CN117701528A - 一种塑料生物降解镜像酶及其应用 - Google Patents

一种塑料生物降解镜像酶及其应用 Download PDF

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郭聪
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Abstract

本发明公开了一种塑料生物降解镜像酶及其应用。蛋白质为如下任一所示蛋白质：(a1)氨基酸序列为ICCG‑WT N端截短10‑48个氨基酸残基所示的蛋白质；(a2)将ICCG‑WT N端截短10‑48个氨基酸残基所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)‑(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)‑(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。由D‑氨基酸组成的该蛋白质能够有效降解PET及其他非手性的塑料。

Description

一种塑料生物降解镜像酶及其应用
技术领域
本发明属于化学及镜像合成生物学技术领域，具体涉及一种塑料生物降解镜像酶及其应用。
背景技术
塑料因其重量轻、经久耐用、延展性好以及生产成本低等优点而广泛应用在我们日常生活的各个方面。由于塑料废弃物的自然降解性差，回收有限，因此塑料污染问题引起世界范围内人们的极大关注。目前，约9％的塑料废物被回收利用，12％被焚烧，其余的继续在自然环境中积累。此外，焚烧塑料后产生的底灰被证明是释放微塑料(尺寸小于5mm的塑料颗粒)的潜在来源。最近的研究表明，在海洋和陆地环境中均可发现微塑料颗粒，严重威胁了海洋生物的生命和土壤质量。然而，从自然环境中收集塑料废物特别是微塑料，给我们带来了巨大的技术和经济挑战。采用生物酶降解塑料不产生额外的污染物，为我们提供了一种理想且环境友好的塑料污染解决方案。特别是，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是世界上生产和使用最广泛的聚酯塑料，占全球固体废物重量的8％，此外，近年来的新冠肺炎大流行导致PET聚合物的生产和使用量增加了数倍。近年来，在自然界中发现了几种PET降解酶，研究人员致力于在天然降解酶的基础上通过定向进化，随机突变等方式对其进行改造，进而提高酶的活性和稳定性以有效降解PET。例如，与野生型Ideonella sakaiensis PETase(IsPETase)相比，在37℃和40℃下，ThermoPETase和DuraPETase的活性分别提高了约14倍和约300倍；从叶枝堆肥酶(leaf-branch compost cutinase-LCC)基础上改造得到的优化角质酶ICCG(包含259个氨基酸)，能够在10小时分解90％的PET，在所有已报道的PET降解酶中，其在～72℃下具有最高的酶活性。但这种高产率是建立在对PET塑料充分集中回收及高温反应条件的基础上，事实上大多数的塑料碎片及微塑料废物是很难收集的，微生物和其他生物分泌的蛋白酶对塑料降解酶的生物降解可能会破坏开放环境中应用PET降解酶的生物稳定性。因此探索一种能够在开放环境中原位降解塑料的方法是解决塑料污染问题的一个重要思路。
生命系统存在单一手性原则，即蛋白质和DNA/RNA分别由L型氨基酸和D型核苷酸构成，而几乎不使用其镜像版本。手性均一性特征至今仍是生命起源及进化过程中的未解之谜。镜像生物学系统中的L型核酸和D型蛋白质不能被天然核酸酶或蛋白酶识别和降解，在自然开放环境中可以长期稳定存在，因此该系统具有独特的生物正交性。同时，与其它生物正交系统相比，由于其与天然系统成完全镜像的关系，遵循天然系统中分子间的作用规律，因此在天然系统中积累的知识技术只需转化为镜像形式即可适用于该系统。除极少数含个别D型氨基酸的短肽外，生物体内只能合成L型蛋白质，因此要得到镜像生物学体系所需的镜像核酸和蛋白质只能通过化学方法进行人工合成。镜像蛋白质的化学合成主要依赖于固相多肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)和自然化学连接(nativechemical ligation，NCL)两项技术。得益于该技术的不断发展，镜像生物学体系已建立了镜像核酸的复制、转录、反转录、测序等系统。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种在开放环境中原位降解塑料的酶。
本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
(a1)氨基酸序列为ICCG-WT N端截短10～48个氨基酸残基所示的蛋白质；
(a2)将ICCG-WT N端截短10～48个氨基酸残基所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白；
所述ICCG-WT的氨基酸序列为genbank登陆号为6THT_A的第1至第258位。
截短10～48个氨基酸残基可为截短10，19，36或48个氨基酸残基。
可选地，根据上述的蛋白质，(a1)所述蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.1第2-249位、SEQ ID No.2第2-240、SEQ ID No.3第2-223位或SEQ ID No.4第2-211位所示的蛋白质。
可选地，根据上述的蛋白质，(a2)所述蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.1第1-249位、SEQ ID No.2第1-240、SEQ ID No.3第1-223位或SEQ ID No.4第1-211位所示的蛋白质，即在上述a1)所述蛋白质的N端添加一个甲硫氨酸。
可选地，根据上述的蛋白质，(a4)所述蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的蛋白质。
上述蛋白质可通过先合成其编码基因，再进行生物表达得到，也可通过全化学人工合成。
上述蛋白质中，所述标签可指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签(例如His6标签)、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
可选地，上述的蛋白质由甘氨酸和非甘氨酸连接而成，所述非甘氨酸为L型氨基酸或D型氨基酸。由甘氨酸和L型非甘氨酸氨基酸合成的上述蛋白质被称为塑料生物降解天然酶。由甘氨酸和D型非甘氨酸氨基酸合成的上述蛋白质被称为塑料生物降解镜像酶。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述蛋白质具体可为下述实施例1制备的ICCG-T1，ICCG-T2，ICCG-T3或者ICCG-T4，也可为实施例3制备的L-ICCG-T3或者D-ICCG-T3。
本发明还提供了上述蛋白质的合成方法：
