생산 배지(pH=5.0) 2.2 dm3에 첨가하였다. 발효는 영구적 교반(80 rpm) 하에 회분 방식으로 일어났고, pH는 30℃에서 NaOH(2 mol.dm-3)을 첨가함으로써 5.0으로 유지하였다. 6회 발효를 이러한 방식으로 수행하였다. 배지 중 에탄올 함량은 13시간 후, 각 전환 후에 최소 94.0 g.dm-3 내지 98.0 g.dm-3이었으며, 잔여 글루코스는 3 g.dm-3 내지 8 g.dm-3 (즉, 이론적 수율 94% 내지 98%)였다.
실시예 10
상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된 고정화물을 사용하였다. 글루코스 농도 150 g.dm-3(고정화물은 발효 배지 부피 30%를 형성함)을 갖는 재조 배지 1050 ㎖를 고정화물 450 g에 첨가하였다. 발효는 회분 방식으로 일어났으며, 영구적으로 교반하였고(80 rpm), pH는 30℃에서 NaOH(2 몰/dm3)을 첨가함으로써 5.0으로 유지하였다. 글루코스 농도가 20 g.dm-3의 값으로 감소한 후, 발효기 중 잔여 글루코스 농도를 15 g.dm-3 내지 30 g.dm-3으로 유지하도록 하는 속도로, 글루코스 농도 320 g.dm-3을 갖는 배양 배지 1500 ㎖를 점차적으로 배합하였다. 배지 중 에탄올 함량은 113.5 g.dm-3, 즉 91%의 이론적 수율이었으며, 20시간 후, 잔여 글루코스는 4.6 g.dm-3이었다.
실시예 11
상기 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된 Z. 모빌리스 CCM 2770 고정화물을 사용하였다. 습윤 고정화물 450 g을 글루코스 150 g.dm-3를 갖는 배양 배지 2.2 dm3으로 옮기고, pH를 5.0으로 조정하였다. pH=5.0 및 30℃의 온도에서 발효가 일어났다. 발효기 중 글루코스 함량이 10 g.dm-3 내지 20 g.dm-3의 값으로 감소한 후, 50 g.dm-3의 글루코스 함량을 갖는 배양 배지를 연속적으로 배합하고, 발효된 배지를, 발효기 중 잔여 글루코스 농도가 17g.dm-3 내지 30 g.dm-3이고, 실제 에탄올 농도가 58 g.dm-3 내지 65 g.dm-3인 희석 속도로 소거하였다. 발효를 50일 동안 연속적으로 수행하는 한편, 장치의 부피 생산성은 30 g에탄올.dm-3.h-1이었으며, 이는 140 ㎎에탄올/㎖겔/h의 에탄올 특이 생산에 상응한다.
실시예 12
절차는 실시예 8에서와 동일하며, 자이모모나스 모빌리스 아종 포마시 이( pomacii ) CCM 2771을 생산 미생물로서 사용하였다. 배지는 발효 15시간 후 에탄올 68.3 g.dm-3을 함유한 한편, 잔여 글루코스 농도는 6.8 g.dm-3이었다.
폴리비닐 알코올 겔 중에 캡슐화된 인버타제에 의한 사카로스 용액으로부터의 전화 당의 제조에 있어서의 상기 언급된 담체의 생산 및 사용 방법이 하기 실시예에 예시될 것이다.
실시예 13
PVA(폴리비닐 알코올) 100 g, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 60 g, 증류수 790 g을 함유하는 PVA 용액을 제조하였다. 효소 제제 인버타제(시그마(Sigma))(효소 농도 100 g/ℓ) 50 ㎖를 상기와 같이 제조된 용액에 첨가하였다. 이와 같이 제조된 PVA 용액 내 효소 혼합물을 경질 플레이트 위에 적하한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도 구배에서 건조 공기의 스트림 중에서 가교결합하고 형상화하였다. 표면 대 부피의 비율이 최소 7 ㎜-1인 고정화물을 10 내지 120분 동안 황산나트륨 용액(0.1 몰/ℓ)으로 옮겼다. 제조된 고정화물을 4℃의 온도에서 10 mM 아세트산염 완충 용액(pH=4.5)에 저장할 수 있다.
