CN109072203B

CN109072203B - 镜像核酸复制体系

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Publication number: CN109072203B
Application number: CN201780026142.7A
Authority: CN
Inventors: 朱听; 刘磊; 徐维亮; 王子谋; 姜文君; 王佳星; 俞林萍
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2015-08-18
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2037-02-15
Also published as: CN106467910A; US20190376050A1; EP3444341A4; CN109072203A; US20220325260A1; EP3444341A1; WO2017177759A1; WO2017028548A1; US11371027B2

Abstract

提供了对镜像核酸进行复制的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得所述镜像核酸。

Description

镜像核酸复制体系

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及镜像核酸的复制和转录。

背景技术

手性是三维空间中一些分子的基本属性，也就是一个物体不能和它在镜中的影像重合。像人的左手和右手一样，二者是物体及镜像的关系，而无论在三维空间中如何翻转都不能重叠。这就是物体在空间中的手性，一个分子的镜像被称为它的对映体。它们有着相同的物理和化学性质，熔点、分子量、溶解度、密度、NMR谱等均相同。对映体之间相互不同的性质是它们的光学性质——旋转平面偏振光方向。手性在自然界中广泛存在。生命体中的生物大分子，如蛋白质、多糖、DNA和RNA等具有手性。地球上所有生物体，无论是大型的植物、哺乳动物或是肉眼不可见的微生物，组成蛋白质的20种氨基酸，除了甘氨酸没有手性以外，其他19种氨基酸全都是L型；而承载遗传信息的DNA和RNA，它们的核糖全都是D型。

氨基酸在紧邻羧基的位置有一个手性碳原子，它作为手性中心使得甘氨酸以外的氨基酸均有L和D两种手性。L指的是左旋(levorotatory)或者left-handed)，D指的是右旋(dextrorotatory或者right-handed)。对于核酸来说，D型是自然界中存在的手性，核酸分子的手性中心位于它的骨架上。

生命体中的两种不同手性的化合物，生物活性可能会完全不同。生物个体中的酶和细胞表面的受体大多数都是手性的，两个对映体在生物体中往往以不同的途径被吸收、活化和降解。对于常见的手性药物而言，两种对映体可能有着等同的药理活性，也可能一个有活性另一个没有活性，甚至其对映体有毒。目前认为，生命体中存在的蛋白质、核酸这些分子，有着手性单一性的特点。如果在天然的蛋白质序列中掺入镜像的氨基酸，会破坏它本身的二级结构(Krause et al.，2000)，并对其蛋白功能产生严重影响。

在地球早期环境中，出现最原始的细胞之前应该会有氨基酸、核酸这些生物分子的存在，尽管RNA作为生命物质起源的理论比较充分，但是目前没有证据表明氨基酸和核酸是哪一种先在地球上出现。人们对1969年坠落在澳大利亚的Murchison的陨石研究发现，其中含有多种氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸等，而且两种手性的氨基酸并不是1∶1的，L-氨基酸多于D氨基酸(Engel and Macko，2001)。Breslow和Levine的实验表明，即使是很小的手性差异，也可以在两次溶液蒸发与结晶后，在溶液中保留90％以上的一种手性的氨基酸(Breslow and Levine，2006)，而这种过程在地球早期环境中是可以发生的。另外有其他假说认为，进化中的单一手性来源于方解石产生具有旋光性的晶体，选择性地吸附一种旋光性的氨基酸，使得另一种在溶液中的比例增加。除了以上两种解释，目前的RNA生命起源假说认为，在地球早期环境中由有机分子形成了RNA，RNA进化成有自我复制、自我剪切等活性的有生物功能的RNA——RNA核酶；在进一步进化中，氨基酸组成的蛋白酶或多肽开始参与催化RNA的复制、解旋等，可能是在这一阶段会经历手性选择的过程，这就导致了最后进化成的复杂生命体中手性的单一性。

发明内容

本研究中，我们用化学合成的方法构建了基于D-ASFV pol X镜像聚合酶的遗传信息转录和复制体系，实现了镜像中心法则中L-DNA的复制以及转录为L-RNA这两个步骤。我们证实了镜像DNA的复制和转录遵循碱基互补配对原则，并且有着良好的手性特异性。我们发现把天然和镜像的DNA复制体系放在同一个溶液体系中，两者可以分别工作而没有严重的相互干扰。镜像聚合酶体系扩增L-DNAzyme脱氧核酶序列，可以实现和天然脱氧核酶相对应的自我剪切活性。镜像遗传信息复制和转录的实现，说明了镜像生命分子的存在并具有生物活性的潜在可能，也为未来在实验室环境中构建镜像细胞奠定了基础。经过对系统的进一步优化，镜像复制系统还将用于生物方法高效筛选镜像核酸药物。

本发明提供了对镜像核酸进行复制的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得所述镜像核酸。

本发明提供了进行镜像PCR的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得镜像核酸。

本发明提供了筛选镜像核酸分子的方法，包括：在允许二者结合的条件下，使随机镜像核酸序列库与靶标分子接触；获得与靶标分子结合的镜像核酸分子；以及通过镜像PCR扩增所述与靶标分子结合的镜像核酸分子。

本发明还提供了D-型ASFV pol X，其序列如SEQ ID NO：17所示，其中除没有手性的甘氨酸以外，其余氨基酸均为D-型氨基酸。

附图说明

图1显示D-ASFV Pol X的化学合成路线。174个氨基酸的ASFV pol X分成肽段1：Metl-Lys85，肽段2：Cys86-Leu105和肽段3：Ala106-Leu174三段来合成和连接。先将Cys86用Acm保护起来，合成Cys86-Leu105，再合成肽段3：Cys106-Glu107-Leu174，经过活化、连接得到肽段2和肽段3的连接产物，然后将Cys106脱硫形成Ala106。再合成肽段1，催化脱去肽段2的Acm保护基，进行活化和连接，获得全长ASFV pol X聚合酶。

图2显示D-ASFV pol X合成全长产物的检测。a.折叠后的D-ASFV pol X HPLC谱图。HPLC分析使用了214nm吸收波长，Vydac C18(4.6×250mm)液相色谱柱。b.ESI-MS谱图通过对于离子峰图的分析和计算，观察到主要合成产物的大小为20317.0Da，ASFV pol X理论值为20316.0Da。

图3显示L型和D型ASFV pol X检测。a.SDS-PAGE检测大肠杆菌表达的、化学合成L型和化学合成D型的ASFV pol X聚合酶在15％的SDS-PAGE胶上分离，并银染检测。M，蛋白分子量marker。b.CD检测L型和D型化学合成ASFV pol X在Applied Photophysics Pistar-180 CD spectrometer上进行检测，吸收曲线是3次独立检测扣除背景后的平均值。

图4显示镜像DNA检测。a.HPLC检测(Chemgenes公司提供)分别对4种L-dNTP进行了HPLC的纯化和分析，L-dATP和L-dGTP的结果几乎没有杂峰，而L-dTTP和L-dCTP有明显的杂峰。b.primer12 CD检测从公司获得的L型经过HPLC纯化和D型经过PAGE纯化的primer12，吸收曲线有对称关系(L-primer12的实际上样浓度小于D-primer)c.template18CD检测从公司获得的L型D型的template18，在CD检测中吸收曲线有对称关系(L-template18的样品实际上样浓度小于D-primer)。

图5显示镜像聚合酶催化DNA延伸。a.天然和镜像DNA复制体系示意图天然DNA复制系统包含L-聚合酶，D-DNA和D-dNTPs；镜像DNA复制系统包含D-聚合酶，L-DNA和L-dNTPs b.天然和镜像聚合酶催化DNA延伸(12nt引物，18nt模板)缓冲液条件为50mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl，在10ul天然或镜像反应体系中加入对应手性的0.7μgASFV pol X，2.5μM primer12，2.5μM template18和4种0.4mM dNTPs。将反应体系置于37℃4小时。“*”表示5’FAM标记。c.L-DNA全长产物ESI-MS检测通过分析计算得到预期的全长产物分子量为5516.9(理论值5517.6)以及模板的分子量5481.9(理论值5481.6)d.天然和镜像聚合酶催化DNA延伸(15nt引物，21nt模板)反应体系在50mM Tris-HCl pH 7.5，20mMMgCl₂，1mM DTT，50mM KCl中进行，加入了2.5μM 15-nt L-primer15(没有FAM修饰)，2.5μM21-nt L-template21，0.2mM L-dNTPs(每种浓度)，以及1.4μg D-ASFV pol X.在37℃反应12小时后进行20％PAGE胶的分离，并且用Sybr Gold染色检测。

图6显示镜像DNA多循环扩增示意图。第一个循环不带FAM的reverse 11引物扩增得到双链的模板，第二个循环FAM标记的primer11只能与第一循环扩增出的模板(橘红色)进行互补，得到全长产物。第三个循环可以产生3倍于第二个循环的荧光全长产物。

图7显示镜像DNA复制体系多循环扩增。D-ASFV pol X多循环扩增L-DNA，Cycle0为对照组，在cycle1进行之前取样。Cycle1扩增得到reverse11的全长产物，可以被后续循环作为模板。样品在8M尿素变性的20％PAGE胶上分离，用Typhoon Trio+扫描荧光。检测到的所有产物均为带FAM标记的DNA。

图8显示镜像DNA延伸的碱基互补配对特异性。在天然或者镜像的系统中分别添加对应手性的0.2mM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP中的一种，模板的下一个位点碱基分别为A、T、C、G(黑底白字方框标记)，缓冲液条件为50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mMKCl，加入对应手性的0.7μg ASFV pol X，2.5μM primer，2.5μM template18。在37℃反应30分钟，在20％的PAGE胶上电泳并用Typhoon Trio+扫描仪扫描荧光信号。“*”表示5’FAM标记。“-”表示未添加D或L-dNTPs的对照组。

图9显示镜像DNA延伸的手性特异性。在缓冲液条件为50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl，加入0.7μg ASFV pol X，2.5μM primer，2.5μMtemplate18，蛋白、引物-模板、dNTPs的手性在图的下方列出，一共有8种组合。在37℃反应12小时，在20％的PAGE胶上电泳并用Typhoon Trio+扫描仪扫描荧光信号。“*”表示5’FAM标记。

图10显示天然和镜像系统在同一溶液中反应。在缓冲液条件为50mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl，加入两种手性的0.7μg ASFV pol X，2.5μM天然5’末端Cy5标记的primer20，2.5μM天然template26，2.5μM镜像5’末端FAM标记的primer12，2.5μM镜像template18，两种手性的dNTPs各四种，每种终浓度0.2mM，反应体系在37℃反应4小时，反应产物在8M尿素变性的20％PAGE胶上分离，用Typhoon Trio+的Cy5和FAM荧光模式扫描，并将图片整合到一起。

图11显示天然和镜像DNAzyme的酶合成与活性检测。a.Zn2+依赖的DNAzyme二级结构在44ntDNAzyme的5’末端添加了12nt的引物序列，全长为56nt。二级结构通过mfold服务器生成(Zuker，2003)。b.DNAzyme的酶合成天然和镜像的DNAzyme都在50mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl缓冲液条件下反应，加入了66nt的DNAzyme template和12nt的引物，在37℃经过36小时获得全长产物。M，marker为化学合成的56nt序列作为分子量标准。c.将延伸得到的全长DNAzyme从PAGE胶上切下，放在缓冲液里扩散过夜，用天恩泽PAGE胶回收试剂盒进行沉淀回收。将沉淀的DNA用buffer1∶50mM HEPES，pH 7.0和100mMNaCl溶解，并在90℃加热2min，再冰上降温5min。然后加入等体积的buffer 2∶50mM HEPES，pH 7.0，100mM NaCl，4mM ZnCl₂或40mM MgCl₂以开始反应(Zn²⁺与Mg²⁺终浓度为2mM与20mM)。在37℃反应36小时。最后用EDTA终止反应。样品在12％PAGE胶上分离并显影。

图12显示天然和镜像体系DNA模板依赖的RNA转录。a.天然和镜像ASFV pol X催化的RNA转录缓冲液条件为50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl，在10ul反应体系中加入0.7μg ASFV pol X，2.5μM primer，2.5μM template和4种0.4mM rNTPs，天然体系中加入2unit RNase抑制剂。在37℃反应60小时后终止反应。b.加入rNTP的天然体系经过37℃36h的反应得到全长产物。加热到75℃10min使ASFV pol X和RNase抑制剂失活。在三个实验中分别加入1μg/μl，0.1μg/μl，0.01μg/μl的RNase A，然后在23℃孵育10min。加入20unit RNase抑制剂终止降解反应，并且加入上样缓冲液。反应产物在8M尿素变性的20％PAGE胶上分离，并且用Typhoon Trio+系统成像。Sample 1：对照组，延伸0h Sample 2：D-primer12经过36小时延伸的全长产物Sample 3：全长产物在75℃加热10min，失活RNase抑制剂以及ASFV pol X Sample 4-6：全长延伸产物，经75℃加热10min，加入0.01μg/μl，0.1μg/μl，1μg/μl的RNase A，23℃放置10min，加入20unit RNase抑制剂终止反应。在20％的PAGE胶上电泳并用Typhoon Trio+扫描仪扫描荧光信号。“*”表示5’FAM标记。

图13显示天然和镜像体系RNA转录的碱基互补配对特异性。天然或者镜像的系统中分别添加对应手性的0.2mM的rATP、rUTP、rCTP、rGTP中的一种，模板的下一个位点碱基分别为A、T、C、G(黑底白字方框标记)，缓冲液条件为50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mMDTT，50mM KCl，加入对应手性的0.7μg ASFV pol X，2.5μM primer，2.5μM template18。在37℃反应12小时，在20％的PAGE胶上电泳并用Typhoon Trio+扫描仪扫描荧光信号。“*”表示5’FAM标记。“-”表示未添加D或L-dNTPs的对照组。

图14显示突变型Dpo4聚合酶的全化学合成设计。(a)野生型Dpo4聚合酶的氨基酸序列；(b)带His6标签的突变型Dpo4聚合酶(Dpo4-5m)的氨基酸序列，高亮氨基酸位点分别是为了增加肽段连接位点而引入的四个突变(S86A，N123A，S207A和S313A)，以及防止在折叠过程中二硫键形成而导致的分子内二聚化而引入的一个突变位点(C31S)。此外，为防止在固相多肽合成以及肽段连接过程中被氧化将肽链中所有的甲硫氨酸用正亮氨酸替代(Met1，Met76，Met89，Met157，Met216和Met251)。本图中这9个肽段的颜色与图2中的肽段(Dpo4-1至Dpo4-9)使用的颜色一一对应。

图15显示Dpo4-5m的合成路线。用酰肼来代替硫酯介导9个肽段从C至N末端方向上的组装最终实现Dpo4-5m的化学全合成。

图16显示Dpo4-5m聚合酶的生化特性。(a)使用12％的SDS-PAGE分析化学合成的Dpo4-5m聚合酶以及从大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达纯化的重组Dpo4-5m聚合酶的分子量及纯度，使用考马斯亮蓝染色，在合成的Dpo4-5m中可以观察到少量未连接的肽段。M为标准分子量蛋白标记。(b)应用重组的野生型Dpo4(图中标为“WT Dpo4”)，重组的突变型Dpo4-5m(“Recombinant”)以及合成的突变型Dpo4-5m(“Synthetic”)聚合酶PCR扩增200bp的DNA序列。PCR反应体系中包含50mM HEPES(pH7.5)，5mM MgCl₂，50mM NaCl，0.1mM EDTA，5mM DTT，10％glycerol，3％DMSO，0.1mg/ml BSA，200μM的超纯dNTPs，0.5μM的双向引物，2nM线性双链DNA模板和大约300nM的Dpo4-5m酶。反应35个循环后，用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并用GoldView(Solarbio)染色。NC是负对照实验，反应体系中仅有模板和引物，而无聚合酶。(c)应用合成Dpo4-5m在的不同的循环数下扩增得到的200bp DNA产物。用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并用GoldView(Solarbio)染色，泳道上方的数字代表了扩增的循环数。M是标准分子量DNA标记。

图17显示应用化学合成的Dpo4-5m聚合酶PCR扩增不同长度的DNA序列。(a)应用合成的Dpo4-5m聚合酶PCR扩增长度从110bp到1kb的序列，每个反应进行35个循环，对于扩增110-300bp的序列每个循环的延伸时间设为2分钟，400-600bp的序列延伸5分钟，700-1000bp的序列延伸10分钟。预期得到的扩增子长度标示在泳道上方，在主产物条带下方可以看到引物二聚体条带。W/o template表示不添加模板的负对照，反应中仅有引物和酶及其它PCR成分；NC(110bp)/NC(1kb)表示不添加酶的负对照，反应中仅有引物和模板(110bp/1kb)及其它PCR成分。(b)应用合成的Dpo4-5m聚合酶PCR扩增1.1kb的dpo4基因，反应进行35个循环，每个循环中的延伸时间设为10分钟。(c)应用合成的Dpo4-5m聚合酶PCR扩增120bp的大肠杆菌中编码5S rRNA的基因rrfB，反应进行35个循环，每个循环中的延伸时间为2分钟。(d)应用合成的Dpo4-5m聚合酶PCR扩增1.5kb的大肠杆菌中编码16S rRNA基因rrfC，反应进行35个循环，每个循环中的延伸时间为15分钟，在主产物条带下方可以观察到引物二聚体。所有的PCR产物都用2％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，并用GoldView染色。预期的扩增子长度标示在泳道上方，NC表示不添加酶的负对照，反应中仅有引物和模板及其它PCR成分，M为标准分子量DNA标记。

