JP2000504574A - カルシトニン・フラグメントの組換え調製、ならびにカルシトニンおよび関連アナログの調製におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 カルシトニン・フラグメントの組換え調製法、ならびにカルシトニンおよび関連アナログの調製における該フラグメントの使用を提供する。該方法には、カルボニックアンヒドラーゼに結合したカルシトニン・フラグメントを含む融合蛋白質を組換え形成させることが含まれる。続いて、組換え形成した融合蛋白質を切断して、カルシトニン・フラグメントを含むポリペプチドを生成する。デスアミノノナペプチドを組換え形成カルシトニンと縮合させることを含むカルシトニンカルバ・アナログの製法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシトニン・フラグメントの組換え調製、ならびに カルシトニンおよび関連アナログの調製におけるその使用 カルシトニン、およびエルカトニン(Elcatonin)のごとき関連アナログは、 骨萎縮治療用に用いることができる公知のポリペプチドである(例えば、米国特 許第4,086,221号を参照されたし)。ウナギ、サケまたはヒト・カルシトニンのご とき天然発生カルシトニンは、３２個のアミノ酸よりなるＣ−末端アミド化ポリ ペプチドであり、各ケースにおいて１番目と７番目のアミノ酸はＬ−システイン であって、それらのメルカプト基はジスルフィド架橋を形成することにより互い に結合している。天然カルシトニンは、例えば、哺乳動物の甲状腺からの抽出に よって得ることができる(例えば、米国特許第5,428,129号を参照されたし)。 エルカトニンは、ウナギ・カルシトニンの活性に匹敵する活性を有するカルシ トニンの修飾合成「カルバ」アナログである(Morikawa ら，Experienta,32,1004 ,(1976))。ウナギ・カルシトニンに対して、エルカトニンはアミノ末端を欠いて おり、ウナギ・カルシトニンのジスルフィド架橋が−(ＣＨ₂)₅−の「炭素架橋」 で置き換わっている。 最近、純粋な化学的方法を用いてエルカトニンを調製するための種々の製法が 知られている。これらの化学的方法には、対応するアミノ酸またはペプチドの縮 合が含まれる(例えば、米国特許第 4,086,221 号および米国特許第 5,428,129 号を参照されたし)。しかしながら、純粋な化学的方法は、すべて、精巧な精製 方法を必要とすることにより、エルカトニンが低収率で得られ、その結果その調 製物が非常に高価となる欠点を被る。 従って、該分子の一部分の組換え調製を含むアプローチの使用を介するエルカ トニンの調製における該純粋な化学的方法の欠点を回避できることは有利であろ う。このことは、例えば、Ｃ−末端ポリペプチド・フラグメントの組換え調製用 の単純な製法が利用可能である場合に達成し得る。次いで、組換え合成Ｃ−末端 フラグメントをカルシトニンまたはエルカトニンのごときカルバ・アナログの調 製用の出発ペプチドとして用いることができる。部分的な組換えストラテジーに より、カルシトニンのペプチド／ペプチド・アナログ、エルカトニン、および潜 在的に非−天然アミノ酸を含有し得る関連アナログまたは誘導体の合成も促進さ れるであろう。 発明の概要 本発明は、カルシトニン・フラグメントの組換え調製法、ならびにカルシトニ ンおよびカルバ・アナログ(以降、本明細書中では「カルシトニンカルバ・アナロ グ」という)を包含する関連アナログの調製における該フラグメントの使用に指向 される。本発明は、切断部位を介してカルボニックアンヒドラーゼに結合した標 的配列を含む融合蛋白質を組換え形成することを含む。該標的配列には、カルシ トニンのＣ−末端付近からのフラグメントに、またはかかるフラグメントの極め て関連するアナログに対応する少なくとも約１５アミノ酸残基の配列が含まれる 。典型的には、該標的配列には、カルシトニンまたは極めて関連するアナログの アミノ酸残基１０〜３２に対応するアミノ酸配列(以降、本明細書中ではひとま とめにして「１０−３２フラグメント」という)が含まれる。続いて、組換え形 成した融合蛋白質を切断試薬で切断して、該標的配列を含むポリペプチドを生成 する。該切断反応は、該融合蛋白質を化学切断試薬か、または酵素切断試薬かの いずれかと接触させることによって行い得る。適当な切断試薬の選択、および該 融合蛋白質に組込む対応する切断部位の選択は、該融合蛋白質中に存在する特定 の標的配列およびカルボニックアンヒドラーゼ配列に依存するであろう。典型的 には、該切断試薬および切断部位は、当該切断部位を構成するアミノ酸配列が標 的配列またはカルボニックアンヒドラーゼのいずれのアミノ酸配列中にも現れな いように選択される。例えば、メチオニンにおける臭化シアン切断は、ブタ、ウ シまたはヒツジ・カルシトニンからの１０−３２フラグメントを含む融合蛋白質 と共に用いられないであろう。 切断部位は、典型的には、カルボニックアンヒドラーゼと標的配列とを結合す るリンカー配列中に存在する。別法として、該融合蛋白質は、カルボニックアン ヒドラーゼのｃ−末端が標的配列のＮ−末端に直接結合した構築物を含み得る。 これは、カルボニックアンヒドラーゼのＣ−末端残基(群)と標的配列のＮ−末端 残基(群)とが２個のフラグメントの間のペプチド結合の切断を許容する切断部位 を構成する場合に生じ得る。リンカー配列中に存在する切断部位に加えて、融合 蛋白質のカルボニックアンヒドラーゼ部分は、切断すべき融合蛋白質が 「ミニ融 合蛋白質」、すなわち、なお標的配列に結合したカルボニックアンヒドラーゼの Ｃ−末端部分を有するポリペプチド、を形成することを許容する種々の切断部位 も含み得る。 本発明の一つの具体例には、カルシトニンのアミノ酸１０−３２または関連ア ナログ(「「１０−３２フラグメント」)に対応するポリペプチドの組換え調製法 が含まれる。該方法は、典型的には、式： ［式中、A₁₀はGlyまたはSerであり、A₁₁はLys、ThrまたはAlaであり、A₁₂はLeu またはTyrであり、A₁₃はSer、ThrまたはTrpであり、A₁₄はGln、LysまたはArgで あり、A₁₅はGlu、AspまたはAsnであり、A₁₆はLeuまたはPheであり、A₁₇はHisま たはAsnであり、A₁₈はLysまたはAsnであり、A₁₉はLeu、TyrまたはPheであり、A_{2 0} はGlnまたはHisであり、A₂₁はThrまたはArgであり、A₂₂はTyrまたはPheであり 、A₂₃はProまたはSerであり、A₂₄はArg、GlyまたはGlnであり、A₂₅はThrまたはM etであり、A₂₆はAsp、Ala、GlyまたはAsnであり、A₂₇はVal、Leu、Ile、Pheまた はThrであり、A₂₉はAla、Val、ProまたはSerであり、A₃₀はGly、ValまたはGluで あり、A₃₁はThr、ValまたはAlaである］ で示されるポリペプチド・フラグメント（「１０−３２フラグメント−Xxx」)の組 換え調製が含まれる。Ｃ−末端の−Xxx基は、典型的には、(典型的には、２〜約 １０個のアミノ酸残基を有する)アミノ酸残基またはポリペプチド基のごとき、 Ｃ−末端カルボン酸(「−ＯＨ」)、Ｃ−末端カルボキサミド(「−ＮＨ₂」)、ま た はＣ−末端カルボキサミドに変換され得る基である。残基A₁₀からA₃₂によって表 される１０−３２フラグメント(配列番号：２)は、ウナギ(配列番号：３７)、サ ケＩ(配列番号：３８)、サケII(配列番号：３９)、サケIII(配列番号：４０)、 ニワトリ(配列番号：４１)、ヒト(配列番号：４２)、ウサギ(配列番号：４３)、 ブタ(配列番号：４４)、ウシ(配列番号：４５)およびヒツジ(配列番号：４６)・ カルシトニンまたは極めて関連するアナログ(図９に示すカルシトニン配列を参 照されたし)のアミノ酸配列の残基１０〜３２に対応する。