CN113881616B - 一种细菌纤维素基生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌纤维素基生物传感器，包括细菌纤维素和表面展示纤维素结合结构域CBM的细胞，细胞通过纤维素结合结构域CBM与细菌纤维素连接。本发明的细菌纤维素基生物传感器可实现细胞在细菌纤维素基质上的高效和特异性固定，可维持细胞生物活性，增强荧光信号输出，为检测物出入提供了足够的孔隙，显著提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、基因工程、纳米材料及生物传感器领域，尤其涉及一种细菌纤维素基生物传感器及其应用。
背景技术
基于荧光检测的生物传感器在环境污染物检测、生化诊断和生物医学传感等领域发挥着重要作用。到目前为止，已公开报道多种工程菌株作为传感器，用以检测重金属、有机化合物和抗生素等在内的化学物质。但生物传感器在应用过程中需要将工程菌株固定到一个材料平台上以维持细胞生物活性和增强荧光信号输出。此外，理想的生物传感器平台还需具备足够的孔隙供检测物出入，同时最大限度减少对环境的污染。
细菌纤维素(BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina) 等中的某种微生物合成的纤维素的统称。因其具有生物相容性好、机械强度高、保水能力强和孔隙度高等特性，作为生物传感器平台具有广阔的应用潜力。BC在气体传感器、声表面波湿度传感器、电化学传感器等方面的应用非常广泛，然而用于生物传感器时，由于BC纤维间孔隙过大，细菌无法长时间持续附着，传感过程中会发生逃逸，限制了BC作为生物传感器的应用。
Kim等人(2019年)开发了基于P(HEMA-co-HAETC)水凝胶的细菌传感器，该传感器首先使用电喷雾制备P(HEMA-co-HAETC)水凝胶珠，然后通过12小时的孵育将细胞加载到水凝胶珠上，制备过程非常耗时，并且需要专业设备的使用；Drachuk等人(2017年)提出了重组细胞与BC生产菌 (Gluconacetobacter xylinus)共培养将细胞包埋在BC材料中的方法，但该方法将BC生产菌引入生物传感系统，干扰分析物的监测；此外，Yoetz Kopelman等人(2016年)提出了一种通过改性聚丙烯酰胺多孔微球形成正电荷，以增强带负电细菌对载体亲和力的固定化方法，尽管该方法被证明作为一种全细胞生物传感器是可行的，但会造成细胞与基质的非特异性结合。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种细菌纤维素基生物传感器，通过在细胞表面展示CBM作为亲和标签，增强细胞对细菌纤维素的粘附性。
本发明公开了一种细菌纤维素基生物传感器，包括细菌纤维素和表面展示纤维素结合结构域CBM的细胞，其中，纤维素结合结构域CBM为可特异性结合纤维素结晶区的纤维素结合结构域，细胞通过纤维素结合结构域 CBM与细菌纤维素连接。
进一步地，将纤维素结合结构域CBM与可表面展示的锚蛋白融合，实现纤维素结合结构域CBM的表面展示。
进一步地，纤维素结合结构域CBM为CBM2a及其它可特异性结合纤维素结晶区的纤维素结合结构域。
进一步地，编码可表面展示CBM2a的基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
5’-ATGAAGGCGACCAAACTGGTGCTGGGTGCGGTTATTCTGGGCAGCACCCT GCTGGCGGGTTGCAGCAGCAACGCGAAAATCGACCAGGGCATTAACCCGTACGTG GGTTTCGAAATGGGCTATGATTGGCTGGGTCGTATGCCGTACAAGGGTAGCGTGGA GAACGGCGCGTATAAAGCGCAGGGTGTTCAACTGACCGCGAAGCTGGGCTACCCG ATCACCGACGATCTGGACATTTATACCCGTCTGGGTGGCATGGTGTGGCGTGCGGA CACCAAGAGCAACGTTTACGGTAAAAACCACGATACCGGCGTGAGCCCGGTTTTT GCGGGTGGCGTGGAGTATGCGATCACCCCGGAAATTGCGACCCGTCTGGAGTATCA ATGGACCAACAACATCGGTGACGCGCACACCATTGGCACCCGTCCGGATAACGGTATTCCGGGCGCTAGCTCCGGTCCGGCCGGGTGCCAGGTGCTGTGGGGCGTCAACCA GTGGAACACCGGCTTCACCGCGAACGTCACCGTGAAGAACACGTCCTCCGCTCCG GTCGACGGCTGGACGCTCACGTTCAGCTTCCCGTCCGGCCAGCAGGTCACCCAGG CGTGGAGCTCGACGGTCACGCAGTCCGGCTCGGCCGTGACGGTCCGCAACGCCCC GTGGAACGGCTCGATCCCGGCGGGCGGCACCGCGCAGTTCGGCTTCAACGGCTCG CACACGGGCACCAACGCCGCGCCGACGGCGTTCTCGCTCAACGGCACGCCCTGCA CGGTCGGCCATCACCATCATCACCACTGA-3’。
进一步地，细菌纤维素可为球状、片状、杆状等不同形态，用于不同情景下的检测。
上述细菌纤维素基生物传感器的构建方法，包括以下步骤：将可在表面展示纤维素结合结构域CBM的细胞与细菌纤维素共同培养，具体地：
(1)将编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因与载体连接，转化入宿主菌，得到重组细胞；
(2)将步骤(1)得到的重组细胞接种于培养基中培养，当OD600为 0.6-0.8时加入转录诱导剂和细菌纤维素，继续培养10-12h，得到上述细菌纤维素基生物传感器。