(1)采用固相多肽合成技术合成多肽片段ICCG-T3-1、ICCG-T3-2、ICCG-T3-3、ICCG-T3-4和ICCG-T3-5，所述ICCG-T3-1的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第1-32位所示，ICCG-T3-2的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第33-78位所示，ICCG-T3-3的氨基酸序列为SEQID No.3的第79-136位所示，ICCG-T3-4的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第137-180位所示，ICCG-T3-5的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第181-231位所示，采用自然化学连接技术连接所述多肽片段获得SEQ ID No.3所示的全长多肽；
(2)将所述SEQ ID No.3所示的多肽进行折叠复性得到所述蛋白质。
所述自然化学连接技术连接所述多肽片段可包括ICCG-T3-2与ICCG-T3-3连接生成ICCG-T3-6,ICCG-T3-1与ICCG-T3-6连接生成ICCG-T3-7，ICCG-T3-4与ICCG-T3-5连接生成ICCG-T3-8，ICCG-T3-7与ICCG-T3-8连接生成ICCG-T3-9,ICCG-T3-9脱硫和脱Acm生成ICCG-T3-11。
可选地，上述合成方法中，(2)包括
21)将所述SEQ ID No.3所示的全长多肽溶解于变性缓冲液，所述变性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为Tris-HCl缓冲液，所述溶质及其浓度分别为6M Gn·HCl、300mMNaCl、20mM DTT、50mM NaAC、0.5mM EDTA和10％(体积百分比浓度)甘油，所述Tris-HCl缓冲液的溶质为Tris碱和HCl，溶剂为水，所述Tris-HCl缓冲液中Tris碱的含量为20mM，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0；
22)每1毫升21)获得的溶液中加入99毫升复性缓冲液将其稀释100倍并搅拌过夜以促进蛋白复性折叠，所述复性缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为Tris-HCl缓冲液，所述溶质及其浓度分别为300mM NaCl、20mM DTT、50mM NaAC、0.5mM EDTA和10％(体积百分比浓度)甘油，所述Tris-HCl缓冲液的溶质为Tris碱和HCl，溶剂为水，所述Tris-HCl缓冲液中Tris碱的含量为20mM，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。所述复性时的搅拌转速可为100-200rpm,如100rpm；复性时间均可为5-15小时，如10小时。复性温度可为4℃。
23)将所述复性后的蛋白质溶液在65℃加热30min，随后离心获得上清液，将上清液浓缩并透析至储存缓冲液中，即得到复性蛋白质。所述储存缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为Tris-HCl缓冲液，所述溶质及其浓度分别为300mM NaCl和50％(体积百分比浓度)甘油，所述Tris-HCl缓冲液的溶质为Tris碱和HCl，溶剂为水，所述Tris-HCl缓冲液中Tris碱的含量为20mM，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。所述离心可为4℃下以10000g离心30min。
上述蛋白质的相关生物材料也属于本发明的保护范围之内，所述生物材料为下述任一种：
c1)编码上述蛋白质的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
c1)所述核酸分子的核苷酸序列可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-33位所获得的核苷酸序列，也可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-33位并在3’端连接His6标签编码基因所获得的核苷酸序列，可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-60位所获得的核苷酸序列，也可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-60位并在3’端连接His6标签编码基因所获得的核苷酸序列，可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-111位所获的核苷酸序列，也可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-111位并在3’端连接His6标签编码基因所获的核苷酸序列，还可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-147位所获的核苷酸序列，更可为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-147位并在3’端连接His6标签编码基因所获的核苷酸序列。编码ICCG-WT基因核苷酸序列具体可为SEQID No.5所示。
c3)所述的重组载体具体可为下述实施例制备的pET26b(+)-ICCG-T1质粒，pET26b(+)-ICCG-T2质粒，pET26b(+)-ICCG-T3质粒或者pET26b(+)-ICCG-T4质粒。
上述蛋白质的应用也属于保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：
(1)作为塑料降解酶；
(2)降解塑料；
(3)制备降解塑料产品。
上述的生物材料也属于保护范围之内。所述应用具体为在如下任一中的应用：
(1)降解塑料；
(2)制备降解塑料产品。
本发明还提供了一种降解塑料的方法，包括使上述蛋白质接触开放环境中的塑料。
所述塑料可选自PET、PBT和PBS中的至少一种。
最常用的塑料(如PET)是非手性的，因此可以被由D-氨基酸组成的镜像酶降解(图1)。同时，镜像酶本身具有抗生物降解性，使其更适合在开放环境中降解塑料。
本发明通过化学合成由D-氨基酸组成的镜像PET降解酶，并通过实验证明其能够有效降解PET及其他非手性的塑料，因此可作为不可生物降解的酶用于缓解自然环境中的塑料污染问题。
本发明合成了塑料降解酶及其镜像版本，能够降解多种非手性塑料；本发明所提供的镜像塑料降解酶。在土壤和海水开放环境中能够稳定存在，并发挥降解作用，未来有望应用于在环境中原位降解塑料污染物。
附图说明
图1为PET水解酶ICCG(PDB:6THT)的3D结构以天然和镜像形式显示，浅色部分为截短的序列。
图2为ICCG-1以及ICCG-1a合成情况。
图3为实施例1检测结果。
图4为实施例1检测结果。
图5为实施例2ICCG-T3的合成路线。
图6A为L-ICCG-T3-1的合成情况。
图6B为L-ICCG-T3-2的合成情况。
图6C为L-ICCG-T3-3的合成情况。
图6D为L-ICCG-T3-4的合成情况。
图6E为L-ICCG-T3-5的合成情况。
图7A为D-ICCG-T3-1的合成情况。
图7B为D-ICCG-T3-2的合成情况。
图7C为D-ICCG-T3-3的合成情况。
图7D为D-ICCG-T3-4的合成情况。
图7E为D-ICCG-T3-5的合成情况。
图8A为L-ICCG-T3-2与L-ICCG-T3-3连接生成L-ICCG-6。
图8B为L-ICCG-T3-1与L-ICCG-T3-6连接生成L-ICCG-7。
图8C为L-ICCG-T3-4与L-ICCG-T3-5连接生成L-ICCG-8。
图8D为L-ICCG-T3-7与L-ICCG-T3-8连接生成L-ICCG-9。
