CN106896093B

CN106896093B - 一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法

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Publication number: CN106896093B
Application number: CN201710115976.7A
Authority: CN
Inventors: 何海伦; 黄嘉丰; 吴日帮; 马昌杯; 刘丹; 张姜; 廖斌强
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2017-03-01
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2037-03-01
Also published as: CN106896093A

Abstract

本发明提供了一种利用疏水荧光探针ANS检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的方法，属于生物技术领域。该方法利用线性生物大分子底物与蛋白质结构域的相互作用，来封闭蛋白质结构域表面的疏水区域，从而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，造成荧光强度降低。该方法可应用于蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的定性定量分析，为研究线性生物大分子与蛋白质结构域相互作用提供新的实验思路及技术手段。

Description

一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法

技术领域

本发明涉及一种利用疏水荧光探针ANS检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的方法，属于生物技术领域。

背景技术

生物大分子是指自然界中存在于生物体内的大分子分子物质，一般以线性大分子状态存在，如胶原蛋白、弹性蛋白、淀粉、纤维素等。生物大分子及其衍生物是一类重要的生命物质，协助机体多种的生理生化功能的实现。生物大分子材料目前已广泛应用于生物医学、材料科学等领域，并应用于治疗、修复或替换生物体受损的组织或器官，增进或恢复其功能。为了使生物大分子更好的应用于生物材料，可以通过化学或是物理方法，采用复合、交联等手段处理大分子，虽然改善了材料的性能，但通过化学处理或交联后会出现力学强度降低、降解速度变快、免疫原性增强、毒性变大等一系列问题。为获得更理想的生物材料，必须开发新的制备方法或寻求新的具有特殊功能的功能蛋白或蛋白质结构域，来对生物大分子进行加工。

目前已经发现很多蛋白质结构域具有定向吸附、膨胀生物大分子的功能，如PPC结构域、PKD结构域、CBD结构域等等。可利用它们的不同特性对生物大分子进行有针对性的改造。这些结构域具有的共同特点是表面具有疏水区域，且结构多为β片层结构。蛋白质结构域表面疏水性对决定其空间构象，保持自身稳定性以及行使生物学活性有着重要的作用。疏水区域可以帮助蛋白质结构域与其他生物分子之间实现相互作用。目前发现的许多可与线性生物大分子相互作用的蛋白质结构域多具有疏水特性。要想定性定量的分析不同蛋白质结构域与线性生物大分子材料之间的相互作用，就需要有高效和准确的检测方法。然而，目前研究蛋白质相互作用的常用实验方法主要有酵母双杂交系统、亲和层析、免疫共沉淀、Pull-down、双分子荧光互补、表面等离子共振分析等。这些方法要么步骤比较繁琐，结果不稳定，要么检测成本较高，适用范围较窄。因此，急需一种快速、高通量、灵敏稳定的检测方法，来测定蛋白质结构域与线性生物大分子之间的相互作用。

8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐(Ammonium 8-Anilino-1-naphthalenesulfonate, ANS)是一种常见的蛋白质疏水区域荧光探针。1965年，Stryer报道了ANS与脱辅基蛋白质及血晶素的疏水区域结合后荧光量子产率显著增大的现象，提出利用ANS作为荧光探针用于研究蛋白质的疏水区域。目前ANS已被广泛应用于蛋白质表面疏水性的检测。

基于此，本发明提供一种新型检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的方法，利用线性生物大分子底物与蛋白质结构域的疏水相互作用，封闭其表面的疏水区域，进而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，从而造成了荧光强度降低。该方法可有效应用于蛋白质结构域与线性大分子之间疏水相互作用的分析，为研究生物大分子物质与蛋白质相互作用提供新的实验思路及技术手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种更为快速、准确、简便的检测蛋白质结构域与线性生物大分子疏水相互作用的新方法。该方法利用线性生物大分子底物与蛋白质结构域的相互作用，来封闭蛋白质结构域表面的疏水区域，从而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，造成荧光强度降低。该方法具有操作简单、快速、成本低廉、需要蛋白质用量少等优点，可应用于蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的定性定量分析。该方法大大的缩短了实验周期，可实现对多种蛋白质结构域与多种线性大分子底物疏水相互作用进行高通量快速检测。