进一步地，细胞为重组菌，以大肠杆菌为宿主，以pETDuet-tac为载体，pETDuet-tac是将pETDuet载体上的两个T7启动子替换为两个tac启动子得到的载体，位于上游的为第一tac启动子，位于下游的为第二tac启动子，pETDuet-tac上含有位于第一tac启动子下游的编码荧光蛋白的基因和位于第二tac启动子下游的编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因。
进一步地，为实现不同物质的检测，可将第一tac启动子替换为在靶化合物存在时，影响下游荧光蛋白基因转录的特定启动子。如阿拉伯糖诱导的启动子(含有阿拉伯糖启动子和AraC的核酸片段)、硝基化合物诱导的启动子或重金属诱导的启动子。
进一步地，阿拉伯糖诱导的启动子(含有阿拉伯糖启动子和AraC的核酸片段)序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
5’-TTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACG GAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAGTAGAGTT GATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCT CAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAA TCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATG CTGTGCGACGCTGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTG ACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTC CATGTGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGC GCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGC TGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTT AAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATT CGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGGAACAGCAA AATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCCCCTGACC GCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAA AATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTA AACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTC CCGCCATTCAGAGAAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTG CGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCAT TCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTAT AATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCC ATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCAT-3’。
进一步地，荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白等，如SEQ ID NO.2所示基因序列，具体为：
5’-ATGTCAAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTTGTTCCGATTCTGGTTGA ACTGGATGGTGATGTGAATGGCCATAAATTTAGCGTGTCAGGCGAAGGCGAAGGTG ATGCCACCTATGGCAAACTGACCCTGAAATTTATTTGTACCACCGGCAAACTGCCG GTTCCGTGGCCGACCTTAGTGACCACCCTGACCTATGGTGTGCAGTGTTTTAGTCG CTATCCGGATCACATGAAACAGCATGATTTTTTTAAATCTGCAATGCCGGAAGGCTA TGTGCAGGAACGCACCATTTTTTTTAAAGATGATGGTAATTATAAAACCCGCGCCGA AGTTAAATTTGAAGGTGATACCTTAGTTAATCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTT TAAAGAAGATGGCAATATTCTGGGCCATAAACTGGAATATAATTATAATAGTCATAAT GTGTATATTATGGCCGATAAACAGAAAAATGGTATTAAAGTTAATTTTAAAATTCGTC ATAATATTGAAGATGGCTCAGTGCAGTTAGCCGATCATTATCAGCAGAATACCCCGA TTGGTGATGGTCCGGTTCTGCTGCCGGATAATCATTATCTGTCTACCCAGAGCGCCC TGAGCAAAGATCCGAATGAAAAACGCGATCACATGGTTCTGCTGGAATTTGTGACC GCAGCAGGTATTACCCTGGGCATGGATGAACTGTATAAATAA-3’。
