CN117904060A

CN117904060A - 一种基于parkin的靶向蛋白泛素化降解剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117904060A
Application number: CN202311769549.2A
Authority: CN
Inventors: 胡宏岗; 于圆圆; 陈芳丹; 苏珍; 李璜; 占青; 丛薇; 沈华星
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明涉及一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂及其制备方法和应用，涉及生物医药领域，靶向蛋白泛素化降解剂的结构如式Ⅰ所示：A‑L‑B(I)；其中，A为与PARKIN E3泛素连接酶结合的磷酸化的突变体，B为与目标蛋白结合的基团，L为偶联基团。该靶向蛋白泛素化降解剂基于一个全新的E3连接酶PARKIN设计，且验证该靶向蛋白泛素化降解剂在体外展现出良好的E3连接酶激活和结合活性，并且在细胞内可在一定浓度条件下实现目标蛋白的降解，从而拓展了PROTAC技术目前可利用的E3连接酶以及可靶向的目标蛋白范围，为PROTAC可能的治疗应用开辟了更多路径。

Description

一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimeras,PROTAC)已成为近年来疾病治疗研究领域的焦点。人体细胞内各种蛋白质的稳态对于维持细胞的正常功能至关重要，多种疾病，如肿瘤、神经退行性疾病等，都与相应的蛋白质失衡密切相关，传统的小分子药物通过结合目标蛋白并阻断其活性功能来达到相应的治疗效果，而PROTAC技术的出现为目前疾病治疗提供了一种强大的手段，其以事件驱动型的药效学方式选择性地降解目标蛋白，为传统小分子药物难以靶向的病理蛋白提供了全新的干预策略。

PROTAC的设计需要考虑三个关键组成部分：目标蛋白配体、E3泛素连接酶的配体以及二者之间的连接子。通过PROTAC一端与目标蛋白结合、一端招募E3泛素连接酶的双功能特点，其可介导细胞内目标蛋白和E3泛素连接酶形成稳定的三元复合物，从而驱动目标蛋白的泛素化，随后被拉向蛋白酶体系统中进行后续降解。E3泛素连接酶的角色在PROTAC驱动的目标蛋白降解过程中至关重要，作为整个降解机制的核心部分，没有合适的E3泛素连接酶介入，将影响整个降解过程的发生。同时，E3连接酶决定了PROTAC分子对目标蛋白的特异性，不同E3连接酶对底物蛋白会因为其在细胞内的定位、信号通路等而具备相应的偏好性。因此，选择合适的E3连接酶对于PROTAC的药效和选择性都有直接影响。E3连接酶在细胞内的分布不同同样会影响PROTAC分子的效用，基于目标蛋白和E3泛素连接酶的细胞内定位，选用合适的E3连接酶设计PROTAC，可以在低浓度下有效降解靶蛋白，提高PROTAC的效率，并且降低非特异性蛋白的降解，降低所设计PROTAC的毒性，还能针对不同E3连接酶的特性，开发针对不同目标蛋白的PROTAC，从而扩大该技术潜在的治疗应用。

PROTAC技术选用的E3泛素连接酶的种类和性质是该技术发展的关键因素之一，人体内约有600多种已知的E3泛素连接酶，但用于PROTAC开发的E3泛素连接酶类型相对局限，因此，扩展PROTAC技术可用E3泛素连接酶工具箱，为促进该技术发展提供更多选择。PARKIN蛋白与多种实体肿瘤密切相关，其中包括卵巢癌、肾癌、肺癌以及乳腺癌等。PARKIN作为一种活性高度可控的E3连接酶，在过表达与磷酸化激活的情况下都展现了显著的抑制肿瘤细胞生长的能力。鉴于此，本发明提供一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂及其制备方法和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂及其制备方法和应用。目的是提供PARKIN作为新型E3连接酶用于靶向蛋白降解设计。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，所述的靶向蛋白泛素化降解剂的结构如式Ⅰ所示：

A-L-B(I)；

其中，A为与PARKIN E3泛素连接酶结合的磷酸化的突变体，B为与目标蛋白结合的基团，L为偶联基团。

进一步，A为将基本骨架突变体的第65位的丝氨酸位点磷酸化的突变体；所述基本骨架突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-11所示的任一种序列。还包括对该骨架突变体上其他位点的不同修饰以及其他位点的突变和序列改造，其中优选为SEQ ID NO：4所示序列。