이와 같이 제조된 고정화 효소를 10 mM pH=4.5의 아세트산염 완충액에 용해된 사카로스의 가수분해에 사용할 수 있다. 고정화 인버타제 120 g을 사카로스 용액(100 g/ℓ) 1000 ㎖에 첨가하였다. 가수분해를 30℃의 온도에서 회분식으로 영구적인 교반(80 rpm) 하에 수행하였다. 사카로스는 50분 동안의 가수분해 후, 글루코스 및 프룩토스로 완전히 가수분해된다.
실시예 14
상기 실시예 13에 기재된 것과 같이 제조된 습윤 고정화물 120 g을 30℃의 온도에서 450 g/ℓ의 농도를 갖는 사카로스 용액 1000 ㎖(pH=4.5, 아세트산염 완충액 10 mM)에 첨가하였다. 가수분해는 회분 방식으로 일어났고, 연속적으로 교반하였다. 잔여 사카로스 농도는 360분 후 상기 방식으로는 10.1 g/ℓ이다.
실시예 15
상기 실시예 13에서 기재된 것과 같이 제조된 습윤 고정화물 120 g을 30℃의 온도에서 280 g/ℓ의 농도를 갖는 사카로스 용액 1000 ㎖ (pH=4.5, 아세트산염 완충액 10 mM)에 첨가하였다. 가수분해는 영구적으로 교반된 회분 방식으로 수행하였다. 잔여 사카로스 농도는 360분 후 이러한 방식으로 1.8 g/ℓ였다. 유체상을 가수분해 후 제거하고, 고정화 인버타제를 상기 언급된 절차에 의해 반복 회분식 가수분해에 사용하였다. 240분 동안의 가수분해 후, 잔여 사카로스 농도는 6회 전환 후 3 g/ℓ였다.
실시예 16
고정화물을 상기 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조하였다. 습윤 고정화물 25 g을 120 g/ℓ의 사카로스 농도를 갖는 당밀 0.5 ℓ에 옮겼다(pH 4.5, H2SO4에 의해 조정). 가수분해는 pH=4.5, 30℃에서 일어났고, 200 rpm 하에 교반하였다. 120 g/ℓ의 농도를 갖는 당밀을 발효기에 연속적으로 배합하고, 발효기 중 사카로스 양이 30 g/ℓ 내지 40 g/ℓ의 값으로 감소한 후, 가수분해된 배지를 30 g/ℓ 내 지 40 g/ℓ의 사카로스 농도를 달성하도록 하는 비율(66% 내지 75% 전환율)로 소거하였다. 고정화물의 비활성은 이러한 방식에서 0.35 g/g.h-1(시간(hr) 당 고정화제의 g 당, 해당 사카로스의 g)이었다.
실시예 17
상기 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조된 고정화물을 사용하였다. 습윤 고정화물 25 g을 120 g/ℓ의 사카로스 농도를 갖는 당밀 0.5 ℓ에 옮겼다(pH 4.5). 가수분해는 pH=4.5, 45℃, 200 rpm의 교반 하에 일어났다. 120 g/ℓ의 농도를 갖는 당밀을 발효기에 연속적으로 배합하고, 발효기 중 사카로스 양이 30 g/ℓ 내지 40 g/ℓ의 값으로 감소한 후, 가수분해된 배지를 30 g/ℓ 내지 40 g/ℓ의 사카로스 농도를 달성하도록 하는 비율(66% 내지 75% 전환율)로 제거하였다. 고정화물의 비활성은 500시간 동안 연속적으로 수행되는 상기 가수분해 방식에서 0.55 g/g.h-1 내지 0.60 g/g.h-1 (시간(hr) 당 고정화제의 g 당, 해당 사카로스의 g)이었다.
폴리비닐 알코올 겔 내에 캡슐화된 글루코아밀라제에 의한 전분 가수분해물로부터 글루코스 생산 공정에 있어서의 상기 언급된 담체의 생산 및 사용 방법이 하기 실시예에서 예시될 것이다.
