CN111647049A - 多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1。上述多肽能够诱导产生特异性较高的KLF4抗体。

Description

多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，特别是涉及一种多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
KLF4基因位于9q31染色体，共有5个外显子，转录RNA长6.3kb。其编码蛋白有470个氨基酸，分子量约为50kDa。KLF4存在多个功能区域，从N端到C端依次是转录激活结构域、转录抑制结构域、核定位信号、“锌指”结构。锌指结构区的丝氨酸磷酸化是KLF4蛋白发挥转录因子作用、促进下游基因表达的关键。KLF4通过调节下游基因转录，与细胞的增殖、分化、凋亡、维持干细胞潜能等细胞基本生物学过程有关。
研究表明，KLF4参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移以及肿瘤微环境。在胃癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、淋巴癌中KLF4表达受到抑制。研究发现，恢复KLF4表达后，肿瘤的致瘤性和肿瘤的转移明显受到抑制，细胞周期停滞，癌细胞发生凋亡。但在乳腺癌中KLF4的表达是上升的，并且其细胞核定位与乳腺癌早期侵袭性有关。研究发现，结肠癌细胞系中KLF4的5’非编码区的过甲基化可能是KLF4作为肿瘤抑制因子的原因之一。KLF4作为转录因子表现出特异性转录激活和转录抑制的双重功能，在不同的细胞环境下KLF4能够发挥抑癌基因或者癌基因的作用。因此，非常有必要研究KLF4的生物学及肿瘤细胞学中的生物功能。其中，识别KLF4的抗体是必不可少的工具。然而，现有的识别KLF4的抗体的特异性较差，严重限制对KLF4的深入研究。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够诱导产生特异性较高的KLF4抗体的多肽。
此外，还有必要提供一种多肽的制备方法和应用、核酸、多肽偶联物及其制备方法和应用。
一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
研究发现，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽能够诱导产生特异性较高的KLF4抗体，以有利于对KLF4的深入研究。经试验验证，采用氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽诱导产生的KLF4抗体对KLF4的特异性高。
在其中一个实施例中，所述多肽的氨基酸序列中，从氨基端向羧基端的方向，第8位氨基酸为磷酸化氨基酸。
在其中一个实施例中，所述多肽的羧基端酰胺化。
一种多肽的制备方法，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或基因工程技术制备得到多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
一种核酸，所述核酸含有上述多肽的编码序列。
一种多肽偶联物，所述多肽偶联物包括多肽部分，所述多肽部分含有上述多肽。
在其中一个实施例中，所述多肽偶联物还包括偶联部分，所述偶联部分与所述多肽部分连接，所述偶联部分选自血蓝蛋白、卵清蛋白及牛血清白蛋白中的至少一种。
一种KLF4抗体的制备方法，包括如下步骤：
采用抗原对动物进行免疫，收集免疫后的所述动物的血清，得到KLF4抗体，所述抗原为上述多肽或者上述多肽偶联物。
一种KLF4抗体，由上述KLF4抗体的制备方法制备得到。
上述多肽、上述核酸、上述多肽偶联物或者上述KLF4抗体在制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置中的应用。
附图说明
图1为实施例4中的点杂交实验的结果；
图2为实施例5的western blot结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的多肽能够诱导产生特异性较高的KLF4抗体，以有利于对KLF4的深入研究，以能够应用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测KLF4或者用于检测KLF4抗体的效价。