进一步，A为如下A-1至A-6的具体基团中的任一种：

进一步，B为BET溴结构域抑制剂；L的核苷酸序列为如SEQ ID NO：12-15所示的任一种序列，或者还包含其他以碳链或PEG等作为连接子的设计，具体的L为如下L-1至L-4的具体基团中的任一种：

进一步，B为小分子药物JQ1。

本发明第二方面提供一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将基本骨架突变体的第65位的丝氨酸位点进行磷酸化处理，得到磷酸化的突变体，即为A；

(2)将目标蛋白结合的基团B通过酰胺缩合反应偶联到偶联基团L的赖氨酸的氨基侧链上，得到L-B偶联体；

(3)通过转肽酶将所述磷酸化的突变体和所述L-B偶联体相连，得到靶向蛋白泛素化降解剂。

进一步，步骤(1)中，所述基本骨架突变体的末端引入SORTASE酶识别序列；通过PINK1激酶对基本骨架突变体的第65位的丝氨酸位点进行磷酸化处理。

进一步，步骤(2)包括如下的具体步骤：将带羧基基团的目标蛋白结合的基团B，在N,N-二异丙基乙胺以及2-肟氰乙酸乙酯的缩合条件下，通过酰胺缩合反应偶联到偶联基团L的赖氨酸的氨基侧链上，得到L-B偶联体；

步骤(3)包括如下的具体步骤：通过SORTASE转肽酶将所述磷酸化的突变体和所述L-B偶联体相连，得到靶向蛋白泛素化降解剂。

本发明第三方面提供一种组合物，所述组合物包括所述的靶向蛋白泛素化降解剂，或其药学上可接受的盐，或其立体异构体；和药学上接受的载体。

本发明第四方面提供将所述的靶向蛋白泛素化降解剂或所述的组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中所述的靶向蛋白泛素化降解剂是一种基于泛素化-蛋白酶体系统的蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)，该靶向蛋白泛素化降解剂基于一个全新的E3连接酶PARKIN设计，且验证该靶向蛋白泛素化降解剂在体外展现出良好的E3连接酶激活和结合活性，并且在细胞内可在一定浓度条件下实现目标蛋白的降解，从而拓展了PROTAC技术目前可利用的E3连接酶以及可靶向的目标蛋白范围，为PROTAC可能的治疗应用开辟了更多路径。

(2)本发明的靶向蛋白泛素化降解剂由PARKIN E3泛素连接酶的配体磷酸化的突变体蛋白A、目标蛋白配体B以及连接两端的偶联基团L组成，通过PROTAC两端的高亲和力配体，可以驱动将目标蛋白与E3泛素连接酶PARKIN通过该靶向蛋白泛素化降解剂形成三元复合物，处于激活状态的E3泛素连接酶PARKIN可对目标蛋白BRD4进行泛素化修饰，被打上泛素标签的BRD4蛋白以此被拉向蛋白酶体从而实现后续降解。

(3)本发明中蛋白泛素化降解剂的骨架突变体的制备基于大肠杆菌蛋白表达系统，后续采用一锅酶法的方式获取全长且带目标修饰基团的蛋白泛素化降解剂，相比较传统全合成的方式，该合成途径可获得更高的产量，同时可大大减少化学溶剂的使用，符合绿色化学的理念。

附图说明

图1为本发明SPR测试蛋白泛素化降解剂介导的三元复合物形成；

图2为本发明细胞内与MZ1阳性对照组相比，本发明蛋白泛素化降解剂介导的BRD4降解效果；

图3为本发明细胞内蛋白泛素化降解剂以浓度依赖性的方式介导目标蛋白BRD4降解；

图4为本发明基本骨架突变体蛋白的S65位点磷酸化修饰检测反应进程示意图；

图5为本发明SORTASE酶法连接合成靶向蛋白泛素化降解剂检测反应进程示意图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。

本实施例涉及一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，所述的靶向蛋白泛素化降解剂的结构如式Ⅰ所示：

