CN107446909A - 一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产l‑赖氨酸的方法 - Google Patents

一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产l‑赖氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌的固定化方法，包括将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和MOPS的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。本发明还公开了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L‑赖氨酸的方法，包括发酵过程和补料过程，所述补料过程使用的营养成分为葡萄糖和硫酸铵。MOPS可以增强大肠杆菌在固定化材料表面的粘附效果；利用本发明的固定化大肠杆菌发酵L‑赖氨酸，L‑赖氨酸浓度由游离细胞发酵的90g/L提高至136g/L，重复发酵8批次仍能保持较高的L‑赖氨酸生产效率，平均每个批次最终L‑赖氨酸产量150g/L。

Description

一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵 生产L-赖氨酸的方法
技术领域
本发明涉及利用固定化细菌发酵生产L-赖氨酸，具体涉及一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法。
背景技术
L-赖氨酸(Lysine)是脂肪族碱性氨基酸一种，化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋)三种旋学异构体，人类和动物可吸收利用的只有L-型。L-赖氨酸是人和动物生长发育所需的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。
L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS(Dutch State Mijinen)法和日本的东丽法，合成法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。1960年，日本首先采用微生物发酵法生产，微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。
近年来，随着我国赖氨酸产量的高速增长，目前已成为世界最大的赖氨酸生产国。随着L-赖氨酸的应用价值不断被发现和拓宽,一方面通过菌种的筛选和分子育种不断发掘新的菌种和改良现有的菌种，另一方面工业化生产的方法也不断地改善和更新。发酵工艺上也主要是通过连续补料实现单批次的高产量，对于使用固定化技术进行连续多批次发酵鲜有报道。目前，应用于大肠杆菌的固定方法主要是凝胶包埋法，但包埋法所用到的凝胶颗粒机械性能差、对细胞毒性作用大，而且材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中杂菌污染严重等问题大大限制了此法应用于大肠杆菌耗氧发酵生产L-赖氨酸。吸附法又称载体结合法,是利用带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力等作用,而使细胞固定在载体表面和内部的方法。该方法操作简单、成本较低，但所固定的大肠杆菌数目受所用载体种类及其表面积的限制。因为大肠杆菌与载体材料作用力小易脱落的缺点很少有人采用吸附法作为大肠杆菌的固定方法。
发明内容
发明目的：为了解决大肠杆菌和载体材料表面作用力弱、粘附力低和吸附固定化效果差，本发明提供了一种大肠杆菌的固定化方法；为了解决发酵底物葡萄糖对大肠杆菌生产L-赖氨酸的抑制效应，本发明还提供了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法。
技术方案：本发明所述一种大肠杆菌的固定化方法，包括将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和3-吗啉丙磺酸的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。
所述3-吗啉丙磺酸简写为MOPS。
大肠杆菌的活化步骤如下：用无菌生理盐水洗下斜面保藏的大肠杆菌得到菌悬液，按照体积分数1％～5％的接种量将菌悬液接入含有30～100ml种子培养基的500ml三角瓶中进行培养，培养温度30～42℃，摇床转速150～250r/min，培养时间15～25h，使得培养液的OD值达到5。
所述种子培养基的配方如下：蔗糖1～5g/L、蛋白胨1～6g/L、硫酸铵1～3g/L、酵母提取物1～4g/L、磷酸氢二钾0.2～0.6g/L、硫酸镁0.1～1g/L、硫酸亚铁0.01～0.1g/L、硫酸锰0.05～0.1g/L，溶剂为水，pH 6.8～7.2。
按照体积比为5～10％将所述活化的大肠杆菌接入所述培养基。
所述培养基的配方如下：葡萄糖10～50g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水，所述培养基体积占所述容器体积的40％～60％。
所述多孔网状材料包括棉纤维、木浆棉、合成海绵、聚酯纤维、细菌纤维素膜、生物过滤棉、丝瓜瓤或木屑，所述预处理包括将多孔网状材料裁剪成1～10cm3的方块，置于体积分数为50％～90％的乙醇水溶液中室温浸泡1～3h，然后用水清洗3～5次；所述多孔网状材料与所述培养基的比例为3～15g:1L。