上述待测物诱导型荧光生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
(1)将编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因和编码荧光蛋白的基因与pETDuet-tac载体连接，得到载体pETDuet-tac-EGFP-CBM；其中，编码荧光蛋白的基因位于第一tac启动子的下游，编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因位于第二tac启动子的下游；
(2)以上述构建的载体pETDuet-tac-EGFP-CBM为模板，将第一tac启动子替换为待测物诱导的启动子，转化入宿主菌，按上述细菌纤维素基生物传感器的构建方法中所述方法连接细菌纤维素，得到待测物诱导型荧光生物传感器。
进一步地，在步骤(2)中，用SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物进行反向PCR扩增删除第一tac启动子。其中，上游引物和下游引物的序列具体为：
SEQ ID NO.4：5’-CAATCGATCTCGATCCTCTACG-3’；
SEQ ID NO.5：5’-TTTCACACAGGAAACAGTATC-3’。
本发明的生物传感器在检测单糖、爆炸物分子以及重金属中均有广泛应用，具体地，将本发明的生物传感器与待测溶液混合，培养3-60h后检测荧光强度，实现待测物的检测。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明通过在细胞表面展示CBM，无需对细菌纤维素(BC)底物进行任何修饰即可实现细胞在BC基质上的高效和特异性固定，向装载有全细胞的BC载体持续施加外部剪切力60h后，表面展示CBM的细胞仍能与 BC载体紧密结合。
(2)本发明采用同步展示固定策略，实现了简单、快速的全细胞装载。
(3)本发明提供的细菌纤维素(BC)基生物传感器在物质检测领域具有巨大潜力。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为SDS-PAGE图，其中，1是含有质粒pETDuet-tac-CBM2a的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)可溶蛋白，2是原始E.coli BL21(DE3)可溶蛋白；
图2为表面展示有CBM2a的重组大肠杆菌免疫荧光显微图；
图3为装载有表面展示CBM2a重组大肠杆菌的细菌纤维素(BC)载体表面形貌SEM图；
图4为检测阿拉伯糖(320mg/L)的片状和球状BC基荧光生物传感器的荧光成像图；
图5为阿拉伯糖浓度与荧光强度的关系；
图6为检测土壤中阿拉伯糖的片状和球状BC基荧光生物传感器的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规操作方法；所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
(1)利用PCR技术，将可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表面展示 CBM2a的基因SEQID NO.1插入质粒pETDuet-tac(以pETDuet为模板，将其上两个T7启动子替换为tac启动子，实验室保藏)。使用内切酶NdeI和KpnI进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。后使用T4连接酶，于16℃连接过夜，将SEQ ID NO.1和载体pETDuet-tac连接。连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR及测序验证，得到载体pETDuet-tac-CBM2a。将pETDuet-tac-CBM2a转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得含有表面展示 CBM2a的重组细胞。
(2)将木醋杆菌(Acetobacter xylinum ATCC)单菌落在50mL HS培养基(葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO42.7 g/L，柠檬酸1.5g/L)中30℃静态培养2天，制备种子液。后取5mL种子液至100 mL HS培养基中30℃静态培养15天，制备BC膜。
(3)挑取步骤(1)含有表面展示CBM2a的重组细胞E.coli BL21(DE3) 单菌落接种于5mL含有100μg/ml Amp(氨苄西林)的Luria-Bertani broth (LB)培养基中，在37℃下，200rpm震荡培养8-12h。将上述1mL菌液接种于含100mL培养基的500mL摇瓶中，37℃下，200rpm震荡培养，当 OD600达到0.6-0.8时，同时加入IPTG(终浓度为0.25mM)和BC基质(步骤2制备得到)，25℃，150rpm培养12h，获得装载有重组大肠杆菌的BC 载体。然后，用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)彻底冲洗BC载体，得到细菌纤维素(BC)基生物传感器。
(4)为了确定展示CBM2a的大肠杆菌对BC的结合能力，我们通过测量孵育BC载体的溶液的荧光强度和OD600来监测从BC载体中释放的细胞。将附载大肠杆菌的BC在4℃，50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，在旋转杂交器中培养。然后，在不同时间点从溶液中采集样品进行荧光和OD600测量。使用96孔细胞培养板在cytation 5成像仪上测定逃逸大肠杆菌的荧光强度和 OD600的时间历程。用λex＝480nm的激发光和λem＝520nm的发射光来表征细胞表达的EGFP的荧光。