图18显示应用合成的Dpo4-5m聚合酶进行组装PCR。(a，b)由2条具有30bp重叠区域的长引物(tC19Z-F115和tC19Z-R113)进行组装PCR反应，扩增的目标产物为198bp的tC19Z基因，反应进行20个循环，PCR产物用3％高分辨率琼脂糖凝胶电泳分析并用GoldView(Solarbio)染色。Exo I表示用核酸外切酶I处理，此酶只消化单链DNA而不消化双链DNA。(c，d)由6条长度范围在47nt到59nt的短引物进行三步PCR反应，组装198bp长的tC19Z基因，PCR产物用3％高分辨率琼脂糖凝胶电泳分析并用GoldView(Solarbio)染色。第一、二、三步PCR反应的循环数分别为5、10和20。这三步PCR反应预期扩增的序列长度分别为88bp，162bp和198bp(标示在泳道上方)。在主产物条带下方可以观察到引物二聚体，M为标准分子量DNA标记。

图19显示Dpo4-10的制备。(A)将54mg Dpo4-1溶解于2ml酸化连接缓冲液(6M Gn·HCl和0.1M NaH₂PO₄的水溶液，pH 3.0)。将混合物放置于冰盐浴中冷却，然后加入200μl含0.5M NaNO₂的酸化连接缓冲液，在冰盐浴中搅拌30分钟后，加入2ml 0.2M MPAA(溶于6MGn·HCl和0.1M Na₂HPO₄，pH 6.0)。再加入49mg的Dpo4-2，并于室温下用氢氧化钠溶液将溶液pH调至6.5。反应15个小时后，用三(2-羧乙基)膦还原，随后进行HPLC纯化，最终得到52mg的Dpo4-10，产率为51％；(B)Dpo4-10的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：WelchC4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到70％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-10的电喷雾电离质谱图。

图20显示Dpo4-11的制备。(A)将43mg Dpo4-10溶解于2ml酸化连接缓冲液(6MGn·HCl和0.1M NaH₂PO₄的水溶液，pH 3.0)。将混合物放置于冰盐浴中冷却，然后加入160μl含0.5M NaNO₂的酸化连接缓冲液，体系在冰盐浴中搅拌25分钟后加入24mg巯乙磺酸钠(MESNa)。在室温下用氢氧化钠溶液将溶液pH调至5.1。反应1个小时后，用HPLC纯化反应产物，最终得到25mg的Dpo4-11，产率为60％；(B)Dpo4-11的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到100％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-11的电喷雾电离质谱图。

图21显示Dpo4-12的制备。(A)将45mg Dpo4-3溶解于4ml酸化连接缓冲液(6M Gn·HCl和0.1M NaH₂PO4的水溶液，pH 3.0)。将混合物放置于冰盐浴中冷却，然后加入200μl含0.5M NaNO₂的酸化连接缓冲液在冰盐浴中搅拌25分钟后加入1ml含0.4M巯乙磺酸钠(MESNa)的酸化连接缓冲液。在室温下用氢氧化钠溶液将溶液pH调至5.1。反应1个小时后，用HPLC纯化产物，最终得到19mg的Dpo4-12，产率为41％；(B)Dpo4-12的分析型高效液相色谱图λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到70％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-12的电喷雾电离质谱图。

图22显示Dpo4-13的制备。(A)将70mg Dpo4-5溶解于2.4ml酸化连接缓冲液(6MGn·HCl和0.1M NaH₂PO4的水溶液，pH 2.9)。将混合物放置于冰盐浴中冷却，然后加入240μl含0.5M NaNO₂的酸化连接缓冲液，在冰盐浴中搅拌约30分钟后加入2.4ml 0.2M MPAA(溶于6M Gn·HCl和0.1M Na₂HPO4，pH 4.9)。在室温下用氢氧化钠溶液将溶液的pH调至5.4，添加36mg的Dpo4-6后，重新将溶液pH调至6.6。反应11个小时后，分析产物并将pH调节至9.0来完全去除Tfa基团。约1小时后再次分析产物，然后加入72mg MeONH₂·HCl来实现Thz向Cys的转化，并加入TCEP·HCl将反应体系的pH调到4.0。约3小时后，用HPLC分析并纯化产物，最终获得56mg Dpo4-13，产率为57％。(B)Dpo4-13的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到70％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-13的电喷雾电离质谱图。

图23显示Dpo4-14的制备。(A)Dpo4-8(53mg)和Dpo4-9(48mg)的连接反应与Dpo4-5、Dpo4-6的连接过程相似，请参见图22。最终获得46mg的Dpo4-13，产率为46％；(B)Dpo4-14的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到100％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-14的电喷雾电离质谱图。

图24显示Dpo4-15的制备。(A)将36mg Dpo4-4溶解于2ml酸化连接缓冲液(6M Gn·HCl和0.1M NaH₂PO₄的水溶液，pH 3.0)。将混合物放置于冰盐浴中冷却，然后加入400μl含0.5M NaNO₂的酸化连接缓冲液在冰盐浴中搅拌30分钟后加入2ml 0.2M MPAA(溶于6M Gn·HCl和0.1M Na₂HPO₄，pH 6.0)。再加入81mg的Dpo4-13后，室温下用氢氧化钠溶液将溶液pH调至6.5。反应15个小时后，用三(2-羧乙基)膦将产物还原后进行HPLC纯化，最终得到54mg的Dpo4-15，产率为46％；(B)Dpo4-15的电喷雾电离质谱图。

图25显示Dpo4-16的制备。(A)将82mg Dpo4-15溶解于7ml酸化连接缓冲液(6MGn·HCl和0.1M NaH₂PO4的水溶液，pH 3.1)。将混合物放置于冰盐浴中冷却，然后加入140μl含0.5M NaNO₂的酸化连接缓冲液在冰盐浴中搅拌30分钟后加入1.75ml含0.8M巯乙磺酸钠(MESNa)的酸化连接缓冲液。在室温下用氢氧化钠溶液将溶液pH调至5.5。反应2个小时后，用三(2-羧乙基)膦将产物还原后再用HPLC纯化产物，最终得到69mg的Dpo4-16，产率为83％；(B)Dpo4-16的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到70％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-16的电喷雾电离质谱图。

图26显示Dpo4-17的制备。(A)Dpo4-7(25mg)和Dpo4-14(47mg)的连接反应与Dpo4-5、Dpo4-6的连接过程相似，请参见图22。最终获得41mg的Dpo4-17，产率为59％；(B)Dpo4-17的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到70％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-17的电喷雾电离质谱图。

图27显示Dpo4-18的制备。(A)将37mg Dpo4-16和41mg Dpo4-17溶解于1.1ml的水溶液(含6M Gn·HCl，0.1M Na₂HPO4，40mM TCEP和125mM MPAA，pH 6.8)中，反应混合物的pH调至6.6。反应12个小时后，用HPLC分析产物后再进行稀释和纯化，最终得到55mg的Dpo4-18，产率为75％；(B)Dpo4-18的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从30％到80％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-18的电喷雾电离质谱图。

图28显示Dpo4-19的制备。(A)通过Pd辅助的去保护法除去Dpo4-18中的Acm基团[1]，

将55mg Dpo4-18溶解于2ml的水溶液(含6M Gn·HCl，0.1M Na₂HPO₄和40mM TCEP，pH7.1)，再将溶解了10.4mgPdCl₂的0.4ml水溶液(含6M Gn·HCl和0.1M Na₂HPO₄)加入到反应体系中。反应13个小时后，再加入4ml 0.75M DTT的水溶液(含6M Gn·HCl和0.1MNa₂HPO₄)，将反应混合物搅拌1小时，用HPLC纯化产物。最终得到47mg的Dpo4-19产率为86％；(B)Dpo4-19的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从30％到80％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-19的电喷雾电离质谱图。

图29显示Dpo4-20的制备。(A)将19mg Dpo4-12和47mg Dpo4-19溶解于1.8ml的水溶液含6M Gn·HCl，0.1M Na₂HPO₄，40mM TCEP和100mM MPAA，pH 6.9冲，将反应混合物的pH调至6.6。反应15个小时后，用HPLC分析产物后再进行稀释和纯化，最终得到47mg的Dpo4-20，产率为85％；(B)Dpo4-20的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从30％到80％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-20的电喷雾电离质谱图。

图30显示Dpo4-21的制备。(A)将24mg Dpo4-20溶解于1.6ml的醋酸溶液，然后在溶液中加入10mg醋酸银，过夜搅拌14个小时后，加入0.3ml 2-巯基乙醇。用连接溶液(6M Gn·HCl，0.1M Na₂HPO₄，pH＝7)将反应体系稀释到两倍，离心后的上清液用半制备级的HPLC纯化，沉淀物则进行彻底洗涤和纯化。冻干后得到20mg除去Acm基团的Dpo4-21，产率为83％；(B)Dpo4-21的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到100％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-21的电喷雾电离质谱图。

图31显示Dpo4-22的制备。(A)将13mg(2倍当量)Dpo4-11和20mg Dpo4-21溶解于0.4ml的水溶液(含6M Gn·HCl，0.1M Na₂HPO₄，40mM TCEP和100mM MPAA，pH 6.9)中，将反应混合物的pH调至6.6。反应15个小时后的产物用HPLC分析，再进行稀释和纯化，最终得到21mg的Dpo4-22，产率为78％；(B)Dpo4-22的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到100％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-22的电喷雾电离质谱图。

图32显示Dpo4-23(Dpo4-5m)的制备。(A)将20mg Dpo4-22溶解于6ml 200mM TCEP溶液(含6M Gn·HCl，0.2M Na₂HPO₄，pH 6.9)中，再加入0.1mmol(32mg)VA-044和0.2mmol(62mg)还原型L-谷胱甘肽。反应在37℃过夜搅拌。用HPLC和ESI-MS分析脱硫产物Dpo4-23，并用半制备型HPLC进行纯化。最终获得16mg冻干的Dpo4-23，产率为80％。(B)Dpo4-23的分析型高效液相色谱图(λ＝214nm)，柱子：Welch C4；梯度：流动相配比CH₃CN∶H₂O从20％到100％(二者均含0.1％TFA)，洗脱30分钟以上；(C)Dpo4-23的电喷雾电离质谱图。(D)Dpo4-23经过进一步复性，加热，镍柱纯化后的电喷雾电离质谱图，产率为15％(最终产物约2mg)。

图33显示人工合成的Dpo4-5m PCR扩增200bp的序列从0-10个循环依次取样。

2％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并用GoldView染色。取样的循环数标记在泳道上方，M是DNA标记。

图34显示PCR扩增序列Sanger测序结果与原始模板序列的比对。将PCR产物克隆到T载体上，并且挑取阳性菌落进行sanger测序，共存在7个单碱基缺失和19个单碱基突变，表明35个循环后的累积突变率约为0.9％。

具体实施方式

本发明提供了一种对镜像核酸进行复制的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得所述镜像核酸。

本文所用的术语“镜像”是指在手性上与天然物质呈镜像关系的异构体。

本文所用的术语“镜像核酸”是指L-型核酸，它与天然核酸(即D-型核酸)呈镜像关系。镜像核酸包括L-型DNA和L-型RNA。术语“镜像DNA”与“L-型DNA”或“L-DNA”可以互换使用。

本文所用的术语“镜像核酸聚合酶”或“镜像聚合酶”是指D-型聚合酶，它与天然聚合酶(即L-型聚合酶)呈镜像关系。术语“镜像聚合酶”与“D-型聚合酶”或“D-聚合酶”可以互换使用。例如，“D-Dpo4”是指D-型Dpo4聚合酶，它与天然的L-型Dpo4聚合酶呈镜像关系。

特别适合于本发明的聚合酶包括D-ASFV pol X、D-Dpo4、D-Taq聚合酶以及D-pfu聚合酶。

Dpo4(Sulfolobus solfataricus P2 DNA polymerase IV，硫化叶菌P2 DNA聚合酶IV)是一种热稳定的聚合酶，也能在37℃合成DNA。它的错配率在8×10^-3-3×10^-4之间。它是一种可以替代Taq做多循环PCR反应的聚合酶。它的氨基酸序列长度在目前的化学合成技术可实现范围内。

Taq聚合酶是1976年Chien及其同事在热泉微生物Thermus aquaticus中发现的热稳定聚合酶，它可以在DNA变性温度下保持活性，所以它替代E.coli聚合酶被用于PCR反应。Taq的最适温度在75℃-80℃，并且在92.5℃的半衰期约为2h。

Pfu聚合酶是在Pyrococcus furiosus中发现的，它在微生物中的功能是在细胞分裂期复制DNA。它优于Taq的地方在于它具有3‘-5’外切酶活性，可以在DNA合成过程中剪切掉延伸的链上错误添加的核苷酸。商业化的Pfu错配率在130万分之一左右。

在一些实施方案中，所述镜像核酸、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs为L-型，所述镜像核酸聚合酶为D型。在某些情况下，反应体系中可以混有不同类型的模板、引物或dNTPs/rNTPs(例如可以混有一部分D型模板引物或dNTPs/rNTPs)，但不会对反应产生严重干扰。

此处的核酸复制反应可以只进行一个循环，也可以进行多个循环。这可以由技术人员根据实际需要来确定。

此处所用的术语“多个”是指至少2个。例如，“多个循环”是指2个或更多个循环，例如3个、4个或10个循环。

此处所用的术语“复制”包括在DNA模板和dNTPs存在下获得目标DNA的一个或多个拷贝；也包括在DNA模板和rNTPs存在下获得目标RNA的一个或多个拷贝(此过程也可以称为RNA的“转录”)。

在核酸的复制过程中，模板和引物通常为DNA，如果目标核酸为DNA，则反应体系中应当添加dNTPs；如果目标核酸为RNA，则反应体系中应当添加rNTPs。

在一些实施方案中，所述镜像核酸为L型DNA，例如L-DNAzyme。在另一些实施方案中，所述镜像核酸为L型RNA。

在特别优选的实施方案中，所述反应为聚合酶链式反应。

本文所用的术语“PCR”具有本领域公知的含义，是指聚合酶链式反应((polymerase Chain Reaction)。

在特别优选的实施方案中，所述反应在如下缓冲液中进行：50mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl。

本发明还提供了进行镜像PCR的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得镜像核酸。

本发明还提供了筛选镜像核酸分子的方法，包括：在允许二者结合的条件下，使随机镜像核酸序列库与靶标分子接触；获得与靶标分子结合的镜像核酸分子；以及通过镜像PCR扩增所述与靶标分子结合的镜像核酸分子。

优选地，所述靶标分子被固定在固相介质上，这样可能更有利于分离纯化。

例如，在随机镜像核酸序列库与靶标分子接触之后，可以通过洗涤去除不与靶标分子结合的镜像核酸序列，从而获得与靶标分子结合的镜像核酸分子。

所述镜像核酸分子可以为L型DNA或L型RNA。

优选地，所述镜像PCR中使用的镜像核酸聚合酶可以是D-ASFV pol X、D-Dpo4、D-Taq聚合酶或D-Pfu聚合酶。

在本发明中，术语“核酸聚合酶”应当做广义的理解，可以指野生型酶，也可以指该酶的功能性变体。

本文使用的术语“功能性变体”是指在野生型酶的氨基酸序列中含有一个或几个(例如1-5个、1-10个或者1-15个，具体地，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15个甚至更多个)氨基酸的取代、缺失或添加的变体，并且所述变体基本保留了野生型酶的生物学活性，例如保留野生型酶生物学活性的50％、60％、70％、80％或90％或更高。所述“功能性变体”可以是自然产生的变体，也可以是人工变体，例如通过定点诱变获得的变体，或通过基因重组方法产生的变体。

在本发明的优选实施方案中，所述镜像核酸聚合酶可以包含亲和标签，以便于蛋白的纯化和重复利用，例如多聚组氨酸标签(His-Tag或His标签)、多聚精氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签等。

例如，本发明的优选实施方案中提供了Dpo4蛋白的功能性变体Dpo4-5m，其中包含6个位点的氨基酸突变以及His6标签。

在特别优选的实施方案中，镜像PCR在如下缓冲液中进行：50mM Tris-HCl，pH7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl。

下面将参照附图和实施例对本发明进行进一步描述，附图和实施例只是出于解释本发明的目的，不应当被理解为是对本发明的限制。

实施例1

哺乳动物中的D-氨基酸

D-氨基酸存在于哺乳动物的体内。1965年Hoeprich及同事在豚鼠和小鼠血液中检测到D-Ala，这是研究者首次在哺乳动物体内发现D-氨基酸(Corrigan，1969)。到现在为止，D-Ala被发现存在于多种哺乳动物的大脑、垂体，并且在尿液中发现D-Ala的排泄。D-Pro和D-Leu在小鼠大脑的7个区域被发现，说明了D-氨基酸在垂体和松果体有着相对较高的浓度(Hamase et al.，2001)。另外，D-Ser和D-Ala也在人、小鼠等哺乳动物的脑和血液中被检测到(Hashimoto et al.，1993；Hashimoto et al.，1995)。D-氨基酸最早被认为是微生物、植物、无脊椎动物合成的，最近的研究表明D-Ser和D-Asp可以被哺乳动物组织合成。通过同位素标记实验发现带放射性的L-Ser在大鼠和小鼠的大脑可以被转化为D-Ser，1999年丝氨酸异构酶(Ser racemase)被克隆和纯化出来，该异构酶在大鼠脑部可以催化L-Ser向D-Ser的催化(Wolosker et al.，1999)。哺乳动物中另一大D-氨基酸的来源是外源的食物和微生物。