图9A为D-ICCG-T3-2与D-ICCG-T3-3连接生成D-ICCG-6。
图9B为D-ICCG-T3-1与D-ICCG-T3-6连接生成D-ICCG-7。
图9C为D-ICCG-T3-4与D-ICCG-T3-5连接生成D-ICCG-8。
图9D为D-ICCG-T3-7与D-ICCG-T3-8连接生成D-ICCG-9。
图10为L-ICCG-T3-9脱硫生成L-ICCG-10。
图11为D-ICCG-T3-9脱硫生成D-ICCG-T3-10。
图12为L-ICCG-T3-10脱Acm生成L-ICCG-11。
图13为D-ICCG-T3-10脱Acm生成D-ICCG-T3-11。
图14为实施例3检测结果。
图15为实施例3检测结果。
图16为实施例4检测结果。
图17为实施例4检测结果。
图18为实施例4检测结果。
图19为实施例4检测结果。
图20为实施例5检测结果。
图21为实施例5检测结果。
图22为实施例5检测结果。
图23为实施例5检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
对苯二甲酸(TPA)，双(2-羟乙基)-TPA(BHET)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)颗粒购自Sigma-Aldrich公司。
单(2-羟乙基)-TPA(MHET)、单(4-羟基丁基)TPA(MHBT)购自毕得医药科技股份有限公司(中国上海)。
聚丁二酸丁二醇酯(PBS)颗粒、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)颗粒、琥珀酸(SA)和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇购自Macklin生化科技有限公司(中国上海)。
聚合物薄膜由PET、PBT和PBS颗粒制备而来。将PET和PBT颗粒(0.1g)溶解于1mL的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇中,然后，将1ml溶液均匀涂布在玻璃培养皿底部并用0.3mL乙腈提取获得半结晶膜。将PBS颗粒(0.1g)溶解于1mL的1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇中，然后均匀涂布在玻璃培养皿底部/>晾干后得到薄膜。将所有薄膜切割成直径为5mm的圆片。
PET微塑料(结晶度约为12.3％)购自中国东莞市特塑朗化工原料经营部。将PET微塑料溶解在10％的吐温水溶液中获得微塑料溶液，其终浓度为5mg/ml。
2-Cl-trityl-Cl树脂(2-氯三苯甲基氯树脂(2CTC)，取代度为0.6mmol/g)购自天津南开合成科技有限公司。
Wang Chemmatrix树脂购自中国上海希施生物科技公司。
9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基保护的L-氨基酸，9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基保护的D-氨基酸和O-(6-氯苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)购自上海吉尔生化有限公司。
N,N-二异丙基乙胺(DIEA),三氟乙酸(TFA),N,N-二甲基甲酰胺(DMF),茴香硫醚,三异丙基硅烷(TIPS),乙二硫醇(EDT),氯化钯(PdCl2)和偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(VA-044)购自J&K Scientific(中国北京)。
4-巯基苯乙酸(MPAA)购自Alfa Aesar。
哌啶,Na2HPO4·12H2O,NaH2PO4·2H2O,亚硝酸钠(NaNO2),NaCl,NaOH,盐酸胍(Gn·HCl)和盐酸购自中国国药集团化学试剂有限公司。
二氯甲烷购自上海泰坦科技有限公司。
三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl),Fmoc-NHNH2,氰基乙氧基-2-肟(Oxyma),N,N′-二环己基碳酰亚胺(N,N’-Di isopropyl-carbodiimide(DIC))和DL-1,4-二硫苏糖醇(DTT)购自阿达玛斯试剂(上海)有限公司。
谷胱甘肽(还原形式)购自Acros Organics。
无水乙醚购自北京通光精细化工有限公司。
乙腈(HPLC级)购自J.T.Baker(Phillipsburg,NJ,USA)。
商用蛋白酶K货号P8111S，购自NEB(美国)。
下述实施例所使用的实验方法具体如下。
高效液相色谱(RP-HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)：
多肽的所有RP-HPLC分析和纯化均采用Shimadzu Prominence HPLC系统，配备SPD-20A检测器和LC-20AT溶剂输送装置。Ultimate XB-C4柱(Welch,5μm,4.6×250mm)用于监测连接反应并分析肽产物的纯度，使用时流速为1ml/min。使用Ultimate XB-C4柱(Welch,/>5μm,10×250mm)和Ultimate XB-C4柱(Welch,/>5μm,10×250mm)以4ml/min的流速分离纯化连接产物。使用C18柱(Welch,/>5μm,21.2×150mm)和C4柱(Welch,/>5μm,21.2×150mm)以8ml/min的流速分离纯化粗肽。纯化后的产物在岛津LC/MS-2020系统上通过ESI-MS进行表征。
在配备Eclipse Plus-C18柱(Agilent，3.5μm，4.6×100mm)的安捷伦1290Infinity II系统(安捷伦科技，美国)上进行塑料降解产物的HPLC分析。TPA,MHET,BHET在波长260nm下以5％-90％的乙腈梯度进行分离，流速为1ml/min。SA在波长210nm处使用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝2.9)进行等度洗脱，流速为1ml/min。
ANS(8-苯胺-1-萘磺酸)测试
蛋白的折叠情况通过ANS测试进行验证。终浓度为10μM的蛋白质与终浓度为50μM的ANS-Na混合后置于～28℃暗反应1-2小时，之后通过酶标仪SpectraMax i3x(MolecularDevices，美国)进行荧光扫描，380nm处激发，收集405-620nm处的发射光谱。
以棕榈酸对硝基苯酯(ρ-NPP)为底物测定酶活：
以ρ-NPP为底物比较蛋白的活性。在碱性条件下，降解ρ-NPP生成的产物ρ-硝基苯酚(ρ-NP)显示出独特的黄色，在410nm处有最大吸收波长，可通过酶标仪SpectraMax i3x(Molecular Devices，美国)进行测定。
反应在室温下进行，体系为200μl，其中包括8μl浓度为2μM的蛋白，20μl浓度为8mM的ρ-NPP，20μl 500mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)以及152μL ddH2O或环境样品(海水和土壤浸出液)。反应混合物在～28℃下孵育1h后加入20μl三氯乙酸溶液终止反应，之后加入20μlNa2CO3使溶液显色。
以微塑料为底物测定酶活：