结果显示，向装载有细胞的BC载体持续施加外部剪切力60h后，表面展示CBM的细胞仍能与BC载体紧密结合。
实施例2
(1)利用PCR技术，将可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表面展示特异性结合纤维素结晶区的CBM的基因插入质粒pETDuet-tac。使用内切酶NdeI和KpnI进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。后使用T4连接酶，于16℃连接过夜，将可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表面展示特异性结合纤维素结晶区的CBM的基因和载体pETDuet-tac连接。连接产物转化感受态细胞E. coli DH5α，菌落PCR及测序验证，得到载体pETDuet-tac-CBM2a。将 pETDuet-tac-CBM2a转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得含有表面展示 CBM2a的重组细胞。
(2)将木醋杆菌(Acetobacter xylinum ATCC)单菌落在50mL HS培养基 (葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO42.7g/L，柠檬酸1.5g/L)中30℃静态培养2天，制备种子液。后取10mL种子液至100mL HS培养基中30℃静态培养15天，制备BC膜。
(3)挑取步骤(1)含有表面展示特异性结合纤维素结晶区的CBM的重组细胞E.coliBL21(DE3)单菌落接种于5mL含有100μg/ml Amp的 Luria-Bertani broth(LB)培养基中，在37℃下，200rpm震荡培养8-12h。将上述1mL菌液接种于含100mL培养基的500mL摇瓶中，37℃下，200rpm 震荡培养，当OD600达到0.6-0.8时，同时加入IPTG(终浓度为0.25mM) 和BC基质(步骤2制备得到)，25℃，150rpm培养12h，获得装载有重组大肠杆菌的BC载体。然后，用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)彻底冲洗BC载体，得到细菌纤维素(BC)基生物传感器。
实施例3
(1)利用PCR技术，将可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表面展示 CBM2a的基因SEQID NO.1插入质粒pETDuet-tac(以pETDuet为模板，将其上两个T7启动子替换为tac启动子，实验室保藏)。使用内切酶NdeI 和KpnI进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。后使用T4连接酶，于16℃连接过夜，将SEQ ID NO.1和载体pETDuet-tac连接。连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR及测序验证，得到载体pETDuet-tac-CBM2a。后以pETDuet-tac-CBM2a为模板，使用NcoI和EcoRI酶切位点，重复上述酶切连接步骤将SEQ ID NO.2绿色荧光蛋白基因插入pETDuet-tac-CBM2a。连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR及测序验证，获得载体 pETDuet-tac-EGFP-CBM2a。后将pETDuet-tac-EGFP-CBM2a转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得底盘荧光细胞。
(2)将木醋杆菌(Acetobacter xylinum ATCC)单菌落在50mL HS培养基(葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO42.7g/L，柠檬酸1.5g/L)中30℃静态培养2天，制备种子液。
将10mL种子液和220mL HS培养基倒入250mL烧瓶中，30℃下150 rpm震荡培养5天，制备球状BC；将10mL种子液和100mL HS培养基倒入250mL烧瓶中，30℃下静态培养15天，制备片状BC；将10mL种子液和100mL HS培养基混合，后将混合液注入硅管，30℃下将硅管静态培养 10天，制备柱状BC。
(3)挑取步骤(1)底盘荧光细胞E.coli BL21(DE3)单菌落接种于5mL 含有100μg/ml Amp的Luria-Bertani broth(LB)培养基中，在37℃下，200rpm 震荡培养8-12h。将上述1mL菌液接种于含100mL培养基的500mL摇瓶中，37℃下，200rpm震荡培养，当OD600达到0.6-0.8时，同时加入IPTG (终浓度为0.25mM)和BC基质(步骤2制备得到)，25℃，150rpm培养12h，根据BC基质形状，分别获得装载有重组大肠杆菌的片状和球状 BC载体。然后，用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)彻底冲洗BC载体。
实施例4
以实施例1中构建载体pETDuet-tac-EGFP-CBM2a为模板，用下述引物进行反向PCR扩增，以删除含有调控绿色荧光蛋白的tac启动子(即第一 tac启动子)：
引物1：5’-CAATCGATCTCGATCCTCTACG-3’；
引物2：5’-TTTCACACAGGAAACAGTATC-3’；
此外，以质粒pCAS为模板，用下述引物进行PCR扩增，以获得如SEQ ID NO.3所示的含有ParaBAD和AraC的核酸片段：