本法を用いて、修飾 カルシトニン配列に対応する１０−３２フラグメントを組換え生成することもで きる。該修飾カルシトニン配列には、天然アミノ酸配列中の１または２以上の同 類アミノ酸置換が含まれ得る。 １０−３２フラグメントは、カルシトニンおよび関連アナログの調製に利用し 得る。該調製は、典型的には、非−酵素的カップリング試薬存在下にて、 式： ［式中、A₂はGly、SerまたはAlaであり；A₃はAsnまたはSerであり；A₈はValまた はMetであり；Ｒ²は−(ＣＨ₂)₄−または−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＨ₂Ｓ−Ｓ−であって； ＹはＯＨまたはＯＲ¹(ここに、−Ｒ¹は低級アルキル基)である］ で示されるＮ−末端フラグメントを、式： ［式中、A₁₀はGlyまたはSerであり、A₁₁はLys、ThrまたはAlaであり、A₁₂はLeu またはTyrであり、A₁₃はSer、ThrまたはTrpであり、A₁₄はGln、LysまたはArgで あり、A₁₅はGlu、AspまたはAsnであり、A₁₆はLeuまたはPheであり、A₁₇はHis またはAsnであり、A₁₈はLysまたはAsnであり、A₁₉はLeu、TyrまたはPheであり、 A₂₀はGlnまたはHisであり、A₂₁はThrまたはArgであり、A₂₂はTyrまたはPheであ り、A₂₃はProまたはSerであり、A₂₄はArg、GlyまたはGlnであり、A₂₅はThrまた はMetであり、A₂₆はAsp、Ala、GlyまたはAsnであり、A₂₇はVal、Leu、Ile、Phe またはThrであり、A₂₉はAla、Val、ProまたはSerであり、A₃₀はGly、ValまたはG luであり、A₃₁はThr、ValまたはAlaであって、−Xxxは−ＯＨ、−ＮＨ₂、アミノ 酸残基またはポリペプチド基である］ で示される組換え形成ポリペプチドと縮合させて、式： を有するカルシトニン誘導体を形成させることを含む。 本発明の一つの具体例において、組換え形成１０−３２フラグメントをデスア ミノノナペプチドと縮合する。該デスアミノノナペプチドは、Ｎ−末端カルシト ニン・フラグメントのカルバ・アナログであって、典型的には、式： [式中、A₂はGly、SerまたはAlaであり；A₃はAsnまたはSerであり；A₈はValまた はMetであって；ＹはＯＨまたはＯＲ¹(ここに、−Ｒ¹は低級アルキル基(すなわ ち、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基))である]を有する。該縮合反応は、(出典明示して本明 細書の一部とみなす)米国特許第 4,086,221 号および米国特許第 5,428,129 号 に記載されているもののごとき化学カップリング反応を用いて行い得る。化学カ ップリング剤は当業者によく知られている。適当な化学カップリング剤には、カ ルボジイミドと、ペプチドのα−カルボン酸基と反応して、他のアミノ酸また はポリペプチドのＮ−末端α−アミノ基と活性化カルボン酸誘導体α−カルボン 酸誘導体を形成することができる種々の他の非−酵素的試薬とが含まれる。デス アミノノナペプチドのＣ−末端α−カルボン酸が酸アジド、混合酸無水物、酸イ ミダゾールまたは活性エステルに変換される化学カップリング反応を、本発明に おいて用い得る。２個のペプチド・フラグメントをカップリングさせる特に有効 な方法は、カルボジイミドと活性エステルを形成することができる試薬との、例 えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(「ＤＣＣ」)とＮ−ヒドロキシスクシン イミド(「ＨＯＳｕ」)または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(「ＨＯＢｔ」) のいずれかとの混合物の存在下で行う。 縮合で用いる組換え形成１０−３２フラグメントは、好ましくは、式： [式中、A₁₀〜A₃₁および−Xxxは前記定義に同じである]を有する。 カップリング反応の生成物は、典型的には、式： [式中、A₁₀〜A₃₁および−Xxxはデスアミノノナペプチド(配列番号：３)または１ ０−３２フラグメント−Xxx(配列番号：１)の定義に同じである]を有するカルシ トニンカルバ・アナログである。 デスアミノノナペプチドと組換え形成ペプチドとのカップリングは、典型的には 、非−酵素的カップリング試薬存在下にて行う。 本発明の好ましい具体例は、式：を有する(以降、本明細書中では「ECF2−アミド」という)ポリペプチド・フラグ メントの組換え調製およびアミド化法、ならびに式： を有する(以降、本明細書中では「ECF１」という）エルカトニンのアミノ末端フ ラグメントにECF２−アミドをカップリングさせる方法を提供する。 本発明は、カルシトニンまたは関連アナログのアミノ酸１０−３２をコードす る配列を含む核酸配列も提供する。該核酸配列は、典型的には、切断部位を介し てカルボニックアンヒドラーゼに結合した１０−３２フラグメントを含む融合蛋 白質をコードする。１０−３２フラグメントをコードする遺伝子の部分は、好ま しくは、イー・コリ (E.coli)、エス・セレビシア（Ｓ.cerevisiae）またはピイ ・パストリス(Ｐ.pastoris)のごとき標的化宿主細胞に対する最適コドン使用頻 度を用いてデザインする。 図面の詳細な説明 図１は、プラスミド pET31FlmhCAII のマップを示す。該プラスミドは、pSP65 複製起点の反対の向きで導入された、プラスミドpEMBL8からの複製起点Ｆ１を含 む。 図２は、プラスミドpABNのマップを示す。プラスミドpABNは、ヒト・カルボニ ックアンヒドラーゼII（「hCAII」）の遺伝子配列のカルボキシ末端付近のプラ スミドに挿入されたリンカーペプチド・フラグメント(配列番号：４９)をコード する核酸配列(配列番号：４７および配列番号：４８)を含む。 図３は、プラスミドpTBNのマップを示す。プラスミドpTBNは、pABNからの１． ５kbフラグメントのプラスミドpBR322への挿入に由来するテトラサイクリン耐性 の発現ベクターである。該１.５kbフラグメントは、pABNからのT7プロモーター 、hCAII、リンカーおよびT7ターミネーター配列を含む。 図４Ａは、ECF2−Alaをコードするヌクレオチド配列のPCR法、および該フラグ メントをプラスミドにクローニングさせるさらなる制限部位を用いる調製の最初 の工程の模式図である。この工程は、PCR MIX1 上でTaq DNAポリメラーゼを用い たPCR反応を行うことによって行った。 図４Ｂは、ECF2−AlaをコードするDNA配列の調製の第２の工程の模式図である 。PCR MIX1 中のオリゴヌクレオチド２および３(各々、２^EXT(配列番号：８)お よび３^EXT(配列番号：５０))の伸長に由来するPCR産物は、それらの３'末端に２ ０bpの相補的配列を有する。Taq DNAポリメラーゼを用いる第２のPCR反応は、EC F2−Alaをコードする完全長非−中断遺伝子配列(配列番号：９)を含む二本鎖ヌ クレオチド・フラグメントを生成する。 図５は、プラスミドpTBN26のマップを示す。プラスミドpTBN26は、全hCAII− リンカー−ECF2−Ala(「hCA−ECF2−Ala」)融合蛋白質構築物の遺伝子配列を含 む。 図６Ａは、hCAII−リンカー−ECF2−Ala融合蛋白質構築物のＮ−末端メチオニ ンおよびhCAII残基1−162のヌクレオチド配列(配列番号：１１)およびアミノ酸 配列(配列番号：１２)を示す。 