优选地，所述多孔网状材料包括合成海绵或丝瓜瓤；最优选地，所述多孔网状材料为合成海绵；所述多孔网状材料与所述培养基的比例为9～12g:1L
所述3-吗啉丙磺酸与所述培养基的比例为50～150mM:1L。
优选地，所述3-吗啉丙磺酸与所述培养基的比例为100～125mM:1L。
所述固定化培养的温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌速率为100～1000rpm，溶解氧DO≥25％，培养时间为15～25h；保持pH6.0～7.5使用氨水调控。
优选地，所述固定化培养的温度为35～37℃，pH为6.5。
本发明还提供了一种利用上述固定化方法制备得到的固定化大肠杆菌。
本发明还提供了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法，包括发酵过程和补料过程，所述补料过程使用的营养成分为葡萄糖和硫酸铵。
所述发酵过程包括将含有固定化大肠杆菌的培养基离心除去上清液，补充与培养基等体积的发酵培养基。
所述发酵过程使用的培养基配方如下：葡萄糖10～50g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸铜0.01～1g/L、硫酸锌0.01～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水。
所述补料过程包括当所述发酵过程中葡萄糖浓度低于15g/L时，流加500g/L～800g/L的葡萄糖水溶液，控制发酵体系的葡萄糖的浓度为2～20g/L，当所述发酵过程中氨氮浓度低于8g/L时，流加300g/L～600g/L硫酸铵水溶液，控制发酵体系的氨氮的浓度为1～10g/L，所述氨氮包括游离氨和铵根离子。
所述发酵过程的发酵温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌速率为100～1000rpm，溶解氧DO≥25％，发酵时间为40～50h，保持pH6.0～7.5使用氨水调控。
优选地，所述发酵过程的发酵温度为35℃，pH为6.5。
所述的固定化容器和所述发酵过程中使用的发酵罐为搅拌式发酵罐，带有温度、溶氧、pH检测系统，可实现自动控制；同时带有补料系统，满足发酵过程中碳源、氮源的连续补料。
L-赖氨酸的单批次发酵生产结束后，将发酵罐内的发酵液全部移除，重新替换新鲜的发酵培养基，利用原始已固定化的大肠杆菌，重复单批次发酵生产L-赖氨酸的条件，如此循环，利用吸附于固定化材料上的大肠杆菌即可实现L-赖氨酸的多批次固定化发酵生产。
需要说明的是：游离大肠杆菌和固定化大肠杆菌生长量测定使用紫外分光光度计法，在波长600nm处以水对空白对照检测发酵液吸光值；葡萄糖的测定方法使用SBA-40E型生物传感仪；L-赖氨酸的测定方法使用SBA-40E型生物传感仪；氨氮的测定方法使用凯氏定氮法。
有益效果：与现有技术相比，本发明优势如下：
(1)大肠杆菌无需包埋且固定化效果高：与传统的包埋固定化不同，吸附固定化大肠杆菌依靠自身吸附作用，吸附在多孔网状材料表面、相互聚集在一起，并被自身所分泌的胞外聚合物包裹形成一个有特定立体结构的细胞群落——生物膜；在培养基中加入MOPS，可以增强大肠杆菌在固定化材料表面的粘附效果，进一步增加菌株吸附量提高吸附效果。
(2)L-赖氨酸生产浓度高：与传统的游离细胞发酵相比，利用本发明的固定化大肠杆菌发酵L-赖氨酸可以有效提高L-赖氨酸的批次生产浓度，L-赖氨酸浓度由游离细胞发酵的90g/L，提高至150g/L，提高了66.7％。
(3)发酵工艺稳定性高：利用本发明的固定化大肠杆菌重复发酵L-赖氨酸，L-赖氨酸批次发酵稳定，重复发酵8批次仍能保持较高的L-赖氨酸生产效率，平均每个批次最终L-赖氨酸产量150g/L。
(4)L-赖氨酸生产效率高：利用本发明的固定化大肠杆菌发酵生产L-赖氨酸，菌体大量吸附于固定化载体，可以直接参与下一批次L-赖氨酸的发酵过程，不需要反复的洗罐、灭菌、接种等操作，降低生产成本。
附图说明
图1为实施例1中MOPS添加量对大肠杆菌在合成海绵表面吸附量的影响；
图2为实施例2中合成海绵添加量对大肠杆菌产L-赖氨酸的影响；
图3为实施例3、4、5中游离大肠杆菌以及合成海绵和丝瓜瓤作为固定化材料固定大肠杆菌单批次发酵生产L-赖氨酸产量对比；
图4为实施例4、5中合成海绵和丝瓜瓤作为固定化材料固定大肠杆菌多批次发酵生产L-赖氨酸产量对比；
图5为实施例1中MOPS添加量对大肠杆菌在合成海绵表面吸附量的影响。
具体实施方式
实施例1
(1)将合成海绵裁剪成1*1*1cm3小方块，置于体积分数为75％乙醇水溶液中浸泡1～3h，去离子水中清洗3～5次，之后再按照10g/L的载体添加量加入到500ml三角瓶中，三角瓶中装有预发酵培养基50ml，然后分别添加0、50、75、100、125、150mM 6个不同浓度的MOPS，每个浓度至少3个平行样，115℃，15min高温高压蒸汽灭菌；
预发酵培养基配方：葡萄糖20g/L、蛋白胨1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、酵母提取物1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸镁0.1g/L，溶剂为水，pH6.8～7.2。