引物3：
5’-TAGAGGATCGAGATCGATTGTTATGACAACTTGACGGCTACAT C-3’；
引物4：
5’-GATACTGTTTCCTGTGTGAAAATGGAGAAACAGTAGAGAGTT GCG-3’；
然后，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自Vazyme)将上述片段进行连接，替换载体pETDuet-tac-EGFP-CBM2a中调控绿色荧光蛋白的 tac启动子为如SEQ IDNO.3所示的含有阿拉伯糖启动子(ParaBAD)和AraC的核酸片段。连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR及测序验证，获得载体pETDuet-araBAD-EGFP-CBM2a。后将重组质粒pETDuet-araBAD-EGFP-CBM2a转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，按实施例 1所述方法与BC连接，获得L-阿拉伯糖诱导型荧光生物传感器。
实施例5
(1)利用L-阿拉伯糖诱导型荧光生物传感器检测溶液中阿拉伯糖。具体方法为：将上述制备的L-阿拉伯糖诱导型荧光生物传感器分别放入不同浓度阿拉伯糖溶液中，于室温条件下培养5h，然后测其荧光强度并进行荧光成像，实现对溶液中阿拉伯糖的检测。
阿拉伯糖溶液的制备方法为：用水逐渐稀释配置的阿拉伯糖储备液至终浓度分别为20mg/L，160mg/L和320mg/L。
(2)利用L-阿拉伯糖诱导型荧光生物传感器检测土壤中阿拉伯糖。具体方法为：将阿拉伯糖与土壤按2.4g阿拉伯糖/Kg土壤混合，制备所需土壤样品。后将荧光生物传感器放入样品中，于37℃培养24h，然后进行荧光成像，实现对溶液中阿拉伯糖的检测。
结果显示，可检测的最低浓度为15mg/L。
实施例6
(1)以实施例1中构建载体pETDuet-tac-EGFP-CBM2a为模板，替换载体pETDuet-tac-EGFP-CBM2a中调控绿色荧光蛋白的tac启动子为yqjF启动子。获得载体pETDuet-yqjF-EGFP-CBM2a。后将重组质粒 pETDuet-yqjF-EGFP-CBM2a转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，按实施例3 所述方法与BC连接，获得2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)诱导型荧光生物传感器。
(2)利用2,4-DNT诱导型荧光生物传感器检测溶液中2,4-DNT。具体方法为：将上述制备的2,4-DNT诱导型荧光生物传感器分别放入不同浓度 2,4-DNT溶液中，于室温条件下培养12h，然后测其荧光强度并进行荧光成像，实现对溶液中2,4-DNT的检测。
2,4-DNT溶液的制备方法为：用水逐渐稀释配置的2,4-DNT储备液至终浓度分别为5mg/L，10mg/L和20mg/L。
(3)利用2,4-DNT诱导型荧光生物传感器检测土壤中2,4-DNT。具体方法为：将2,4-DNT与土壤按0.24g 2,4-DNT/Kg土壤混合，制备所需土壤样品。后将荧光生物传感器放入样品中，于37℃培养24h，然后进行荧光成像，实现对溶液中2,4-DNT的检测。
结果显示，可检测的最低浓度为4mg/L。
实施例7
(1)以实施例1中构建载体pETDuet-tac-EGFP-CBM2a为模板，替换载体pETDuet-tac-EGFP-CBM2a中调控绿色荧光蛋白的tac启动子为znt启动子(包括zntA启动子和zntR核酸序列)。获得载体 pETDuet-znt-EGFP-CBM2a。后将重组质粒pETDuet-CBM2a-znt-EGFP转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，按实施例3所述方法与BC连接，获得重金属诱导型荧光生物传感器。
(2)利用重金属诱导型荧光生物传感器检测溶液中重金属。具体方法为：将上述制备的重金属诱导型荧光生物传感器分别放入不同浓度重金属溶液中，于室温条件下培养24h，然后测其荧光强度并进行荧光成像，实现对溶液中重金属的检测。
重金属溶液包括Zn2+,Cd2+和Hg2+。制备方法为：用水逐渐稀释配置的上述Zn2+储备液至终浓度分别为20mg/L，100mg/L和300mg/L；用水逐渐稀释配置的上述Cd2+储备液至终浓度分别为0.5mg/L，2.0mg/L和4.0mg/L；用水逐渐稀释配置的上述Hg2+储备液至终浓度分别为0.004mg/L，0.016 mg/L和0.06mg/L。
(3)利用重金属诱导型荧光生物传感器检测土壤中重金属。具体方法为：将重金属与土壤分别按0.3g Zn2+/Kg土壤、4mg Cd2+/Kg土壤和0.06mg Hg2+/Kg混合，制备所需土壤样品。后将荧光生物传感器放入样品中，于37 ℃培养24h，然后进行荧光成像，实现对溶液中重金属的检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种细菌纤维素基生物传感器及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
atgaaggcga ccaaactggt gctgggtgcg gttattctgg gcagcaccct gctggcgggt 60
tgcagcagca acgcgaaaat cgaccagggc attaacccgt acgtgggttt cgaaatgggc 120
tatgattggc tgggtcgtat gccgtacaag ggtagcgtgg agaacggcgc gtataaagcg 180