在其中一个实施例中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。具体地，如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列为：CPGSEYGSPSVIS。此种设置的多肽能够诱导产生特异性识别KLF4的抗总肽段抗体。
进一步地，多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且多肽的羧基端酰胺化。具体地，即氨基酸序列为：CPGSEYGSPSVIS；且羧基端的S(即丝氨酸)的羧基被酰胺化为酰胺基(即NH2-CPGSEYGSPSVIS-CONH2)。
研究发现，ERK1和ERK2磷酸化KLF4的123位丝氨酸能够抑制KLF4的活性，以促进小鼠胚胎干细胞分化。相反地，抑制KLF4磷酸化能够促进KLF4的活性，抑制小鼠胚胎干细胞分化。研究还发现JNK1和JNK2磷酸化KLF4的224和225位苏氨酸能够抑制KLF4的转录活性和反式转录活性，以抑制多潜能干细胞的重编程。其中，ERK(extracellular regulatedprotein kinases)是指细胞外调节蛋白激酶。JNK(c-Jun N-terminal kinase)是指c-Jun氨基末端激酶，又被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)。
在其中一个实施例中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且多肽的氨基酸序列中，从氨基端向羧基端的方向，第8位氨基酸为磷酸化氨基酸。具体地，其氨基酸序列为：CPGSEYGp[Ser]PSVIS。即多肽的氨基酸序列中，从氨基端向羧基端的方向，第8位丝氨酸为磷酸化丝氨酸。此种设置的多肽能够诱导产生特异性识别KLF4的磷酸化抗体。
进一步地，多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，多肽的氨基酸序列中，从氨基端向羧基端的方向，第8位氨基酸为磷酸化氨基酸，且多肽的羧基端酰胺化。具体地，其氨基酸序列为：CPGSEYGp[Ser]PSVIS；且羧基端的R(即精氨酸)的羧基被酰胺化为酰胺基(即NH2-CPGSEYGp[Ser]PSVIS-CONH2)。
研究发现，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽能够诱导产生特异性较高的KLF4抗体，以有利于对KLF4的深入研究。
上述实施方式的多肽的制备方法，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或基因工程技术制备得到多肽。
在其中一个实施例中，多肽固相合成法为Boc固相合成法或Fmoc固相合成法。其中，Boc为叔丁氧羰基。Boc固相合成法中以易酸解的Boc基团作为N-ɑ-保护基团。Fmoc为9-芴甲氧羰基。Fmoc固相合成法中以易酸解的Fmoc基团作为N-ɑ-保护基团。
在其中一个实施中，基因工程技术具体为：构建重组载体，重组载体含有上述多肽的编码序列。通过构建重组载体能够较好地保存编码上述多肽的编码序列，有利于多肽的表达。
进一步地，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。重组载体能够表达或克隆多肽。
更进一步地，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于多肽的分离纯化。进一步地，纯化标签为His标签、GST标签或SUMO标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。
具体地，重组载体包括基因工程载体。上述多肽的编码序列插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pET-32a载体、pGEX-6P-1载体、pPIC-9K载体或pPIC-Zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。
在其中一个实施中，基因工程技术具体为：通过构建重组细胞，重组细胞含有上述多肽的编码序列或上述重组载体。重组细胞为克隆上述多肽的细胞或表达上述多肽的细胞。
通过构建重组细胞，能够克隆或表达上述多肽，使得能够大规模的制备多肽，并且通过重组细胞定向表达该多肽，以能够获得纯度较高的多肽，进而有利于多肽的应用。