실시예 18
PVA(폴리비닐 알코올) 100 g, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 60 g, 증류수 790 g을 함유하는 PVA 용액을 제조하였다. 효소 제제 SUN 울트라 L(SUN Ultra L)(Novozymes(노보자임스)) 50 ㎖를 상기와 같이 제조된 용액에 첨가하였다. 이와 같이 제조된 PVA 용액 내 효소 혼합물을 경질 플레이트 위에 적하한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도 구배에서 건조 공기의 스트림 중에서 가교결합하고 형상화하였다. 이어서, 표면 대 부피의 비율이 최소 7 ㎜-1인 고정화물을 10 내지 120분 동안 황산나트륨 용액(0.1 몰/ℓ)으로 옮겼다. 제조된 고정화물을 4℃의 온도에서, 10 mM 아세트산염 완충 용액(pH=4.5)에 용해된 30 중량% 글루코스에 저장할 수 있다.
이와 같이 제조된 고정화 효소를, 10 mM 아세트산염 완충 용액(pH=4.5)에 용해된 전분 가수분해물, 예를 들어 말토스 당밀(조성: 고급 당류 33 중량%, 말토트리오즈 20 중량%, 말토스 53 중량%, 글루코스 4 중량%)의 가수분해에 사용하였다. 고정화 글루코아밀라제 120 g을 상기와 같이 제조된 100 g/ℓ사카로스 농도를 갖는 용액 1000 ㎖에 첨가하였다. 가수분해는 30℃의 온도에서, 영구적 교반(200 rpm) 하에 회분 방식으로 수행하였다. 배지는 가수분해 60분 후 글루코스 70 g/ℓ 내지 80 g/ℓ를 함유하였다.
실시예 19
당류 250 g/ℓ의 농도를 갖는 말토스 배지(pH=4.5) 5000 ㎖를, 40℃의 온도에서 상기 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조한 습윤 고정화물 200 g에 첨가하였다. 가수분해는 영구적 교반 바에 회분 방식으로 일어났다. 글루코스 180 g/ℓ가 6시간 후 이러한 방법으로 생성되었다. 가수분해 후에 유체상을 제거하였고, 고정화 글루코아밀라제를 상기 언급된 절차 중 반복 회분식 가수분해에 사용하였다. 생성된 글루코스 농도는 여섯 번째 전환 후 6시간 동안의 가수분해 후, 178 g/ℓ였 다.
실시예 20
상기 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조된 고정화물을 사용하였다. 습윤 고정화물 25 g을 100 g/ℓ의 당류 농도를 갖는 말토스 당밀 0.5 ℓ에 옮겼다(pH 4.5). 가수분해는 pH=4.5, 30℃, 및 200 rpm의 교반 하에 일어났다. 100 g/ℓ의 당류 농도를 갖는 말토스 당밀을 발효기에 연속적으로 배합하였고, 발효기 중 글루코스 농도가 55 g/ℓ 내지 65 g/ℓ의 값으로 증가한 후, 50 g/ℓ 내지 60 g/ℓ의 글루코스 농도를 달성하도록 하는 비율(50% 내지 60% 전환율)로 가수분해된 배지를 제거하였다. 고정화제의 비활성은 900시간 동안 연속적으로 수행되는 상기 가수분해 방식에서 0.3 g/g.h-1 내지 0.4g/g.h-1(시간 당 고정화물의 g 당, 생성된 글루코스의 g)이다.
실시예 21
상기 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조된 고정화물을 사용하였다. 습윤 고정화물 25 g을 100 g/ℓ의 당류 농도를 갖는 말토스 당밀 0.5 ℓ에 옮겼다(pH 4.5). 가수분해는 pH=4.5, 45℃의 온도, 및 200 rpm의 교반 하에 일어났다. 100 g/ℓ의 당류 농도를 갖는 말토스 당밀을 발효기에 연속적으로 배합하고, 발효기 중 글루코스 농도가 55 g/ℓ 내지 65 g/ℓ의 값으로 증가한 후, 60 g/ℓ 내지 70 g/ℓ의 글루코스 농도를 달성하도록 하는 비율(60% 내지 70% 전환율)로 가수분해된 배지를 제거하였다. 고정화물의 비활성은 1500시간 동안 연속적으로 수행되는 상기 가수분해 방식에서 0.55 g/g.h-1 내지 0.6 g/g.h-1 (시간 당 고정화물의 g 당, 생성된 글루코스의 g)였다.