図６Ｂは、hCAII−リンカー−ECF2−Ala融合蛋白質構築物のhCAII残基162−25 7、ならびにリンカーおよびECF2−Alaフラグメントのヌクレオチド配列(配列番 号：１１)およびアミノ酸配列(配列番号：１２)を示す。 図７は、エルカトニンおよびウナギ・カルシトニンの23アミノ酸Ｃ−末端フラ グメント(「ECF2」)のヌクレオチド配列(配列番号：５)およびアミノ酸配列(配 列番号：６)を示す。示すヌクレオチド配列は、プラスミドpTBN26に組込んだhCA −ECF2−Ala融合蛋白質の遺伝子中に存在するECF2をコードする配列である。 図８は、ECF2−アミド(配列番号：６)を含有する試料の(ポリスルホルエチル −アスパルトアミド(polysulfolethyl−aspartamide)カラムを用いた)代表的な 分 取用HPLC軌跡を示す。ECF2−アミドのピークは、14.5分と16.3分との間に出現す る。 図９Ａは、多種の種からのカルシトニンの残基1−15のアミノ酸配列を示す。 図９Ｂは、多種の種からのカルシトニンの残基16−32のアミノ酸配列を示す。 図１０は、PCR法を介して実施例１．１に記載する５オリゴヌクレオチドから 合成した二本鎖DNAフラグメント(配列番号：９)、ならびに該二本鎖DNAフラグメ ントによってコードされるペプチド配列(配列番号：１０)を示す。 図１１は、ECF2をコードする遺伝子配列のPCR合成の間に生成したオリゴヌク レオチド２^Ext(配列番号：８)のヌクレオチド配列を図示する。 図１２は、ECF2をコードする遺伝子配列のPCR合成の間に生成したオリゴヌク レオチド３^Ext(配列番号：５０)のヌクレオチド配列を図示する。 発明の詳細な説明 本発明による融合蛋白質の組換え調製には、切断部位を介してカルボニックア ンヒドラーゼに結合した標的配列をコードする核酸配列(「FP核酸配列」)の構築 が含まれる。図６に示すFP核酸配列は、本法で使用するための適当な核酸配列の １つの例である。図６に示す核酸配列は、ヒト・カルボニックアンヒドラーゼII (「hCAII」)の残基1−257をコードするコドンを含む。 融合蛋白質にカルボニックアンヒドラーゼのこのアミノ酸配列または他の機能 的に活性なフラグメントが含まれることにより、細胞夾雑物からの融合蛋白質の 単離が大幅に促進される。本明細書中で用いる「カルボニックアンヒドラーゼ」 なる語は、天然発生カルボニックアンヒドラーゼ(およびいずれかの対立遺伝子 変異型)、機能的に活性なカルボニック・フラグメント、またはそれらの修飾バ ージョン(「突然変異体」)が含まれる。本明細書中の「機能的に活性なカルボニ ックアンヒドラーゼのフラグメントおよび突然変異」とは、hCAII の酵素インヒ ビター結合特性を示すカルボニックアンヒドラーゼのフラグメントまたは修飾バ ージョンを意味する。かかる特性を有するフラグメントは、スルファニルアミド のごときカルボニックアンヒドラーゼ・インヒビターに極めて強固に結合するこ とがで きる。かかる結合特性を有する機能的に活性なフラグメントは、低分子量リガン ド、例えばスルファニルアミドまたはその合成誘導体に対して、非常に選択的な 親和性の結合を示す。該結合は、一般的に、カルボニックアンヒドラーゼ／リガ ンドコンジュゲートが約１０^-7Ｍ以下の溶液解離定数（結合定数の逆数）を示す であろう程、強固である。一般的に、該リガンドはカルボニックアンヒドラーゼ に対して可逆的なインヒビターである。適当なカルボニックアンヒドラーゼ・フ ラグメントは、該フラグメントが酵素の機能的インヒビター結合活性を保持する 限り、該酵素のＮ−末端またはＣ−末端部分を欠き得る。同様に、本発明の融合 蛋白質において結合蛋白質として用い得る修飾カルボニックアンヒドラーゼは、 当該修飾酵素が前記したインヒビター結合活性を実質的に示す限り、１または２ 以上のアミノ酸の付加、欠失または挿入によって修飾し得る。典型的には、カル ボニックアンヒドラーゼは、当該修飾酵素が融合蛋白質中の切断部位として用い られる特定のアミノ酸(群)を含まないように、アミノ酸残基を欠失または改変す ることによって修飾される。例えば、臭化シアンを切断試薬として用いる場合に は、カルボニックアンヒドラーゼを修飾して、通常存在するいずれのメチオニン (「Met」)残基を除去または置換え得る。 FP核酸配列には、10−32フラグメント、すなわち、カルシトニンのアミノ酸残 基10−32または極めて関連するアナログをコードする配列が含まれる。極めて関 連するアナログは、カルシトニン10−32フラグメント中の同類アミノ酸置換由来 とし得る。該核酸配列のこの部分をデザインして、特定の宿主細胞における融合 蛋白質の発現を最適化し得る。例えば、融合蛋白質の発現を宿主生物としてのイ ー・コリ（E.coli）のごとき腸内細菌を用いて行うべき場合には、10−32フラグ メントをコードする核酸配列および切断部位を、典型的には、標的化宿主生物に 対するコドン使用頻度に基いて構築する(例えば、Gribskov らによるNucl.Acids Res.,12,539−549(1984)中のコドン使用頻度のディスカッションを参照された し)。 切断部位は、化学切断部位または酵素切断部位とし得る。化学および酵素切断 部位およびこれらの部位のうちの１つの近くのペプチド結合の切断に影響するた めに用いられる対応する剤は、(出典明示して本明細書の一部とみなす)PCT 特許 出願WO 92/01707号に詳記されている。本発明において切断部位として用いるの に適するペプチド配列(およびそれをコードするDNA遺伝子配列)、ならびに対応 する切断酵素または化学切断条件の例を表１に示す。示す遺伝子配列は、対応す るペプチド配列をコードする１つの可能性である。他のDNA配列を構築して、同 一のペプチド配列をコードさせ得る。好ましくは、切断部位をコードする核酸配 列は、融合蛋白質の発現に用いられる宿主細胞についてより一般的に用いられる 各アミノ酸のコドンに基いてデザインする。例えば、該ヌクレオチド配列は、イ ー・コリ(E.coli)のごとき腸内細菌に対する最適コドン使用頻度に基き得る(例 えば、GribskovらによるNucl．Acids Res.,12，539−549(1984)を参照されたし) 。 切断部位は、カルボニックアンヒドラーゼと標的配列とを結合するリンカーペ プチドの一部分として存在し得る。例えば、図６に図示する hCAII−リンカー− ECF2−Ala(「hCA−ECF2−Ala」)のアミノ酸配列(配列番号：１２)には、リンカ ーのＣ−末端アスパラギン残基と標的配列のＮ−末端グリシン残基との間に、ヒ ドロキシルアミンによって切断可能な化学切断部位(「Asn−Gly」)を設ける７ア ミノ酸リンカー配列(−Phe−Val−Asp−Asp−Asp−Asp−Asn−;(配列番号：１４ ))が含まれる。 融合蛋白質は、標的配列の少なくとも１のコピーを含み得、その複数のコピー を含み得る。標的配列の複数のコピーが存在する場合には、該コピーは互いに縦 列結合させ得る。別法として、標的配列のコピーは、インナー結合 (innerconnecting)リンカーペプチドによって互いに結合させ得る。該インナー 結合リンカーペプチドは、カルボニックアンヒドラーゼを標的配列の最初のコピ ーに結合させるイントラ結合(intraconnecting)リンカーペプチドと同一または それとは異なるものとし得る。インナー結合およびイントラ結合リンカーペプチ ドが同一であるか、またはそれらが同一の切断部位を含む場合には、融合蛋白質 を直接切断して、各々が標的ペプチドの単一コピーを含む多数のフラグメントを 生成し得る。しかしながら、インナー結合およびイントラ結合リンカーペプチド が異なる切断部位を含む場合には、カルボニックアンヒドラーゼ・フラグメント を最初に切除して、１を超えるコピーの標的ペプチドを有する中間ポリペプチド を形成することが可能となり得る。 