进一步地，重组细胞包括受体细胞。上述多肽的编码序列或上述重组载体位于受体细胞内。
更进一步地，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细胞。具体地，受体细胞为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤酵母GS115或毕赤酵母SMD1168。需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。
上述多肽的制备方法，工艺简单、操作方便，且能够制备纯度较高的多肽，以诱导产生特异性较高的KLF4抗体，以有利于对KLF4的深入研究。
进一步地，提供一实施方式的核酸，该核酸含有上述实施方式的多肽的编码序列。此种设置使得能够通过基因工程技术以获得上述实施方式的多肽，并且该核酸能够用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测KLF4或者用于检测KLF4抗体的效价。
一实施方式的多肽偶联物包括多肽部分，多肽部分含有上述实施方式的多肽。通过将上述多肽制成多肽偶联物，有利于增强多肽的免疫原性，以高效诱导KLF4抗体，以能够应用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测KLF4或者用于检测KLF4抗体的效价。
进一步地，多肽偶联物还包括偶联部分。偶联部分与多肽部分连接。更进一步地，偶联部分选自血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)及牛血清白蛋白(BSA)中的至少一种。该偶联部分能够与多肽部分偶联，以激起更加充分的免疫反应。
可选地，偶联部分为KLH。KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)，即血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一能够与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量为45000～130000。KLH比BSA有更高的免疫原性。
在一个具体示例中，多肽部分为上述多肽，偶联部分为KLH。
此外，提供上述实施方式的多肽偶联物的制备方法，包括如下步骤：将Sulfo-SMCC[即4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐]、多肽部分与偶联部分混合并反应，以使多肽部分与偶联部分连接，得到多肽偶联物；多肽部分含有上述实施方式的多肽或上述实施方式的多肽的制备方法制备得到的多肽。
在其中一个实施例中，Sulfo-SMCC、多肽部分和偶联部分的质量比为1:10:10。
在其中一个实施例中，将Sulfo-SMCC、多肽部分与偶联部分混合并反应的步骤包括S110～S120：
S110、将Sulfo-SMCC与偶联部分混合并反应形成中间物。
在其中一个实施例中，S110包括：将偶联部分与AH溶液混合，得到第一混合物；将Sulfo-SMCC与DMSO(二甲亚砜)混合，得到第二混合物；将第一混合物与第二混合物混合并反应，得到中间物。其中，AH溶液包括Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl和EDTA，且AH溶液的pH值为7.2。进一步地，第一混合物中偶联部分的终浓度为10mg/mL。第二混合物中Sulfo-SMCC的终浓度为100mg/mL。反应温度为室温。反应时间为4h。
在其中一个实施例中，将Sulfo-SMCC与偶联部分混合并反应的步骤之前，还包括如下步骤：对Sulfo-SMCC与偶联部分混合并反应得到的反应物进行纯化。需要说明的是，采用本领域的常规方法对上述反应物进行纯化，例如层析柱分离纯化，此处不再赘述。
S120、将中间物与多肽部分混合并反应，得到多肽偶联物。
具体地，将中间物与多肽部分混合并反应的步骤包括：将多肽部分溶解后与AH溶液混合，得到多肽混合物；向中间物中加入多肽混合物混合并反应，得到多肽偶联物。其中，溶解多肽的化学试剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。多肽混合物中多肽的浓度为6mg/mL。中间物和多肽混合物混合的混合物中，多肽部分、偶联部分与Sulfo-SMCC的质量比为10:10:1。