(2)用无菌生理盐水洗下斜面保藏的L-赖氨酸生产菌株大肠杆菌，按照体积比10％的接种量将菌悬液接入灭好菌的摇瓶种子培养基(50mL/500mL)中进行种子活化培养，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间20～24h，OD600达到5；
摇瓶种子培养基配方：蔗糖2g/L、蛋白胨2g/L、硫酸铵2g/L、酵母提取物1g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.02g/L、硫酸锰0.07g/L，溶剂为水，pH 6.8～7.2。
(3)将活化好的大肠杆菌按照体积比10％的接种量接入步骤(1)灭好菌的摇瓶预发酵培养基中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间20～24h。
(4)培养结束取出固定化材料，测定吸附的细胞量。
具体测定方法如下：a、用无菌水冲洗载体材料，洗掉多余的发酵液和未固定到材料上的细胞；b、1％结晶紫染色材料20min；c、清水冲洗固定化材料3次；d、用80％乙醇和20％乙酸洗脱结晶紫；e、在分光光度计600nm处测步骤d中洗脱液的OD。
检测结果见图1，根据数据可以看出MOPS添加量在100～125mM左右时，大肠杆菌在材料表面的吸附量较大，相比不添加时吸附量增加了60％。
实施例2
(1)将合成海绵裁剪成1*1*1cm3小方块，置于体积分数为75％乙醇水溶液中浸泡1～3h，去离子水中清洗3～5次，之后再分别按照0、3、6、9、12、15g/L的载体添加量加入到摇瓶预发酵培养基(50ml种子培养基/500ml三角瓶)中，每个载体添加量至少3个平行样，115℃，15min高温高压蒸汽灭菌；摇瓶预发酵培养基的配方同实施例1。
(2)大肠杆菌活化培养过程同实施例1中步骤(2)。
(3)将活化好的大肠杆菌按照体积比10％的接种量接入步骤(1)灭好菌的摇瓶预发酵培养基中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间20～24h。培养结束用SBA-40E型生物传感仪检测L-赖氨酸量，检测结果见图2，根据数据可以看出在摇瓶中载体添加量在9～12g/L时，赖氨酸产量达4.5g/L，相比游离培养提高40.6％。
实施例3
(1)摇瓶种子培养：用无菌生理盐水洗下斜面保藏的L-赖氨酸生产菌株大肠杆菌，按照体积比5％的接种量将菌悬液接入含有50ml种子培养基的500ml三角瓶中进行培养，培养温度35℃，摇床转速190r/min，培养时间20～24h，摇瓶种子培养基配方同
实施例1。
(2)预发酵培养：摇瓶中培养液OD600达到5时，按照体积比5％的接种量接入提前灭好菌且装有预发酵培养基的预发酵罐中，预发酵过程控制通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌转速100～1000rpm，调节通气量和搅拌转速控制溶氧DO≥25％，温度35℃，氨水调控pH6.5，培养时间20～24h；预发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨1.5g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、酵母提取物1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸镁0.1g/L，溶剂为水。
(3)发酵：预发酵培养液OD600达到20时，按照体积比15％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中生产L-赖氨酸。发酵过程控制通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌转速100～1000rpm，调节通气量和搅拌转速控制溶氧DO≥25％，温度35℃，氨水调控pH6.5。发酵开始每隔3小时取样离线检测发酵液中葡萄糖、氨氮、L-赖氨酸浓度，当葡萄糖低于15g/L时开始流加500g/L的葡萄糖水溶液，当氨氮浓度低于8g/L时开始流加300g/L的硫酸铵水溶液，根据每3h检测的葡萄糖和氨氮浓度，计算消耗速率，根据消耗速率及时调控补料速率，连续补料控制发酵液糖浓度在2～20g/L，氨氮浓度在1～10g/L。后期停止流加使发酵结束糖浓度小于5g/L，氨氮浓度小于3g/L，发酵结果见图3，游离发酵过程赖氨酸生产速率平均2g/L/h，产率90g/L，糖酸转化率60％；
发酵培养基配方如下：葡萄糖20g/L、酵母提取物2g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、蛋白胨1g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸铜0.02g/L、硫酸锌0.02g/L、硫酸镁0.1g/L，溶剂为水；
葡萄糖消耗速率：g/L/h＝(加入糖量+初糖量-残糖量)/3h；氨氮消耗速率：g/L/h＝(加入氨氮量+初氨氮量-残氨氮量)/3h。
实施例4
步骤(1)和步骤(2)同实施例3，不同的是预发酵罐中还装有预处理过的合成海绵以及MOPS，合成海绵与所用培养基的比例为10g:1L，MOPS与所用培养基的比例为100mM:1L。