メチオニン残基を含まない標的配列は、メチオニン残基を含むインナー結合ペ プチドを有する複数コピー構築物から、本法を用いて作製し得る。メチオニン残 基が標的配列のＣ−末端に直接結合される場合には、複数コピー構築物を臭化シ アンで切断し得る。得られたフラグメントは、カルボキシペプチダーゼ、例えば カルボキシペプチダーゼＹのごときセリン・カルボキシペプチダーゼを用いてペ プチド転移させて、Ｃ−末端のホモセリンをα−アミド化アミノ酸で置換え得る 。該フラグメントは、カルボキシペプチダーゼでアミド基転移させて、Ｃ−末端 のホモセリンを２−ニトロベンジルアミン化合物で置換えることもできる。この ことにより、光化学的に分解して（α−アミド化ペプチドフラグメント）−（ホ モセリン残基）を生成し得るＣ−末端(２−ニトロベンジル)アミド基を有するフ ラグメントが生成する。 複数コピーの標的配列を含む融合蛋白質の１つの例は、hCA− (MetValAspAspAspAspAsn−ECF2)_n−Xxx（ここに、hCA、ECF2およびXxxは本明細 書中の定義に同じであって、ｎは整数(典型的には２〜２０)である）を含む構築 物である。かかる構築物はCNBrで処理して、ValAspAspAspAspAsn−ECF2−Hse(配 列番号：４９)ペプチド・フラグメント(ここに、HseはCNBrとMet残基との反応に よって生成したホモセリン残基)を形成し得る。次いで、そのペプチド・フラグ メントを、カルボキシペプチダーゼＹのごときペプチダーゼ存在下にて、ｏ−ニ トロフェニルグリシンアミド(「0NPGA」)のごとき求核試薬と反応させて、ONPGAに よるHse残基の置換を生じさせることができる。光分解の際に、ペプチド転移産 物がＣ−末端カルボキサミドに変換する。Ｎ−末端テイル配列、 ValAspAspAspAspAsn(配列番号：５０)は、ヒドロキシルアミンでの処理によって 該フラグメントを切除し得る。 本発明の好ましい具体例は、Ｃ−末端ウナギ・カルシトニンポリペプチド・フ ラグメント、ECF2−アミド(配列番号：６)の調製に指向される。該調製には、以 下の蛋白質構築物： Met−hCAII'−Met₂₄₀-Val₂₄₁-hCAII"−リンカー−ECF2−aa （「hCA−ECF2−aa」） ［式中、aaはアミノ酸残基であって、Metはいずれかのイー・コリ（E.coli）蛋 白質の必要なＮ−末端残基である］ の初期遺伝子発現が含まれる。Met残基はhCAII”(ヒト・カルボニックアンヒド ラーゼIIの２３９アミノ酸Ｎ−末端ポリペプチドセグメント)の最初の残基のＮ −末端に付加され、Met₂₄₀−Val₂₄₁はヒト・カルボニックアンヒドラーゼII(「h CAII」)中の唯一の臭化シアン反応活性ペプチド結合であり、hCAII”はhCAIIの Ｃ−末端付近からの１６アミノ酸フラグメント(残基242−257)(配列番号：２１) である。aaと命名する、ECF2−aaのＣ−末端アミノ酸残基(配列番号：２２)はア ミド化シグナルを提供して、エルカトニン(配列番号：１３)のＣ−末端を構成す るPro−アミドへの変換が可能となる。aa残基は、典型的には、アラニンのごと きアミノ酸残基であり、それはアミド基転移反応を介して求核試薬と交換され得 る。 目的の生成物ECF2−aa(配列番号：２２)は、少なくとも２つの方法で、ECF−a a蛋白質構築物から得ることができる。最初のものは、ヒドロキシルアミンでのA sn−Gly結合におけるhCA−ECF2−aaの切断を用いて、ECF2−aa(配列番号：２ ２)を直接得る。別法として、臭化シアン(CNBr)での切断により、ECF2−aaポリ ペプチド(配列番号：２２)に結合したhCAIIのhCAII”Ｃ−末端フラグメント(配 列番号：２１)を含むミニ融合蛋白質を得る。該ミニ融合蛋白質は、続いて、ECF 2−aa(配列番号：２２)を得るための誘導体化の前か、または、例えば、ECF2−a a(配列番号:２1)のLys残基を誘導体化してＺ−保護側鎖アミノ基を有するLys残 基を形成するような、ミニ融合蛋白質側鎖残基の誘導体化の後かのいずれかにヒ ドロキシルアミンで切断し得る。誘導体化試薬がLysの側鎖アミノ官能基を修飾 する場合には、誘導体化したミニ融合蛋白質の切断後は、得られた保護ECF2−aa (配列番号：２２)はＮ−末端グリシン残基のα−位に単一の遊離アミノ官能基の みを有するであろう。該遊離Ｎ−末端α−アミノ基は、ECF1(配列番号：７)のＣ −末端残基へのカップリングのごとき、続く特定の化学反応に用いて、エルカト ニン(配列番号：１３)を得ることができる。このタイプのカップリング反応は、 ECF2−aaポリペプチド(配列番号：２２)がＣ−末端残基Pro−アミド(「ECF2−ア ミド」;(肺列番号：６))を有するECF2誘導体に変換された後に行うことができ、 あるいは、それを用いて、エルカトニン(配列番号：１３)への続く変換用の誘導 体化形のエルカトニン(例えば「エルカトニン−aa」(配列番号：３０))を生成す ることができる。 ECF2−aaの好ましい配列は： Gly−Lys−Leu−Ser−Gln−Glu−Leu−His−Lys−Leu−Gln−Thr−Tyr−Pro−Ar g−Thr−Asp−Val−Gly−Ala−Gly−Thr−Pro−Ala (「ECF2−Ala」；配列番号：２３)である。 ECF2−Alaペプチド・フラグメントは、例えばヒドロキシルアミンでの処理に よって、hCA−ECF2−Ala蛋白質構築物の切断から由来し得る。hCA−ECF2−Ala蛋 白質構築物は、配列： を含み得る。 別法として、hCA−ECF2−Ala蛋白質構築物は、異なる結合で切断して、プレー ECF2−Alaペプチド、すなわちミニ融合蛋白質を生成し得る。例えば、hCA−ECF2 −Ala蛋白質構築物は、切断されてhCAIIのＣ−末端フラグメントまたはECF2−Al a(配列番号：２３)のＮ−末端に結合したその修飾バージョンを含むプレーECF2 −Alaペプチドを生成し得る。本発明の好ましい具体例において、hCA−ECF2−Al a−蛋白質構築物(配列番号：１２)を臭化シアン(CNBr)で切断して、アミノ酸配 列： を有するミニ融合蛋白質(「MFP」)を得ることができる。 該MFPは、hCAIIのＣ−末端からのVal₂₄₁-hCAII”フラグメント： および式： を有するリンカー配列を含む。 ヒト・カルボニックアンヒドラーゼＩＩ(hCAII)のポリペプチドセグメントhCA II'−Met₂₄₀−Val₂₄₁−hCAII”は、Biochemistry，9,2638(1970)に報告されてお り、(WO92/01707)に記載されているもののごとき方法を用いるカルボニックアン ヒドラーゼ−ECF2−aa蛋白質構築物の精製用の結合蛋白質セグメントとして用い ることができる。WO92/01707によれば、カルボニックアンヒドラーゼ・フラグメ ントまたは修飾カルボニックアンヒドラーゼも、結合蛋白質セグメントとし て使用できる。 多種の他のカルボニックアンヒドラーゼのアミノ酸配列も報告されている(例 えば、Hewett−EmmettらによるThe Carbonic Anhydrases，Dodgsonら編，第２ 章，15−32(1991)を参照されたし)。特定のカルボニックアンヒドラーゼのアミ ノ酸配列は知られているが遺伝子が利用できない場合には、カルボニックアンヒ ドラーゼをコードするｃＤＮＡを当業者によく知られている方法(例えば、Sambr ookらによるMolecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab oratory発行,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)、およびTanhauserらによるGene,1 17，113-117(1992)を参照されたし)を用いて単離し得る。