在其中一个实施例中，反应的时间为2h～12h。反应的温度为室温。
上述多肽偶联物的制备方法，操作简单，制备得到的多肽偶联物能够高效诱导KLF4抗体。
一实施方式的KLF4抗体的制备方法能够制备特异性和效价均较高的KLF4抗体，以能够应用于制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置。检测试剂、检测试剂盒或者检测装置用于检测KLF4或者用于检测KLF4抗体的效价。该KLF4抗体的制备方法包括如下步骤：采用抗原对动物进行免疫，收集免疫后的动物的血清，得到KLF4抗体，抗原为上述实施方式的多肽或者上述实施方式的多肽偶联物。
具体地，将抗原与弗氏完全佐剂按体积比为1：1混合后乳化，以180μg/只～220μg/只的抗原剂量免疫兔子，饲养2周～3周后，得到初次免疫的兔子；然后将抗原与弗氏不完全佐剂按体积比为1：1混合后乳化，按照初次免疫的剂量与操作对初次免疫的兔子进行加强免疫，饲养1周～2周后，得到免疫后兔子。
其中，加强免疫的次数不限，可以为一次，也可以为多次，例如可以为四次。加强免疫的次数为四次时，相邻两次加强免疫的时间间隔为1周～2周。
其中，兔子为本领域常规的用于动物实验的兔子，例如可以为RB59731新西兰兔或者RB59732新西兰兔。
需要说明的是，动物不限于为兔子，也可以为其他动物，例如小鼠或者大鼠。
在其中一个实施例中，收集免疫后的动物的血清的步骤之后，还包括如下步骤：纯化血清，得到KLF4抗体。纯化血清的方式为本领域常用的纯化方式，例如可以为抗原亲和纯化。
上述KLF4抗体的制备方法操作简单，采用上述实施方式的多肽或者上述实施方式的多肽偶联物作为抗原能够制备得到特异性和效价均较高的KLF4抗体。
一实施方式的检测试剂盒包括上述实施方式的多肽或者上述实施方式的多肽偶联物。该检测试剂盒能够用于检测KLF4抗体的效价。
需要说明的是，上述检测试剂盒还可以包括本领域中其他常见的试剂，例如包括包被液、封闭液和洗涤液。其中，包被液例如可以为pH8.5的Tris-HCl、10mM、pH7.4的PBS或者50mM、pH9.6的Na2CO3。封闭液包括BSA(牛血清蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白或者明胶等。洗涤液为PBST(磷酸盐缓冲液)或纯水。
上述检测试剂盒能够用于检测KLF4抗体的效价，并且检测的准确性较高。
一实施方式的检测试剂盒包括上述实施方式的KLF4抗体。该检测试剂盒能够用于检测KLF4。
需要说明的是，上述检测试剂盒还可以包括本领域中其他常见的试剂，可以根据需要进行设置，此处不再赘述。
上述检测试剂盒中的KLF4抗体具有较高的特异性和效价，能够用于检测KLF4，并且检测的特异性和准确性较高。
以下为具体实施例部分：
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
多肽的合成
根据设计的氨基酸序列，采用固相合成法合成多肽。其中，氨基酸序列为：NH2-CPGSEYGp[Ser]PSVIS-CONH2的多肽命名为P1。氨基酸序列为：NH2-CPGSEYGSPSVIS-CONH2的多肽命名为P2。两种多肽由苏州东安生物科技有限公司合成。
固相合成法的过程具体包括：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构与固相载体(即不溶性的高分子树脂)相连，然后以该结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分(即经活化的待连接氨基酸)反应，接长肽链，重复操作，直到达到所要合成的肽链长度为止，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，得到多肽。
其中，将裂解树脂后的肽链进行纯化的方式为RP-HPLC(反相高效液相色谱)，纯化条件为：流动相A为质量百分含量为0.1％的TFA(三氟乙酰基)的水溶液，流动相B为质量百分含量为0.1％的TFA的乙腈溶液；洗脱方式为梯度洗脱，即以流动相A和流动相B的体积比为90:40在30min内洗脱至梯度流动相A和流动相B的体积比为40:90，流速为1mL/min；温度为室温(即23℃)；检测器为紫外检测器，检测波长为214nm。
纯化的具体步骤包括：将裂解树脂后的肽链溶解在流动相A中，注入20mg～30mg(或者2mL～2.5mL)样品，按照上述纯化条件进行层析，并收集主峰，然后冻干，得到纯化后的多肽。