A-L-B(I)；

其中，PARKIN属于RING类E3泛素连接酶，在正常情况下，PARKIN的UBA结构域与RING0结构域共同作用，遮蔽了RING2活性结构域，当磷酸化的突变体蛋白与PARKIN结合时，可以诱导其构象发现改变，暴露出其活性结构区域，促使PARKIN激活；这种活化不仅依赖于磷酸化的突变体蛋白与PARKIN的直接相互作用，还依赖于磷酸化的突变体蛋白诱导的PARKIN级联放大激活。因此，基于磷酸化的突变体蛋白对PARKIN的结合和激活效果，开发了一种可用于蛋白质靶向降解策略的新型E3连接酶。

本发明中所述的靶向蛋白泛素化降解剂是一种基于泛素化-蛋白酶体系统的蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)，该靶向蛋白泛素化降解剂基于一个全新的E3连接酶PARKIN设计，且验证该靶向蛋白泛素化降解剂在体外展现出良好的E3连接酶激活/结合活性，并且在细胞内可在一定浓度条件下实现目标蛋白的降解。

本发明的靶向蛋白泛素化降解剂由PARKIN E3泛素连接酶的配体磷酸化的突变体蛋白A、BRD4蛋白配体B以及连接两端的偶联基团L组成，通过PROTAC两端的高亲和力配体，可以驱动将目标蛋白BRD4与E3泛素连接酶PARKIN通过该靶向蛋白泛素化降解剂形成三元复合物，处于激活状态的E3泛素连接酶PARKIN可对目标蛋白BRD4进行泛素化修饰，被打上泛素标签的BRD4蛋白以此被拉向蛋白酶体从而实现后续降解。

本实施例优先的，A为将基本骨架突变体的第65位的丝氨酸位点磷酸化的突变体；所述基本骨架突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-11所示的任一种序列。还包括对该骨架突变体上其他位点的不同修饰以及其他位点的突变和序列改造，其中最优选为SEQ ID NO：4所示序列。

具体的，A为如下A-1至A-6的具体基团中的任一种：

。

本实施例优先的，B为BET溴结构域抑制剂；L的核苷酸序列为如SEQ ID NO：12-15所示的任一种序列，或者还包含其他以碳链或PEG等作为连接子的设计，具体的L为如下L-1至L-4的具体基团中的任一种：

具体的，B为小分子药物JQ1。

本实施例也涉及一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂的制备方法，包括如下步骤：

本实施例优先的，包括但不限于：以全化学合成手段或酶法半合成获取磷酸化的突变体蛋白作为靶向蛋白降解策略的PARKIN E3连接酶配体，通过大肠杆菌系统的蛋白表达技术纯化出A各基本骨架突变体，运用PINK1激酶对A的各基本骨架突变体进行S65位点的酶法磷酸化修饰；通过多肽固相合成法合成所述偶联基团L，将A与偶联基团L以及目标蛋白结合的基团B相连接，得到所述基于PARKIN E3连接酶的靶向蛋白泛素化降解剂。

本实施例具体的，所述的靶向蛋白泛素化降解剂的制备方法，包括如下具体的步骤：

1)通过分子克隆技术构建A中各个基本骨架突变体的核苷酸序列，在末端引入SORTASE酶识别序列；

2)运用大肠杆菌表达体系，将目标质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，放大培养；通过AKTA蛋白纯化仪提取目标蛋白，即A的各个基本骨架突变体蛋白；

3)通过PINK1激酶对A的各个基本骨架突变体蛋白第65位丝氨酸位点进行酶法的磷酸化修饰，质谱法确认分子量；

4)偶联基团L通过多肽固相合成技术合成；将偶联基团L的第一个氨基酸的C端固定于氨基树脂上，N端利用Fmoc保护基团保护，通过哌啶对第一个氨基酸的N端进行Fmoc保护基脱除，依次将后续氨基酸连接成固定于树脂上的目标多肽序列；

5)运用四三苯基膦钯脱除偶联基团A中引入的赖氨酸侧链alloc保护基；将带羧基基团的B(例如小分子药物JQ1)，在N,N-二异丙基乙胺以及2-肟氰乙酸乙酯的缩合条件下通过酰胺缩合反应偶联到赖氨酸的氨基侧链上，得到L-B偶联体；所述L-B偶联体采用制备型反相高效液相色谱仪纯化；