실시예 22
상기 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조된 고정화물을 사용하였다. 195 g/ℓ의 당류 농도를 갖는 말토스 당밀, 효모 추출액 5 g/ℓ, (NH4)2SO4 1 g/ℓ, MgSO4×7H2O 0.5 g/ℓ, KH2PO4 1 g/ℓ이 모두 증류수에 용해되어 있는 조성을 갖는 배지(pH=4.5)를 사용하였다. 고정화된 글루코아밀라제를 갖는 고정화제 50 g을 상기와 같이 제조된 무균 배지 1 ℓ에 첨가하였다. 이어서, 현탁액을 미생물의 지수 성장 기간 중 10 체적% 자이모모나스 모빌리스 접종액으로 접종하였다. 초기 글루코스의 이용 및 미생물에 의한 에탄올 생산이 동시에 가수분해 공정에서 일어났다. 에탄올 70 g/ℓ이 13.5시간 후 이 방식으로 생성되었다.
실시예 23
상기 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조된 고정화물을 사용하였다. 80 g의 당류 함량을 갖는 말토스 당밀, 효모 추출액 10 g, (NH4)2HPO4 1 g, MgSO4×7H2O 0.2 g, MnSO4×4H2O 0.05 g, FeSO4×7H2O 0.01 g이 모두 증류수 1 ℓ에 용해되어 있는 조성을 갖는 배지를 전환에 사용하였다. 고정화된 글루코아밀라제를 갖는 고정화물 50 g을 상기와 같이 제조된 무균 배지 1 ℓ에 첨가하였다. 현탁액을 5 체적% 바실러스 코아굴란스 포자 현탁액으로 접종하였다. 초기 글루코스의 이용 및 미생물에 의한 락트산 생산이 동시에 가수분해 공정에서 일어났다. 24시간 동안의 발효 후, 배지 중 락트산 55.2 g/ℓ 및 글루코스 1.2 g/ℓ이 있다.
D-갈락토스, D-글루코스 및 갈락토올리고당류의 제조에 있어, 폴리비닐 알코올 겔 내로 캡슐화된 β-갈락토시다제에 의한 락토스 용액의 가수분해에서의 상기 언급된 담체의 생산 및 사용 방법이 하기 실시예에서 예시될 것이다.
실시예 24
PVA(폴리비닐 알코올) 100 g, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 60 g, 증류수 790 g을 함유하는 PVA 용액을 제조하였다. 락토자임(노보자임스) 효소 제제 50 ㎖를 상기와 같이 제조된 용액에 첨가하였다. 이와 같이 제조된 PVA 용액 내 효소 혼합물을 경질 플레이트 위에 적하한 후, 80℃ 내지 15℃의 온도 구배에서 건조 공기의 스트림 중에서 가교결합하고 형상화하였다. 이어서, 표면 대 부피의 비율이 최소 7 ㎜-1인 고정화물을 10 내지 120분 동안 인삼칼륨 완충 용액(pH=6.5)에 옮겼다. 제조된 고정화물은 4℃의 온도에서 에탄올 5% 내지 10%의 첨가로 인산염 완충 용액(pH=6.5) 중에 저장될 수 있다.
이러한 방식으로 제조된 고정화 효소는 900±100 U.㎝-3의 초기 활성을 가졌다.
실시예 25
상기 실시예 24에 기재된 것과 같이 제조한 고정화물을 사용하였다. 2 mM MgCl2이 첨가된, pH=6.5의 0.1 M 인산염 완충액 중 락토스 용액을 가수분해에 사용하였다. 고정화 β-갈락토시다제 130 g을 100 g/ℓ의 락토스 농도를 갖는, 상기와 같이 제조된 용액 1000 ㎖에 첨가하였다. 가수분해는 30℃의 온도에서 영구적 교반(200 rpm) 하에, 회분 방식으로 일어났다. 가수분해 후에 유체상을 제거하고, 고정화 β-갈락토시다제를 상기 언급된 절차에서 반복 회분식 가수분해에 사용하였다. 배지는 210분 동안의 가수분해 후에 락토스 13 g/ℓ 내지 2 g/ℓ를 함유하였다.
실시예 26
상기 실시예 24에 기재된 바와 같이 제조된 고정화물을 사용하였다. 2 mM MgCl2이 첨가된, pH=6.5의 0.1 M 인산염 완충액 중 락토스 용액을 가수분해에 사용하였다. 786 U.㎝-3의 초기 활성을 갖는 고정화된 β-갈락토시다제 130 g을 100 g/ℓ의 락토스 농도를 갖는 상기와 같이 제조된 용액 1000 ㎖에 첨가하였다. 가수분해는 30℃의 온도에서 연속 교반(200 rpm) 하에 회분 방식으로 일어났다. 전환 기간은 일정하였다. 5% 내지 10%의 고정화제 활성 감소가, 일반적으로 160시간 동안 지속된 25회 회분식 가수분해 후 관찰되었다.