采用液相色谱质谱法(LC-MS)鉴定纯化后的多肽的纯度，鉴定条件为：流动相A为质量百分含量为0.05％的TFA的水溶液，流动相B为质量百分含量为0.1％的TFA的乙腈溶液；洗脱方式为梯度洗脱，即以流动相A和流动相B的体积比为90:10在10min内洗脱至梯度流动相A和流动相B的体积比为40:60，流速为1mL/min；温度为室温(即23℃)；检测器为紫外检测器，检测波长为214nm；质谱为大气压电喷雾(API-ESI)质谱。
实施例2
多肽偶联物的制备
(1)柱床准备：纯水及偶联缓冲液洗涤柱床；偶联缓冲液即AH溶液，包括Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl和EDTA，且AH溶液的pH值为7.2。
(2)多肽混合物的制备：采用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解多肽，静置30min，待溶液中无颗粒状不溶物，加AH溶液混合，得到多肽混合物，多肽混合物中多肽的浓度为6mg/mL。其中，多肽为实施例1合成的每种多肽，得到每种多肽的多肽混合物。
(3)将偶联部分与AH溶液混合，得到第一混合物，第一混合物中偶联部分的终浓度为10mg/mL。将Sulfo-SMCC与DMSO混合，得到第二混合物，第二混合物中Sulfo-SMCC的终浓度为100mg/mL；将第一混合物与第二混合物混合并在室温下反应4h，用层析柱进行分离，得到中间物。偶联部分为钥孔血蓝蛋白。
(4)向中间物中加入多肽混合物，并用垂直混合仪混匀，再置于室温下过夜反应，得到多肽偶联物，将多肽偶联物至于-20℃保存。其中，中间物和多肽混合物混合的混合物中，多肽部分、偶联部分与Sulfo-SMCC的质量比为10:10:1。
需要说明的是，上述六种多肽均用上述方法制备得到两种多肽偶联物，分别命名为P1-KLH和P2-KLH。
实施例3
KLF4抗体的制备
1、免疫动物为兔子，即新西兰兔(公兔，3月龄～4月龄，每只兔子的体重为2kg～2.5Kg。
2、免疫后兔子的制备：
(1)初次免疫：将抗原与弗氏完全佐剂按体积比为1：1混合后，以200μg/只的抗原剂量免疫兔子，饲养14天后，得到初次免疫的兔子。免疫方式为皮下多点注射。
(2)二次免疫：在初次免疫之后，于第14天按照初次免疫的操作对初次免疫的兔子进行二次免疫，正常饲喂。
(3)三次免疫：在初次免疫后的第21天按照步骤(2)的操作对二次免疫的兔子进行三次免疫正常饲喂。
(4)四次免疫：在初次免疫之后，于第28天按照步骤(2)的操作对三次免疫的兔子进行四次免疫。
(5)五次免疫：在初次免疫之后，于第35天按照步骤(2)的操作对四次免疫的兔子进行五次免疫。进行第五次免疫之前，对四次免疫的兔子进行采血，采血量为5mL，并收集血清
实施例2的两种多肽偶联物均用上述方法制备得到对应的血清。
实施例4
对实施例2的两种多肽偶联物作为抗原免疫动物得到的血清中的抗体进行特异性检测(点杂交实验)具体如下：
(1)磷酸化的KLF4(p-KLF4 peptide)及KLF4(KLF4 peptide)溶于PBS+0.1％NaN3中，其中，磷酸化的KLF4的氨基酸序列为：NH2-CPGSEYGp[Ser]PSVIS-CONH2，KLF4的氨基酸序列为NH2-CPGSEYGSPSVIS-CONH2。
(2)在甲醇激活PVDF膜晾干后，将0.5μg磷酸化的KLF4及10μg KLF4分别点到PVDF膜上，晾干后用5％脱脂奶封闭两小时。
(3)将实施例3采用P1-KLH作为抗原制备的血清中的抗体和实施例3中采用P2-KLH作为抗原制备的血清中的抗体分别溶于5％BSA中，抗体与5％BSA的体积之比为1：1000；接着将每种抗体分别点于PVDF膜的包被有磷酸化的KLF4和KLF4的区域，室温孵育1小时；TBST洗3次，每次15分钟，加入羊抗兔二抗，室温孵育1小时，TBST洗3次，每次15分钟，加入ECL显影。结果如图1所示。
由图1可看出，由P2-KLH作为抗原制备的抗体与磷酸化的KLF4和KLF4均能结合，而以P1-KLH作为抗原制备的抗体仅与磷酸化的KLF4结合，说明P1-KLH作为抗原制备的抗体对磷酸化的KLF4特异性好。
实施例5
(1)接种HEK-293T细胞于六孔板中，待到细胞密度约为70％时，通过Lipo3000转染试剂将各质粒按表1转染至HEK-293T细胞中，于培养箱中培养36小时。
表1
Figure BDA0002565039830000141