以微塑料为底物比较蛋白的活性。将80μL PET微塑料溶液加入到420μL的反应缓冲液中，其中包括50μL 500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0)，20μL浓度为2μM的蛋白和350μL ddH2O或环境样品(海水或土壤提取物)。将反应混合物在～28℃下孵育10天或在更高温度(50℃、60℃和72℃)下孵育9小时。在多个时间点采集样品，以最大速度离心15分钟后，立即通过HPLC分析上清液中的产物释放情况，包括对苯二甲酸(TPA)、单(2-羟乙基)-TPA(MHET)和双(2-羟乙基)-TPA(BHET)。将沉淀的微塑料重新悬浮在二甲基亚砜(DMSO)中，吸取5μL用于光学显微镜下观察。每个样品拍摄六张图像用于统计分析并使用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij)计算颗粒数目。
以聚合物薄膜为底物测定酶活：
将聚合物薄膜(PET,PBT或PBS)浸泡在200μL缓冲液中，该缓冲液中含有20μL 500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0)、8μL 2μM蛋白和172μL ddH2O或环境样品(海水或土壤提取物)。
土壤浸出液和海水样品的制备
海水样品取自于中国山东省海阳市。土壤样品取自于中国云南省丘北县天兴乡，将2g土壤样品悬浮在10mL去离子水中，并在30℃下振荡3h获得土壤悬浮液。使用孔径为0.45μm的滤膜对海水和土壤悬浮液进行过滤以除去不溶性的固体颗粒杂质，使大部分细菌保留在海水和土壤浸出液中。
His-tag杂交印迹检测：
蛋白样品通过12％SDS-PAGE进行分离，并转移到硝化纤维素膜上(MerckMillipore，德国)。使用20ml即用型InVisionTMHis-tag In-gel Stain(ThermoFisherscientific,美国)对硝酸纤维素膜进行染色，在室温下孵育20min后，将膜取出用纯净水短暂漂洗2min后使用成像仪(Azure biosystems C600，美国)对膜进行可视化和成像。
扫描电子显微镜(SEM)：
使用蛋白处理塑料薄膜15天后，用1％十二烷基硫酸钠(SDS)、蒸馏水和乙醇分别清洗薄膜三次。使用EIKO IB-3(日本)离子镀膜仪对样品进行喷射镀金，之后在10kV加速电压下，通过S-3400N(日立，日本)扫描电镜对薄膜的表面形态进行观察和成像。
在最初设计的化学合成路线中，ICCG-WT的第一条肽段(图2a所示)采用实施例2所述的固相多肽合成法(SPPS)合成的产物HPLC分析结果如图2b左侧所示，无明显的产物峰，表明该肽段很难通过固相多肽合成法(SPPS)直接合成。通过O-酰基异肽法在该肽段Val34-Ser35处添加异二肽结构并采用实施例2所述的SPPS法合成ICCG-1a的HPLC结果如图2b右侧所示，ICCG-1a的产率约为3％，尚能够接受。如图2c左侧所示，将ICCG-1a用于实施例2所述的自然化学连接反应(NCL)时，经HPLC分析无明显的连接产物峰(图2c右侧所示)。因此，本研究基于ICCG-WT的3D结构设计并表达了实施例1所述的ICCG突变体蛋白以提高化学合成产率。
实施例1、大肠杆菌表达DuraPETase、ThermoPETase、ICCG-WT及其突变体
一、DuraPETase、ThermoPETase及ICCG-WT表达载体构建
编码ICCG-WT的基因(序列如SEQ ID No.5所示)、DuraPETase的基因(序列如SEQID No.6所示)和ThermoPETase(序列如SEQ ID No.7)的基因由安升达生命科学公司(天津)合成，并在C端添加His6标签，克隆到pET-26b(+)质粒中。
pET26b(+)-ICCG-WT质粒为连接编码ICCG-WT基因和His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒。该质粒表达在N端添加一个甲硫氨酸和C端连接His6标签的ICCG-WT，ICCG-WT的氨基酸序列为genbank登陆号为6THT_A的第1至第258位。
pET26b(+)-DuraPETase质粒为连接编码DuraPETase基因和C端连接His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒。
pET26b(+)-ThermoPETase质粒为连接编码ThermoPETase基因和C端连接His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒。
二、蛋白的体外表达和纯化
将pET26b(+)-DuraPETase及pET26b(+)-ThermoPETase质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。37℃条件下在LB培养基中生长至OD600＝0.6后加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在16℃下诱导培养16h。离心(10000g，5min，4℃)收集菌体；在裂解缓冲液(50mM Na2HPO4，pH 7.5，100mM NaCl)中再悬浮。使用超声波破碎仪破碎细胞后离心(12000g，1h，4℃)弃去沉淀收集上清。将上清液与Ni+珠(Invitrogen，美国)在4℃条件下结合1-2h。之后使用漂洗缓冲液(50mM Na2HPO4，pH7.5，100mM NaCl，30mM咪唑)去除未结合的蛋白质。用洗脱缓冲液(50mM Na2HPO4，pH 7.5，100mM NaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白。最后将目的蛋白过夜透析至储存缓冲液(50mM Na2HPO4，pH 7.5，100mM NaCl，50％甘油)中。
将pET26b(+)-ICCG-WT质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，37℃条件下在LB培养基中生长至OD600为0.4～0.6后加入1mM IPTG在16℃下过夜诱导培养。离心(10000g，5min，4℃)收集菌体；在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,500mM NaCl)中再悬浮。使用超声波破碎仪破碎细胞后离心(12000g，1h，4℃)弃去沉淀收集上清。将上清液与Ni+珠(Invitrogen，美国)在4℃条件下结合1-2h。之后使用漂洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,10mM咪唑)去除未结合的蛋白质。用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,300mM咪唑)洗脱目标蛋白。最后将目的蛋白过夜透析至储存缓冲液(20mMTris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,50％甘油)中。
以ρ-NPP为底物测定及比较DuraPETase、ThermoPETase和ICCG-WT的降解活性，反应体系为200μL，其中包括8μL浓度为2μM的蛋白，20μL浓度为8mM的ρ-NPP，20μL 500mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)以及152μL ddH2O。