一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法，包括以下步骤：

a. 重组蛋白质结构域分离纯化；

b. 制备线性生物大分子底物溶液；

c. 重组蛋白质结构域与线性生物大分子底物混合反应；

d. 荧光探针ANS结合反应；

e. 荧光强度测定。

步骤a中重组蛋白质结构域选用GST-PPC融合蛋白。PPC结构域（Pre-Peptidase C-terminal domain）广泛分布于分泌型海洋细菌蛋白酶的C末端，特别是在海洋细菌和致病菌蛋白酶中较为多见。氨基酸序列分析及空间结构预测发现，PPC结构域表面存在大量疏水氨基酸残基。且前期研究表明，PPC结构域对胶原蛋白具有较强的吸附、膨胀作用，可与蛋白酶在胶原蛋白降解过程中产生协同作用。因此，我们选取两种氨基酸组成差异较大的PPC结构域作为本发明的研究对象（本发明不限于PPC结构域蛋白）。

步骤b线性大分子底物选用猪来源可溶胶原蛋白中、角蛋白、羟甲基纤维素钠和木聚糖（本发明不限于上述大分子底物）。

上述方法具体包括以下步骤：

1）重组表达蛋白质结构域（GST-结构域融合蛋白）：重组表达GST-结构域融合蛋白，重组蛋白质结构域溶液最终浓度控制为0.5 mg/ml。

2）线性生物大分子底物溶液的制备：用PBS缓冲液（20 mM, pH 7.4）溶解线性大分子底物，终浓度为1 mg/ml。

3）分别取100 µl重组蛋白质结构域（0.5 mg/ml）和100 µl PBS缓冲液（20 mM, pH7.4）混合、100 µl重组蛋白质结构域和100 µl线性生物大分子底物（1 mg/ml）混合，37ºC温浴5 min。然后再加入1 µl荧光探针ANS（8 mM），扫描加入线性大分子前后重组蛋白质结构域混合溶液的荧光强度（激发波长为374 nm，检测发射波长为485 nm，每个样品设置三个平行，重复检测5次）。根据相互作用前后的相对荧光强度，判断重组蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的相对强弱。

本发明的优点和有益效果

本发明的优点在于建立一种新型检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的技术方法。具体体现如下：

1、运用疏水荧光探针ANS快速检测蛋白质结构域与线性生物大分子物质的疏水相互作用。根据相互作用前后的相对荧光强度判断蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的相对强弱。

2、结果稳定、重复性好，灵敏度高。

3、与已有的蛋白相互作用技术相比，该方法具有操作简单、快速、成本低廉、需要蛋白质用量少等优点，直观显示蛋白质结构域与线性生物大分子底物疏水相互作用相对强度。

4、该方法大大的缩短了实验周期，可实现对多种蛋白质结构域与线性生物大分子疏水相互作用进行高通量快速检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明方法检测两种PPC结构域重组蛋白与可溶性猪胶原蛋白的疏水相互作用；

图2为本发明方法检测两种PPC结构域重组蛋白与可溶性角蛋白的疏水相互作用；

图3为本发明方法检测两种PPC结构域重组蛋白与羟甲基纤维素钠的疏水相互作用；

图4为本发明方法检测两种PPC结构域重组蛋白与木聚糖的疏水相互作用。

横坐标为样品反应体系，纵坐标是相对荧光强度，以最高荧光值为100%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1：利用荧光探针ANS检测两种PPC结构域与可溶性猪胶原蛋白的疏水相互作用。

所述的两种PPC结构域：ePPC结构域来源于Vibrio anguillarum分泌的胞外金属蛋白酶empA C末端PPC结构域；SPPC结构域来源于Salinivibrio sp. YH4分泌的胞外丝氨酸蛋白酶YHS C末端PPC结构域。

所述鳗弧菌（Vibrio anguillarum）菌株由本实验室分离得到（分离至渤海水样）；所述盐弧菌（Salinivibrio sp. YH4）菌株由本实验室分离得到（分离至山西运城盐湖水样）。质粒载体pGEX4T-1由本实验室保存。

步骤如下：

（1）利用Primer Premier 5.0软件设计引物。通过PCR反应获取ePPC和SPPC结构域基因。琼脂糖电泳验证，回收DNA目的条带。将目的DNA条带进行双酶切并连接到具有相同酶切位点的质粒载体pGEX4T-1上。重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中，通过菌落PCR筛选阳性克隆。

PCR反应体系：

Pha聚合酶PCR反应体系(100 µl)：2×buffer 50 µl，dNTP(10 mM) 3 µl，前后引物各1 µl，模板DNA 1 µl，Pha酶1 µl，加ddH2O至100 µl。