cagggtgttc aactgaccgc gaagctgggc tacccgatca ccgacgatct ggacatttat 240
acccgtctgg gtggcatggt gtggcgtgcg gacaccaaga gcaacgttta cggtaaaaac 300
cacgataccg gcgtgagccc ggtttttgcg ggtggcgtgg agtatgcgat caccccggaa 360
attgcgaccc gtctggagta tcaatggacc aacaacatcg gtgacgcgca caccattggc 420
acccgtccgg ataacggtat tccgggcgct agctccggtc cggccgggtg ccaggtgctg 480
tggggcgtca accagtggaa caccggcttc accgcgaacg tcaccgtgaa gaacacgtcc 540
tccgctccgg tcgacggctg gacgctcacg ttcagcttcc cgtccggcca gcaggtcacc 600
caggcgtgga gctcgacggt cacgcagtcc ggctcggccg tgacggtccg caacgccccg 660
tggaacggct cgatcccggc gggcggcacc gcgcagttcg gcttcaacgg ctcgcacacg 720
ggcaccaacg ccgcgccgac ggcgttctcg ctcaacggca cgccctgcac ggtcggccat 780
caccatcatc accactga 798
<210> 2
<211> 717
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
atgtcaaaag gcgaagaact gtttaccggc gttgttccga ttctggttga actggatggt 60
gatgtgaatg gccataaatt tagcgtgtca ggcgaaggcg aaggtgatgc cacctatggc 120
aaactgaccc tgaaatttat ttgtaccacc ggcaaactgc cggttccgtg gccgacctta 180
gtgaccaccc tgacctatgg tgtgcagtgt tttagtcgct atccggatca catgaaacag 240
catgattttt ttaaatctgc aatgccggaa ggctatgtgc aggaacgcac catttttttt 300
aaagatgatg gtaattataa aacccgcgcc gaagttaaat ttgaaggtga taccttagtt 360
aatcgtattg aactgaaagg cattgatttt aaagaagatg gcaatattct gggccataaa 420
ctggaatata attataatag tcataatgtg tatattatgg ccgataaaca gaaaaatggt 480
attaaagtta attttaaaat tcgtcataat attgaagatg gctcagtgca gttagccgat 540
cattatcagc agaatacccc gattggtgat ggtccggttc tgctgccgga taatcattat 600
ctgtctaccc agagcgccct gagcaaagat ccgaatgaaa aacgcgatca catggttctg 660
ctggaatttg tgaccgcagc aggtattacc ctgggcatgg atgaactgta taaataa 717
<210> 3
<211> 1190
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 3
ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct 60
cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaag tagagttgat cgtcaaaacc 120
aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg 180
gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag 240
atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt 300
gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg 360
tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gtgccgcagt aacaattgct caagcagatt 420
tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga tttgcccaaa 480
caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg tattggcaaa 540
tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt aaacccactg 600
gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc ctggcgggaa 660
cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca ccaccccctg 720
accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt cgataaaaaa 780
atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg cattaaacga 840
gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac tcccgccatt 900
cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg tcttttactg 960
gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt aacaaagcgg 1020
gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca gaaaagtcca 1080
cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat ccataagatt 1140
agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1190
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 4
caatcgatct cgatcctcta cg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 5
tttcacacag gaaacagtat c 21
Claims (6)
1.一种细菌纤维素基生物传感器，其特征在于：所述生物传感器包括细菌纤维素和表面展示纤维素结合结构域CBM的细胞，所述细菌纤维素来源于木醋杆菌，所述纤维素结合结构域CBM为CBM2a，编码可表面展示CBM2a的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述纤维素结合结构域CBM为可特异性结合纤维素结晶区的纤维素结合结构域，所述细胞通过纤维素结合结构域CBM与细菌纤维素连接；
所述细胞为重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌以pETDuet-tac为载体表达所述纤维素结合结构域CBM，所述pETDuet-tac是将pETDuet载体上的两个T7启动子替换为两个tac启动子得到的载体，位于上游的为第一tac启动子，位于下游的为第二tac启动子，所述pETDuet-tac上含有位于第一tac启动子下游的编码荧光蛋白的基因和位于第二tac启动子下游的编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因；
将所述第一tac启动子替换为待测物诱导的启动子，所述待测物诱导的启动子在靶化合物存在时影响下游荧光蛋白基因的转录。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于：所述待测物诱导的启动子为阿拉伯糖诱导的启动子、硝基化合物诱导的启动子或重金属诱导的启动子。
3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于：所述阿拉伯糖诱导的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求1所述的生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因和编码荧光蛋白的基因与pETDuet-tac载体连接，得到载体pETDuet-tac-EGFP-CBM；其中，编码荧光蛋白的基因位于第一tac启动子的下游，编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因位于第二tac启动子的下游；编码可表面展示纤维素结合结构域CBM的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）以上述载体pETDuet-tac-EGFP-CBM为模板，将第一tac启动子替换为待测物诱导的启动子，转化入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌与来源于木醋杆菌的细菌纤维素共同培养，得到所述生物传感器。
5.权利要求1-3任一项所述的生物传感器在检测单糖、爆炸物分子、重金属中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的生物传感器检测时包括以下步骤：将权利要求1-3任一项所述的生物传感器与待测溶液混合，培养3-60 h后检测荧光强度，实现对待测物的检测。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624537A (en) * | 1994-09-20 | 1997-04-29 | The University Of British Columbia - University-Industry Liaison Office | Biosensor and interface membrane |
| CN102174532A (zh) * | 2011-01-19 | 2011-09-07 | 中国科学技术大学 | 家族3纤维素结合域在真核生物中作为重组蛋白质表达和纯化的亲和标签的应用 |
| CN105492612A (zh) * | 2013-07-02 | 2016-04-13 | 韩国生命工学研究院 | 重组纤维素糖化酶混合物和重组酵母复合菌株及其用途 |
| GB201708484D0 (en) * | 2016-05-27 | 2017-07-12 | Customem Ltd | Production of functionalised composite cellulose nanomaterials |