以PET微塑料为底物测定DuraPETase、ThermoPETase和ICCG-WT的降解活性，反应体系为500μL,其中包括80μL PET微塑料溶液，50μL 500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0),20μL浓度为2μM的蛋白和350μL ddH2O。将反应混合物在～28℃下孵育10天,在第2，5，10天采集样品，通过HPLC分析产物，总产物释放情况量化为检测到的化合物的总和，包括TPA、MHET和BHET。
检测结果如图3所示，a为DuraPETase，ThermoPETase和ICCG-WT分别降解ρ-NPP的结果，使用相对于ICCG-WT生成的ρ-NP的百分比计算相对活性，结果显示DuraPETase，ThermoPETase的降解活性只有ICCG-WT的50％左右。b为DuraPETase，ThermoPETase和ICCG-WT分别降解PET微塑料10天时的总产物释放情况，结果显示ICCG-WT的产物释放量最多，是用于后续全化学合成的最适蛋白。
三、ICCG-WT突变体表达载体构建
根据ICCG-WT(PDB:6THT)的3D结构(图1所示)，设计了不同版本的截短突变体以促进化学合成，并在其N端添加一个甲硫氨酸和其C端添加His6标签，该截短突变体分别为ICCG-T1(序列如SEQ ID No.1所示)、ICCG-T2(序列如SEQ ID No.2所示)、ICCG-T3(序列如SEQ ID No.3所示)和ICCG-T4(序列如SEQ ID No.4所示)，在其N端分别截短了10、19、36和48个氨基酸。用于克隆截短突变体的引物见表1。使用Q5高保真DNA聚合酶(New EnglandBiolabs,USA)进行PCR制备截短后的基因，并通过无缝克隆技术(Seamless AssemblyCloning Kit,CloneSmarter,USA)将基因连接到pET-26b(+)质粒载体上。构建好的载体通过Sanger测序进行验证(安升达生命科学公司(天津))。
pET26b(+)-ICCG-T1质粒为连接编码ICCG-T1基因和C端连接His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒，编码ICCG-T1基因的核苷酸序列为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-33位获得的核苷酸序列。该质粒表达ICCG-T1，ICCG-T1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
pET26b(+)-ICCG-T2质粒为连接编码ICCG-T2基因和C端His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒，编码ICCG-T2基因的核苷酸序列为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-60位获得的核苷酸序列。该质粒表达ICCG-T2，ICCG-T2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
pET26b(+)-ICCG-T3质粒为连接编码ICCG-T3基因和C端His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒，编码ICCG-T3基因的核苷酸序列为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-111位获得的核苷酸序列。该质粒表达ICCG-T3，ICCG-T3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
pET26b(+)-ICCG-T4质粒为连接编码ICCG-T4基因和C端His6标签编码基因的pET-26b(+)质粒，编码ICCG-T4基因的核苷酸序列为去掉编码ICCG-WT基因核苷酸序列的第4-147位获得的核苷酸序列。该质粒表达ICCG-T4，ICCG-T4的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
表1：用于克隆ICCG截短突变体的引物
Name Primer(5'→3')
PET26b(+)-F CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCG
PET26b(+)-R ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGG
ICCG-F GGTGGTGGTGCTCGAGTTGGCAGTGGCGATTATTGG
ICCG-TruncN10-R GAAGGAGATATACATATGACCCGCAGCGCACTGACC
ICCG-TruncN19-R GAAGGAGATATACATATGCCGTTTAGCGTGGCAACC
ICCG-TruncN36-R GAAGGAGATATACATATGGGCGGTGGCGTGATTTATTACC
ICCG-TruncN48-R GAAGGAGATATACATATGCTGACGTTCGGTGGCATCGC
四、ICCG-WT突变体的体外表达和纯化
采用“二”中表达、纯化ICCG-WT相同的方法表达、纯化ICCG-T1、ICCG-T2、ICCG-T3和ICCG-T4。其中，ICCG-T2在包涵体中表达，无法从大肠杆菌BL21(DE3)细胞中纯化出可溶性蛋白(原因可能为截短影响了ICCG-T2的折叠和溶解度)，因此后续实验只比较ICCG-WT、ICCG-T1、ICCG-T3和ICCG-T4的酶活.
采用“二”中以ρ-NPP为底物来测定比较DuraPETase、ThermoPETase和ICCG-WT酶活相同的方法测定比较ICCG-WT、ICCG-T1、ICCG-T3和ICCG-T4的酶活。
以PET微塑料为底物测定ICCG-WT、ICCG-T1、ICCG-T3和ICCG-T4的酶活，反应体系为500μL,其中包括80μL PET微塑料溶液，50μL 500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0),20μL浓度为2μM的蛋白和350μL ddH2O。将反应混合物在～28℃下孵育10天或在更高温度(50℃,60℃和72℃)下孵育9小时。通过HPLC分析产物的释放情况(包括TPA、MHET和BHET)，计算不同温度下每mg酶每小时产生的TPA当量，并以此为单位来比较ICCG-WT、ICCG-T1、ICCG-T3和ICCG-T4的水解活性。结果如图4所示。a图为以ρ-NPP为底物测定并比较ICCG-WT、ICCG-T1、ICCG-T3和ICCG-T4的酶活情况，使用相对于ICCG-WT生成的ρ-NP的百分比计算相对活性，结果显示ICCG-T1和ICCG-T3具有与ICCG-WT相似的酶活性，而ICCG-T4的活性显著下降。b图为以PET微塑料为底物计算ICCG-WT、ICCG-T1、ICCG-T3和ICCG-T4在不同温度下(～28℃，50℃,60℃和72℃)的水解活性。结果显示ICCG-T3不仅具有优异的活性，而且还具有热稳定性，因此选用ICCG-T3用于后续的全化学合成。
实施例2、化学合成ICCG-T3
选用N端截短36个氨基酸的ICCG-T3用于本实施例的化学合成，氨基酸序列如SEQID No.3所示。
ICCG-T3的化学合成路线如图5所示，ICCG-T3被分成了5个肽段，ICCG-T3-1序列为SEQ ID No.3的第1-32位、ICCG-T3-2序列为SEQ ID No.3的第33-78位、ICCG-T3-3序列为SEQ ID No.3的第79-136位、ICCG-T3-4序列为SEQ ID No.3的第137-180位和ICCG-T3-5序列为SEQ ID No.3的第181-231位，并按照图中路线进行连接。