상기 실시예에 언급된, 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물의 제조를 위한 캐스팅 장치의 배열이 이하에 설명될 것이다. 하기 설명은 본 발명의 적용의 원리를 단지 예시하는 것임이 명백하다.
도 1은 연속적인 산업적 생산을 위한 조정에 있어, 폴리비닐 알코올 담체 기 재의 고정화물의 생산을 위한 캐스팅 장치의 본 구조 양태를 나타낸다. 구조 양태는, 2열의 캐스팅 주입기가 장착되고, 압력 조절(pressure tempered) 탱크(15) 및 압축기 또는 압력 공기 저장소(16)에 연결된 적하 캐스팅 2열 헤드(들)(17)에 의해 형성된 상부 건조 채널(2)의 전면에 위치한 적하 캐스팅 조립체를 포함한다. 구동 조절되는 연속 컨베이어 벨트(1)가 내부에 이동하는 상부 건조 채널(2)에는, 건조 시스템[건조 공기의 공급원(4)이 있어, 이로부터 제습된 공기가 제1 보조 통풍기(19)를 통해, 일체화된 가열 소자(5)를 갖는 공기 분배 시스템(6)으로 운반되어 몇몇 지점에서 상부 건조 채널(2)로 이동함]이 장착되어 있다. 연속식 컨베이어 벨트(1)는, 상부 건조 채널을 떠난 후, 재팽윤 탱크(7), 및 대향하여 (캐스팅 장치의 바닥면에) 위치한 최종 건조 채널(3)을 통과하는데, 캐스팅 장치의 한쪽에는 헹굼 상자(13)를 떠난 후 컨베이어 벨트 최종 건조에 사용되는 상부 건조 채널로부터의 건조 공기의 이동을 위해 제2 보조 통풍기(20)을 갖춘 파이프라인이 이어지고, 캐스팅 장치의 다른 쪽으로부터는 습윤 폐공기의 출구(18)가 나온다. 일체화된 고압 펌프(10) 및 저압 펌프(11)을 갖는 파이프라인에 의해, 냉각이 구비되고, 재팽윤 수집 염 용액(24)을 함유하는 수집 저장소(8)와 연결된, 기계적 와이핑 및 고압 헹굼의 원리로 설계된 와이핑가능한 수집 장치(9), 및 탈이온수를 함유하는 헹굼 탱크(12)와 파이프라인에 의해 연결된 저압 펌프(14)에 연결된 제트에 의해 연속식 컨베이어 벨트(1)의 세정을 위한 헹굼 상자(13)가, 재팽윤 염 용액(24)를 갖는 재팽윤 탱크(7), 및 최종 건조 채널(3) 사이에서 일체화된다.
폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물의 생산 장치의 기능은 다음과 같다: 폴리비닐 알코올 겔 및 생물학적 물질의 혼합물이, 상이한 주파수 및 펄스 길이의 전자석에 의해 진동하는 직경 0.1 내지 2.0 ㎜의 2열의 캐스팅 니들이 장착된 2개의 캐스팅 헤드(17)에 의해 형성된 적하 캐스팅 조립체로부터, 상부 건조 채널(2)를 통해 이동하는 구동 조절되는 연속식 컨베이어 벨트(1) 상으로 전달되거나 주입된다. 적하 캐스팅을 위한 혼합물은, 압축기 또는 압력 공기 탱크(16)에 연결된 압력 조절 탱크(15)로 배합된다. 컨베이어 벨트(1) 상의 혼합물 건조는, 상부 건조 채널의 온도 구배를 조절하며 상부 건조 채널(2)의 각 구획으로 이어지는 공기 조절 분배 파이프라인(6)에 놓인 가열 소자(5) 및 제1 보조 통풍기(19) 상으로 이동하는 연속적인 대기 제습제(4)로부터 수득한 습기-물 공기의 유리에 의해 고정된다. 이어서, 연속식 컨베이어 벨트(1) 상에 부착되어 고착된 건조 혼합물은, 재팽윤 염 용액을 갖는 재팽윤 탱크(7)를 통해 이동하고, 이후 생성물, 즉 폴리비닐 알코올 담체 기재의 고정화물이 와이핑가능한 수집 장치(9)에서 탈착된다. 이 장치에는 고압 펌프(10) 및 제트에 의해 형성된 고압 수 공급을 위한 시스템이 장착되어 있으며, 상기 시스템은 독립적인 회로에 연결된다. 컨베이어 벨트로부터의 생성물 탈착은 중합체 와이핑가능한 블레이드 및 고압 펌프(10)에 의해 공급된 수성 염 용액에 의한 제트에 의해 일어난다. 컨베이어 벨트(1)은 헹굼 상자(13) 및 저압 펌프(14)에 배치된 제트에 의해 최종적으로 처리되며, 헹굼 탈이온수는 헹굼 상자(13)로부터 흘러 들어가게 되는 헹굼 탱크(12)에서 수집된다. 컨베이어 벨트 헹굼을 위한 저압 수 운반 시스템이 독립적인 회로에 연결된다. 이어서, 습윤 컨베이어 벨트(1)는, 건조 공기가 상부 건조 채널로부터 파이프라인을 통해 송풍되어, 제2 보조 통풍기(20)가 장착된 건조 공기 채널(3)에서 최종 건조되는 한편, 습윤 폐공기는 습윤 폐공기 배출구(18)을 통해 하부 건조 채널(3)로부터 배출된다.
도 2는 재팽윤 탱크의 구성을 나타낸다. 본 양태에서 재팽윤 탱크(7)는 비스듬한 바닥을 갖는 탱크(21)로 구성되며, 최하단 지점에는 출구 밸브(22)가 생성물 및 재팽윤 염 용액을 내보내기 위해 배치된다. 탱크(21)를 가득 채운 재팽윤 염 수용액(24)으로의 컨베이어 벨트 함침을 동시에 구체화하는 한 쌍의 리딩 인장 롤러(23)에 의해 주도되는 컨베이어 벨트(1)가 탱크(21)을 통해 이동한다.
도 3은 와이핑가능한 수집 장치(9)의 구성을 나타낸다. 본 양태에서 와이핑가능한 수집 장치(9)는, 기계적 중합체 와이퍼가 스프링 압력 조립체(28)를 갖는 스테인레스 압력 조립체(27) 상에 위치하고 있는 측면 프레임(25)으로 이루어진다. 상기 스프링 압력 조립체(28)는, 그 위에 스프링 (35)가 배치된, 세정기를 갖는 추력 제어 스크류(34)에 의해 형성된다. 와이핑가능한 수집 장치(9)는, 45° 내지 80°의 각으로 헹굼을 가능하게 하는 프레임(25)에 고정된 지지 스테인레스 파이프 분배 시스템 상에 결합된 고압 제트(26)에 의해 추가로 형성된다. 스테인레스 파이프 분배 시스템(30)에는 조절 스크류(31)에 의해 고정된 고도 제어가 구비된다. 상부 프레임(33)에 고정된 중합체 브러쉬(32)를 갖는 하부 및 상부 와이퍼(29)는, 컨베이어 벨트(1)가 이들 와이퍼 사이로 이동하는 동안, 컨베이어 벨트의 내부 면의 세정을 위해, 기계적 와이퍼(27) 뒤에 이의 내부 및 외부 면 상에 견고히 위치한다. 컨베이어 벨트에는 프레임(25)의 출구 지점에 컨베이어 벨트(1)의 내부 및 외부 면의 최종 처리를 위해 하부 및 상부 중합체 와이퍼(29)가 장착된다.