この方法には、典型的 には、問題のカルボニックアンヒドラーゼのフラグメントをコードする核酸プロ ーブ(例えば、約20−30塩基対長)を構築することが含まれる。公知のアミノ酸配 列に基く縮重ヌクレオチドプローブ、または関連ＤＮＡ配列を用いて、ｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーンすることができる(例えば、Wallace らによるNucleic Acids Res.，6,3543(1979)および Wallace ら,Nucleic Acids Res.,9,879(1 981)を参照されたし)。 本発明のもう一つの態様において、標的配列には、10−32フラグメントのＣ− 末端残基の少なくとも１個が１または２以上のアミノ酸残基(「遊離単位」)で置 換えられたアミノ酸配列が含まれ得る。該標的配列のＣ−末端は、融合蛋白質を 切断してカルボニックアンヒドラーゼ部分を取り出す前か後かのいずれかに、ペ プチド転移反応を介して修飾し得る。該ペプチド転移反応は、典型的には、標的 配列のＣ−末端からの遊離単位の除去、および「10−32フラグメント」の欠失し ているＣ−末端残基(または残基群)によるその置換を生じる。例えば、ウナギ(1 0−30)−Ala(Ｃ−末端アラニンにカップリングしたウナギ・カルシトニンのアミ ノ酸残基 10−30)のごとき、Ｃ−末端遊離単位を有する組換え作製ペプチドは、 エス・アウレウス(S．aureus)のV8を用いてペプチド転移して、Ｃ−末端Ala残基 の代りにGlu₃₀の後にThr−Pro−ＮＨ₂ジペプチドを導入し得る。 エルカトニンのごときカルシトニンのカルバ・アナログの調製に用いることに 加えて、本発明の組換え合成10−32フラグメントはカルシトニンの合成にも用い 得る。例えば、Ser、ThrおよびGlu残基がベンジルエーテルまたはエステルとし て保護され、Lys残基がCBZ基によって保護されているようなECF2−アミドの側鎖 保護誘導体は、非酵素的カップリング試薬を用いて、ウナギ・カルシトニンの残 基1−9の環状酸化型とカップリングし得る。該カップリング反応を行うために用 い得る適当な非−酵素的カップリング試薬の例には、DCC、N−エチル−Ｎ'−ジ メチルアミノプロピル−カルボジイミド(「EDAPC」)、DCC/HOSu、DCC/HOBt およ び EDAPC/HOSu(例えば、出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,429, 129号を参照されたし)。Ｉ．融合蛋白質の組換え体形成 ａ．ベクター 融合蛋白質を組込んでいる発現ベクターは、宿主細胞との和合性であることで 選択する。用いるベクターは、一般に多くの特徴を有する。これらの特徴には、 宿主細胞と和合性である複製起点、(誘導系については)転写および転写の調節用 の調節DNA配列、(原核生物宿主については)効率的なリボソーム結合部位、(真核 生物宿主については)ポリ−Ａシグナルが含まれる。加えて、表現型遺伝子、調 節領域、およびリーダー配列も含まれ得る。 イー・コリ（E.coli）における発現用のもののごとき原核生物ベクターは、複 製起点、形質転換細菌を選抜するための遺伝子マーカー(表現型)、および目的の 遺伝子の発現を指示するDNA調節配列によって特徴付けられる。該調節配列には 、典型的には、転写を作動させるためのプロモーター、転写を制御するための( オン／オフのスイッチ)オペレーター、翻訳を開始させるための効率的なリボソ ーム結合部位、および転写終止シグナルが含まれるであろう。該開始および終止 コドンは、挿入した(融合蛋白質)遺伝子によって提供される。 原核生物ベクターには、特に、多種の利用可能なプロモーター／オペレーター 系のうちのいずれかに基く適当な「発現カセット」が含まれる。真核生物ベクター に含ませる典型的なプロモーターには、ラクトース、トリプトファン、Ｔ７、リ ポ蛋白質、アルカリ性ホスファターゼ、ラムダＰ_LまたはＰ_Rプロモーター、また はそれらの組合せ(ハイブリッドプロモーター)が含まれる。ラクトースおよびト リプトファン・オペレーター、ならびに温度感受性ラムダプロモーターは、原核 生物ベクターに含ませ得る典型的なオン／オフスイッチである。原核生物ベクタ ーに含ませる典型的な表現型マーカーには、アンピシリン、テトラサイクリン、 カナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を発現する遺伝子が含ま れる。 酵母サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)における発現 用のもののごとき真核生物ベクターは、典型的には、イー・コリ（E.coli）の複 製起点およびエス・セレビシアの複製起点、両方の細胞型用の遺伝子マーカー、 および酵母における発現を指示するDNA調節配列を含むシャトルベクターである 。該調節配列には、典型的には、プロモーター、調節配列、および(ポリアデニ ル化シグナルを含む)転写終止シグナルが含まれる。細胞性分泌指示用の任意の シグナル配列も、真核生物ベクターに挿入し得る。組込ませる典型的なマーカー は、ウラシル、ロイシン、ヒスチジン、アデニン、トリプトファンなどの産生に 必要な遺伝子中の突然変異の補充による陽性選抜を提供する。真核生物ベクター に好ましく組込ませ得るプロモーター配列には、アルコール・デヒドロゲナーゼ ＩまたはIIグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロ キナーゼ、ガラクトース、トリプトファン、接合因子アルファなどが含まれる。 選択したベクターの性質に依存して、ECF2−aa遺伝子フラグメントは種々の生 物で発現させ得る。特異的な宿主域を有するベクターおよび広範な宿主域を有す るベクターの両方が、本発明における使用に適する。例えばイー・コリ（E.coli ）については、特異的な宿主域を有するベクターの例は pBR322(Bolivar らによ るGene，2，95−113,1977)、pUC18/19(Yanisch PerronらによるGene，33，103 −119,1985)、pK18/19(PridmoreによるGene,56,309−312,1987)、pRK290X(Alvar ez−MoralesらによるNucleic Acids Res.,14,4207−4227,1986)および（Nycomed Pharm a AS社、Huidove,Denmarkから市販されている）pRA95 である。 用いることができる他のベクターは「広宿主域」ベクターであり、これはグラ ム陰性細菌における使用に適する。かかる「広宿主域」ベクターの例は pRK290(Ditta らによる Proc．Natl．Acad．Sci.，77,7347−7351，1980)、pKT2 40(Bagdasarian らによる Gene,26,273−282,1983)、pLAFR1(Long らによるNatu re,289,485−488,1982)のごときpRK290の誘導体、pMMB66EH(Furste らによる Ge ne，48，119−131(1986))のごとき pKT240 の誘導体、またはpGSS33(Sharpe,Gen e,29,93−102(1984))である。 ｂ．プラスミドpTBNの構築 hCAII遺伝子を含む発現ベクターpET31FlmhCAIIは、フロリダ大学のP.J.Laipis 博士から寄贈戴いた。