| CN107446909A (zh) * | 2017-09-29 | 2017-12-08 | 南京工业大学 | 一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产l‑赖氨酸的方法 |
| CN107741413A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-02-27 | 大连工业大学 | 一种预测纤维素结晶度的方法 |
| CN111139258A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-12 | 义乌市颂健生物科技有限公司 | 一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒 |
| CN111304232A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-06-19 | 温州医科大学 | 基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用 |
| WO2021035115A2 (en) * | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Growing programmable enzyme-functionalized and sense-and-response bacterial cellulose living materials with engineered microbial co-cultures |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101688232A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-03-31 | 实验室基因组有限公司 | 定量氨基酸的生物芯片及使用该芯片分析氨基酸的方法 |
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| JP2019162036A (ja) * | 2016-08-05 | 2019-09-26 | 味の素株式会社 | ヘミセルラーゼ |
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Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624537A (en) * | 1994-09-20 | 1997-04-29 | The University Of British Columbia - University-Industry Liaison Office | Biosensor and interface membrane |
| CN102174532A (zh) * | 2011-01-19 | 2011-09-07 | 中国科学技术大学 | 家族3纤维素结合域在真核生物中作为重组蛋白质表达和纯化的亲和标签的应用 |
| CN105492612A (zh) * | 2013-07-02 | 2016-04-13 | 韩国生命工学研究院 | 重组纤维素糖化酶混合物和重组酵母复合菌株及其用途 |
| GB201708484D0 (en) * | 2016-05-27 | 2017-07-12 | Customem Ltd | Production of functionalised composite cellulose nanomaterials |
| CN107446909A (zh) * | 2017-09-29 | 2017-12-08 | 南京工业大学 | 一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产l‑赖氨酸的方法 |
| CN107741413A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-02-27 | 大连工业大学 | 一种预测纤维素结晶度的方法 |
| WO2021035115A2 (en) * | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Growing programmable enzyme-functionalized and sense-and-response bacterial cellulose living materials with engineered microbial co-cultures |
| CN111139258A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-12 | 义乌市颂健生物科技有限公司 | 一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Clostridium thermocellum;Liat Bahari 等;《Journa of Industrial Microbiology and Biotechnology》;20100906;第38卷(第7期);第825-832页 * |
| 纤维素结合域的研究进展;欧阳嘉等;《生物加工过程》;20080315(第02期);第11页右栏、第12页右栏、13-14页、表1 * |
| 纳米纤维素研究及应用进展Ⅱ;范子千 等;《高分子通报》;20100315;第40-60页 * |
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