와이핑 수집 장치(9) 기능은, 재팽윤 탱크(7) 뒤의 생산 라인에 비치되며, 이로부터 컨베이어 벨트(1)가 장치의 하부 구획으로부터, 따라서 반대 방향으로 이미 이동한다. 컨베이어 벨트(1) 상으로 상부 장치 구획에서 적용된 생성물이 수직 방향으로 이제 거꾸로 된다는 것이 명백하다. 컨베이어 벨트로부터 그것을 제거하는 방법은, 기계적 와이퍼(27) 및 고압 제트(26)가 컨베이어 벨트(1)의 외부면에 접착된 생성물과 협력하여 영향을 준다는 사실에 기초한다. 컨베이어 벨트(1) 상의 생성물은, 고압 헹굼으로 우선 이끌어지는데, 이는 스프링 압력 메커니즘(28)을 갖는 기계적 와이퍼(27)에 대해 40° 내지 80°의 각에서 작동하는 압력 제트(26)에 의해 운반된 염 수용액의 압력 분배 시스템에 의해 보장되고, 컨베이어 벨트(1)에 대한 그 기울기는 5° 내지 15° 범위에서 또한 조절가능하다. 이의 내부 및 외부 면 상에서 컨베이어 벨트(1)를 동시에 최종 처리하는 중합체 브러쉬를 갖는 하부 및 상부의 견고히 고정된 와이퍼(29)가, 스테인레스 압력 조립체(28) 상의 스프링 기계적 중합체 와이퍼(27) 뒤에 탑재된다. 컨베이어 벨트(1)는 하부 및 상부 중합체 와이퍼(29) 상의 프레임(25)에서 나오며, 이에 의해 양 면에서 최종 처리된다.
도 4는 헹굼 상자(13)의 구조를 나타낸다. 본 양태에서, 헹굼 상자(13)는 컨베이어 벨트(1)가 그 사이로 이동하는, 서로 연결된, 뚜껑(43)을 갖는 상부 부분(36) 및 출구(38)를 갖는 하부 부분(37)으로 형성되는 한편, 이들 부분들은 캐스팅 기계 프레임(39)에 연결된다. 또한, 헹굼 물 공급 파이프(41)에 연결된 상부 헹굼 제트(40)가 상부 부분(36)에 탑재되며, 이와 동일한 방식으로 공급 파이 프(41)에 연결된 하부 헹굼 제트(42)가 하부 구획(37)에 탑재되어 있다. 조정가능한 중합체 와이퍼(44)가 컨베이어 벨트로부터 물을 와이핑하기 위해 상부 구획(36)의 양 면에 고정되며, 이와 동일한 방식으로 와이퍼(45)가 하부 부분(37)의 양 면에 고정된다. 헹굼 상자(13)는 상부 및 하부 조립 세그먼트(46 및 47)에 의해 캐스팅 기계 프레임(39)에 고정된다.
본 발명은 식품 산업, 제약 및 폐수 처리에서, 특히 음용수, 공급수 및 폐수(폐수, 농업용수, 도시쓰레기, 산업용 폐수)로부터의 질소 화합물의 생물학적 제거(여기에서, 존재하는 다양한 질소 화합물들은 질화 및 탈질화 세균의 생리학적 활성에 의해 기체상 질소로 전환됨)에서, 또한 락트산, 에탄올, 글루코스 및 글루코스-프룩토스 당밀의 제조 공정에, D-갈락토스로의 락토스 가수분해에 및 갈락토올리고당류의 제조에 적용하기 위한 고정화물의 생산에 사용될 수 있다. 이들 모두는 시간(hr) 당 렌티캣츠(LentiKats)(상표명)의 고정화물 1 ㎏ 내지 10 ㎏의 용량의 연속적인 산업적 생산을 제공하는 장치에 의해 생산된다.
식품 산업, 제약 용도 및 폐수 처리를 위한 고정화물의 제조 장치는 연속적 생산에 사용될 수 있다.