6)通过SORTASE转肽酶将带有识别序列的A和L-B偶联体相连，酶法生成序列完整的靶向蛋白泛素化降解剂，反应效率大于90％。

其中，上述的PINK1(PTEN诱导的蛋白酶1)是一种线粒体定位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PINK1的一个关键底物是泛素蛋白，主要在泛素的S65残基上催化磷酸化反应。运用该特性，可实现运用大肠杆菌表达体系大量获得不带修饰的磷酸化基本骨架突变体蛋白，再基于PINK1酶法对基本骨架突变体的S65位点上进行磷酸化基团修饰。

其中，上述的SORTASE转肽酶是一类细菌来源的酶，SORTASE的功能是识别并催化蛋白质上的特定肽段序列，本发明在磷酸化的突变体的C端构建了特定的六肽序列(LPETGG)，在偶联基团L的N端构建了三个甘氨酸的识别序列；由于SORTASE酶的高度专一性，在特定的生化条件下可介导偶联基团L与B的L-B偶联体由SORTASE介导转运至带有特定六肽序列的磷酸化的突变体上，以此构建完整的基于PARKIN E3泛素连接酶的靶向蛋白泛素化降解分子。

本实施例还涉及一种组合物，所述组合物包括所述的靶向蛋白泛素化降解剂，或其药学上可接受的盐，或其立体异构体；和药学上接受的载体。在制备用于治疗和/或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物中的应用中，给药浓度为50μM以下，优选为2.5～10μM。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1：基本骨架突变体蛋白的制备和纯化

1、突变体质粒的构建及纯化

以SEQ ID NO：1作为基本骨架，使用snapgene软件设计基于基本骨架突变体引物，将基本骨架SEQ ID NO：1的第6个位点突变为Cys，用于后续穿膜肽的引入，具体地，点突变正向引物序列为SEQ ID NO：16，反向引物序列为SEQ ID NO：17,得到突变后的目标核酸序列，序列为SEQ ID NO：2；设计一个基于基本骨架突变体序列起始部分以及包括翻译后为LPETGG氨基酸序列的正向引物，另一个反向引物包含基本骨架突变体的终止部分和相应的互补序列，具体地，反向PCR正向引物序列为SEQ ID NO：18，反向PCR正向引物序列为SEQ IDNO：19；使用上述设计的引物，以SEQ ID NO：2作为基本骨架突变体的模板DNA，在合适配对温度下进行PCR反应，得到突变后的目标核酸序列，序列为SEQ ID NO：3；使用PCR产物快速纯化试剂盒纯化扩增后的PCR产物；由于在体内泛素羧基水解酶L1可特异性识别突变体C端的两个连续甘氨酸序列，基于SEQ ID NO：3，将第76位氨基酸突变为缬氨酸，正向引物为SEQID NO：20，反向引物为SEQ ID NO：21，所得目标核酸序列为SEQ ID NO：4；其余突变体骨架SEQ ID NO：5-11均遵守上述实验流程进行相应核酸序列构建，引物序列包括但不限于SEQID NO：22-35；具体地，突变体骨架序列所对应核酸序列构建引物如表1所示。

表1突变体骨架序列所对应质粒构建引物

2、阳性克隆的筛选

使用热刺激转化法将1中所述DNA产物转化到大肠杆菌感受态trans 5α(购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)中，转化后的感受态细胞涂布在含有适当抗生素的琼脂平板上，37℃培养箱中孵育16h，从生长的单克隆中挑取若干菌落，进行PCR筛选确认阳性克隆；从筛选出的阳性克隆中提取质粒DNA，并进行测序以确保正确的点突变构建和序列添加。

3、基本骨架突变体蛋白的表达和纯化

选择大肠杆菌宿主菌株BL21(DE3)(购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将构建的基本骨架突变体质粒转化至该宿主中，将转化的大肠杆菌涂布于含有相应抗生素的琼脂平板，经夜孵育后挑选单克隆，将选取的单克隆放入LB培养液中进行摇瓶培养，至OD600约0.6时，添加IPTG(购买于上海源叶生物科技有限公司)以诱导蛋白表达，诱导结束后，通过离心收获细胞，采用高压破碎仪在30mM tris，150mM NACL(购买于白鲨生物科技有限公司)的中性缓冲液条件下裂解细胞，裂解后离心收集具有稳定活性的基本骨架突变体蛋白上清液，再用AKTA蛋白纯化仪通过SOURCE Q阴离子交换柱(购买于思拓凡生物科技有限公司)进一步提高蛋白的纯度以及去除部分DNA杂质，使用超滤装置浓缩泛素蛋白至目标浓度。