PCR反应程序：

94ºC 3.5 min，94ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s，72ºC 5 min，30个循环。

酶切体系：

10×buffer 2 µl，待测样品1 µg，限制性内切酶（EcoR I, Xho I）各1 µl，加无菌水至20 µl，37ºC反应1 h。

连接体系：

酶切产物4 µl，质粒载体1 µl，连接酶Solution I 5 µl，16ºC连接过夜。

（2）挑取E. coli BL21(DE3)转化子单菌落，接种于含抗生素的LB液体培养基中，37ºC振荡培养过夜。然后按1％(v/v)接种量转接到新鲜LB培养基。37ºC培养至OD600值为0.6-1.0，加入IPTG至终浓度为0.2 mM，然后转入15ºC摇床培养16 h。收集菌液，11 000 rpm离心5 min。将菌体用20 mM的Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬，进行超声破碎，1l 000 rpm离心20 min，去掉菌体残渣，保留上清。参照Novagen公司的产品说明书进行。取适量Glutathione Agarose Beads，10000 rpm离心5 min，弃上清并用5-10倍体积的PBS洗两次；加入细胞裂解上清液，于40ºC轻摇摆30 min，10000 rpm离心5 min，弃上清，用5倍体积的PBS洗两次；加入l倍体积的GST Elution Buffer，40ºC轻摇摆30 min，3000 rpm离心5 min，收集洗脱液，内含纯化的GST融合蛋白。经SDS-PAGE电泳鉴定GST融合的重组PPC结构域蛋白，重组蛋白溶液最终浓度控制为0.5 mg/ml。

LB培养基组分如下：

蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加水至1 L，pH 7.0。

（3）线性生物大分子底物溶液的制备：用PBS缓冲液（20 mM, pH 7.4）溶解线性分子底物，终浓度为1 mg/ml。

（4）重组蛋白质结构域与线性生物大分子底物混合反应。

样品反应液包括：PBS缓冲液（20 mM, pH 7.4），GST-ePPC融合蛋白（0.5 mg/ml）,GST-SPPC融合蛋白（0.5 mg/ml），可溶性猪胶原蛋白融合（1 mg/ml），8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐（8 mM）。反应体系具体如下：

对照组：200 µl PBS缓冲液

实验组1：100 µl PBS缓冲液+100 µl可溶性猪胶原蛋白

实验组2：100 µl PBS缓冲液+100 µl GST蛋白

实验组3：100 µl GST蛋白+100 µl可溶性猪胶原蛋白

实验组4：100 µl PBS缓冲液+100 µl GST-ePPC融合蛋白

实验组5：100 µl GST-ePPC融合蛋白+100 µl可溶性猪胶原蛋白

实验组6：100 µl PBS缓冲液+100 µl GST-SPPC融合蛋白

实验组7：100 µl GST-SPPC融合蛋白+100 µl可溶性猪胶原蛋白

样品缓冲液在37ºC温浴5 min。然后再加入1 µl荧光探针ANS（8 mM），振荡混匀，扫描混合溶液的荧光强度（激发波长为374 nm，检测发射波长为485 nm，每个样品设置三个平行，重复检测5次）。

（5）疏水相互作用分析

实验通过检测线性大分子底物添加前后的待测蛋白荧光值变化，确定蛋白质结构域与线性分子间存在疏水相互作用，且根据作用前后相对荧光强度判断蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的强弱。

由图1可看出，可溶性猪胶原蛋白与ANS混合不发生荧光，说明可溶性猪胶原蛋白不存在疏水表面。ANS与GST标签蛋白反应可产生少量荧光，而GST标签蛋白与胶原蛋白混合后加入ANS荧光值不发生明显变化，说明GST蛋白存在少量疏水表面，且GST标签蛋白与可溶性猪胶原蛋白不存在疏水相互作用，因此GST标签蛋白对该实验无影响。

GST-ePPC、GST-SPPC融合蛋白与ANS混合均能产生明显荧光，说明PPC结构域表面存在明显疏水区域。然而，当PPC结构域与可溶性胶原蛋白混合之后，加入荧光探针ANS荧光急剧减少甚至消失，说明胶原蛋白结合在PPC结构域疏水区域，从而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，造成荧光强度降低。以上结果说明，在PPC结构域结合可溶性猪胶原蛋白过程中，存在明显的疏水相互作用力。