관련 부호의 목록
1 - 구동 조절되는 컨베이어 벨트
2 - 상부 건조 채널
3 - 하부 건조 채널
4 - 건조 공기 공급원 - 연속적 흡착 제습제
5 - 공기 파이프라인 상의 가열 소자
6 - 건조 공기 분배 시스템
7 - 생산 캐스팅 장치의 하부 구획의 재팽윤 탱크
8 - 냉각을 수반하는 수집 저장소
9 - 수집 고압 장치
10 - 고압 펌프
11 - 운반 저압 펌프
12 - 헹굼 탱크
13 - 헹굼 상자
14 - 헹굼 저압 펌프
15 - 압력 조절되는 10 ℓ 내지 12 ℓ 탱크
16 - 압축기
17 - 캐스팅 적하 헤드
18 - 습윤 폐공기의 배출구
19 - 제1 통풍기
20 - 제2 통풍기
21 - 탱크
22 - 탈출 코크
23 - 인장 롤러
24 - 재팽윤 염 용액
25 - 측면 프레임
26 - 제트
27 - 기계적 와이퍼
28 - 압력 스프링 메커니즘
29 - 상부, 하부 와이퍼
30 - 분배 파이프
31 - 조정 스크류
32 - 브러쉬
33 - 상부 보호 프레임
34 - 추력 제어 스크류
35 - 스프링
36 - 상자의 상부 구획
37 - 상자의 하부 구획
38 - 배출구
39 - 캐스팅 기계 프레임
40 - 상부 헹굼 제트
41 - 공급 파이프
42 - 하부 헹굼 제트
43 - 뚜껑
44 - 조정가능한 와이퍼
45 - 와이퍼
46 - 상부 조립 세그먼트
47 - 하부 조립 세그먼트
Claims (17)
- 연속식 컨베이어 벨트;컨베이어 벨트가 통과하는 상부 건조 채널의 전면에 위치되는, 생체촉매를 함유하는 혼합물을 컨베이어 벨트에 적용하기 위해 컨베이어 벨트 상에 탑재된 캐스팅 메커니즘;고정화된 생체촉매를 함유하는 컨베이어 벨트가 통과하는, 상부 건조 채널 이후의 재팽윤 탱크;컨베이어 벨트가 통과하여 컨베이어 벨트로부터 고정화된 생체촉매를 제거 및 수집하는, 재팽윤 탱크 이후의 와이핑 및 수집 장치;컨베이어 벨트가 통과하여 고정화된 생체촉매의 제거 이후에 컨베이어 벨트를 세정하는, 와이핑 및 수집 장치 이후의 헹굼 상자; 및컨베이어 벨트가 통과하여 컨베이어 벨트를 건조시키는, 헹굼 상자 이후의 하부 건조 채널을 포함하며, 여기서 캐스팅 메커니즘은 2열의 캐스팅 니들 주입기를 갖는 하나 이상의 캐스팅 헤드를 포함하며, 이를 통해 혼합물이 압력 조절 탱크 및 압축기에 의해 컨베이어 벨트로 공급되며, 상부 건조 채널은 건조 공기를 컨베이어 벨트 상의 혼합물에 전달하여 혼합물을 건조시키고 생체촉매를 고정화하도록 배치되며, 건조 공기는 가열 소자가 포함된 공기 분배 시스템으로 통풍기를 통해 상부 건조 채널로 송풍되며, 와이핑 및 수집 장치는 기계적 와이퍼 및 고압 헹굼기를 포함하며, 고압 헹굼기는 일체화된 고압 펌프 및 저압 펌프를 갖는 각각의 파이프라인에 연결되며, 기계적 와이퍼는 냉각 가능한 수집 저장소에 연결되며, 여기서 고정화된 생체촉매가 수집되며, 헹굼 상자는 저압 펌프에 연결된 제트를 포함하며, 이는 각각의 파이프라인에 의해 헹굼 탱크에 연결되는 것인, 고정화된 생체촉매의 생산을 위한 산업용 생산 장치.
- 제1항에 있어서, 와이핑 및 수집 장치는 고정화된 생체촉매를 함유하는 컨베이어 벨트가 통과하는 프레임을 포함하며, 기계적 와이퍼는 스프링 압력 메커니즘에 의해 프레임에 고정되며, 고압 헹굼기는 프레임에 고정되어 45° 내지 80°의 각으로 헹굼을 가능하게 하는 고압 제트를 포함하고, 여기서 기계적 와이퍼 및 고압 헹굼기는 고정화된 생체촉매를 함유하는 컨베이어 벨트가 고압 헹굼기를 통과하고, 이후 기계적 와이퍼를 통과하도록 하는 위치에서 프레임에 고정되어, 기계적 와이퍼 및 고압 헹굼기가 협력하여 고정화된 생체촉매를 컨베이어 벨트부터 제거하는 기능을 하며, 기계적 와이퍼 이후에, 프레임은 추가로 브러시를 갖는 고정된 하부 와이퍼 및 상부 와이퍼를 포함하며, 컨베이어 벨트가 프레임으로부터 나올 때 컨베이어 벨트의 내부 및 외부의 최종 세정을 위하여 이 사이를 컨베이어 벨트가 통과하는 것인, 산업용 생산 장치.
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