实施例2：酶法反应相关蛋白纯化

1、PINK1激酶纯化

将带GST-Tag的PINK1激酶质粒使用热刺激转化法转化到大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，将转化的大肠杆菌涂布于含有相应抗生素的琼脂平板，经过夜孵育后挑选单克隆，将选取的单克隆放入LB培养液中进行摇瓶培养，至OD600约0.6时，添加IPTG后在17℃条件下过夜诱导17小时以上，使用低速离心机收取菌液；在30mM tris，300mM KCL，10％甘油(购买于白鲨生物科技有限公司)缓冲盐浓度下裂解细胞，超高速离心收取裂解上清蛋白溶液；上清通过谷胱氨肽凝胶珠孵育后，用裂解缓冲液清洗三次凝胶珠，使用30mM tris，300mM NACL，25mM谷胱氨肽(购买于源叶生物科技有限公司)洗脱凝珠胶上蛋白，收集洗脱液；使用PreScission蛋白酶(购于上海碧云天生物技术有限公司)过夜酶切，将GST-Tag切除，所得PINK1激酶蛋白浓缩备用。

实施例3：靶向蛋白泛素化降解剂的制备

1、偶联基团L与目标蛋白结合的基团B的合成与连接：

称量0.5g氨基树脂(购买于金斯瑞生物科技股份有限公司)并投入到多肽固相合成管中，用DMF溶胀氨基树脂30min，真空抽干多余的DMF溶液后，通过酰胺缩合反应将第一个氨基酸的C端固定于树脂上，N端利用Fmoc保护基保护。在Fmoc脱除液中脱去第一个氨基酸的N端保护，具体的，在多肽固相合成管中加入Fmoc脱除液，于摇床上放置10min，真空泵抽空脱保护液，用DMF、DCM交替洗涤3次，用茚三酮法进行脱保护检测，检测结果呈现深蓝色即为阳性结果，再将下一个预处理的氨基酸加入到脱去保护的树脂中进行反应，以此依次将氨基酸连接成固定于树脂的多肽。

2、偶联基团与目标蛋白结合的基团B的缩合

取4倍当量带羧基修饰的JQ1小分子(分子式是C₂₃H₂₅ClN₄O₂S，三苯甲烷三异氰酸酯)，在4倍当量DIEA(N,N-二异丙基乙胺)以及2-肟氰乙酸乙酯的缩合条件下，于37℃摇床上孵育过夜，所得为固定在树脂上偶联基团2与目标蛋白结合的基团B的缩合物。

3、偶联基团与目标蛋白结合的基团B缩合物的纯化

用DMF和DCM各洗涤树脂3次，最后一遍用DCM洗涤后抽干30min。从多肽固相合成管中取出合成的肽树脂，加入切割试剂，切割试剂优选为(TFA：H₂O：乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚＝90％:2.5％:2.5％：2.5％：2.5％)在室温下裂解3h。将树脂过滤后，将溶液在氮气下吹除多余的切割试剂至溶液总体积剩余5ml左右，且为澄清状，用提前预冷的无水乙醚洗涤3次，离心弃去上清，在通风橱中过夜晾干，用带千分之一三氟乙酸的乙腈/水溶液溶解所得多肽，通过反向高效液相色谱法以合适的洗脱梯度进行纯化。

4、基本骨架突变体蛋白的S65位点磷酸化修饰：

在10mM ATP，10mM氯化镁，1mM DTT，5mM PINK1激酶(制备方法详见实施例2)的中性缓冲液条件下，投入合适浓度的基本骨架突变体，30℃水浴孵育3h，反向高效液相色谱监测反应进程，反应效率约为60％。(图4)