本实施例全化学合成了ICCG-T3的天然和镜像版本。所有肽段均通过SPPS制备，通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行纯化，并通过自然化学连接反应(NCL)以收敛的策略组装，然后利用金属自由基脱硫策略在连接后将未保护的半胱氨酸转化为丙氨酸。最后，通过Pd辅助的脱保护策略去除保护半胱氨酸的乙酰氨甲基(Acm)基团。
一、基于Fmoc的固相多肽合成
基于9-芴甲基氧羰基(Fmoc)为保护基策略的固相多肽合成法(Fmoc-SPPS)，使用Liberty Blue自动微波肽合成器(CEM Corporation，美国)合成所有肽。其中L-肽链均使用Fmoc保护基保护的甘氨酸和L-非甘氨酸氨基酸连接而来，D-肽链均使用Fmoc保护基保护的甘氨酸和D-非甘氨酸氨基酸连接而来。
在Wang Chemmatric树脂上通过双偶联方法预先加载ICCG-T3-5的C端第一个组氨酸残基。其具体方法为在第一次偶联反应中使用4当量的氨基酸，3.8当量的HCTU和8当量DIEA在30℃下偶联氨基酸，1小时后用DMF和二氯甲烷清洗树脂。在没有脱保护的情况下，使用4当量氨基酸、4当量Oxyma和4当量DIC在25℃下过夜进行第二次偶联反应。
其余的四条肽ICCG-T3-(1-4)均使用2-Cl-trityl-Cl树脂合成酰肼多肽。所有树脂首先在DMF中溶胀5-10分钟。Fmoc保护基用20％哌啶和0.1M Oxyma在85℃条件下脱除。除Fmoc Cys(Trt)-OH和Fmoc His(Trt)-OH之外的氨基酸偶联是在85℃条件下，使用4当量氨基酸、4当量Oxyma和8当量DIC进行。Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH的偶联反应在50℃下进行10分钟，以避免在高温下发生副反应。三氟乙酰基噻唑烷-4-羧酸(Trifluoroacetyl thiazolidine-4-carboxylic acid-OH)在室温下通过Oxyma/DIC活化偶联过夜。在第57位(ICCG-T3-2)使用2,4二甲氧基苄基(DMB)-甘氨酸，以提高肽的纯度；在第168、205、213和222位使用Fmoc-Cys(Acm-OH)，以避免在脱硫步骤中发生副反应。
完成肽链组装后，使用H2O/硫苯甲醚/TIPS/EDT/TFA(0.5/0.5/0.25/8.25)(vol/vol)从树脂上切割多肽链。切肽反应耗时2-3h。之后使用高纯氮气去除体系中的大部分三氟乙酸，加入乙醚沉淀粗肽，离心收集沉淀。将粗肽溶解在CH3CN/H2O中，通过RP-HPLC和电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析，并使用半制备级别的RP-HPLC纯化目标多肽片段。
图6A-6E分别为L-ICCG-T3-(1-5)的合成情况，图7A-7E分别为D-ICCG-T3-(1-5)的合成情况，其中，a为多肽片段的氨基酸序列，b为RP-HPLC分析结果，c为ESI-MS分析结果。
二、自然化学连接反应
将带有C端酰肼的肽段溶解在酸性连接缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液，含有6MGn·HCl，pH 3.0)。将混合物在冰盐浴(-12℃)中冷却，并向其中添加10当量的NaNO2(0.5M，pH3.0)开始氧化反应，氧化过程在冰盐浴中进行，反应时长为23分钟，然后在连接缓冲液中添加40当量的MPAA(MPAA溶液的pH值调整为5.0～6.0)和1当量的N端为半胱氨酸的肽链。将溶液恢复至室温后调整pH值为6.5～6.8并搅拌过夜。反应结束后，向连接体系中加入等体积的含150mM TCEP的连接缓冲液(pH＝7.0)，在室温下搅拌反应20分钟。最后通过RP-HPLC和ESI-MS分析连接产物，并通过半制备RP-HPLC进行纯化。
图8A为L-ICCG-T3-2与L-ICCG-T3-3连接生成L-ICCG-6，图8B为L-ICCG-T3-1与L-ICCG-T3-6连接生成L-ICCG-T3-7，图8C为L-ICCG-T3-4与L-ICCG-T3-5连接生成L-ICCG-T3-8，图8D为L-ICCG-T3-7与L-ICCG-T3-8连接生成L-ICCG-T3-9，图9A为D-ICCG-T3-2与D-ICCG-T3-3连接生成D-ICCG-T3-6，图9B为D-ICCG-T3-1与D-ICCG-T3-6连接生成D-ICCG-T3-7，图9C为D-ICCG-T3-4与D-ICCG-T3-5连接生成D-ICCG-T3-8，图9D为D-ICCG-T3-7与D-ICCG-T3-8连接生成D-ICCG-T3-9，其中，a为相应连接步骤，b为RP-HPLC分析结果，c为ESI-MS分析结果。
三、脱硫
将含半胱氨酸的肽(1.5mg/ml)溶解于脱硫缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液，含有6MGn·HCl，200mM TCEP，40mM还原型谷胱甘肽和20mM VA-044，pH 6.8)中。将混合物在37℃下搅拌过夜，通过RP-HPLC和ESI-MS分析脱硫产物，并通过半制备RP-HPLC纯化。
图10为L-ICCG-T3-9脱硫生成L-ICCG-T3-10，图11为D-ICCG-T3-9脱硫生成D-ICCG-T3-10，其中a为相应步骤，b为RP-HPLC分析结果，c为ESI-MS分析结果。
四、乙酰氨基甲基(Acm)脱保护
通过金属Pd介导的脱保护策略脱除Acm保护基团，将Acm保护的肽链溶解在脱保护缓冲液(6M Gn·HCl，0.1M磷酸盐和40mM TCEP,pH＝7.0)中，使其终浓度为1mM，之后加入40当量的PdCl2。混合物在30℃下搅拌反应3h后，添加DTT至其终浓度为50mM以终止反应。将反应混合物在室温下搅拌1h，并通过半制备RP-HPLC纯化。
图12为L-ICCG-T3-10脱Acm生成L-ICCG-T3-11，图13为D-ICCG-T3-10脱Acm生成D-ICCG-T3-11，a为相应步骤，b为RP-HPLC分析结果，c为ESI-MS分析结果。
经过合成，连接，纯化和冻干后，共获得2mg天然ICCG-T3全长多肽(即L-ICCG-T3-11)，通过质谱观察到的分子量为25051.4Da(图12c)(理论分子质量为25051.6Da)；共获得4mg镜像ICCG-T3全长多肽(D-ICCG-T3-11)，通过质谱观察到的分子量为25051.0Da(图13c)(理论分子质量为25051.6Da)。
实施例3、天然和镜像ICCG-T3全长多肽的折叠复性
将L-ICCG-T3-11(1mg)溶解在变性缓冲液(6M Gn·HCl、20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,20mM DTT,50mM NaAC,0.5mM EDTA,10％甘油)中，使其终浓度为1mg/ml。加入复性缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0、300mM NaCl、20mM DTT、50mM NaAC、0.5mM EDTA、10％甘油)将肽溶液稀释100倍后将样品放置在4℃搅拌(100rpm)10h。将复性后的蛋白溶液在65℃加热30min，随后在4℃下以10000g离心30min除去沉淀。将上清液浓缩并透析至储存缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，50％甘油)得到天然ICCG-T3(即L-ICCG-T3)。