实施例2：利用荧光探针ANS检测两种PPC结构域与可溶性角蛋白的疏水相互作用。

同实施例1，所不同的是使用可溶性角蛋白作为线性大分子底物。

由图2可看出，可溶性角蛋白与ANS混合不发生荧光，说明可溶性角蛋白不存在疏水表面。GST蛋白与角蛋白反应前后的ANS荧光值不发生明显变化，说明GST标签蛋白与可溶性角蛋白不存在疏水相互作用。

GST-ePPC、GST-SPPC融合蛋白与可溶性角蛋白混合之后，加入荧光探针ANS后，荧光较未加入底物时显著减少，说明可溶性角蛋白结合在PPC结构域疏水区域，从而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，造成荧光强度降低。以上结果说明，在PPC结构域结合可溶性角蛋白的过程中，存在明显的疏水相互作用力。

实施例3：利用荧光探针ANS检测两种PPC结构域与羟甲基纤维素钠和木聚糖的疏水相互作用。

同实施例1，所不同的是使用羟甲基纤维素钠和木聚糖作为线性大分子底物。

由图3、图4可看出，羟甲基纤维素钠或木聚糖与ANS混合均不发生荧光，说明羟甲基纤维素钠和木聚糖不存在疏水表面。单独表达的GST标签蛋白与ANS混合产生少量荧光，且GST标签蛋白与羟甲基纤维素钠或木聚糖混合后加入ANS荧光值不发生明显变化，说明GST标签蛋白与羟甲基纤维素钠或木聚糖不存在疏水相互作用。

GST-ePPC与羟甲基纤维素钠混合之后，加入荧光探针ANS后，荧光较未加入底物时显著减少，但仍然存在较高荧光值，说明羟甲基纤维素钠与PPC结构域部分疏水区域结合，说明PPC结构域具有一定的纤维素结合能力，且为疏水相互作用力。GST-SPPC融合蛋白与羟甲基纤维素钠混合之后，加入荧光探针ANS后，荧光值较未加入底物时的荧光值无显著差异，说明SPPC与羟甲基纤维素钠不存在疏水相互作用。

GST-ePPC与木聚糖混合之后，加入荧光探针ANS后，荧光较未加入底物时显著减少，但仍然存在较高荧光值，说明木聚糖与PPC结构域部分疏水区域结合，说明PPC结构域具有一定的木聚糖结合能力，且为疏水相互作用力。GST-SPPC融合蛋白与木聚糖混合之后，加入荧光探针ANS后，荧光值较未加入底物时的荧光值存在显著差异，但仍然存在较高荧光值，说明SPPC与木聚糖可能存在疏水相互作用。

综上，ePPC结构域较SPPC结构域具有更强的纤维素与木聚糖的结合能力。

本发明不限于上述实施例。

本发明实施例的结果稳定、重复性好，灵敏度高。可直观显示蛋白质结构域与线性生物大分子底物疏水相互作用相对强度。本发明方法大大的缩短了实验周期，可实现对多种蛋白质与多种底物疏水相互作用进行高通量快速检测，具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种重组蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法，包括以下步骤：

a.重组蛋白质结构域分离纯化；

b.制备线性生物大分子底物溶液；

c.重组蛋白质结构域与线性生物大分子底物混合反应；

d.荧光探针ANS结合反应；

e.荧光强度测定；

具体为：a.重组表达GST-结构域融合蛋白并分离纯化，重组蛋白质结构域溶液最终浓度控制为0.5mg/ml；b.用20mM pH 7.4的PBS缓冲液溶解线性大分子底物，终浓度为1mg/ml；c.取100μl步骤a制备的的0.5mg/ml的重组蛋白质结构域和100μl步骤b制备的1mg/ml的线性大分子底物溶液混合，37℃温浴5min；d和e.加入1μl 8mM荧光探针ANS，扫描加入线性大分子前后重组蛋白质结构域混合溶液的荧光强度，其中激发波长为374nm，检测发射波长为485nm，每个样品设置三个平行，重复检测5次，并根据相互作用前后的相对荧光强度，判断重组蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的相对强弱；

其中，步骤a中使用的重组蛋白须具有表面疏水区。

2.根据权利要求1的测定方法，其中所述线性生物大分子为大分子线性蛋白或线性多糖。

3.根据权利要求2的测定方法，其中所述线性生物大分子为胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、淀粉或纤维素。