アンピシリン耐性のT7発現ベクターは、Tanhauserらによ るGene,117,113−117(1992)に記載の方法によって、プラスミドpET−3c(Studier らによるMethods Enzymol.,185,60−89(1990))から構築した。pET−3cベクター からのT7発現カセットを、切頭pSP65プラスミドにトランスファーした。一本鎖 プラスミドDNAの産生を可能ならしめるために、pEMBL8+(DenteらによるNucleic Acids Res.,11,1645−1655(1983))からの F1 起点を、陽性クローンの Bgl II 制限部位に連結した。得られたプラスミドをpET31Flmと命名し、ここにFlmとはF 1起点がpSP65複製起点とは反対の向きを有することを示す。最後に、ヒト・カル ボニックアンヒドラーゼIIのcDNA(hCAII cDNA)を、Nde+とBam HI部位との間のp ET31Flmプラスミドにクローン化して、pET31FlmhCAII と命名するプラスミドを 得た(図１を参照されたし)。 該プラスミドのリンカー領域は、最初に、DNA Synthesis Core Facility of t he Interdisciplinary Center for Biotechnology at the University of Flori daで２種の相補的オリゴヌクレオチド： を合成することによって作製した。 該オリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニールさせ、hCAII の遺伝子配列のカ ルボキシ末端付近のHind III部位に連結した。インサートを含んでいるプラス ミドは、ポリペプチドフラグメント、リンカー(配列番号：１４)中の４番目のア スパラギン酸残基の直後にユニークEcoR V部位を有する。得られたプラスミド をpABNという(図２を参照されたし)。 プラスミドpABNおよびpBR322(BolivarらによるGene,2,95−113(1977))を用い て、ECF−aa(配列番号：２７)(例えば、aaはAla)の産生に用いるべきテトラサイ クリン耐性発現ベクターを構築した。pABNからの1.5kbのSspI/BspE Ｉフラグメ ントを、pBR322のScal 部位に挿入してpTBNを得た(図３を参照されたし)。 ｃ．宿主株および形質転換 本発明よる制限酵素切断、連結、形質転換、選抜、培養、および溶菌を行う方 法は、一般的に、当該技術分野で知られている標準的な方法に従った。これらの 方法を詳細に説明している刊行物には、(出典明示して本明細書の一部とみなす) SambrookらによるMolecular Cloning,A Laboratory Manual，第２版，Cold Spri ng Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)が含まれる。 醗酵用の産生菌株を調製するために、hCA−ECF2−aaをコードするDNAフラグメ ントを、hCA−ECF2融合蛋白質の発現に適する宿主菌株に導入した。この遺伝子 を発現させるのに適した微生物の例には、典型的には、基質および出発物質の高 い耐性を有する菌株が含まれ、Escherichia 属由来からのごとき、腸内細菌であ る。イー・コリ（E.coli）種の微生物が特に好ましい。該微生物には、ベクター 分子上か、またはその染色体に一体化されたかのいずれかのhCA−ECF2−aa DNA フラグメントを含ませ得る。選択した微生物を、当業者によく知られている方法 (例えば、Sambrook らによる前掲文献を参照されたし)を用いて、hCA−ECF2−aa DNA フラグメントを含むベクターで形質転換した。適当な産生菌株の例はイー ・コリ（E．coli）JM109(DE3)およびイー・コリ（E.coli）BL21(DE3)であり、各 々の場合において、融合蛋白質をコードするプラスミド、例えばpTBN26を含んで いる。 真核生物細胞には、酵母のごとき単細胞生物、ならびに植物、昆虫または哺乳 動物細胞のごとき高等生物由来の不死細胞が含まれ得る。適当な真核生物宿主細 胞には、サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア・ パストリス(Pichia pastoris)、アスペルギルス・ニーゲル(Aspergillus niger) 、スポドプテラ・フルピペルダ(Spodoptera frupiperda)、およびトウモロコシ 、タバコまたはダイズ植物の細胞が含まれる。宿主として有用な高等生物には、 形質転換し得る生殖細胞を有する高等植物および動物が含まれる。これに含まれ るのは、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよび果実を実らせる植物のごとき植物 、無脊椎動物、ならびに魚類、鳥類、およびヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマおよびブ タのごとき哺乳動物のごとき脊椎動物である。 形質転換宿主株は、典型的には、ベクター上に位置するマーカー遺伝子により 宿主株がそれに対して耐性となる、抗生物質を添加した選択栄養培地から単離す る。 ｄ．醗酵 hCA−ECF2−aa融合蛋白質の組換え調製は、hCA-ECF2-aa DNAフラグメントお よび／または(hCA-ECF2-aa フラグメントを含む)ベクタープラスミドを含む微生 物を用いて行う。該方法は、例えばWO92/01707記載の方法によるように、現在知 られている方法によって行い得る。これによれば、ルリアブロスのごとき市販の 増殖培地を用いることができる。該醗酵は、酸素を供給しアミノ酸を補充したバ ッチで行って、高細胞密度を得た。醗酵が完了した後に、該微生物を WO92/0170 7に記載ごとく破砕し、例えばWO92/01707に記載のスルファニルアミド・アフィ ニティークロマトグラフィーを用いて、hCA-ECF2-aa融合蛋白質を精製した。ＩＩ．ECF2−Alaを得るための融合蛋白質の切断 以下に示す配列を有する融合蛋白質は、以下に「*」によって示すアミノ酸Asn ７(リンカー配列のアミノ酸７)とGly A₁₀(ECF2−Alaのアミノ酸１)との間で切 断し得る。 この部位における特異的切断は、ヒドロキシルアミンでの処理によって達成す ることができる。得られたECF2−Alaフラグメント(配列番号：２３)は、慣用技 術によって精製し得る。ＩＩＩ．ECF2−アミド(配列番号：６)を形成するためのECF2−aa ( 配列番号：２２)のアミド化 ECF2−aa(配列番号：２２)のアミド化は、カルボキシペプチダーゼＹ存在下に て、求核試薬アミノ化合物でECF2−Ala(配列番号：２３)のごときECF2-aaペプチ ドをアミド基転移させて、反応し得るペプチド中間体を形成させるか、または分 解してECF2−NH₂(配列番号：６)を形成させるかによって、WO92/05271により行 い得る。適当な求核試薬の例には、ｏ−ニトロフェニルグリシンアミド(「ONPGA 」)のごときｏ−ニトロベンジルアミンが含まれる。アミド基転移は、求核試薬 アミンによるECF2−aa(配列番号：２２)のＣ−末端−aa残基の置換を生じる。得 られた光反応活性中間体、例えばECF2−ONPGA(配列番号：２８)の光分解は、該 求核試薬の切断およびカルボキシ末端にアミド化プロリンを有するECF2フラグメ ント(「ECF2-アミド」:配列番号：６)を産生に通じる。該ECF2−アミドは慣用技 術によって精製し得る。反応図式１ ＩＶ．