采用与天然ICCG-T3全长多肽相同的折叠复性方法进行D-ICCG-T3-11的折叠复性，最终获得镜像ICCG-T3(即D-ICCG-T3)。
通过12％SDS-PAGE分析L-ICCG-T3和D-ICCG-T3，以及实施例1从大肠杆菌中表达和纯化的ICCG-T3(带C端His6标签)，结果如图14所示，M为蛋白marker，大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3(Recombinant L-)，合成的天然L-ICCG-T3(Synthetic L-)和镜像D-ICCG-T3(Synthetic D-)大小一致，其氨基酸序列都为SEQ ID No.3所示，区别仅为L型采用甘氨酸和L-非甘氨酸氨基酸合成，D型采用甘氨酸和D-非甘氨酸氨基酸合成，。
通过ANS(8-苯胺-1-萘磺酸)测试分析L-ICCG-T3和D-ICCG-T3，以及实施例1从大肠杆菌中表达和纯化的ICCG-T3(带C端His6标签)的折叠复性情况，结果如图15所示，合成的天然L-ICCG-T3(Synthetic L-)和镜像D-ICCG-T3(Synthetic D-)与大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3(Recombinant L-)的结构一致。
实施例4、天然L-ICCG-T3和镜像D-ICCG-T3的酶活测定及比较
一、以ρ-NPP为底物测定并比较酶活
以ρ-NPP为底物测定并比较天然L-ICCG-T3，镜像D-ICCG-T3与大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3的酶活。反应体系为200μl，其中包括8μl浓度为2μM的蛋白，20μl浓度为8mM的ρ-NPP，20μl 500mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)以及152μL ddH2O。酶活定义为：在pH8.0，室温条件下，每分钟释放1μmolρ-NP所需要的酶量。
结果如图16所示，NC为不含蛋白的阴性对照，天然L-ICCG-T3(Synthetic L-)和镜像D-ICCG-T3(Synthetic D-)的酶活和大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3(Recombinant L-)的酶活无明显差别。
二、以PET微塑料为底物测定并比较酶活
以PET微塑料为底物测定并比较天然L-ICCG-T3，镜像D-ICCG-T3与大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3的酶活。反应体系为500μL,其中包括80μLPET微塑料溶液，50μL 500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0),20μL浓度为2μM的蛋白和350μL ddH2O。将反应混合物在～28℃孵育2、5、10天后和在60℃孵育9h后，离心(18000g，5min)收集上清，通过HPLC分析产物的释放情况(包括TPA、MHET和BHET)，总产物的释放情况量化为检测到的化合物的总和，同时计算在不同温度下每mg酶每小时产生的TPA当量，并以此为单位来比较天然L-ICCG-T3，镜像D-ICCG-T3和大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3的酶活。将沉淀中的微塑料颗粒重新用500μlDMSO悬浮起来，吸取5μl在光学显微镜下观察。结果如图17所示，计算并比较天然L-ICCG-T3，镜像D-ICCG-T3和大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3分别在～28℃和60℃下对PET微塑料的水解活性。结果显示L-ICCG-T3(Synthetic L-)，D-ICCG-T3(Synthetic D-)的酶活与大肠杆菌体内重组表达并纯化的ICCG-T3(RecombinantL-)的相比无明显差别。
结果如图18所示，a为PET微塑料颗粒分别与天然L-ICCG-T3和镜像D-ICCG-T3孵育2d，5d和10d后的光学显微镜下成像情况，比例尺，500μm。b为天然L-ICCG-T3和镜像D-ICCG-T3与PET微塑料颗粒孵育2d，5d和10d后的总产物释放情况，包括TPA、MHET和BHET。光学显微镜下的图像结果显示，随着时间的推移，PET微塑料颗粒 逐渐被L-和D-ICCG-T3消化，大部分颗粒在10天后消失，这一观察结果也通过HPLC分析释放的降解产物情况得到证实。
三、以聚合物薄膜为底物测定并比较酶活
将PET、PBT和PBS薄膜分别浸泡在200μL缓冲液中，该缓冲液中含有20μL500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0)、8μL 2μM天然L-ICCG-T3或镜像D-ICCG-T3和172μLddH2O。反应混合物在～28℃下放置15天后采用扫描电子显微镜(SEM)检测薄膜表面情况并通过HPLC分析产物释放情况。
结果如图19所示，从左到右依次为PET、PBT和PBS的聚合物结构式；天然L-ICCG-T3，镜像D-ICCG-T3降解聚合物薄膜表面的SEM成像情况，比例尺，10μm，以及PET薄膜的降解产物TPA,MHET和BHET。PBT薄膜的降解产物TPA和单(4-羟基丁基)-TPA(MHBT)和PBS薄膜的降解产物琥珀酸(SA)的HPLC色谱图。NC，不含蛋白的阴性对照。结果显示，经L-ICCG-T3和D-ICCG-T3处理的薄膜表面在15天后显示出特征性的表面缺陷，而只经缓冲液处理的薄膜显示出光滑均匀的表面。此外，HPLC分析结果显示L-ICCG-T3和D-ICCG-T3降解不同类型的塑料薄膜产生了对应的产物峰，表明L-ICCG-T3和D-ICCG-T3具有相似的降解PET、PBT和PBS的能力。综上，D-ICCG-T3较高的酶活和底物多样性使其可能适用于降解多种非手性塑料聚合物。
实施例5、天然和镜像ICCG-T3在不同环境中的稳定性和降解活性
一、蛋白酶K处理天然和镜像ICCG-T3
取25μL浓度为0.1mg/mL的L-ICCG-T3和D-ICCG-T3，分别加入0.5μL蛋白酶K在～28℃下孵育15分钟后在55℃下灭活10分钟。吸取10μL混合物进行12％SDS-PAGE分析，并采用His-tag杂交印迹进行检测；吸取4μL混合物以ρ-NPP为底物来测定酶活情况。反应体系为200μl，其中包括4μl混合物，20μl浓度为8mM的ρ-NPP，20μl 500mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以及156μL ddH2O。
结果如图20所示，a图His-tag杂交印迹显示L-ICCG-T3可被蛋白酶K快速消化，b图降解ρ-NPP的实验结果显示L-ICCG-T3已丧失大部分酶活性。相比之下，D-ICCG-T3能够完全抵抗蛋白酶K的消化，其酶活性也不受影响。
二、海水和土壤浸出液处理天然和镜像ICCG-T3