5、SORTASE酶法连接合成靶向蛋白泛素化降解剂：

于反应完毕的PINK1酶法体系中，加入10mM CaCl₂，5μM SORTASE酶(购买于上海碧云天生物技术有限公司)，以10倍当量投入peptide段(即偶联基团L)，在25℃的水浴条件下孵育30min，反向高效液相色谱监测反应进程，反应效率约为90％，分析峰形图可见磷酸化基本骨架突变体蛋白原料显著减少。(图5)

实施例4

(1)表面等离子共振法测试靶向蛋白泛素化降解剂介导目标蛋白BRD4和PARKIN的三元复合物形成：

置入NTA芯片后，以150μl/min的流速用PBS缓冲液置换系统内溶液和平衡芯片，待仪器显示信号到达基线后，调整缓冲液流速至20μl/min。

以0.5NiCl₂，10mM HEPES-NaOH，150mM NaCl，0.005％ Tween-20缓冲体系激活NTA芯片后，以体积为200μl浓度为0.5μg/ml的BD1/BD2通过进样口注入仪器中，使其持续流过芯片4min，将其通过his-tag固定在NTA芯片上，以100nM的实施例3(其中突变体骨架序列如SEQ ID NO：4)制备的靶向蛋白泛素化降解剂溶液流过已固定配体的NTA芯片上，观察仪器信号稳定后；再用PBS缓冲液流过芯片3遍以去除非特异性结合以400nM的PARKIN溶液流过已固定配体以及PROTAC的二元复合物NTA芯片上，观察仪器信号，可见随着PARKIN溶液的流过，PARKIN可通过蛋白泛素化降解剂与固定在芯片上的BD1/BD2配体形成三元复合物，仪器信号逐渐上升(图1)。

(2)细胞内蛋白泛素化降解剂诱导目标蛋白的降解活性测试：

将8×10⁵个HELA细胞(购买于中国科学院细胞库/干细胞库)均匀地铺在16孔板中，与细胞培养箱中37℃过夜培养，在细胞到达70％～80％汇合度时，分别将含1.25μM，2.5μM，5μM，或10μM实施例2制备的靶向蛋白泛素化降解剂的培养基置于各个孔板中孵育16h；使用细胞裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量法定量后，使用免疫印迹分析对BRD4蛋白含量进行定量分析来测试蛋白泛素化降解对BRD4的蛋白降解能力(图2和图3)。

总之，本发明的靶向蛋白泛素化降解剂基于一个全新的E3连接酶PARKIN设计，且验证该靶向蛋白泛素化降解剂在体外展现出良好的E3连接酶激活和结合活性，并且在细胞内可在一定浓度条件下实现目标蛋白的降解，从而拓展了PROTAC技术目前可利用的E3连接酶以及可靶向的目标蛋白范围，为PROTAC可能的治疗应用开辟了更多路径。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，其特征在于，所述的靶向蛋白泛素化降解剂的结构如式Ⅰ所示：

A-L-B(I)；

2.根据权利要求1所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，其特征在于，A为将基本骨架突变体的第65位的丝氨酸位点磷酸化的突变体；所述基本骨架突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-11所示的任一种序列。

3.根据权利要求1或2所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，其特征在于，A为如下A-1至A-6的具体基团中的任一种：

4.根据权利要求1所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，其特征在于，B为BET溴结构域抑制剂；L的核苷酸序列为如SEQ ID NO：12-15所示的任一种序列，或者L为如下L-1至L-4的具体基团中的任一种：

5.根据权利要求1所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂，其特征在于，B为小分子药物JQ1。

6.基于权利要求1至5任一项所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基本骨架突变体的末端引入SORTASE酶识别序列；通过PINK1激酶对基本骨架突变体的第65位的丝氨酸位点进行磷酸化处理。

8.根据权利要求6所述一种基于PARKIN的靶向蛋白泛素化降解剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括如下的具体步骤：将带羧基基团的目标蛋白结合的基团B，在N,N-二异丙基乙胺以及2-肟氰乙酸乙酯的缩合条件下，通过酰胺缩合反应偶联到偶联基团L的赖氨酸的氨基侧链上，得到L-B偶联体；

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1至5任一项所述的靶向蛋白泛素化降解剂，或其药学上可接受的盐，或其立体异构体；和药学上接受的载体。

10.将权利要求1至5任一项所述的靶向蛋白泛素化降解剂或权利要求9所述的组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤、神经退行性疾病的药物中的应用。