エルカトニン−フラグメント１(ECF1)およびECF2−アミドの縮合 Ｎ−末端エルカトニン・フラグメントECF1(配列番号：７)およびエルカトニン 関連フラグメント ECF2−Xxx(配列番号：１)は、例えば、DCC/HOSu、EDAPC/HOSu または DCC/HOBt 存在下にてのように、本明細書中に記載した標準的なペプチド カップリング反応を用いてカップリングし得る。該カップリング反応をECF1 お よびECF2−アミドの非保護形を用いて行う場合には、ECF1 フラグメントのＣ− 末端α−カルボン酸を、典型的には、ECF2 フラグメントの付加前に活性化エス テルに変換する。該カッブリング反応によって生成したエルカトニン(配列番号 ：１３)は、分取用HPLC法のごとき慣用技術によって精製し得る。 他のカルシトニンのカルバ−アナログ(例えば、サケＩカルシトニン(配列番号 ：３８))および関連カルシトニンのカルバ・アナログは、ECF1(配列番号：７)お よび他の10-32フラグメント、例えばサケＩカルシトニン10−32フラグメント(配 列番号：２９)を用いた同様の方法で調製し得る。本発明は、１の種からのカル シトニンに対応するＮ−末端カルバ・フラグメントと異なる種からのカルシトニ ンのＣ−末端フラグメントの結合を介したカルバ・アナログの調製も許容する。反応図式２ Ｖ．ミニ融合蛋白質(ＭＦＰ)を与える融合蛋白質ｈＣＡ−ＥＣＦ２−ａａの切断 エルカトニン（配列番号：１３）の形成における化学的カップリング反応を用 いた本発明のもう１つの具体例では、Ｍｅｔ−ｈＣＡＩＩ’−Ｍｅｔ₂₄₀−Ｖａ ｌ₂₄₁−ｈＣＡＩＩ”−リンカー−ＥＣＦ２−Ａｌａ 融合蛋白質（配列番号： １２）を、ＣＮＢｒ処理により、Ｍｅｔ₂₄₀およびＶａｌ₂₄₁残基の間で切断して 、４８のアミノ酸のミニ融合蛋白質（Ｖａｌ₂₄₁−ｈＣＡＩＩ”−リンカー−Ｅ ＣＦ２−Ａｌａ、以下「ＭＦＰ」(配列番号：２４)）を得ることができる。該Ｍ ＦＰは、３つの成分フラグメントから構成される。該ミニ融合蛋白質のアミノ末 端部は、本質的に該ＥＦＣ２−Ａｌａフラグメント（配列番号：２３）のＮ−末 端上、２４残基の「生物学的ブロッキング基」を構成する。該ＭＦＰ（配列番号 :２４）は、常法により精製し、続いて、アミノ酸側鎖残基を保護するように誘 導体化することができる。ＶＩ．ミニ融合蛋白質への保護基の導入 ＥＦＣ２−ａａ（配列番号：２２）が化学的にブロックされた形態で単離され る場合、ミニ融合蛋白質を、該融合蛋白質から分離し、続いて切断し、次いで、 リシン残基のようなイプシロンアミノ基のごとき、種々の保護基（「Ｒ」）を用い て、反応性側鎖基を保護するように化学的誘導化に付すことができる。該Ｎ−末 端ペプチドセグメント基は、ブロッキング基として機能して、化学的保護試薬に よる誘導体化由来のＥＣＦ２−ａａの該Ｎ−末端Ｇｌｙのような該α−アミノ基 を保護する。 該アミノ保護基Ｒは、ポリペプチド化学において通例であり[例えば、Ｈｏｕ ｂｅｎ−Ｗｅｙｌ（有機化学の手法 １５／１および１５／２、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ １９７４）に記載されたもの]、保護基と して使用するのに適切である。好ましいアミノ保護基は、ベンジルオキシカルボ ニル−(「Ｚ」)、ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニル−(「ＢＯＣ])、フルオレニル メトキシカルボニル-(「ＦＭＯＣ])、またはアダマンヂルオキシカルボニル−(「 ＡＤＯＣ」)を含む。他の反応性側鎖基は、また保護基で保護することができ、例 えば、ヒドロキシルおよびカルボキシル基を、それぞれ、ベンジルエーテルおよ びベンジルエステルとして保護することができる。ＶＩＩ．保護ＥＣＦ２−Ａｌａフラグメントの調製 保護された１０−３２フラグメントを、Ｒが該アミノ保護基（式中、ｎはミニ 融合蛋白質中のリシン残基の数に対応する。)である適当な誘導化試薬(「Ｒ試薬」 )によって、先ず、該ミニ融合蛋白質を処理することによって形成することがで きる。該得られた保護ミニ融合蛋白質（「Ｒ_n−ＭＦＰ」(配列番号：２４)）を 、次いで、切断して、保護された１０−３２フラグメント（「Ｒ_n−ＥＦＣ２− Ａｌａ」(配列番号：２３)）を形成することができ、そこでは、リシン残基のよ うな遊離ε−アミノ基のみが該「Ｒ」基によって保護され、該α−アミノ基は保 護されない(下の反応図式３を参照)。化学的または酵素的に、該切断を行うこと ができる。該化学的切断に関して、例えば、Ｒ_n−ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号 ：２３）を生成するためにＢｏｒｎｓｔｅｉｎによって記載された方法 ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，２４０８−２４２１，（１９７９）］に従 い、ヒドロキシルアミンを使用して、該Ａｓｎ−Ｇｌｙ結合（矢印で示す）を切 断することができる。得られたＲ_n−ＥＣＦ２−Ａｌａフラグメント（配列番号 ：２３）を、所望すれば、続いて、通例の化学的手法によって精製することがで きる。 本発明のこの具体例のひとつの例において、ＢＯＣ−保護Ｖａｌ₂₄₁−ｈＣＡＩ Ｉ”−リンカー−ＥＣＦ２−Ａｌａ（「ＢＯＣ₄−ＭＦＰ」(配列番号：２４))を、 該ＭＰＦとＢＯＣ−酸無水物と反応させることによって形成することができる。 該ＡｓｎおよびＧｌｙアミノ酸残基の間で、該得られた ＢＯＣ₄−ＭＦＰ（配列番号：２４）をヒドロキシアミンを用いて切断して、Ｂ ＯＣ₂−ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）を得ることができる。反応図式３ ＩＸ．非アミド化エルカトニンを生成するＥＣＦＩフラグメントへの保護Ｒ_n− ＥＣＦ２−ａａのカップリング 本発明は、さらに、エルカトニン（配列番号：１３）のごとき、カルシトニン 類似体の調製における、ＥＣＦ２−ａａ（配列番号：２２）または、 Ｒ_n−ＥＣＦ２−ａａのごとき、それらの修飾形態の使用に関する。この具体例 において、Ｒ_n−ＥＣＦ２−ａａ（配列番号：２２）の該遊離α−アミノ基を、 先ず、非酵素的カップリング試薬を用いて、当業者に通例の方法により、ＥＣＦ Ｉ（配列番号：７）または保護されたＥＦＣ１のごとき、ペプチドフラグメント の該遊離カルボキシル基に縮合して、エルカトニン−Ａｌａのごときエルカトニ ン前駆体を生成することができる。 例えば、上記のごとく、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基のヒドロキシル基ならびにリシ ン残基の側鎖アミノ基が保護されている出発原料を用いて、該エルカトニン前駆 体を生成するために用いられた該縮合を行うことができる。これは、エルカトニ ンの側鎖保護、アミノ酸拡張、非アミド化形態（「Ｒ_n−エルカトニン−Ａｌａ」( 配列番号：３１)）の形成をもたらす。 該縮合を、公知の方法（カルボジイミド法またはアジド法）で、行うことがで きる。該２つのフラグメントを化学的に縮合した後、該生成物を、個々の保護基 に対して適当な常法（例えば、［Ｈｏｕｂｅｎ Ｗｅｙｌ，Ｍｅｔｈ． ｄｅｒ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉe，１５，１−２ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９７４］に記載されたごとき、水素化分解、酸、還元に よる加水分解、またはヒドラジン分解）を用いて、脱保護することができる。ＩＸ．エルカトニン−Ａｌａのエルカトニンへの転換 式：のエルカトニンへのアミノ酸拡張エルカトニン前駆体の転換を、ＷＯ９２／０５ ２７１に従い、前駆体ポリペプチド、エルカトニン−ａａ（配列番号：３０）と 親核性化合物（例えば、ＯＮＰＧＡ）とを、カルボキシペプチダーゼの存在下で 反応することによって行い、切断可能な中間体を得ることができ、それを、次い で、光分解によって切断して、エルカトニン（Ｃ−末端α−カルボキシアミドと して存在）を得ることができる。 