(3)固定化发酵：预发酵罐内的发酵液全部移出，替换成发酵培养基，利用预发酵已固定的大肠杆菌，发酵生产L-赖氨酸。发酵过程控制通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌转速100～1000rpm，调节通气量和搅拌转速控制溶氧DO≥25％，温度35℃，氨水调控pH6.5。发酵开始每隔3h取样离线检测发酵液中葡萄糖、氨氮、L-赖氨酸浓度，当葡萄糖低于15g/L时开始流加高浓度葡萄糖溶液，当氨氮浓度低于8g/L时开始流加高浓度硫酸铵溶液，根据耗糖耗硫酸铵速率，连续补料控制发酵液糖浓度在2～20g/L，硫酸铵浓度在1～10g/L。后期停止流加使发酵结束糖浓度小于5g/L，氨氮浓度小于3g/L，发酵结果见图3。单批次发酵刚开始固定化产酸速率低于游离，主要是因为这个阶段菌株完成固定化材料上的吸附生长，并形成生物膜，达到最大吸附量，待发酵至20h左右，菌体生长稳定，开始产L-赖氨酸，产酸速率开始增加达到4.3g/L/h，是游离发酵生产速率的2.15倍，最终L-赖氨酸产量136g/L，相比游离大肠杆菌发酵提高了51.1％，糖酸转化率(赖氨酸产量/葡萄糖消耗)达80％(w/w)，发酵培养基配方同实施例3。
(4)多批次连续发酵：在上述发酵生产结束后，将发酵罐内的发酵液全部移出，重新替换新的发酵培养基，利用原始已固定的大肠杆菌，重复单批次发酵生产L-赖氨酸的条件，如此循环，利用吸附于固定化材料上的大肠杆菌即可实现L-赖氨酸的多批次固定化发酵生产，发酵结果见图4，连续生产8批，从第四批次开始发酵工艺稳定，产酸量上升并趋于稳定，此现象主要是由生物膜的成熟性决定的，第二、三个批次由于生物膜还处于生长期，换液时固定化材料上菌体吸附量少且不稳定，产率偏低，随着发酵过程的进行，三个批次的培养后生物膜趋于成熟，菌体吸附量变多也趋于稳定，产酸量上升并趋于稳定。平均每个批次最终L-赖氨酸产量150g/L，产量相比单批次游离发酵提高了66.7％且节省前期准备工作，提高设备利用率，降低生产成本。
实施例5
方法同实施例4，不同的是固定化材料为经过预处理的丝瓜瓤，丝瓜瓤与所用培养基的比例为10g:1L。发酵结果见图3，发酵效果略低于合成海绵固定化发酵，产酸速率稳定期达4g/L/h，是游离发酵生产速率的2倍，最终L-赖氨酸产量128g/L，相比游离提高42.2％，糖酸转化率(赖氨酸产量/葡萄糖消耗)达78％(w/w)。
多次发酵结果见图4。连续生产8批，发酵现象同实施例4，从第四批次开始发酵工艺稳定，产酸量上升并趋于稳定，平均每个批次最终L-赖氨酸产量140g/L，产量相比单批次游离发酵提高55.6％且节省前期准备工作，提高设备利用率，降低生产成本。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌的固定化方法，其特征在于，将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和3-吗啉丙磺酸的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。
2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述培养基的配方如下：葡萄糖10～50g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水，所述培养基体积占所述容器体积的40％～60％。
3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述多孔网状材料包括棉纤维、木浆棉、合成海绵、聚酯纤维、细菌纤维素膜、生物过滤棉、丝瓜瓤或木屑，所述预处理包括将多孔网状材料裁剪成1～10cm3的方块，置于体积分数为50％～99％的乙醇水溶液中室温浸泡1～3h，然后用水清洗3～5次。
4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述多孔网状材料与所述培养基的比例为3～15g:1L，所述3-吗啉丙磺酸与所述培养基的比例为50～150mM:1L。
5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化培养的温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/min·L，搅拌速率为100～1000rpm，溶解氧DO≥25％，培养时间为20～24h。
6.利用权利要求1-5任一所述的固定化方法制备得到的固定化大肠杆菌。
7.利用权利要求6所述的大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，包括发酵过程和补料过程，所述补料过程补加的营养成分为葡萄糖和硫酸铵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵过程使用的培养基配方如下：葡萄糖10～50g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸铜0.01～1g/L、硫酸锌0.01～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述补料过程包括当所述发酵过程中葡萄糖浓度低于15g/L时，流加500～800g/L的葡萄糖水溶液，控制发酵体系的葡萄糖的浓度为2～20g/L；当所述发酵过程中氨氮浓度低于8g/L时，流加300～600g/L硫酸铵水溶液，控制发酵体系的氨氮的浓度为1～10g/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵过程的发酵温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/min·L，搅拌速率为100～1000rpm，溶解氧DO≥25％，发酵时间为40～50h。
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