镜像蛋白质的化学合成

尽管镜像氨基酸在自然状态的生命体中被证实有着较为广泛的存在，镜像氨基酸自然存在状态以单体为主，也有存在于短肽片段中，例如革兰氏阳性菌的四肽侧链氨基酸d-丙-d-谷-r-l-赖-d-丙，目前尚未发现自然界中有功能性的镜像氨基酸组成的镜像蛋白，中心法则中的翻译是核糖体和tRNA参与的、按照mRNA遗传信息合成蛋白质的过程，镜像氨基酸没有在这一过程中当做底物被使用。一般认为，生命体的遗传信息转录、翻译和主要生物功能的实现，依赖于天然手性的L-氨基酸。

由于现有生物体的手性单一性特点，生物方法无法获得镜像蛋白质，目前对于镜像蛋白的研究均通过化学合成的方法来实现。多肽和小的蛋白可以通过固相多肽合成(SPSS，solid phase peptide synthesis)的方法来实现(Kent，1988)。这一方法通常可以得到60个氨基酸左右的片段，进而通过自然化学连接(native chemical ligation)在溶液中把脱保护的肽段逐一连接起来(Dawson and Kent，2000)。固相多肽合成以及自然化学连接的方法扩展了蛋白合成的范围，目前可以实现300个氨基酸以上蛋白的合成。通过这一技术也可以进行镜像蛋白质的合成研究。1992年Kent课题组合成了首个镜像蛋白酶，HIV-1蛋白酶(HIV-1 protease)(Milton et al.，1992)。基于理论L和D对映异构体有互为镜像的结构，科学家通常猜测镜像蛋白有着和天然蛋白相对应的功能，这一猜想在镜像HIV-1蛋白酶项目上首次得到证实。L型和D型HIV-1蛋白酶有着相同的质谱分子量、相同的HPLC保留时间、相反的圆二色光谱曲线。在活性方面L型HIV-1蛋白酶可以切割L型肽底物，而D型蛋白酶可以切D型的底物。另一项研究中，两种手性的芽孢杆菌RNA酶(barnase)也显示出了类似的特性，天然L型barnase可以切割天然的RNA，而对于镜像RNA它的活性要弱4000倍左右。而对于镜像D型barnase，切割镜像RNA的活性则显著高于天然RNA(Vinogradov et al.，2015)。1995年4-草酰巴豆酯互变异构酶的L型和D型被化学合成，它的两种对映体在催化无手性的底物2-羟粘康酸的异构反应中显示了相同的反应效率。同位素标记催化位点碳原子上的氢，表明两种手性的异构酶作用在碳原子的不同侧面(Fitzgerald et al.，1995)。上述研究一致地表明了镜像蛋白酶和天然手性蛋白酶有着相同的活性，但是作用于不同的异构位置。

2014年M.S.Kay课题组合成了最长的蛋白，312氨基酸的DapA。DapA是依赖分子伴侣GroEL/ES的蛋白，在表达后依赖分子伴侣的协助才能折叠成功能构象。GroEL/ES可以折叠D和L两种手性的DapA，但是对于天然L-DapA的折叠效率要高于镜像DapA(Weinstock etal.，2014)。

镜像核酸化学合成研究

关于生命起源早期假说的研究表明非酶催化的、模板指导的RNA扩增反应可以在单一手性的系统里进行。但是如果体系里有两种手性的RNA单体，那么延长反应会由于其镜像单体的加入而被阻止(Joyce et al.，1984)。这对于生命起源于自然产生的RNA的理论产生了严重的挑战。为了解释这个理论问题，Joyce及其同事通过体外筛选的方法得到了RNA聚合核酶(RNA polymerase ribozyme)，它由83个核糖核苷组成，可以催化对映手性的RNA聚合反应(Sczepanski and Joyce，2014)。在这项研究中的镜像RNA是通过化学合成的方法得到的。它可以通过连接11个寡聚核苷酸片段来产生全长的与其自身手性相反的RNA聚合核酶，在同一反应体系中对于两种RNA的扩增可以互不干扰地进行。这为生命起源早期，两种手性的RNA分子共存，并且通过RNA聚合核酶进行扩增提供了一种理论上的可能。

2013年Barciszewski课题组首次报道了有催化活性的镜像核苷酸酶，这种核苷酸酶是根据已有的天然核苷酸酶序列设计的，具有催化剪切镜像的L-核苷酸分子的功能(Wyszko et al.，2013)。镜像核苷酸酶可以在体内实现剪切功能。在实验中证实了镜像核苷酸酶在血清中不易降解，还有无毒性、不引起免疫反应的特点，这使它成为较为理想的药物分子。

镜像核酸适体研究

DNA/RNA最早被认为是遗传信息的携带工具，也被认为比蛋白质的结构要简单很多。但是实际上DNA/RNA也能够折叠成三级结构，也就有着一系列潜在的生理功能。最早在1990年，研究者就发现了RNA结构可以特异性地结合小分子底物。这些RNA结构像抗体一样，可以选择性地结合底物并且有很高的亲和性。这些能结合特定底物RNA结构就被称作核酸适体(aptamers)。后来，DNA的核酸适体也被研究者发现。

体外筛选技术利用随机DNA/RNA序列库寻找与特定靶标分子结合的核酸适体。体外筛选首先要有一个随机序列库，既可以是DNA也可以是RNA的。库一般含有30-80个核苷酸的随机序列，以及在两边有两段引物区，以方便PCR扩增。然后进行多个循环的筛选过程，将目标小分子底物固定在一个基质上面，再把随机序列库加到底物上面，在清洗之后，不结合的DNA或RNA分子流过被固定的底物，而被筛选的有结合能力的序列就会留在上面。然后将这些特殊的序列洗脱下来，进行PCR扩增，再经过多个循环的富集、筛选过程，就可以得到一个或者几个能和底物特异性结合的核苷酸序列。

与天然的核酸适体一样，镜像核酸序列根据其序列具有特定的二级、三级结构，可以紧密、高特异性地结合目标分子。如果应用体外筛选策略对于镜像的靶标分子进行筛选，再合成镜像的核苷酸序列，就可以得到能结合天然靶标的镜像核苷酸分子。研究者用体外筛选的方法得到了结合D-腺苷和L-精氨酸的镜像L-RNA适体(Klusmann et al.，1996；Nolte et al.，1996)，D.P.Bartel在1997年得到了结合抗利尿激素的L-DNA适体(Williamset al.，1997)。镜像核苷酸分子的优势在于在体内稳定不易降解、无毒性、不引起免疫反应，而且生产成本较为低廉，有着良好的作为药物分子的应用前景。

研究目的

镜像生物分子是否能够实现遗传信息的复制、转录，镜像分子在进化上是否有组成生命的理论可能，目前没有研究可以给出明确的论断。尽管已经有研究组合成并验证了镜像蛋白的活性以及比较了它们跟天然蛋白的特性，但是这些研究通常仅从化学合成的角度阐释了镜像蛋白的特性。

我们的研究旨在设计并合成基于聚合酶的镜像复制与转录体系，这一体系的意义有以下三个方面：

一、镜像复制与转录体系可以实现聚合酶对于镜像DNA、RNA的扩增，说明镜像聚合酶可以像天然手性聚合酶一样催化DNA、RNA的合成，证明镜像生物分子具有有效的生物活性；

二、镜像复制与转录体系实现了镜像中心法则中两个关键的步骤，为镜像原始细胞的合成工作奠定开创性的基础；

三、现阶段体外筛选技术得到的天然核酸分子，作为药物有着体内易水解的严重缺陷。为了避免这一问题，需要用特殊方法进行镜像核酸的筛选。现有的体外筛选技术，通过天然随机库对镜像靶标进行筛选，得到有效的核酸序列，再化学合成镜像核酸分子，这样得到的镜像核酸分子可以结合天然靶标，也就是潜在的镜像药物。但是这一方法的局限在于生物体内的常见药物靶点有很多是大于300个氨基酸的蛋白，通过化学方法无法合成镜像靶标。镜像体外筛选如果能直接用天然的靶标分子和镜像的随机库进行，将极大地提高这一技术的普遍性，在更广泛的疾病领域筛选到药物分子。天然药物靶标、镜像随机库目前已经不存在技术难点，镜像药物筛选的瓶颈在于镜像PCR无法实现。而我们的镜像复制与转录体系可以实现镜像的PCR，尽管PCR效率有待进一步优化和提高，仍然为镜像药物筛选工作提供了理论和实践的基础。

实验材料与实验方法

实验药品与试剂

Q5 DNA polymerase NEB

NdeI NEB

RamHI NEB

Trans 5α克隆感受态细胞北京全式金

BL21(DE3)pLysS表达感受态细胞北京全式金

EasyTaq 北京全式金

Trans 2K DNA marker 北京全式金

T4 DNA连接酶北京全式金

质粒小提试剂盒北京艾德莱

IPTG 北京艾德莱

Gel Extraction Kit QIAgen

Agarose Biowest

预染蛋白marker Bio-Rad

40％Acrylamide 生工生物

Urea 生工生物

SYBRGold染液 Invitrogen

考马斯亮蓝快速染液北京天根生物

Ni-NTA beads 中科院过程研究所

咪唑生工生物

D型氨基酸希施生物科技

L型氨基酸吉尔生化

2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N；N′-四甲吉尔生化

基脲六氟磷酸酯

1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑吉尔生化

N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑吉尔生化

1-羟基-苯并-三氮唑吉尔生化

N，N′-二环己基碳酰亚胺阿尔法爱莎

1，2-乙二硫醇和4-巯基苯乙酸阿尔法爱莎

乙腈(HPLC级别) 杰帝贝柯

三(羟甲基)甲胺盐酸盐(Tris-HCl) 国药集团

氯化钾国药集团

四水合醋酸镁国药集团

乙二胺四乙酸国药集团

磷酸二氢钠国药集团

甘油国药集团

盐酸胍国药集团

无水乙醚国药集团

85％水合肼国药集团

还原型谷胱甘肽百灵威

茴香硫醚百灵威

三氟乙酸百灵威

三异丙基硅烷北京耦合

N，N-二异丙基乙基胺北京耦合

氢氧化钠北京化工

N，N-二甲基甲酰胺北京化工

二氯甲烷北京化工

亚硝酸钠北京化工

2-氯三苯基氯树脂天津南开合成

β-巯基乙醇北京中科拓展

L-DNA Chemgenes

L-dNTPs Chemgenes

L-NTPs Chemgenes

D-DNA引物北京擎科生物

pEASY T3试剂盒全式金

RNase A Fermentas

PAGE DNA纯化试剂盒天恩泽

酚氯仿索莱宝

糖原艾德来

RNase抑制剂 TaKaRa

实验设备

核酸电泳槽北京君意东方

PAGE电泳槽北京君意东方

台式恒温振荡器华美生化仪器厂

SDS-PAGE电泳槽 Bio-Rad

电泳仪 Bio-Rad

凝胶成像系统 Bio-Rad

Centrifuge5424 Eppendorf

分光光度计 Eppendorf

PCR仪 AB

Milli-Q纯水仪 MilliPore

AKTA蛋白纯化系统 GE

QIAcube QIAgen

核酸序列

上述没有D-/L-标记的序列都指的是D-DNA.

ASFV pol X的蛋白和DNA序列

蛋白序列

1 mltliqgkki vnhlrsrlaf eyngqlikil sknivavgsl rreekmlndv dlliivpekk

61 llkhvlpnir ikglsfsvkv cgerkcvlfi ewekktyqld lftalaeekp yaifhftgpv

121 syliriraal kkknyklnqy glfknqtlvp lkittekeli kelgftyrip kkrl(SEQID NO：17)

DNA序列

实验方法

ASFV pol X的化学合成

我们将D-ASFV pol X的氨基酸序列分为三片段，采取从C端到N端顺序自然链接法。每一个多肽片段的合成采用的是基于9-芴甲氧羰基(Fmoc)为保护基策略的固相多肽合成法(Fmoc-SPPS)。合成片段1采用的是2-Cl-trityl-Cl树脂(2CTC，取代度为0.5mmol/g)，而合成片段2以及片段6则使用肼取代的2CTC树脂。多肽片段的合成首先将树脂在二氯甲烷(DCM)以及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液中溶胀半小时，然后除去溶剂。随后，对于片段1，将溶有4倍当量的氨基酸和8倍当量的N，N-二异丙基乙基胺的5ml DMF溶液加入到反应管中，在30℃的恒温摇床内反应12小时，之后加入200μL甲醇，封闭未反应的活性氯。对于片段2以及片段6，将溶有4倍当量的氨基酸、3.8倍当量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、3.8倍当量的苯并三氮唑(HOAT)和8倍当量的N，N-二异丙基乙基胺的5ml DMF溶液加入到反应管中，在30℃的恒温摇床内反应1小时。多肽片段合成过程中，脱去Fmoc保护基的方法是使用含有20％哌啶的DMF溶液，浸泡两次，一次5分钟，另一次10分钟。从第二个氨基酸开始直到最后，缩合体系都使用的是HATU/HOAT/DIEA。多肽片段合成完毕后，使用切割试剂K(三氟乙酸/苯酚/水/茴香硫醚/乙二硫醇＝82.5/5/5/5/2.5)浸泡3小时，然后用高纯氮气除去三氟乙酸将体系浓缩，随后加入乙醚，使多肽沉淀出来，最后离心，收集固体沉淀，使用半制备级别的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化目标多肽片段。

按照以下方法进行多肽片段的自然化学连接。首先将含有酰肼基团的多肽片段溶于缓冲液中(6M盐酸胍，200mM磷酸氢二钠，pH 3.0)。在冰盐浴中，往反应液中加入15倍当量的NaNO₂溶液，反应20分钟。随后加入混有40倍当量4-巯基苯乙酸(MPAA)，等当量的N端为半胱氨酸的多肽片段，pH值为7.0的缓冲溶液。搅拌均匀后，将体系的pH值调至7.0，反应12小时。反应结束后，加入80mM磷酸三氯乙酯(TCEP)缓冲液，将体系浓度稀释一倍。最后使用半制备级别的RP-HPLC分离目标产物。

按照以下方法进行多肽的脱硫反应。首先将1μmol多肽片段3溶于2.5ml 200mMTCEP缓冲溶液中(6M盐酸胍，0.2M磷酸氢二钠，pH＝6.9)，然后加入50μmol VA-044和100μmol还原型谷胱甘肽，溶液在37℃下反应12小时。最后脱硫产物4用半制备级别的RP-HPLC分离纯化。

按照以下方法脱除Cys86侧链的乙酰胺甲基(Acm)保护基。0.5μmol多肽片段4溶于1ml 50％醋酸水溶液中。然后加入5mg醋酸银，在30℃下搅拌过夜。随后加入2.5mmol巯基乙醇，并且用6M盐酸胍水溶液将体系稀释2倍。通过离心，除去沉淀，用RP-HPLC分离上清液，获得目标产物5。

ASFV pol X的折叠复性

按照以下方法对D-ASFV pol X进行折叠复性。将5mg D-ASFV pol X溶于10ml 6M盐酸胍溶液中，将溶液置于3K Da的透析袋。然后把透析袋放在含有4M盐酸胍的缓冲液体系内(50mM Tris-HCl，40mM KCl，6mM醋酸镁，0.01M EDTA和16％甘油)浸泡10小时，随后将盐酸胍浓度逐渐降低为2M，1M和0M。透析袋在每种浓度盐酸胍溶液中浸泡时间均为10小时。使用圆二色谱和质谱可以证明，D-ASFV pol X折叠正确并且D-Cys81和D-Cys86之间通过空气氧化形成二硫键。

天然和镜像DNA、RNA聚合酶反应方法

DNA聚合反应方法：配置聚合酶反应缓冲液，50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl。在10ul反应体系中加入0.7μg ASFV pol X，2.5μM primer，2.5μMtemplate和4种0.4mM dNTPs。将反应体系置于37℃4小时，加入0.5M EDTA 1μl终止反应。反应得到与模板互补的DNA片段。

RNA聚合反应方法：配置聚合酶反应缓冲液，50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl。在10ul反应体系中加入0.7μg ASFV pol X，2.5μM primer，2.5μMtemplate和4种0.4mM rNTPs。将反应体系置于37℃60小时，加入0.5M EDTA 1μl终止反应。反应得到primer DNA和RNA的复合体。

PAGE胶回收DNA/RNA片段方法

我们采用PAGE胶回收的方法分离纯化扩增产物，首先在终止了反应的体系中加入含有二甲苯青、溴酚蓝的上样缓冲液，在合适浓度的变性丙烯酰胺凝胶上进行电泳，在电泳结束后将胶取下。用溴化乙锭进行DNA/RNA染色，在UV光下把DNA/RNA的目的大小片段切下，弃去杂带和空白的区域，切割的胶块应该尽量小。然后将胶块放在TE缓冲液中，颠倒混合过夜。小心吸取上清，加入1/10体积的乙酸钠(3mol/L，PH＝5.2)于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol/L。加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中30分钟。12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴。于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干。加适量的ddH₂O溶解DNA/RNA，可以获得高纯度的酶扩增L-DNA/RNA片段。

镜像DNAzyme反应方法

我们用100μl的反应体系扩增了一段DNAzyme的序列，这种DNAzyme是单链具有自我剪切活性的DNA短链。反应体系为：50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，and50mM KCl，28.9μg D-ASFV pol X，5μM primer12引物，5μM DNAzymeTemplate模板和1.6mMdNTPs。在37℃反应36小时。下一步将反应产物加上上样缓冲液，在12％PAGE胶上用300V 3个小时将条带分开。为了方便跑胶分离和切胶回收全长反应产物——单链的DNAzyme，DNAzymeTemplate模板在设计时比全长产物多10个核苷酸，拆下胶板后显影并切下全长产物序列。将胶块用上面描述的方法处理，扩散过夜并乙醇沉淀回收DNA。沉淀下来的产物用buffer 1∶50mM HEPES，pH 7.0和100mM NaCl溶解，并在90℃加热2min，再冰上降温5min。然后加入等体积的buffer 2∶50mM HEPES，pH 7.0，100mM NaCl，4mM ZnCl₂ or 40mM MgCl₂以开始反应。在37℃反应36小时。最后用EDTA终止反应。样品在12％PAGE胶上分离并显影。