将20μL浓度为0.5mg/mL的L-ICCG-T3和D-ICCG-T3分别与80μL土壤浸出液或海水在～28℃下孵育15d，在6个时间点(第0，1，2，4，7和15d)分别吸取10μL混合物用于His-tag杂交印迹检测，当孵育2d后，吸取4μL混合物以ρ-NPP为底物来测定酶活情况。反应体系为200μl，其中包括4μl混合物，20μl浓度为8mM的ρ-NPP，20μl500mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)以及156μL土壤浸出液或海水。
结果如图20所示，c图His-tag杂交印迹显示在土壤浸出液和海水环境下，L-ICCG-T3在2-4天内迅速降解，而D-ICCG-T3可稳定存在15天以上，b图降解ρ-NPP的实验结果显示L-ICCG-T3在孵育2d后已丧失大部分酶活，而D-ICCG-T3的酶活显著高于L-ICCG-T3。但在海水中D-ICCG的活性也略有下降，后续实验证明海水中较高的盐浓度抑制ICCG-T3发挥降解活性。
三、天然和镜像ICCG-T3在环境样品中的降解活性测定
以PET微塑料为底物测定并比较L-ICCG-T3和D-ICCG-T3分别在土壤浸出液和海水中的降解活性。反应体系为500μL,其中包括80μL PET微塑料溶液，50μL500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0),20μL浓度为2μM的蛋白和350μL土壤浸出液或海水。反应混合物在～28℃孵育0天和10天时离心，将沉淀中的微塑料颗粒重新用500μl DMSO悬浮起来，吸取5μl在光学显微镜下观察。每个样品拍摄六张图像用于统计分析并使用ImageJ软件(https://imag ej.nih.gov/ij)计算颗粒数目。
结果如图21中所示，a图为在土壤浸出液和海水环境中的PET微塑料分别与L-ICCG-T3和D-ICCG-T3孵育10天时的光学显微镜下成像。NC，无ICCG-T3的阴性对照。比例尺，500μm。b图以L-ICCG-T3和D-ICCG-T3在土壤浸出液和海水环境中相对于在纯水中的降解率的百分比来计算相对活性，降解率的计算依据为与0天相比，在第10天光学显微镜下统计的微塑料颗粒数目的减少情况。与纯水处理相比，在土壤浸出液和海水中L-ICCG-T3的酶活性显著降低，而D-ICCG-T3的酶活性明显高于L-ICCG-T3，但在海水中D-ICCG的活性也略有下降，后续实验证明海水中较高的盐浓度抑制ICCG-T3发挥降解活性。
以PET薄膜为底物测定并比较L-ICCG-T3和D-ICCG-T3分别在土壤浸出液和海水中的降解活性。反应体系为200μL，其中含有20μL 500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0)、8μL 2μML-ICCG-T3或D-ICCG-T3和172μL土壤浸出液或海水。反应混合物在～28℃放置15天后采用SEM检测薄膜表面情况。
结果如图22所示，SEM图像显示与L-ICCG-T3相比，D-ICCG-T3处理的PET薄膜表面出现的褶皱更多，孔洞更大。
四、高盐对ICCG-T3酶活的影响
以ρ-NPP为底物测定不同盐浓度下的ICCG-T3(即实施例1制备的ICCG-T3)酶活情况，反应总体系为200μl，其中包括8μl浓度为4μM的蛋白，20μl浓度为8mM的ρ-NPP，20μl500mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，ddH2O以及不同体积的体积分数为5％的NaCl溶液，使反应体系中NaCl的终体积分数为0.09％，0.3％，0.96％，1.84％，3.59％。
结果如图23所示，使用相对于标准NaCl终体积分数(即0.09％)下生成的ρ-NP的百分比计算不同盐浓度下的相对活性，结果显示随着盐浓度增高，酶活逐渐降低。
综上表明，在复杂的环境中L-ICCG-T3会严重丧失其稳定性和活性，而D-ICCG-T3的活性基本不受影响并且能稳定持续的发挥降解作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
(a1)氨基酸序列为ICCG-WT N端截短10-48个氨基酸残基所示的蛋白质；
(a2)将ICCG-WT N端截短10-48个氨基酸残基所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白；
所述ICCG-WT的氨基酸序列为genbank登陆号为6THT_A的第1至第258位。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：
(a1)所述蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.1第2-249位、SEQ ID No.2第2-240位、SEQID No.3第2-223位或SEQ ID No.4第2-211位所示的蛋白质；
(a2)所述蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.1第1-249位、SEQ ID No.2第1-240、SEQID No.3第1-223位或SEQ ID No.4第1-211位所示的蛋白质；
(a4)所述蛋白质为氨基酸序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和SUMO标签中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质由甘氨酸和非甘氨酸连接而成，所述非甘氨酸为L型氨基酸或D型氨基酸。
5.权利要求1-4任一所述蛋白质的合成方法，其特征在于：包括
(1)采用固相多肽合成技术合成多肽片段ICCG-T3-1、ICCG-T3-2、ICCG-T3-3、ICCG-T3-4和ICCG-T3-5，所述ICCG-T3-1的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第1-32位所示，ICCG-T3-2的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第33-78位所示，ICCG-T3-3的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第79-136位所示，ICCG-T3-4的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第137-180位所示，ICCG-T3-5的氨基酸序列为SEQ ID No.3的第181-231位所示，采用自然化学连接技术连接所述多肽片段获得SEQ ID No.3所示的全长多肽；
(2)将所述SEQ ID No.3所示的多肽进行折叠复性得到所述蛋白质。
6.权利要求1所述蛋白质的相关生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述任一种：
c1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
7.权利要求1-4任一所述蛋白质在如下任一中的应用：
(1)作为塑料降解酶；
(2)降解塑料；
(3)制备降解塑料产品。
8.权利要求6所述的生物材料在如下任一中的应用：
(1)降解塑料；
(2)制备降解塑料产品。
9.一种降解塑料的方法，其特征在于：包括使用权利要求1-4任一所述蛋白质降解开放环境中的塑料。
10.根据权利要求7或8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述塑料选自PET、PBT和PBS中的至少一种。
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