(2)培养结束后，向含有不同质粒的细胞中分别加入1mL NTEN细胞裂解液(1％NP-40,10mM Tris ph-7.6,1mM EDTA,150mM NaCl)于冰上裂解细胞，30分钟。于离心机中(16000×RCF，30分钟，4℃)离心细胞裂解液，弃沉淀，得到上清液，并从中取60μL作为Input样品。
(3)在步骤(2)中剩余的940μL上清液中加入1μg HA-probe antibody(santacruz，SC-7392)，于4℃过夜孵育；然后加入20μL protein A/G磁珠(MCE，HY-K0202)，于4℃孵育两小时；接着用NTEN细胞裂解液清洗磁珠3次，每次10分钟，加入60μL SDS loadingbuffer，于95℃洗脱(10分钟)，得到洗脱液，作为IP样品。
(4)将步骤(2)的Input样品和步骤(3)的IP样品，按表2上样进行SDS-PAGE。
表2
Figure BDA0002565039830000142
(5)甲醇激活PVDF膜，在电流240mA下转膜120min，将步骤1电泳后的蛋白转至PVDF膜上,用5％BSA封闭2小时。
(6)一抗分别为：P1-KLH作为抗原制备的能够与磷酸化的KLF4特异性结合的抗体(1：1000,Rabbit pAb)、KLF4抗体(1：2000，Goat pAb，R&D，AF3640)、Myc抗体(1：2000，mousemAb，CST，2276S)、CDK3抗体(1：2000，rabbit pAb)和β-actin抗体(1：2000，mouse mAb，proteintech，66009)，将上述一抗分别溶于5％BSA中并加入到上述步骤(5)封闭后的PVDF膜中，4℃过夜孵育；TBST清洗三次，每次15分钟；加入相应的二抗，室温孵育2小时；TBST清洗三次，每次15分钟；加ECL显影，结果如图2所示。
已有文献及数据指出CCNE1与CDK3结合并激活CDK3的激酶活性，使得KLF4蛋白的244位丝氨酸磷酸化。由图2可知，在Input样品的对照组(没有转入pCDH-Myc-CCNE1和pCDH-CDK3的293T细胞)也检测到了磷酸化KLF4，这可能是来源于细胞裂解液中其他物质的干扰，故我们开展了将共转染有pCDH-Myc-CCNE1、pCDH-CDK3和pCDNA-Flag-HA-wtKLF4的293T细胞裂解液用标签纯化后进行验证。由图2可知，经标签纯化后的细胞裂解液中磷酸化的KLF4量明显多于对照组，说明P1-KLH作为抗原制备的抗能明显地检测到磷酸化KLF4。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Pro Gly Ser Glu Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中，从氨基端向羧基端的方向，第8位氨基酸为磷酸化氨基酸。
3.根据权利要求1～2任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽的羧基端酰胺化。
4.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或基因工程技术制备得到多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种核酸，其特征在于，所述核酸含有权利要求1所述的多肽的编码序列。
6.一种多肽偶联物，其特征在于，所述多肽偶联物包括多肽部分，所述多肽部分含有权利要求1～3任一项所述的多肽。
7.根据权利要求6所述的多肽偶联物，其特征在于，所述多肽偶联物还包括偶联部分，所述偶联部分与所述多肽部分连接，所述偶联部分选自血蓝蛋白、卵清蛋白及牛血清白蛋白中的至少一种。
8.一种KLF4抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用抗原对动物进行免疫，收集免疫后的所述动物的血清，得到KLF4抗体，所述抗原为权利要求1～3任一项所述的多肽或者权利要求6～7任一项所述的多肽偶联物。
9.一种KLF4抗体，其特征在于，由权利要求8所述的KLF4抗体的制备方法制备得到。
10.权利要求1～3任一项所述的多肽、权利要求5所述的核酸、权利要求6～7任一项所述的多肽偶联物或者权利要求9所述的KLF4抗体在制备检测试剂、检测试剂盒或者检测装置中的应用。
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