镜像多循环聚合酶反应方法

配置聚合酶反应缓冲液，50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mMKCl。在反应体系中加入2.672μg D-ASFV pol X，2.5μM L-FAM-primer，2.5μM L-template和4种0.4mM L-dNTPs。将反应体系置于37℃4小时，加入0.5M EDTA 1μl终止反应。由于ASFVpol X有着很强的结合DNA的能力，即使在95℃加热变性的条件下也无法解离，我们用酚氯仿抽提的方法去除前一轮反应中的聚合酶。第二轮反应中，反应体系加热到95℃30s，然后降至室温。在反应体系中再加入0.334μg D-ASFV pol X，反应体系在37℃放置20h。第三个循环用同样的方法处理。反应产物在8M尿素变性的20％PAGE胶上分离，并且用TyphoonTrio+系统成像。电泳条带定量使用ImageQuant软件进行。

RNase A消化天然RNA聚合产物

L-ASFV pol XRNA反应体系(见2.2.3)，经过37℃36h的反应，加热到75℃10min使ASFV pol X和RNase抑制剂失活。在三个实验中分别加入1μg/μl，0.1μg/μl，0.01μg/μl的RNase A，在23℃孵育10min。加入20unit RNase抑制剂终止反应，并且加入上样缓冲液。反应产物在8M尿素变性的20％PAGE胶上分离，并且用Typhoon Trio+系统成像。

镜像手性的遗传信息复制和转录体系的设计

概述

在地球上的生命体中，组成蛋白质的氨基酸除了没有手性的甘氨酸，几乎都为L型，核酸中的核糖都为D型。蛋白质和核酸有着手性单一性的特点，在天然的蛋白质中错误地加入一个或几个镜像的氨基酸，可能会使得蛋白质二级结构发生改变，甚至失去生物活性(Krause et al.，2000)。生物体具有严格的手性单一性特点。虽然在进化中研究者尚无法找到关于镜像手性为何丢失的明确证据，我们仍然可以通过化学合成的方法来研究镜像的蛋白质和核酸的特性，尝试构建镜像细胞生命体所需要的生物原件。作为镜像生命体的核心，尝试构建镜像中心法则中的关键步骤，DNA的复制和转录RNA是重点研究的方向。

镜像DNA复制体系的设计

在天然生命体中，DNA的复制需要作为模板的DNA长链、作为引物的DNA短链、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dTTP、dGTP四种分子，以及适宜的溶液条件，例如合适的pH和Mg²⁺离子。我们参照天然生命体系，设计镜像DNA复制体系的成分，50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl，再加入镜像的蛋白和核酸分子，D-聚合酶、L-DNA模板、L-DNA引物和四种L-dNTPs。镜像蛋白和核酸分子在天然的生命体中不存在，而对于化学合成的过程来说，投入特定的原料，合成一种手性的分子与对映手性的分子所需要的化学过程并没有区别。所以我们确定用化学的方法获得镜像的D-聚合酶和L-DNA。

蛋白质的化学合成主要通过60氨基酸左右的多肽固相合成，以及自然化学连接在溶液中把脱保护的肽段逐一连接起来，目前能够合成的蛋白上限根据序列的不同大约是350个氨基酸。大肠杆菌聚合酶I的大小是928个氨基酸，我们常用的taq聚合酶是832个氨基酸，比通常认为聚合酶功能更简单的T4DNA连接酶也有487个氨基酸。这些酶超出了我们的合成范围。通过文献检索我们选定了一个174氨基酸的聚合酶ASFV pol X，非洲猪瘟病毒聚合酶X。

ASFV编码两种DNA聚合酶，一种是真核类型的family B的DNA聚合酶，用于病毒基因组的复制；还有一种是family X的DNA聚合酶，被命名为ASFV pol X(Oliveros et al.，1997)。ASFV Pol X是现在发现的最小的DNA聚合酶(Showalter and Tsai，2001)，由174个氨基酸组成，大小为20kDa。ASFV Pol X是模板依赖的聚合酶，保真度很低，缺少3’-5’外切酶活性，对于双脱氧核苷酸的识别能力非常差(Oliveros et al.，1997)。

将ASFV Pol X的基因序列和其他代表性的family X的聚合酶进行比对，可以看到ASFV Pol X和人、牛、鼠的TdT、人、鼠polβ等在结构和功能上有一定的联系。ASFV Pol X的三维结构已经用NMR的方法解出。Pol X和其它聚合酶不一样，它只具有一个palm结构和一个C端子域(Maciejewski et al.，2001)。在真核的Polβ中，一般还有一个N端结构域负责DNA结合。Pol X没有这个关键的结构域，结合DNA的能力却强于Polβ。

另外，ASFV Pol X可以结合单个核苷酸剪切修复(BER)的中间产物，并且可以高效地修复单个核苷酸缺口(Showalter et al.，2001)。BER的步骤中，Pol X修复缺口并且很容易引入突变。在最后一步再由一种ASFV编码的一种容错连接酶把带有错配的新合成链连入基因组。Pol X在修复基因组时将新的突变引入，有助于病毒变异的产生，以便在有生存压力的环境中存活下来。

ASFV pol X聚合酶的化学合成

D-ASFV PolX的化学全合成方法采用的是由Merrifield于1963年提出的固相多肽合成技术(SPPS)，该技术是目前最有效的多肽合成方法。根据保护策略的不同，主要有叔丁氧羰基(Boc)和芴甲氧羰酰基(Fmoc)两种方法。在本项目中，我们拟使用Fmoc-固相合成技术将D型氨基酸连接成多肽。

尽管理论上SPPS的每一步缩合反应其产率能达到99％，但是在实践中Fmoc-固相合成技术通常只能合成少于50个氨基酸的肽链。由于这个原因，合成蛋白质往往需要把多肽片段连接起来，即将目标蛋白质分子分割成几个片段，使得每一片段的氨基酸都少于50个，然后通过高效的化学反应将各个片段连接起来获得目标蛋白质分子。因此，在本项目中我们拟将目标D-ASFV蛋白质分子的多肽链分为4段，采用收敛法两两组合，通过改良后的一锅法自然化学连接(Native chemical ligation，NCl)---蛋白酰肼连接法，得到目标蛋白质的全长氨基酸序列。

由于酰肼链接的位点必须利用半胱氨酸，因此，我们拟将36位以及129位的丙氨酸突变为半胱氨酸，在连接反应完成后，进行脱硫反应，将半胱氨酸还原为丙氨酸(Qian andDanishefsky，2007)。与此同时，在连接反应过程中，为了避免副反应的发生，需要对81位以及86位的半胱氨酸进行侧链巯基保护，在连接反应结束后，再进行脱除。我们拟使用乙酰胺甲基(Acm)作为反应过程中的巯基保护基团(Liu et al.，2012)。合成D-ASFV pol X的具体合成路线和步骤参照图1。

为了验证合成途径的可行性，同时处于节约成本的考虑，我们先进行了L-ASFVpol X的合成。此后用相同的方法合成了D-ASFV pol X。

化学ASFV pol X聚合酶的复性和分析检测

在得到全长的L和D型ASFV pol X之后，我们对它进行了反相色谱(RP-HPLC)纯化，使用了Vydac C18(4.6×250mm)液相色谱柱，加入TFA并用20％-70％的乙腈梯度进行分离(图2)。得到强吸收的主峰和微弱的杂峰。电喷雾电离质谱(ESI-MS)得到的D-ASFV pol X合成全长产物分子量为20317.0Da，理论值为20316.0Da.

我们通过变性-透析的方法对合成的D-ASFV pol X进行复性，首先把冻干的聚合酶干粉加入含有6M盐酸胍的10ml透析液，透析液中含有50mM Tris-HCl，pH7.4，40mM KCl，6mM(AcO)₂Mg，0.01M EDTA和16％甘油。透析过程不断降低透析液中的盐酸胍浓度从4M、2M到0，每次都在4℃搅拌透析10小时。D-Cys81和D-Cys86之间通过空气氧化形成二硫键。我们又通过SDS-PAGE比较了大肠杆菌表达、合成的L型和合成的D型ASFV pol X，它们的条带位置保持一致(图3)。我们同时观察到少量未完全连接的肽段。我们通过圆二色光谱(CD)的方法对比了L和D型ASFV pol X。由于D-ASFV pol X不能被常用的蛋白酶降解(如胰蛋白酶和胃蛋白酶，实验结果未列出)无法进行测序，我们只用质谱测序分析了L-ASFV pol X的序列，在检测结果中覆盖到了100％的pol X序列(表3.1)。

表3.1化学合成的L-ASFV pol X质谱测序肽段序列

镜像DNA的检测

在D-ASFV pol X聚合酶成功合成之后，镜像遗传信息复制体系中还缺少镜像核酸。我们在美国Chemgenes公司购买了L-primer12、L-template18等镜像DNA片段(序列见2.1.3)和四种L-dNTP。

小结

我们设计了镜像DNA复制的体系，包括镜像聚合酶、镜像DNA、四种镜像dNTP以及适宜的缓冲液条件。我们通过Chemegenes获得了镜像DNA和四种dNTP。由于镜像蛋白质不能通过生物方法获得，我们找到了174个氨基酸的ASFV pol X聚合酶，并且设计了合成路线并合成了L型和D型的ASFV pol X聚合酶。通过盐酸胍变性-透析复性的方法将蛋白折叠至正确的构象。经过质谱、SDS-PAGE检测，验证化学合成蛋白的大小和天然蛋白一致。又通过CD检测，看到天然和镜像聚合酶的吸收谱对称。通过对合成L型ASFV pol X的测序，验证了化学合成蛋白序列的正确性。至此我们得到了镜像DNA复制系统的各个组成部分，具备了进行后续对于镜像聚合酶反应研究的条件。

镜像手性遗传信息复制和转录体系的功能研究

概述

目前为止前人没有关于镜像DNA复制和转录的研究，我们合成的镜像聚合酶，首先要验证镜像蛋白质和DNA相互作用的可能性，镜像聚合酶的手性特异性，以及复制出的DNA是否具有生物活性。我们同时尝试实现镜像DNA的多循环扩增，未来可以在研究中用于获得更多镜像核酸分子。由于ASFV pol X所在的X聚合酶家族中有一些酶可以利用NTP，模板互补扩增得到RNA分子，我们也尝试基于镜像DNA复制体系尝试依赖模板的转录。

镜像聚合酶催化的DNA延伸

我们已经设计了镜像DNA复制体系，并且通过化学合成的方法获得了体系中的主要组成部分(图5a)。下面我们在非手性的pH7.5Tris-HCl缓冲液中，加入20mM Mg²⁺，在天然的体系中加入0.7μg L-ASFV pol X聚合酶，2.5μM D-template18模版，2.5μM D-primer12引物以及0.2mM D-dNTPs；在镜像体系中加入相同浓度的D-ASFV pol X聚合酶以及D-引物、模板和dNTPs。将反应体系置于37℃静置4h。我们在L和D型的引物5’末端都添加了荧光素氨基磷酸酯(FAM)标记，而模板未加修饰。这样在未经染色的条件下用488nm光激发，可以看到primer条带。在两个体系中，天然和镜像的12nt引物都延伸到18nt(图5b)。在8M尿素变性的20％PAGE胶上，可以清晰分辨从12-18nt每个碱基的位置。0h作为对照组，引物长度为12nt，而4h是完全延伸的终产物，长度为18nt。根据模板序列推测延伸的6个碱基为ACTGAG，说明在镜像体系中4种dNTP均可以被用作底物合成DNA链，这一结论仍然需要后续的互补配对验证。我们进一步希望验证镜像延伸产物是否添加了正确的镜像核苷。由于目前的一代测序方法仍然依赖聚合酶和天然的dNTP衍生物，这一体系无法用于L-DNA的测序。我们尝试通过质谱的方法来验证18nt延伸产物的质量是否正确。我们通过ESI-MS检测得到镜像全长延伸产物分子量为5516.9Da(理论值5517.6Da)，在误差范围内认为18nt的全长产物质量正确。另外，我们希望了解镜像扩增体系是否有局限性，是否可以应用到不同的引物、模板序列，在另一组实验中使用了15nt引物、21nt模板(15nt引物不带FAM标记，PAGE胶经过Sybr Gold染色)，仍然可以观察到引物减少、中间条带出现以及全长DNA的量增大这些现象，说明镜像DNA延伸可以用于不同的DNA序列(图5d)。

镜像DNA复制系统多循环扩增DNA

我们尝试镜像DNA复制系统尝试进行多循环的PCR扩增。尽管ASFV pol X不是一个热稳定的酶，我们仍然可以通过每个循环加酶的方式进行多个循环的扩增。ASFV pol X结合DNA会阻碍下一个循环的扩增，所以我们在每个循环结束后进行酚氯仿抽提去除蛋白，再加入新的ASFV pol X。每个循环的抽提会带来较大的DNA损失(回收效率约为40％)，我们只进行3个循环的扩增。由于循环较少难以检测到DNA产物的增加，我们使用了FAM标记的引物，而且它只能使用第一个循环产生的全长延伸产物才能进行第二轮的扩增(图6)。在反应中使用了FAM标记的primer11，不带标记的reverse11，以及template27，全长产物为22nt(序列见2.1.3)。我们通过FAM标记的全长产物定量，检测到第2到第3循环发生了2.3倍的扩增，理论扩增值为3(图7)。结果在理论上证实了镜像DNA复制体系多循环扩增DNA的可行性。

镜像DNA复制系统的碱基互补配对特异性

我们进一步需要检测镜像聚合酶催化的DNA扩增是否遵守碱基互补配对的规则。我们将4种dNTP分别加入反应体系，在模板的下一个碱基分别为A、T、C、G时检测延伸情况(图8)。对于天然的系统，我们使用了primer12和四种不同的template，在其3’端第13个碱基的位置分别为A、T、C、G序列。而对于镜像系统，我们为了减少购买镜像DNA的成本，分别用primer12进行了1、2、3nt的延伸，并进行PAGE胶回收得到primer13、primer14、primer15，它们与template18互补，下一个模板上的碱基分别为T、G、A、C。我们观察到只有A：T、T：A、C：G、G：C4种正确的配对条件下dNTP可以高效率地添加到引物序列的3’末端，没有明显的错配发生，在天然和镜像的系统中保持一致。所以镜像DNA复制系统也遵循互补配对原则，并且有着一定的保真度。

镜像DNA复制系统的手性特异性

关于聚合酶在添加dNTP时的手性特异性，在天然的聚合酶上已经有了一些研究。之前的研究表明哺乳动物聚合酶γ、大肠杆菌聚合酶I、HIV-1逆转录酶催化的DNA延伸会受到L-dTTP的抑制，而对于哺乳动物聚合酶α，L-dTTP不会抑制其催化的DNA聚合反应，对于哺乳动物β，抑制的效果比较微弱(Yamaguchi et al.，1994)。L-dTTP会抑制人的DNA聚合酶γ、δ、牛胸腺末端转移酶，但是不会抑制人DNA聚合酶β，但是DNA聚合酶β、γ、δ不能使用L-dTTP作为底物。在3’末端添加的L-核苷会让DNA难以被3’-5’外切酶降解(Focher et al.，1995)。所以有的聚合酶在添加两种底物时会受到镜像dNTP的抑制而有的不会。我们的研究希望阐释对于镜像ASFV pol X是否会有手性特异性，以及它的聚合酶活性是否会受到天然手性dNTP的抑制。我们的研究中首先尝试单独添加不同手性的聚合酶、引物-模板、dNTP的组合，再尝试将天然和镜像两个体系放在同一溶液中进行反应。

我们在与之前相同的缓冲液条件下，分别改变ASFV pol X、引物-模板和dNTP的手性，每个成分L型和D型两种手性，体系共有8种组合(图9)。将体系置于37℃孵育12小时，在20％PAGE胶上观察结果。我们发现L-ASFV pol X、D-引物-模板、D-dNTPs的天然体系可以延伸6个碱基到全长，D-ASFV pol X、L-引物模板、L-dNTPs的镜像体系可以延伸到全长，而其他的组合均不可以延伸。例如L-ASFV pol X、D-引物-模板、L-dNTPs，天然的聚合酶不能将镜像的dNTPs添加到天然引物的3’末端；对于L-ASFV pol X、L-引物-模板、D-dNTPs，天然的聚合酶不能将天然的dNTPs添加到镜像引物的3’末端；D-ASFV pol X、L-引物-模板、D-dNTPs，镜像的聚合酶不能将天然的dNTPs添加到镜像引物的3’末端；对于D-ASFV pol X、D-引物-模板、L-dNTPs，镜像的聚合酶不能将镜像的dNTPs添加到天然引物的3’末端。所以在镜像和天然的体系中，错误手性的引物-模板、dNTP均不能被作为底物参加延伸反应，天然和镜像的DNA复制体系有着良好的手性特异性。

我们进而希望探究天然和镜像的系统在同一个溶液体系之中，是否会发生相互干扰。前面所述的文献表明，对于某些聚合酶镜像的dNTP会阻止DNA延伸反应的继续进行。我们的实验使用了与之前相同的缓冲液体系，并同时加入了两种手性，相同浓度的ASFV polX和dNTPs。为了分别观察引物的延伸，我们设计了长度不同的引物和模板序列，并且使用了不同的荧光修饰，天然反应使用Cy5标记的primer20以及template26，镜像反应是FAM标记的primerl2和templatel8。我们将相同浓度的两种手性引物和模版都加入同一个溶液体系，在37℃反应4小时以后在20％PAGE胶上分离检测反应产物(图10)。红色的条带为天然反应，在21nt和26nt之间，而绿色的条带为镜像反应，在12nt和18nt之间。左边的样品是只有天然体系的对照组，中间的是镜像体系单独反应的对照组，右侧是天然和镜像相同浓度在同一溶液体系中反应的实验组。我们可以看到在实验组中两个体系都可以分别延伸到18nt和26nt的全长，混合体系反应速率与单独反应相差不多，说明天然和镜像体系在同一个溶液之中不存在严重的相互干扰。

镜像DNAzyme的酶合成以及功能检测

我们已经验证了镜像DNA复制系统可以依赖模板合成DNA，而且具有一定的碱基互补配对特异性。进而我们希望验证镜像聚合酶合成的镜像DNA序列具有生物活性。

上世纪九十年代，体外筛选技术(in vitro selection)创立并得到应用。这项技术可以通过复杂度高的随机DNA或RNA序列库进行设计筛选，得到功能性的DNA或RNA分子，主要有可以结合特定靶标的核酸适体(aptamer)和有催化活性的核酶(ribozyme)和脱氧核酶(DNAzyme)。以核酸适体为例，体外筛首先要合成单链核酸序列库，其中含有20-80个随机序列，文库复杂度达到10¹⁴。文库中不同核酸的一级序列不同，它们在溶液中会形成不同的空间构型。在适宜的条件下将随机库与靶标分子相互作用，捕获能够与靶标结合的DNA或RNA分子，再将这些分子进行PCR扩增。得到扩增的这些分子相对于原始随机库对于靶标的亲和力得到了增强，将它作为次级库，再对于靶标分子进行第二轮的筛选。这样经过反复的扩增就能筛选到高亲和力的核酸适体序列。

我们选择用D-ASFV pol X合成一段L-DNAzyme序列，再验证它的脱氧核酶活性。R.Breaker及其同事在2013年的研究中发现并验证了多个DNAzyme序列的活性(Gu et al.，2013)，我们选取了其中一个44nt的Zn²⁺依赖的DNAzyme作为合成的目标。我们设计出的全长DNAzyme包括5’末端12nt的引物序列和完整的44ntDNAzyme序列(图11a)：5’ACTACGAACGCGGGTGCTACAGCCATAGTTGAGCAATTAGTTGAAGTGGCTGTACA(SEQ ID NO：12)

我们将它的反向互补序列作为模板(为了方便胶回收分离单双链，我们在模板的3’末端额外添加了10nt)，加入primer12经过36小时的延伸获得了全长的DNAzyme序列(图11b)。与marker的比对发现通过聚合酶合成的DNAzyme大小是正确的。天然的聚合酶催化合成DNAzyme全长序列的速率高于镜像系统，这可能由于镜像引物、模板和dNTP中含有杂质。此实验进一步说明镜像DNA复制系统的延伸长度在44nt以上，并且没有明显的序列选择性。我们进一步将反应到全长的DNAzyme胶染色并切下，与66nt的template小心分开，放在缓冲液中扩散过夜，并且用试剂盒沉淀DNAzyme序列。溶解DNAzyme之后先在90℃加热再降至室温使56nt的DNAzyme序列折叠成正确的结构。然后再反应体系中加入buffer2以开始反应。对照组buffer2含有20mM Mg²⁺，实验组含有2mM Zn²⁺，在37℃反应36h。天然和镜像酶合成的DNAzyme，均可以在2mM Zn²⁺离子存在的条件下实现高效率的自我剪切，在缺少Zn²⁺或者加入Mg²⁺的对照实验中都不能自我剪切(图11c)。所以说明通过镜像ASFV pol X合成的DNAzyme序列具有自我剪切的活性。

DNA模板依赖的镜像转录

我们已经验证了镜像的DNA聚合酶可以依照DNA模板进行引物的延伸，进而希望研究是否可以将镜像DNA转录为镜像RNA。已知的X家族DNA聚合酶对于dNIP和rNTP的选择性很差，pol μ可以依照模板添加dNTP或者rNTP到DNA链上，定量来看，它对于rNTP的选择特异性低于pol β 1000倍(Sa and Ramsden，2003)。ASFV pol X没有被验证过是否可以利用rNTP。我们首先用天然手性的ASFV pol X在primer12和template18的体系中加入rNTP。我们发现尽管延伸的效率降低了很多，仍然可以在36小时后得到全长的延伸产物(图12a)。

RNase A特异性地催化RNA的核糖在C和U残基的下一个核苷酸5′磷酸二酯键断裂，它可以识别3’，5’磷酸二酯键而不能切断2’，5’键，形成具有2′，3′-环磷酸衍生物3′C或3′U寡聚核苷酸。我们将36小时反应后的延伸产物加热到75℃10min时间，失活RNase抑制剂以及ASFV pol X，然后再加入不同浓度的RNase A进行消化(图12b)。我们可以看到第一步的加热反应没有使RNA发生降解，但是RNase A的加入使得全长的18nt产物降解为13nt，并且随着RNase A的浓度越高降解越明显。这一实验证明了RNase A消化RNA合成产物验证了添加的是rNTP，并且rNTP的添加方式为3’，5’连接。

在镜像的ASFV pol X和DNA的体系中，也可以将L-rNTP添加到引物链上，尽管速率比天然的体系要慢(图12a)。我们同样认为这可能是镜像模板、引物和rNTP的纯度不够高引起的(在HPLC中可以观察到杂峰，在CD中发现模板、引物的量小于标称值)。

镜像转录RNA系统的碱基互补配对特异性

最后我们需要验证RNA转录体系是否依照模板遵循碱基互补配对规则。将4种rNTP分别加入反应体系，使用了5’末端FAM标记的primer12作为引物，在模板的下一个碱基分别为A、T、C、G时，观察是否可以延伸到13nt。对于天然的系统，我们使用了primer12和四种不同的template，在其3’端第13个碱基的位置分别为A、T、C、G序列。而对于镜像系统，分别用primer12添加A、AC、ACT进行了延伸反应，并进行PAGE胶回收得到primer13、primer14、primer15，它们与template18互补时下一个模板上的碱基分别为T、G、A、C。我们观察到A：U、U：A、C：G、G：C4种正确的配对条件下rNTP可以高效率地添加到引物序列的3’末端。镜像体系中出现了一些较为明显的错配，比如T：rG，A：rC等等，但是错误核苷添加的效率显著低于正确配对的(图13)。所以镜像RNA转录系统遵循互补配对原则，有着一定的保真度。

小结

我们设计构建的镜像手性遗传信息复制和转录体系，包含核心成分为D-ASFV polX、L-引物、L-模板、L-dNTPs/rNTPs，可以依照模板实现DNA的扩增和转录RNA，说明镜像手性的聚合酶和DNA有相互作用。利用ASFV pol X聚合酶，我们实现了理论上的多循环扩增DNA，在第二至第三循环实现了2.3倍的DNA扩增。另外，我们验证了在利用天然和镜像体系添加dNTP或rNTP延伸引物链，遵循碱基互补配对原则，保真度良好。聚合酶、引物模板和dNTP在反应体系中存在手性特异性，只有三者全是天然或者全是镜像分子时引物链可以延伸，其他的各种组合均不能实现扩增。在同一溶液体系中加入相同浓度的两种手性的DNA复制体系，两个体系可以分别进行延伸反应，没有严重的相互阻碍。我们用镜像ASFV pol X延伸了44nt的Zn²⁺依赖的DNAzyme序列，在含有2mM Zn²⁺的缓冲液环境中，经过纯化分离的单链L-DNAzyme有着自我剪切的生物活性。

总结与展望

总结

起源于对镜像生物分子的存在与生物活性的探究，我们的工作构建了基于D-ASFVpol X的镜像遗传信息复制和转录体系。主要结论如下：

一.我们设计了镜像DNA复制的体系，包括镜像聚合酶、镜像DNA、四种镜像dNTP，以及适宜的缓冲液条件(50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl)。通过全化学合成的方法得到了D-ASFV pol X的全长序列，并且通过盐酸胍变性-透析的方法成功对其进行折叠复性。通过HPLC、SDS-PAGE、ESI-MS、CD等方法对其进行了分析检测。

二.在镜像DNA复制体系中，在上述缓冲液条件下加入0.7μg D-ASFV pol X聚合酶，2.5μM L-模版，2.5μM L-引物以及0.2mM L-dNTPs(每种浓度)，我们证实在多个模板引物组合中(primer12-template18，primer15-template21，primerl2-DNAzymeTemplate)镜像DNA的复制延伸均可以进行。并且在DNA复制过程中新合成的DNA与模板链互补，镜像复制过程遵循碱基互补配对法则，有着较好的保真性。

三.在反应体系中加入合适的模板和双链引物，使用95℃变性-室温退火-37℃延伸的PCR循环，每次退火后重新加入D-ASFV pol X，可以实现对于DNA模板的多循环扩增。

四.在实验中变换ASFV pol X、引物-模板、dNTP的手性组合，一共有8种情况，在适宜的反应体系中尝试进行延伸反应，只有L-ASFV pol X、D-引物-模板、D-dNTPs的全天然组合，以及D-ASFV pol X、L-引物-模板、L-dNTPs的全镜像组合可以反应，其余六种条件在反应时间内均未检测到延伸。说明基于ASFV pol X的天然和镜像DNA复制系统可以识别错误手性的底物，在延伸反应中有着良好的手性特异性。

五.在混合两种手性的实验中，同一个反应体系中加入两种手性的ASFV pol X、引物、模板和dNTP，两个体系可以正确地识别本体系的蛋白或核酸分子，分别完成DNA链的延伸，没有严重的相互干扰。

六.用镜像DNA复制体系扩增一段44nt的Zn²⁺依赖DNAzyme序列，在经过36小时的延伸后获得全长DNA链。通过PAGE胶回收分离得到单链DNAzyme，在含有2mM Zn²⁺的缓冲液环境中，L-DNAzyme有着自我剪切的生物活性，而对照组20mM Mg²⁺条件下不能剪切。镜像DNA复制系统可以扩增长链的、有活性的L-DNA序列。

七.镜像转录体系含有D-ASFV pol X、L-模板、L-引物和L-rNTP，在50mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM MgCl₂，1mM DTT，50mM KCl条件下可以将L-rNTP添加到模板的3’末端，合成一段RNA序列。D-ASFV pol X模板依赖的转录RNA反应速率低于复制DNA，转录同样遵循碱基互补配对原则，有一些错配产生。

我们的工作实现了构建镜像DNA复制和转录体系，并且证实了镜像聚合酶可以依照模板复制镜像DNA或者生成RNA链。虽然生命起源早期的进化证据已经无从查找，我们仍然不知道为何镜像的分子在高等细胞生命的进化过程中被舍弃了，但是我们在实验上证实了镜像生命分子可以实现相应的生物功能，提供了镜像分子存在的可能性依据。对于镜像中心法则中两个重要环节的实现，为未来在实验室环境中构建完整的镜像生命奠定了基础。

应用及展望

我们的工作延续了对于镜像手性生物分子的研究，不仅证实了镜像分子如研究者预期的那样具有和天然分子相对应的活性和手性特异性，而且作为理论和实践应用的开端，完成了镜像中心法则中的DNA复制和转录RNA两个环节。本发明有两个主要的应用领域：一是将镜像DNA复制体系用于体外筛选获得核酸药物，二是尝试构建完整的镜像原始细胞。

一.镜像体外筛选获得核酸药物是未来很有应用前景的方向。天然和镜像的核酸序列都可以由于其多样的序列折叠成复杂多样的结构，有一些可以结合特定靶标分子DNA或RNA被称为核酸适体(aptamer)。通常获得核酸适体的方式是体外筛选技术，体外筛选使用含有通常30-80个随机序列的DNA或RNA，一般可以达到1014以上的复杂度，两端加上固定的引物互补区方便PCR扩增。在筛选的过程中通常要用不同的方法固定靶标分子，将随机序列库与靶标分子放在一起结合，然后用洗涤液分离去除不与靶标分子结合的核酸序列，进而再获得亲和力较强的核酸分子，通过PCR扩增富集高亲和强度的序列。经过多循环的筛选，即可得到与靶标分子较强结合的一个或几个核酸序列。

如果针对疾病相关的某种蛋白或小分子进行体外筛选，例如CDK、GPCR、Bcl-2等，可能可以获得与之高亲和力的核酸适体分子。然而将这些分子应用于临床的效果并不理想，在体内会快速被降解。进而有研究者希望以在体内更稳定的镜像核酸分子作为药物。目前已有的研究通过合成镜像的靶标分子，再用天然的随机序列库进行体外筛选，获得可以结合镜像靶标的天然核酸序列。由于手性镜像的关系，使用同样的序列合成镜像核酸适体，即可结合天然靶标(Williams et al.，1997)。这种筛选方法可以有效的获得能结合天然分子的镜像核酸适体，但是问题在于蛋白质化学合成的技术难度很高，很少有学术或商业机构可以合成较为复杂的蛋白质，而且生命体中的大多数的靶点都超出了目前蛋白合成的技术范围，例如PD-L1蛋白大小为40kDa。

镜像体外筛选的难度在于目前没有办法在筛选的每一轮进行镜像PCR扩增。我们的镜像PCR技术将可以实现这一点。通过DNA合成仪合成镜像随机序列库，直接将其用于天然药物靶点的结合，再通过漂洗、洗脱、扩增高亲和序列，经多个循环直接得到镜像核酸适体序列，可以经优化和临床试验作为潜在药物分子。对于镜像PCR技术，本文用ASFV pol X每个循环加酶的方式实现了镜像PCR。ASFV pol X的反应速率很低(在病毒中主要用于基因组缺口的修复)，以及它不是耐热聚合酶，在3.5M脯氨酸保护的条件下50℃1分钟即失去活性。未来可以选用已经发现的高效、耐热聚合酶，在合成技术范围内的比如352个氨基酸的Dpo4(Sulfolobus solfataricus P2 DNA polymerase IV)，文献报道Dpo4可以用于PCR扩增，未来可以使用镜像Dpo4蛋白进行PCR和镜像的体外筛选。

二.构建镜像生命的重要步骤是将镜像中心法则中的另一个重要步骤——翻译过程在实验室实现。镜像核糖体和tRNA是实现翻译的主要生物原件，目前的技术水平仍然倾向于使用化学合成的方法来构建。细菌的核糖体包含rRNA，通常还有50-80个核糖体蛋白组成(Wilson et al.，2009)，大多数的都短于240个氨基酸，目前的蛋白合成技术可以实现，还有一个557个氨基酸的rpsA蛋白需要未来改进的蛋白合成技术来实现。各组成部分别合成之后在体外进行复性和组装，成为有功能的镜像核糖体。通过化学合成DNA和PCR扩增更长的L-DNA模板，转录出长的L-mRNA，再用镜像的核糖体和tRNA可以得到实现镜像细胞功能的蛋白分子，例如DNA连接酶、解旋酶、丙酮酸脱氢酶等等。如果能尽量多地合成出镜像细胞所需的蛋白和核酸组成成分，未来通过进一步的技术进展将会有可能构建简单的镜像细胞，也可以使用镜像细胞生产镜像的药物或镜像生物材料。

主要符号对照表

ASFV pol X 非洲猪瘟病毒聚合酶X

DNAzyme 脱氧核酶

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis)

Tris 三羟甲基氨基甲烷

NMDA N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid)

HPLC 高效液相色谱(high performance liquid chromatography)

ESI-MS 电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry)

EDTA 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)

FAM 荧光素氨基磷酸酯(fluorescein amidite)

参考文献

Breslow，R.，and Levine，M.(2006).Amplification of enantiomericconcentrations under credible prebiotic conditions.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 103，12979-12980.

Corrigan，J.(1969).D-Amino Acids in Animals.Science 164，142-149.

Dawson，P.E.，and Kent，S.B.H.(2000).Synthesis of Native Proteins byChemical Ligation.Annual Review of Biochemistry 69，923-960.

Dawson，P.E.，Muir，T.W.，Clark-Lewis，I.，.，and Kent，S.B.(1994).Synthesisof proteins by native chemical ligation.Science 266，776-779.

Engel，M.，and Macko，S.(2001).The stereochemistry of amino acids in theMurchison meteorite.Precambrian Research 106，35-45.

Fields，G.(2002).Introduction to Peptide Synthesis，Vol Chapter 11.

Fitzgerald，M.C.，Chernushevich，I.，Standing，K.G.，Kent，S.B.H.，andWhitman，C.P.(1995).Total Chemical Synthesis and Catalytic Properties of theEnzyme Enantiomers L-and D-4-Oxalocrotonate Tautomerase.Journal of theAmerican Chemical Society 117，11075-11080.

Focher，F.，Maga，G.，Bendiscioli，A.，Capobianco，M.，Colonna，F.，Garbesi，A.，and Spadari，S.(1995).Stereospecificity of human DNA polymerases alpha，beta，gamma，delta and epsilon，HIV-reverse transcriptase，HSV-1 DNA polymerase，calfthymus terminal transferase and Escherichia coli DNA polymerase I inrecognizing D-and L-thymidine 5′-triphosphate as substrate.Nucleic AcidsResearch 23，2840-2847.

Gu，H.，Furukawa，K.，Weinberg，Z.，Berenson，D.F.，and Breaker，R.R.(2013).Small，Highly Active DNAs That Hydrolyze DNA.Journal of the American ChemicalSociety 135，9121-9129.

Hamase，K.，Inoue，T.，Morikawa，A.，Konno，R.，and Zaitsu，K.(2001).Determination of Free[formula omitted]-Proline and[formula omitted]-Leucinein the Brains of Mutant Mice Lacking[formula omitted]-Amino Acid OxidaseActivity.Analytical Biochemistry 298，253-258.

Hashimoto，A.，Kumashiro，S.，Nishikawa，T.，Oka，T.，Takahashi，K.，Mito，T.，Takashima，S.，Doi，N.，Mizutani，Y.，Yamazaki，T.，et al.(1993).EmbryonicDevelopment and Postnatal Changes in Free d-Aspartate and d-Serine in theHuman Prefrontal Cortex.Journal of Neurochemistry 61，348-351.

Hashimoto，A.，Oka，T.，and Nishikawa，T.(1995).Anatomical Distributionand Postnatal Changes in Endogenous Free D-Aspartate and D-Serine in RatBrain and Periphery.European Journal of Neuroscience 7，1657-1663.

Joyce，G.，Visser，G.，Van Boeckel，C.，Van Boom，J.，Orgel，L.，and VanWestrenen，J.(1984).Chiral selection in poly(C)-directed synthesis of oligo(G).Nature 310，602.Kent，S.B.(1988).Chemical synthesis of peptides andproteins.Annual Review of Biochemistry 57，957-989.

Klusmann，S.，Nolte，A.，Bald，R.，Erdmann，V.，and Furste，J.(1996).Mirror-image RNA that binds D-adenosine.Nature Biotechnology 14，1112.

Krause，E.，Bienert，M.，Schmieder，P.，and Wenschuh，H.(2000).The Helix-Destabilizing Propensity Scale of d-Amino Acids：The Influence of Side ChainSteric Effects.

Liu，S.，Pentelute，B.L.，and Kent，P.S.B.H.(2012).Convergent ChemicalSynthesis of [Lysine 24，&thinsp；38，&thinsp；83]Human Erythropoietin&dagger.Angewandte Chemie International Edition 51，993&ndash；999.

Maciejewski，M.，Shin，R.，Pan，B.，Marintchev，A.，Denninger，A.，Mullen，M.，Chen，K.，Gryk，M.，and Mullen，G.(2001).Solution structure of a viral DNA repairpolymerase.Nature Structural&Molecular Biology 8，936.

Milton，R.，Milton，S.，and Kent，S.(1992).Total chemical synthesis of aD-enzyme：the enantiomers of HIV-1 protease show reciprocal chiral substratespecificity[corrected].

Science 256，1445-1448.

Mothet，J.，Parent，A.，Wolosker，H.，Brady，R.，Linden，D.，Ferris，C.，Rogawski，M.，and Snyder，S.(2000).d-Serine is an endogenous ligand for theglycine site of the

N-methyl-d-aspartate receptor.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 97，4926.

Nagata，Y.，Homma，H.，Lee，J.，and Imai，K.(1999).d-Aspartate stimulationof testosterone synthesis in rat Leydig cells.FEBS Letters 444，160-164.

Nolte，A.，Klusmann，S.，Bald，R.，Erdmann，V.，and Furste，J.(1996).Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-arginine.NatureBiotechnology 14，1116.

Ohide，H.，Miyoshi，Y.，Maruyama，R.，Hamase，K.，and Konno，R.(2011).d-Aminoacid metabolism in mammals：Biosynthesis，degradation and analytical aspects ofthe metabolic study.Journal of Chromatography B 879，3162-3168.

Oliveros，M.，Yanez，R.，Salas，M.，Salas，J.，Vinuela，E.，and Blanco，L.(1997).

Characterization of an African Swine Fever Virus 20-kDa DNAPolymerase Involved in DNA Repair.Journal of Biological Chemistry 272，30899-30910.

Qian，W.，and Danishefsky，S.J.(2007).Free-radical-based，specificdesulfurization of cysteine：a powerful advance in the synthesis ofpolypeeptides and glycopolypeeptides.

Angewandte Chemie International Edition 46，9248-9252.

Sa，N.，and Ramsden，D.(2003).Polymerase mu is a DNA-directed DNA/RNApolymerase.

Molecular and Cellular Biology 23，2309-2315.

Schell，M.，Molliver，M.，and Snyder，S.(1995).D-serine，an endogenoussynaptic modulator：localization to astroeytes and glutamate-stimulatedrelease.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 92，3948-3952.

Sczeepanski，J.，and Joyce，G.(2014).A cross-chiral RNA polymeraseribozyme.Nature 515，440.

Showalter，A.，Byeon，I.，Su，M.，and Tsai，M.(2001).Solution structure of aviral DNA polymerase X and evidence for a mutagenic function.NatureStructural&Molecular Biology 8，942.

Showalter，A.，and Tsai，M.(2001).A DNA Polymerase with Specificity forFive Base Pairs.

Vinogradov，A.，Evans，E.，and Pentelute，B.(2015).Total synthesis andbiochemical

characterization of mirror image barnase.Chemical Science 6，2997-3002.

Weinstock，M.，Jacobsen，M.，and Kay，M.(2014).Synthesis and folding of amirror-image enzyme reveals ambidextrous chaperone activity.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 111，11679-11684.

Williams，K.，Liu，X.，Schumacher，T.，Lin，H.，Ausiello，D.，Kim，P.，andBarrel，D.(1997).

Bioactive and nuclease-resistant 1-DNA ligand ofvasopressin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 94，11285-11290.

Wilson，D.，Gupta，R.，Mikolajka，A.，and Nierhaus，K.(2009).RibosomalProteins：Role in Ribosomal Functions，Vol 2009.

Wolosker，H.，Blackshaw，S.，and Snyder，S.(1999).Serine racemase：A glialenzyme synthesizing d-serine to regulate glutamate-N-methyl-d-aspartateneurotransmission.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 96，13409-13414.

Wyszko，E.，Szymanski，M.，Zeichhardt，H.，Muller，F.，Barciszewski，J.，andErdmann，V.(2013).Spiegelzymes：Sequence Specific Hydrolysis of L-RNA withMirror Image Hammerhead Ribozymes and DNAzymes.PloS one 8，e54741.

Yamaguchi，T.，Iwanami，N.，Shudo，K.，and Saneyoshi，M.(1994).ChiralDiscrimination of Enantiomeric 2′-Deoxythymidine 5′-Triphosphate by HIV-1Reverse Transcriptase and Eukaryotic DNA Polymerases.Biochemical andBiophysical Research Communications 200，1023-1027.

Zuker，M.(2003).Mfold web server for nucleic acid folding andhybridization prediction.Nucleic Acids Research 31，3406-3415.

实施例2

热稳定DNA聚合酶的化学全合成

聚合酶链式反应(PCR)是应用于现代生物学研究中的重要工具。为了实现镜像生命体系的聚合酶链式反应，我们设计并且化学合成了一个具有热稳定性的DNA聚合酶。该酶是由352个氨基酸残基组成的来自硫磺矿硫化叶菌P2菌株(Sulfolobus solfataricus P2)的DNA聚合酶IV(DNA polymerase IV，Dpo4)。这一化学合成的L型DNA聚合酶是迄今为止报道过的分子量最大的人工合成蛋白质。经过PCR反应体系的优化，我们最终使用这一人工合成的L型Dpo4酶扩增出长达1.5Kb的DNA序列。L型Dpo4酶的化学合成路线的确立为日后合成适用于镜像体系PCR的D型DNA聚合酶奠定了坚实的基础，从而为发现更多镜像分子工具开辟新道路。

在之前的研究中，我们化学合成了含有174个D型-氨基酸残基的镜像非洲猪热病毒聚合酶X(D-ASFV pol X)，并且成功通过该酶实现镜像DNA复制与转录[1]。然而由于ASFVpol X酶的持续合成能力较低，通过引物延伸实验我们最终只能得到一条长为44nt的依赖于锌离子进行自我剪切的L型-脱氧核酶(DNAzyme)[1]。此外，由于ASFV pol X不具有热稳定性，我们只应用其进行了概念上的镜像基因复制链式反应实验，即在每一个循环都添加新的酶[1]，这使得该酶不能有效地扩增L构型DNA，从而限制了其在镜像生命体系中的应用。

为了实现镜像DNA的有效扩增，我们可以通过对目前的L-ASFV pol进行定向改造或者寻找和发展新的合成途径来获得更高效的和具有热稳定性的镜像聚合酶。PCR反应中最常使用的Taq DNA聚合酶有832个氨基酸残基，而目前通过化学方法合成的最大的蛋白质仅含有312个氨基酸残基，因此很难通过全化学合成的方法合成Taq DNA聚合酶。然而来自硫化叶菌P2菌株的具有热稳定性的DNA聚合酶IV(Dpo4)不但能够PCR扩增长达1.3kb的DNA序列[3]，而且只含有352个氨基酸残基，因此我们着手探索Dpo4酶的化学合成路线。

结果：

突变型Dpo4酶全化学合成的设计

由于通过固相多肽合成法(SPPS)直接合成的肽链一般不超过50个氨基酸残基，因此我们采用自然化学连接法(NCL)通过天然肽键将短的多肽片段连接成长的多肽片段[4，5]。这种方法要求在连接位点的N末端有半胱氨酸(Cys)残基，然而在野生型(WT)的Dpo4氨基酸序列(图14a)中仅存在一个半胱氨酸(Cys31)。在缺失半胱氨酸连接位点的情况下，我们在序列中寻找若干个丙氨酸(Ala)位点，在化学合成时将其替代为半胱氨酸，然后采用非金属自由基脱硫的方法在连接完成后将半胱氨酸再转变为丙氨酸。在原始序列中，A42，A155，A229和A268可作为这种方法的连接位点。然而，即使应用这四个丙氨酸残基作为连接位点，大多数多肽片段还是大于50个氨基酸残基，因此为了在此酶的氨基酸序列中引入更多可用的连接位点，我们在原始氨基酸序列引入了四个点突变(S86A，N123A，S207A和S313A)(图14b)。此外为避免在折叠过程中蛋白分子通过二硫键形成二聚体，还另外引入了C31S突变。我们在大肠杆菌中表达并纯化了含有这五个突变的重组聚合酶并且测试了活性，实验表明这五个点突变(C31S，S86A，N123A，S207A和S313A)不影响酶的PCR活性(图16b)。

我们利用这5个点突变采用基于酰肼基团的自然化学连接法(图15)从C至N末端方向组装9个多肽片段(Dpo4-1至Dpo4-9)，从而实现了Dpo4-5m聚合酶的全化学合成[5，7，8]。为避免氨基酸侧链在SPPS和蛋白质连接过程中发生氧化，我们用正亮氨酸(Nle)取代蛋白中原有甲硫氨酸残基(Met1，Met76，Met89，Met157，Met216和Met251)。由于正亮氨酸和甲硫氨酸是等排的，所以正亮氨酸取代甲硫氨酸对蛋白质结构和功能几乎没有影响[9]。此外我们还在合成酶的N末端添加了组氨酸标签(His6)，以便在后续实验中进一步纯化该蛋白。这样使得最终合成的多肽(Dpo4-5m)总长度为358个氨基酸(352个氨基酸的聚合酶加上6个氨基酸的His6标签；参见图14b)。

Dpo4-5m的化学合成

长度范围在22至52个氨基酸的所有肽段都是通过基于Fmoc的固相多肽合成法来合成，并用反相高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化。在用固相多肽合成法合成肽段过程中，我们发现未经修饰的肽段Dpo4-1和Dpo4-3具有高疏水性，它们在乙腈水溶液中的溶解性很低。文献报道将异酰基二肽掺入肽片段可以提高肽段的水溶性[10，11]，并且在自然化学连接的条件下(pH～7)可以快速地进行O至N-酰基转移成为天然酰基键，从而实现无痕修饰[10，11]。因此，我们在Val30-Ser31(在肽段Dpo4-1中)和Ala102-Ser103(在肽段Dpo4-3中)之间插入异酰基二肽。我们的实验结果表明掺入异酰基二肽不仅提高了肽段的溶解度，而且提高了多肽纯度。此外，我们还采用乙酰胺甲基(Acm)来保护肽段Dpo4-3和Dpo4-4的N-末端Cys，这样可以防止在连接和Cys脱硫过程中肽段的环化[12]。同时，我们在肽段Dpo4-5、Dpo4-7和Dpo4-8中引入三氟乙酰基噻唑烷-4-羧酸(Tfa-Thz)作为N-末端Cys的保护基团，Tfa-Thz与酰肼氧化相互兼容而且可以在碱性条件下迅速地转化回Thz。因此，可以通过自然化学连接和Tfa-Thz脱保护的一锅法策略，方便地获得N-末端Cys未保护的肽段Dpo4-13，Dpo4-14和Dpo4-17(参见附录)。

通过使用自然化学连接法，在C末端到N末端方向上组装9个肽片段之后[5，7，8]，我们得到含358个氨基酸的合成肽段，终产量为16mg(图19-32)。利用分析型反相高效液相色谱(HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析所得全长肽的分子量为40797.5Da，理论值为40799.9Da(图32B，C)。将冻干的肽段粉末溶解于含6M盐酸胍的变性缓冲液中，然后用分别含4M、2M、1M和0M盐酸胍的复性缓冲液连续透析来实现帮助肽段正确折叠。然后将折叠好的聚合酶加热到78℃，热不稳定的肽段以及未正确折叠的全长肽段在此温度下会聚集沉淀，进而可以通过超速离心将其移除；而折叠完全的合成的Dpo4-5m聚合酶由于具有热稳定性会存在于上清中，经Ni-NTA柱纯化后用离心过滤器进行浓缩。浓缩后的Dpo4-5m聚合酶用SDS-PAGE分析其分子量大小及纯度(图16a)。同时使用LC-MS/MS质谱对其氨基酸序列进行测定，我们分别进行了由胰蛋白酶和胃蛋白酶处理的两个独立质谱测序实验，两次检测结果覆盖了100％的序列(见附表S2)。

应用化学合成的Dpo4-5m聚合酶进行PCR反应

我们首先应用200bp的模板检测通过上述方法制备的Dpo4-5m聚合酶的PCR活性。如图33所示，通过比较不同循环数的PCR产物的相对量，可以得出其PCR扩增效率约为1.5，与重组表达得到的野生型和突变型的聚合酶扩增效率基本相当。随后将扩增35个循环后的PCR产物克隆到T载体上进行sanger测序，与原始序列比对结果显示在测得的22个克隆中，共存在7个单碱基缺失和19个单碱基突变(图34)，该结果说明在35个循环后的其累积突变率约为0.9％，这与文献中报道的野生型Dpo4聚合酶的复制错误率基本一致[3，14]。

随后，我们应用Dpo4-5m聚合酶扩增不同长度的DNA序列。如图17a所示，在35个循环后可以扩增得到从110bp到1.0kb的不同长度的PCR产物，随着模板长度的增加，PCR扩增效率会逐渐下降。在该实验中，各个PCR反应条件基本一致，延伸时间随模板长度的不同而有所变化，对于110-300bp的片段，每个循环的延伸时间为2分钟，400-600bp为5分钟，700-1000bp为10分钟。

在Dpo4-5m能够扩增1.0kb的DNA片段的基础上，我们尝试并成功实现了长达1.1kb的dpo4基因片段的PCR扩增(图17b)，该片段是Dpo4聚合酶自身的编码基因。此外，我们还成功扩增了120bp的大肠杆菌5s rRNA基因rrfB和1.5kb的大肠杆菌16S rRNA基因rrfC，这些基因可用于转录相应的核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)，因此对于镜像核糖体(ribosome)的组装具有重要意义[15]。我们通过该方法得到的1.5kb的扩增片段超过此前文献中报道的应用野生型Dpo4聚合酶扩增的最长片段(1.3kb)。

应用化学合成的Dpo4-5m聚合酶进行组装PCR反应

组装PCR是一种可以得到化学合成(通常小于150nt)不能有效合成的长DNA寡核苷酸链的方法。自然界中缺乏可用的L型DNA模板，那么就可以用这一方法获得长的镜像基因序列。我们应用Dpo4-5m聚合酶成功组装了198bp的tC19Z基因，该基因编码一个通过体外进化方法得到的具有以RNA为模版的RNA聚合酶活性的核酶(ribozyme)[17]。实验中我们使用两个具有30bp重叠序列的长引物(tC19Z-F115和tC19Z-R113)进行PCR扩增反应。在20个循环后，使用核酸外切酶I(Exo I)消化实验组与负对照组(不加酶)，该酶只能消化单链DNA而不能消化双链DNA，因此最终反应体系中只剩下组装好的全长双链DNA。图18a中的琼脂糖电泳结果表明该实验成功组装得到了全长198b的双链DNA，其产物序列也通过sanger测序进行了验证。

我们同时尝试使用6个长度在47nt到59nt之间的短引物，进行三步组装PCR来扩增得到长为198bp的tC19Z基因序列(图18c)。这样的扩增策略未来可以应用于镜像PCR系统中，由短的寡核苷酸引物链出发最终组装成为全长的L型基因序列。在该实验中第一步用tC19Z-F1和tC19Z-R1引物进行五个循环数的组装PCR；第二步是以第一步的组装PCR产物为模版用引物tC19Z-F2和tC19Z-R2扩增10个循环；最后一步的以第二步的产物作为模版用引物tC19Z-F3和tC19Z-R3扩增20个循环后得到最终的全长产物。琼脂糖凝胶电泳分析表明三步PCR反应的分别得到长度为88bp，162bp和198bp的扩增产物(图18d)，最终全长产物也通过sanger测序法进行了验证。我们也尝试了同时使用6个引物进行一步PCR反应，但该方法会出现较多的副产物条带。

讨论：

我们之前报道过的基于ASFV pol X的镜像遗传复制系统由于缺少持续性和热稳定性因而使其不能进行有效的PCR扩增实验来得到较长的L型DNA序列[1]。因此为了实现镜像系统的PCR，我们设计并且化学合成了一个能够进行PCR反应的突变型Dpo4聚合酶，这也为日后适用于镜像体系PCR的D型DNA聚合酶的合成奠定了坚实的基础。由此建立的高效镜像PCR系统能产生更多的镜像分子工具，例如利用这个反手性的PCR系统可以进行镜像核酸适配体的体外筛选(mirror-image Systematic Evolution of Ligands bv ExponentialEnrichment，miSELEX)，从而筛选出能够特异性结合某一生物靶标的L型核酸适配体，并有望成为用于研究和治疗的工具。

镜像PCR工具的开发中一个较大的难题是得到长的DNA模版序列。而合成的Dpo4-5m能够利用短的化学合成的寡核苷酸来进行组装PCR，因此解决了这一问题。但由于合成的Dpo4-5m聚合酶对于较长的模版的扩增效率很低，所以要获得像16S和23S rRNA这样大于1kb的镜像基因还是比较困难。未来可能需要开发高效的镜像DNA或RNA连接酶来解决这个问题，例如可以通过全化学方法合成由D型氨基酸组成的核酸连接酶，或使用具有跨镜像连接酶活性的核酶[20]。

尽管基于我们开发的化学合成路线得到的Dpo4-5m聚合酶的终产量可达16mg，但是对工业上大规模生产D型酶来说仍不是一个实用的方法，未来可以从合成路线以及采用其他的连接方法等方面进行优化[21-23]，或者是设计并全化学合成截短的Dpo4聚合酶。

此外，实现高效镜像PCR的另一策略是寻找Dpo4聚合酶以外的其它聚合酶系统。Dpo4聚合酶除了对于长的DNA序列的扩增效率较低外，另一个缺点是保真性不高，其复制错误率在4×10^-4至8×10^-3之间[3，14]。要实现更高效的镜像PCR系统，可以通过继续寻找其它的具有热稳定性的分子量较小的DNA聚合酶，或者通过定向改造分子量较小的DNA聚合酶使其获得热稳定性以及较高的扩增效率[24，25]。

材料与方法：

基于9-芴甲氧羰基(Fmoc)的固相多肽合成法(Fmoc-SPPS)

所有的肽段都是人工合成的。氨基酸的偶联反应在溶有4倍当量的Fmoc-氨基酸、4倍当量的乙基氰基乙醛酸-2-肟(Oxyma)和4倍当量的N，N′-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)进行，或者是溶有4倍当量的Fmoc-氨基酸、3.8倍当量的6-氯苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)和8倍当量的N，N-二异丙基乙胺的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。必要时，用空气浴加热来加速反应进行[26]。肽段Dpo4-9在Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂(GL Biochem)上合成，其他肽段在Fmoc-肼2-氯三苯甲基氯树脂上合成以制备酰肼肽[27]。肽段Dpo4-1中的Val30-Ser31和肽段Dpo4-3中的Ala102-Ser103作为异酰基二肽进行偶联。在室温下用Oxyma/DIC来活化偶联Tfa-Thz-OH。肽链组装完成后，使用切割试剂(水/苯甲硫醚/三异丙基硅烷/1，2-乙二硫醇/三氟乙酸，比例为0.5/0.5/0.5/0.25/8.25)将肽段从树脂上切割下来。在氮气鼓泡浓缩后，加入冰乙醚使多肽沉淀出来，最后离心，收集固体沉淀，得到多肽粗产品。

自然化学连接(NCL)

将C-末端含有酰肼基团的多肽片段，溶解于酸化的连接缓冲液(6M盐酸胍和0.1M磷酸二氢钠，pH 3.0)中。将混合物置于冰盐浴(-15℃)上，往其中加入10-20倍当量的NaNO₂溶液，搅拌反应30分钟。随后加入混有40倍当量4-巯基苯乙酸(MPAA)和等当量的N端为半胱氨酸的多肽片段，在室温下将体系的pH值调至6.5。过夜反应后，加入100mM磷酸三氯乙酯(TCEP)缓冲液将体系浓度稀释两倍，然后室温下搅拌反应1小时。最后使用半制备级的RP-HPLC分离目标产物。用HPLC和ESI-MS分析连接产物，并用半制备级的HPLC进行纯化。

蛋白质复性与纯化

将冻干的Dpo4-5m聚合酶粉末溶解在含有6M盐酸胍的变性缓冲液中，随后分别用含有4M，2M，1M和0M盐酸胍的复性缓冲液进行透析，每一步透析都在4℃条件下轻柔旋转搅拌10小时。变性和复性缓冲液中还包含50mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaAc，1mM DTT，0.5mM EDTA和16％的甘油。复性后再用含有10mM磷酸钾(pH 7.0)，50mM氯化钠，10mM醋酸镁，10％甘油和0.1％2-巯基乙醇的缓冲液透析。将折叠好的聚合酶加热到78oC，使热不稳定的肽段沉淀，随后在4℃下超速离心(19,000rpm)40分钟除去。上清液加入到Ni-NTA树脂(Qiagen)中并放于4℃孵育过夜，随后按照之前所述的方法进行纯化，但没有用Mono S柱进一步纯化[28]。纯化后使用分光光度计在测量蛋白在280nm波长下的吸光值，消光系数设为24,058M^-1cm^-1，分子量设为40.8kDa。最终使用12％的SDS-PAGE分析合成的聚合酶(约100μg)和重组酶的纯度及产量。

应用化学合成的Dpo4-5m聚合酶进行PCR反应

文中所述PCR反应均在20μl的体系中进行，该体系中包含50mM HEPES(pH 7.5)，5mM MgCl₂，50mM NaCl，0.1mM EDTA，5mM DTT，10％glycerol，3％DMSO，0.1mg/ml BSA，200μM的超纯dNTPs，0.5μM的双向引物，2nM线性双链DNA模板和大约300nM的Dpo4-5m聚合酶。PCR程序设定为86℃变性3分钟；之后是35个循环的86℃变性30秒，58-65℃退火1分钟(退火温度取决于引物Tm值)，65℃延伸2到15分钟(延伸时间根据扩增子长度确定)，最后65℃延伸5分钟。在扩增不同长度的DNA序列的实验中，使用相同的引物(M13-long-F和M13-long-R，见附表S1)进行PCR，110-300bp的模板延伸时间为2分钟，400-600bp的模板延伸5分钟，700-1000bp的模板延伸10分钟。PCR结束后使用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并用GoldView(Solarbio)染色。在测试Dpo4-5m的扩增效率和保真度的实验中，以Q5 DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)制备的长为200bp的线性双链DNA作为模板，使用Image Lab软件(Bio-Rad)分析前10个循环的产物条带来分析其扩增效率。使用DNA Clean&Concentrator试剂盒(Zymo Research)纯化35个循环后的PCR产物，然后克隆到T载体进行sanger测序来分析其保真度。

应用合成的Dpo4-5m进行组装PCR

使用具有30bp重叠区域的分别长为115nt和113nt的引物(tC19Z-F115和tC19Z-R113)来进行组装PCR反应(附表S1)，反应中不再加入其它模板，目标产物为198bp的tC19Z基因，负对照组中不加入酶。在经过20个循环的反应后，实验组组和对照组的产物都用核酸外切酶I在37℃处理10分钟(每5μl的PCR产物中加10U)。采用三步法用6条短引物来组装198bp的tC19Z基因的实验中，第一步反应使用tC19Z-F1和tC19Z-R1引物，第二步反应使用tC19Z-F2和tC19Z-R2引物，第三步反应使用tC19Z-F3和tC19Z-R3引物。上一步PCR产物作为下一步反应的模板，约占下一步反应体系的5％。第一、二、三步PCR反应的循环数分别为5、10和20。PCR反应结束后产物使用3％高分辨率琼脂糖凝胶电泳进行分析并用GoldView(Solarbio)染色。最终得到的全长产物使用DNA Clean&Concentrator试剂盒(ZymoResearch)进行纯化回收，然后克隆到T载体上进行sanger测序。

附录：

热稳定DNA聚合酶的化学全合成

材料：

化学药品与试剂

实验方法：

反相高效液相色谱(HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)

使用Shimadzu Prominence HPLC系统(溶剂递送单位：LC-20AT)进行反相高效液相色谱分析及纯化产物，配合使用月旭公司(Welch)生产的C4和C18的色谱柱，流动相为水和乙腈(二者均含0.1％TFA)。电喷雾电离质谱使用Shimadzu LCMS-2020液相色谱质谱仪获得。

液相色谱-二级质谱连用(LC-MS/MS)进行肽段测序

用12％SDS-PAGE来纯化人工合成的Dpo4-5m，加入胰蛋白酶或胃蛋白酶进行凝胶内37℃过夜消化，提取出的肽段用LC-MS进行分析。通过直接与Thermo Scientific QExactive质谱仪连接的Thermo-Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分离样品，以0.3μl/min的流速进行梯度洗脱。分析柱是填充有C-18树脂(

5μm，Varian，Lexington，MA，U.S.)的自制熔凝硅石毛细管柱(75μm ID，长150mm；Upchurch，Oak Harbor)。Q Exactive质谱仪在软件Xcalibur 2.1.2数据相关的采集模式下操作，轨道阱(300-1800m/z，70,000分辨率)中还有一个单独的全扫描质谱，在27％归一化碰撞能量下进行20次数据依赖性的MS/MS扫描。

附表S1|引物序列

参考文献：

1.Wang，Z.，et al.，A synthetic molecular system capable of mirror-imagegenetic replication and transcription.Nat Chem，2016.8(7)：p.698-704.

2.Weinstock，M.T.，M.T.Jacobsen，and M.S.Kay，Synthesis and folding of amirror-image enzyme reveals ambidextrous chaperone activity.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America，2014.111(32)：p.11679-11684.

3.Boudsocq，F.，et al.，Sulfolobus solfataricus P2 DNA polymerase IV(Dpo4)：an archaeal DinB-like DNA polymerase with lesion-bypass propertiesakin to eukaryotic polη.Nucleic Acids Research，2001.29(22)：p.4607-4616.

4.Kent，S.B.H.，Total chemical synthesis of proteins.Chemical SocietyReviews，2009.38(2)：p.338-351.

5.Zheng，J.-S.，et al.，Chemical synthesis of proteins using peptidehydrazides as thioester surrogates.Nat Protocols，2013.8(12)：p.2483-2495.

6.Wan，Q.and S.J.Danishefsky，Free-radical-based，specificdesulfurization of cysteine：a powerful advance in the synthesis ofpolypeptides and glycopolypeptides.Angew Chem Iht Ed Engl，2007.46(48)：p.9248-52.

7.Fang，G.-M.，et al.，Protein Chemical Synthesis by Ligation of PeptideHydrazides.Angewandte Chemie International Edition，2011.50(33)：p.7645-7649.

8.Huang，Y.-C.，G.-M.Fang，and L.Liu，Chemical synthesis of proteinsusing hydrazide intermediates.National Science Review，2016.3(1)：p.107-116.

9.Dery，L.，et al.，Accessing human selenoproteins through chemicalprotein synthesis.Chemical Science，2017.

10.Coin，I.，The depsipeptide method for solid-phase synthesis ofdifficult peptides.J Pept Sci，2010.16(5)：p.223-30.

11.Liu，F.，et al.，A Synthetic Route to Human Insulin Using IsoacylPeptides.Angewandte Chemie，2014.126(15)：p.4064-4068.

12.Raibaut，L.，N.Ollivier，and O.Melnyk，Sequential native peptideligation strategies for total chemicalprotein synthesis.Chem Soc Rev，2012.41(21)：p.7001-15.

13.Huang，Y.C.，et al.，Synthesis of l-and d-Ubiquitin by One-PotLigation and Metal-Free Desulfurization.Chemistry，2016.22(22)：p.7623-8.

14.Ling，H.，et al.，Crystal structure of a Y-family DNA polymerase inaction：a mechanism for error-prone and lesion-bypass replication.Cell，2001.107(1)：p.91-102.

15.Jewett，M.C.，et al.，In vitro integration of ribosomal RNAsynthesis，ribosome assembly，and translation.Mol Syst Biol，2013.9：p.678.

16.Stemmer，W.P.，et al.，Single-step assembly of a gene and entireplasmid from large numbers ofoligodeoxyribonucleotides.Gene，1995.164(1)：p.49-53.

17.Wochner，A.，et al.，Ribozyme-catalyzed transcription of an activeribozyme.Science，2011.332(6026)：p.209-12.

18.Williams，K.P.，et al.，Bioactive and nuclease-resistant l-DNA ligandof vasopressin.Proceedings of the National Academy of Sciences，1997.94(21)：p.11285-11290.

19.Yatime，L.，et al.，Structural basis for the targeting of complementanaphylatoxin C5a using a mixed L-RNA/L-DNA aptamer.Nat Commun，2015.6：p.6481.

20.Sczepanski，J.T.and G.F.Joyce，A cross-chiral RNA polymeraseribozyme.Nature，2014.515(7527)：p.440-442.

21.Fiala，K.A.and Z.Suo，Pre-steady-state kinetic studies of thefidelity of Sulfolobus solfataricus P2 DNA polymerase IV.Biochemistry，2004.43(7)：p.2106-15.

22.Bode，J.W.，Emerging methods in amide-and peptide-bondformation.Curt Opin Drug Discov Devel，2006.9(6)：p.765-75.

23.Englebretsen，D.R.，B.Garnham，and P.F.Alewood，A cassette ligationstrategy with thioether replacement of three Gly-Gly peptide bonds：totalchemical synthesis of the 101 residue protein early pregnancy factor[psi(CH(2)S)28-29，56-57，76-77].J Org Chem，2002.67(17)：p.5883-90.

24.Zeng，W.，et al.，Assembly of synthetic peptide vaccines bychemoselective ligation of epitopes：influence of different chemical linkagesand epitope orientations on biological activity.Vaccine，2001.19(28-29)：p.3843-52.

25.Pinheiro，V.B.，et al.，Synthetic genetic polymers capable ofheredity and evolution.Science，2012.336(6079)：p.341-4.

26.Larsen，A.C.，et al.，A general strategy for expanding polymerasefunction by droplet microfluidics.Nat Commun，2016.7：p.11235.

27.Huang，Y.-C.，et al.，Accelerated Fmoc solid-phase synthesis ofpeptides with aggregation-disrupting backbones.Organic&BiomolecularChemistry，2015.13(5)：p.1500-1506.

28.Huang，Y.-C.，et al.，Facile synthesis of C-terminal peptidehydrazide and thioester of NY-ESO-1(A39-A68)from an Fmoc-hydrazine 2-chlorotrityl chloride resin.Tetrahedron，2014.70：p.2951-2955.

序列表

<110> 清华大学

<120> 镜像核酸复制体系

<130> 82032

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-/L-primer12

<400> 1

actacgaacg cg 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-/L-FAM-primer12

<400> 2

actacgaacg cg 12

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-/L-template18

<400> 3

ctcagtcgcg ttcgtagt 18

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-/L-DNAzymeTemplate

<400> 4

tgtacagcca cttcaactaa ttgctcaact atggctgtag cacccgcgtt cgtagtatgc 60

aatgca 66

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cy5-primer20

<400> 5

agtgcgatac tacgaacgcg 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> template26

<400> 6

ctcagtcgcg ttcgtagtat cgcact 26

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> template18A

<400> 7

ctcagacgcg ttcgtagt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> template18C

<400> 8

ctcagccgcg ttcgtagt 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> template18G

<400> 9

ctcatgcgcg ttcgtagt 18

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L-primer15

<400> 10

gatcacagtg agtac 15

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L-template21

<400> 11

ctattgtact cactgtgatc 20

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNAzyme marker

<400> 12

actacgaacg cgggtgctac agccatagtt gagcaattag ttgaagtggc tgtaca 56

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L-template27

<400> 13

cgcgctgtta tagggatacg gcaaaaa 27

<210> 14

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L-primer11

<400> 14

cgcgctgtta t 11

<210> 15

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L-FAM-primer11

<400> 15

cgcgctgtta t 11

<210> 16

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L-reverse11

<400> 16

gccgtatccc t 11

<210> 17

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X

<400> 17

Met Leu Thr Leu Ile Gln Gly Lys Lys Ile Val Asn His Leu Arg Ser

1 5 10 15

Arg Leu Ala Phe Glu Tyr Asn Gly Gln Leu Ile Lys Ile Leu Ser Lys

20 25 30

Asn Ile Val Ala Val Gly Ser Leu Arg Arg Glu Glu Lys Met Leu Asn

35 40 45

Asp Val Asp Leu Leu Ile Ile Val Pro Glu Lys Lys Leu Leu Lys His

50 55 60

Val Leu Pro Asn Ile Arg Ile Lys Gly Leu Ser Phe Ser Val Lys Val

65 70 75 80

Cys Gly Glu Arg Lys Cys Val Leu Phe Ile Glu Trp Glu Lys Lys Thr

85 90 95

Tyr Gln Leu Asp Leu Phe Thr Ala Leu Ala Glu Glu Lys Pro Tyr Ala

100 105 110

Ile Phe His Phe Thr Gly Pro Val Ser Tyr Leu Ile Arg Ile Arg Ala

115 120 125

Ala Leu Lys Lys Lys Asn Tyr Lys Leu Asn Gln Tyr Gly Leu Phe Lys

130 135 140

Asn Gln Thr Leu Val Pro Leu Lys Ile Thr Thr Glu Lys Glu Leu Ile

145 150 155 160

Lys Glu Leu Gly Phe Thr Tyr Arg Ile Pro Lys Lys Arg Leu

165 170

<210> 18

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X

<400> 18

atgttaacgc ttattcaagg aaaaaaaatt gtaaatcact tacgttcccg acttgcgttt 60

gaatataatg gacaacttat aaaaatttta tcaaaaaaca tcgttgctgt tggtagttta 120

agacgcgaag agaaaatgct taatgacgtg gatcttctta ttattgttcc agaaaaaaaa 180

cttttaaaac acgtcctgcc caacattcgc ataaagggtc tttctttttc tgtaaaagtc 240

tgcggagaac gaaagtgtgt actttttatt gaatgggaaa aaaagacgta tcaacttgat 300

ctttttacgg ctttagccga ggaaaaacca tacgcaatat ttcattttac gggtcccgtt 360

tcttatctaa taagaattcg agccgcgtta aaaaaaaaga attataagct aaatcagtat 420

ggattattta aaaatcaaac tttagtacct ctaaaaatca ctactgaaaa agaacttatt 480

aaagaattag gatttacgta tcgcatacct aagaaacgtt tataa 525

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 19

Glu Glu Lys Met Leu Asn Asp Val Asp Leu Leu Ile Ile Val Pro Glu

1 5 10 15

Lys

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 20

His Val Leu Pro Asn Ile Arg Ile Lys Gly Leu Ser Phe Ser Val Lys

1 5 10 15

Val Cys Gly Glu Arg

20

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 21

Lys Cys Val Leu Phe Ile Glu Trp Glu Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 22

Lys Lys Thr Tyr Gln Leu Asp Leu Phe Thr Ala Leu Ala Glu

1 5 10

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 23

Lys Leu Leu Lys His Val Leu Pro Asn Ile Arg

1 5 10

<210> 24

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 24

Lys Thr Tyr Gln Leu Asp Leu Phe Thr Ala Leu Ala Glu Glu Lys Pro

1 5 10 15

Tyr Ala Ile Phe His Phe Thr Gly Pro Val Ser Tyr Leu Ile Arg

20 25 30

<210> 25

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 25

Leu Asn Gln Tyr Gly Leu Phe Lys Asn Gln Thr Leu Val Pro Leu Lys

1 5 10 15

Ile Thr Thr Glu Lys Glu Leu Ile Lys Glu Leu Gly Phe Thr Tyr Arg

20 25 30

Ile Pro Lys Lys Arg Leu

35

<210> 26

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 26

Met Leu Thr Leu Ile Gln Gly Lys Lys Ile Val Asn His Leu Arg Ser

1 5 10 15

Arg Leu Ala Phe Glu Tyr Asn Gly Gln Leu Ile Lys

20 25

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 27

Asn Tyr Lys Leu Asn Gln Tyr Gly Leu Phe Lys

1 5 10

<210> 28

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASFV pol X的片段

<400> 28

Ser Arg Leu Ala Phe Glu Tyr Asn Gly Gln Leu Ile Lys Ile Leu Ser

1 5 10 15

Lys Asn Ile Val Ala Val Gly Ser Leu Arg Arg Glu Glu Lys

20 25 30

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13-long-F

<400> 29

gtaaaacgac ggccagtgaa ttagaactcg gt 32

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13-long-R

<400> 30

caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agttt 35

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5s rRNA(rrfB)-F

<400> 31

tgcctggcgg cagtagcgc 19

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5s rRNA(rrfB)-R

<400> 32

atgcctggca gttccctact ctcgc 25

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16s rRNA(rrsC)-F

<400> 33

aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctgg 39

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16s rRNA(rrsC)-R

<400> 34

taaggaggtg atccaaccgc aggttcc 27

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dpo4-F

<400> 35

atgattgttc ttttcgttga ttttgactac ttt 33

<210> 36

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dpo4-R

<400> 36

agtatcgaag aacttgtcta atcctattgc t 31

<210> 37

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-F115

<400> 37

gtcattgaaa aaaaaagaca aatctgccct cagagcttga gaacatcttc ggatgcagag 60

gaggcagcct tcggtggcgc gatagcgcca acgttctcaa cagacaccca atact 115

<210> 38

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-R113

<400> 38

ggagccgaag ctccggggat tatgacctgg gcgtgtctaa catcgccttt tcgtcaggtg 60

ttatccccac ccgccgaagc gggagtattg ggtgtctgtt gagaacgttg gcg 113

<210> 39

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-F1

<400> 39

agaggaggca gccttcggtg gcgcgatagc gccaacgttc tcaacagaca cccaatact 59

<210> 40

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-R1

<400> 40

caggtgttat ccccacccgc cgaagcggga gtattgggtg tctgttgaga acgttggcg 59

<210> 41

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-F2

<400> 41

caaatctgcc ctcagagctt gagaacatct tcggatgcag aggaggcagc cttcggtgg 59

<210> 42

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-R2

<400> 42

attatgacct gggcgtgtct aacatcgcct tttcgtcagg tgttatcccc acccgccga 59

<210> 43

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-F3

<400> 43

gtcattgaaa aaaaaagaca aatctgccct cagagcttga gaacatcttc g 51

<210> 44

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tC19Z-R3

<400> 44

ggagccgaag ctccggggat tatgacctgg gcgtgtctaa catcgcc 47

<210> 45

<211> 352

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> WT-Dpo4氨基酸序列

<400> 45

Met Ile Val Leu Phe Val Asp Phe Asp Tyr Phe Tyr Ala Gln Val Glu

1 5 10 15

Glu Val Leu Asn Pro Ser Leu Lys Gly Lys Pro Val Val Val Cys Val

20 25 30

Phe Ser Gly Arg Phe Glu Asp Ser Gly Ala Val Ala Thr Ala Asn Tyr

35 40 45

Glu Ala Arg Lys Phe Gly Val Lys Ala Gly Ile Pro Ile Val Glu Ala

50 55 60

Lys Lys Ile Leu Pro Asn Ala Val Tyr Leu Pro Met Arg Lys Glu Val

65 70 75 80

Tyr Gln Gln Val Ser Ser Arg Ile Met Asn Leu Leu Arg Glu Tyr Ser

85 90 95

Glu Lys Ile Glu Ile Ala Ser Ile Asp Glu Ala Tyr Leu Asp Ile Ser

100 105 110

Asp Lys Val Arg Asp Tyr Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Gly Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Asn Lys Ile Leu Glu Lys Glu Lys Ile Thr Val Thr Val Gly Ile

130 135 140

Ser Lys Asn Lys Val Phe Ala Lys Ile Ala Ala Asp Met Ala Lys Pro

145 150 155 160

Asn Gly Ile Lys Val Ile Asp Asp Glu Glu Val Lys Arg Leu Ile Arg

165 170 175

Glu Leu Asp Ile Ala Asp Val Pro Gly Ile Gly Asn Ile Thr Ala Glu

180 185 190

Lys Leu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Lys Leu Val Asp Thr Leu Ser Ile

195 200 205

Glu Phe Asp Lys Leu Lys Gly Met Ile Gly Glu Ala Lys Ala Lys Tyr

210 215 220

Leu Ile Ser Leu Ala Arg Asp Glu Tyr Asn Glu Pro Ile Arg Thr Arg

225 230 235 240

Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Ile Val Thr Met Lys Arg Asn Ser Arg

245 250 255

Asn Leu Glu Glu Ile Lys Pro Tyr Leu Phe Arg Ala Ile Glu Glu Ser

260 265 270

Tyr Tyr Lys Leu Asp Lys Arg Ile Pro Lys Ala Ile His Val Val Ala

275 280 285

Val Thr Glu Asp Leu Asp Ile Val Ser Arg Gly Arg Thr Phe Pro His

290 295 300

Gly Ile Ser Lys Glu Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Val Lys Leu Leu Gln

305 310 315 320

Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Arg Lys Ile Arg Arg Ile Gly Val Arg

325 330 335

Phe Ser Lys Phe Ile Glu Ala Ile Gly Leu Asp Lys Phe Phe Asp Thr

340 345 350

<210> 46

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的Dpo4 (具有S86C, N123A, S207 A, S313A和C31S.)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(358)

<223> D-氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (163)..(163)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (222)..(222)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (257)..(257)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<400> 46

His His His His His His Xaa Ile Val Leu Phe Val Asp Phe Asp Tyr

1 5 10 15

Phe Tyr Ala Gln Val Glu Glu Val Leu Asn Pro Ser Leu Lys Gly Lys

20 25 30

Pro Val Val Val Ser Val Phe Ser Gly Arg Phe Glu Asp Ser Gly Ala

35 40 45

Val Ala Thr Ala Asn Tyr Glu Ala Arg Lys Phe Gly Val Lys Ala Gly

50 55 60

Ile Pro Ile Val Glu Ala Lys Lys Ile Leu Pro Asn Ala Val Tyr Leu

65 70 75 80

Pro Xaa Arg Lys Glu Val Tyr Gln Gln Val Ser Cys Arg Ile Xaa Asn

85 90 95

Leu Leu Arg Glu Tyr Ser Glu Lys Ile Glu Ile Ala Ser Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Tyr Leu Asp Ile Ser Asp Lys Val Arg Asp Tyr Arg Glu Ala Tyr

115 120 125

Ala Leu Gly Leu Glu Ile Lys Asn Lys Ile Leu Glu Lys Glu Lys Ile

130 135 140

Thr Val Thr Val Gly Ile Ser Lys Asn Lys Val Phe Ala Lys Ile Ala

145 150 155 160

Ala Asp Xaa Ala Lys Pro Asn Gly Ile Lys Val Ile Asp Asp Glu Glu

165 170 175

Val Lys Arg Leu Ile Arg Glu Leu Asp Ile Ala Asp Val Pro Gly Ile

180 185 190

Gly Asn Ile Thr Ala Glu Lys Leu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Lys Leu

195 200 205

Val Asp Thr Leu Ala Ile Glu Phe Asp Lys Leu Lys Gly Xaa Ile Gly

210 215 220

Glu Ala Lys Ala Lys Tyr Leu Ile Ser Leu Ala Arg Asp Glu Tyr Asn

225 230 235 240

Glu Pro Ile Arg Thr Arg Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Ile Val Thr

245 250 255

Xaa Lys Arg Asn Ser Arg Asn Leu Glu Glu Ile Lys Pro Tyr Leu Phe

260 265 270

Arg Ala Ile Glu Glu Ser Tyr Tyr Lys Leu Asp Lys Arg Ile Pro Lys

275 280 285

Ala Ile His Val Val Ala Val Thr Glu Asp Leu Asp Ile Val Ser Arg

290 295 300

Gly Arg Thr Phe Pro His Gly Ile Ser Lys Glu Thr Ala Tyr Ala Glu

305 310 315 320

Ser Val Lys Leu Leu Gln Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Arg Lys Ile

325 330 335

Arg Arg Ile Gly Val Arg Phe Ser Lys Phe Ile Glu Ala Ile Gly Leu

340 345 350

Asp Lys Phe Phe Asp Thr

355

<210> 47

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的Dpo4 (具有S86A, N123A, S207 A, S313A和C31S.)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(358)

<223> L-氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (163)..(163)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (222)..(222)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (257)..(257)

<223> Xaa = 正亮氨酸

<400> 47

His His His His His His Xaa Ile Val Leu Phe Val Asp Phe Asp Tyr

1 5 10 15

Phe Tyr Ala Gln Val Glu Glu Val Leu Asn Pro Ser Leu Lys Gly Lys

20 25 30

Pro Val Val Val Ser Val Phe Ser Gly Arg Phe Glu Asp Ser Gly Ala

35 40 45

Val Ala Thr Ala Asn Tyr Glu Ala Arg Lys Phe Gly Val Lys Ala Gly

50 55 60

Ile Pro Ile Val Glu Ala Lys Lys Ile Leu Pro Asn Ala Val Tyr Leu

65 70 75 80

Pro Xaa Arg Lys Glu Val Tyr Gln Gln Val Ser Ala Arg Ile Xaa Asn

85 90 95

Leu Leu Arg Glu Tyr Ser Glu Lys Ile Glu Ile Ala Ser Ile Asp Glu

100 105 110

Ala Tyr Leu Asp Ile Ser Asp Lys Val Arg Asp Tyr Arg Glu Ala Tyr

115 120 125

Ala Leu Gly Leu Glu Ile Lys Asn Lys Ile Leu Glu Lys Glu Lys Ile

130 135 140

Thr Val Thr Val Gly Ile Ser Lys Asn Lys Val Phe Ala Lys Ile Ala

145 150 155 160

Ala Asp Xaa Ala Lys Pro Asn Gly Ile Lys Val Ile Asp Asp Glu Glu

165 170 175

Val Lys Arg Leu Ile Arg Glu Leu Asp Ile Ala Asp Val Pro Gly Ile

180 185 190

Gly Asn Ile Thr Ala Glu Lys Leu Lys Lys Leu Gly Ile Asn Lys Leu

195 200 205

Val Asp Thr Leu Ala Ile Glu Phe Asp Lys Leu Lys Gly Xaa Ile Gly

210 215 220

Glu Ala Lys Ala Lys Tyr Leu Ile Ser Leu Ala Arg Asp Glu Tyr Asn

225 230 235 240

Glu Pro Ile Arg Thr Arg Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Ile Val Thr

245 250 255

Xaa Lys Arg Asn Ser Arg Asn Leu Glu Glu Ile Lys Pro Tyr Leu Phe

260 265 270

Arg Ala Ile Glu Glu Ser Tyr Tyr Lys Leu Asp Lys Arg Ile Pro Lys

275 280 285

Ala Ile His Val Val Ala Val Thr Glu Asp Leu Asp Ile Val Ser Arg

290 295 300

Gly Arg Thr Phe Pro His Gly Ile Ser Lys Glu Thr Ala Tyr Ala Glu

305 310 315 320

Ser Val Lys Leu Leu Gln Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Arg Lys Ile

325 330 335

Arg Arg Ile Gly Val Arg Phe Ser Lys Phe Ile Glu Ala Ile Gly Leu

340 345 350

Asp Lys Phe Phe Asp Thr

355

Claims

1.对镜像核酸进行复制的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得所述镜像核酸，其中所述镜像核酸聚合酶为引入了氨基酸突变的野生型Dpo4蛋白的功能性变体，并且所述野生型Dpo4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 45所示，其中：

a) 所述氨基酸突变为S86A、N123A、S207A和S313A，或者

b) 所述氨基酸突变为C31S、S86A、N123A、S207A和S313A，或者

c) 上述a)或b)，其还包含N端His6标签，或者

d) 上述a)、b)或c)，其中所有的甲硫氨酸Met1、Met76、Met89、Met157、Met216和Met251用正亮氨酸替代。

2.权利要求1的方法，其中所述反应重复多个循环。

3.权利要求1的方法，其中所述镜像核酸、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs为L-型，所述镜像核酸聚合酶为D型。

4.权利要求1的方法，其中所述镜像核酸聚合酶包含亲和标签。

5.权利要求1的方法，其中所述镜像核酸为L-DNAzyme。

6.权利要求1的方法，其中所述镜像核酸为L型DNA。

7.权利要求1的方法，其中所述镜像核酸为L型RNA。

8.权利要求1的方法，其中所述反应为聚合酶链式反应。

9.权利要求1-8之任一项的方法，其中所述反应在如下缓冲液中进行：50 mM HEPES-NaOH pH 7.5、5 mM MgCl₂、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、10%甘油、3% DMSO、0.1mg/mL BSA。

10.进行镜像PCR的方法，包括：在镜像核酸聚合酶、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs的存在下进行反应，以获得镜像核酸，其中所述镜像核酸聚合酶为引入了氨基酸突变的野生型Dpo4蛋白的功能性变体，并且所述野生型Dpo4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 45所示，其中：

a) 所述氨基酸突变为S86A、N123A、S207A和S313A，或者

b) 所述氨基酸突变为C31S、S86A、N123A、S207A和S313A，或者

c) 上述a)或b)，其还包含N端His6标签，或者

11.权利要求10的方法，其中所述反应重复多个循环。

12.权利要求10的方法，其中所述镜像核酸、镜像核酸模板、镜像核酸引物以及镜像dNTPs/rNTPs为L-型，所述镜像核酸聚合酶为D型。

13.权利要求10的方法，其中所述镜像核酸聚合酶包含亲和标签。

14.权利要求10的方法，其中所述镜像核酸为L型DNA。

15.权利要求10的方法，其中所述镜像核酸为L型RNA。

16.权利要求10的方法，其中所述镜像核酸为L-DNAzyme。

17.权利要求10-16之任一项的方法，其中所述反应在如下缓冲液中进行：50 mM Tris-HCl, pH 7.5，20 mM MgCl₂、1 mM DTT，50 mM KCl。

18.筛选镜像核酸分子的方法，包括：

在允许二者结合的条件下，使随机镜像核酸序列库与靶标分子接触；

获得与靶标分子结合的镜像核酸分子；以及

通过镜像PCR，利用镜像核酸聚合酶扩增所述与靶标分子结合的镜像核酸分子，其中所述镜像核酸聚合酶为引入了氨基酸突变的野生型Dpo4蛋白的功能性变体，并且所述野生型Dpo4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 45所示，其中：

a) 所述氨基酸突变为S86A、N123A、S207A和S313A，或者

b) 所述氨基酸突变为C31S、S86A、N123A、S207A和S313A，或者

c) 上述a)或b)，其还包含N端His6标签，或者

19.权利要求18的方法，其中所述靶标分子被固定在固相介质上。

20.权利要求18的方法，其中在随机镜像核酸序列库与靶标分子接触之后，通过洗涤去除不与靶标分子结合的镜像核酸序列，从而获得与靶标分子结合的镜像核酸分子。

21.权利要求18的方法，其中所述镜像核酸分子为L型DNA。

22.权利要求18的方法，其中所述镜像核酸分子为L型RNA。

23.权利要求18的方法，其中所述镜像核酸聚合酶包含亲和标签。

24.权利要求18-23之任一项的方法，其中所述镜像PCR在如下缓冲液中进行：50 mMTris-HCl, pH 7.5，20 mM MgCl₂、1 mM DTT，50 mM KCl。

25.Dpo4蛋白的功能性变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 47所示。