該アミノ酸に関して、本明細書中で使用している略号は： Ｇｌｙ、グリシン；Ｌｙｓ、Ｌ−リシン；Ｌｅｕ、Ｌ−ロイシン； Ｓｅｒ、Ｌ−セリン；Ｇｌｎ、Ｌ−グルタミン；Ｇｌｕ、Ｌ−グルタミン酸； Ｈｉｓ、Ｌ−ヒスチジン；Ｔｈｒ、Ｌ−トレオニン；Ｔｙｒ、Ｌ−チロシン； Ｐｒｏ、Ｌ−プロリン；Ａｒｇ、Ｌ−アルギニン；Ａｓｐ、Ｌ−アスパラギン酸 ； Ｖａｌ、Ｌ−バリン；Ａｌａ、Ｌ−アラニン；Ｍｅｔ、Ｌ−メチオニン； Ａｓｎ、Ｌ−アスパラギン；Ｔｒｐ、Ｌ−トリプトファン； Ｉｌｅ、Ｌ-イソロイシン；およびPｈｅ、Ｌ−フェニルアラニン。 実施例 １．１ ｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質をコードするＤＮＡを含有 するプラスミドｐＴＢＮ２６の調製 ＥＣＦ２のアミノ酸１０−３２をコードする遺伝子は、ＰＣＲ手法を用いて構 成される。次の５つのオリゴヌクレオチドは、ユニバーシティ・オブ・フロリダ で合成された。 オリゴヌクレオチド２-５は、１つのＰＣＲ反応混合物（ＰＣＲ ＭＩＸ１） 中で結合される。オリゴヌクレオチド３の３’末端は、オリゴヌクレオチド５の ３’末端に対して相補的であり、一方、オリゴヌクレオチド２は、オリゴヌクレ オチド４の３’末端に対して相補的である。これらの４つのヌクレオチドは、図 ４Ａに示すごとく、互いにアニールする。ＰＣＲの間中、ＴａｑＤＮＡポリメラ ーゼを使用して、オリゴヌクレオチド３をオリゴヌクレオチド５の５’末端へ拡 張し、オリゴヌクレオチド５をオリゴヌクレオチド３の５’末端に拡張し、なら びに、オリゴヌクレオチド２をオリゴヌクレオチド４の５’末端に拡張する。そ れらをダイアグラムＡ中、点線で示す。 別のＰＣＲ反応を使用して、該完全、非分断Ａｓｎ−ＥＣＦ２−Ａｌａ遺伝子 配列ならびにクローニングの機能をする制限サイトを含有する二本鎖ヌクレオチ ドフラグメント（配列番号：９）を引き起こすＰＣＲ ＭＩＸ１由来の該ＰＣＲ 生成物を接合する。オリゴヌクレオチド２（それぞれ、２^Ext（配列番号：８） および３^Ext(配列番号：５０)）から誘導された該ＰＣＲ拡張生成物は、それら の３’末端に２０ｂｐの相補配列を有する(図４Ｂの概略図を参照)。ＰＣＲ Ｍ ＩＸ２を用いた反応の初めの数サイクルの間、オリゴヌクレオチド２^Ext（配列 番号：８）および３^Ext（配列番号：５０）はアニールし、ここで、それらの配 列は相補的であり、拡張されてＥＣＦ２（配列番号：１０）に対する完全長、非 分断遺伝子配列を含む二本鎖フラグメントを生成する。最後に、オリゴヌクレオ チド１および２を使用して、完全長遺伝子配列を増幅する。図１１および１２は 、完全、非分断ＥＣＦ２遺伝子配列（配列番号：１０）および、それぞれ、オリ ゴヌクレオチド２^Ext（配列番号：８）ならびに３^Ext（配列番号：５０）に関す る該核酸配列を示している。 該増幅ＰＣＲ生成物をＨｐａ ＩおよびＥｃｏＲＶで消化する。この平滑断端 ＤＮＡフラグメントは、該ポリペプチドフラグメントリンカーならびに全ポリペ プチドフラグメントＥＣＦ２のＣ−末端アミノ酸（Ａｓｎ）をコードし、ｐＡＢ Ｎプラスミドの特異的ＥｃｏＲ Ｖサイトに挿入される。該プラスミドは、Ａｓ ｐ−ＥＣＦ２遺伝子が、正しい配向で挿入されることを保証するようにスクリー ニングされる。この得られたプラスミドをｐＡＢＮ２６とよぶ。最後に、ｐＡＢ Ｎ２６をＸｂａ ＩおよびＢｓｐＥ Ｉで消化し、全Ｍｅｔ−ｈＣＡＩＩ’−Ｍ ｅｔ₂₄₀−Ｖａｌ₂₄₁−ｈＣａＩＩ”−リンカー−ＥＣＦ２−ａａ配列を、同じ酵 素で消化して、プラスミド生成物ｐＴＢＮ２６（図５）を生成するようにしたｐ ＴＢＮプラスミドに移す。 Ｍｅｔ臭化シアン分解サイトを下線で、該Ａｓｎ−Ｇｌｙ（配列番号：１１） および対応するアミノ酸配列（配列番号：１２）切断サイトを矢印で表わし、最 終構成体のＤＮＡ配列を図６に示す。 １．２ ｈＣＡ−ＥＣＦ２−ａａＤＮＡフラグメントを含有するプラスミド ｐＴＢＮ２６ベクターの形質転換 ＷＯ９２／０１７０７に記載の方法に従い、形質転換を行う。使用した宿主微 生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で あり、両方とも［ｖａｎ Ｈｅｅｋｅら、 蛋白質の発現および精製、４、２６ ５−２７５、(１９９３)］に記載されている。 １．３ ｈＣＡ−ＥＣＦ２−ＡｌａＤＮＡを含有するベクターの選出 ＷＯ９２／０１７０７に記載のごとく、標準的な方法に従って、選出を行う。 選出は、宿主生物体へのテトラサイクリン耐性の導入に基づく。２． プラスミドpＴＢＮ２６を含有するＥ．ｃｏｌｉの発酵 ２．１ 発酵曹に接種するための予備培地の増殖 プラスミドpＴＢＮ２６を含有する該Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、 テトラサイクリン（１５ｍｇ／Ｌ）およびグルコース溶液（５０ｍｇ／Ｌ）を含 有するルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ(ＬＢ)）媒体中、振とうフラス コ中、３７℃で、５５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ５５０）が約４に達するま で約１４時間、増殖する。該ルリア・ブロス媒体（ＬＢ媒体）の組成は、１．０ ｇ／Ｌ トリプトン、１．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌおよび０．５ｇ／Ｌ 酵母抽出物 である。 ２．２ 発酵 新型ブランスウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）ＭＰＰ−８０発酵曹中 で、発酵を行う。発酵媒体は、１５ＬのＨ₂Ｏに溶解した３００ｇの酵母抽出物 、３０ｇのＮａＣｌおよび１２００ｇのカサミノ酸を含有し、該発酵曹に添加さ れ、引き続いて、３０Ｌの蒸留水が添加される。該発酵曹を、適当に、１２１℃ で２５分間、滅菌する。発酵曹中の該内容物が３７℃まで冷却した後、以下の滅 菌溶液を連続的に添加する：８００ｍＬのＨ₂Ｏ中の４８０ｇグルコース、２５ ０ｍＬ Ｈ₂Ｏ中の１２０ｇ ＭｇＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、３．０ＬのＨ₂Ｏ中の４９５ｇ Ｋ₂ＰＯ₄および４６５ｇＫＨ₂ＰＯ₄、および３０ｍｌの９５％エタノールおよ び２０ｍＬのＨ₂Ｏの混合溶媒中の０．９ｇテトラサイクリン塩酸塩。また、４ ９０．０ｍＬ Ｈ₂Ｏおよび１０．０ｍＬ 濃ＨＣｌに溶解した、３．６ｇ Ｆ ｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３．６ｇ ＣａＣｌ・２Ｈ₂Ｏ、０．９０ｇ ＭｎＳＯ₄、０ ．９０ｇ ＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、０．０９ｇ ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．１８ｇ モリブデン酸および０．３６ｇ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを含有する滅菌ミネラル混 合物も添加する。 試薬級ＮＨ₄ＯＨ（２８％）を、該発酵曹の自動ｐＨ供給ポンプに接触させて 、該ｐＨを６．８に調整する。該発酵液のｐＨを校正電極を用いて、連続的に監 視 し、ＮＨ₄ＯＨの断続的添加よってｐＨ６．８に保持する。さらに、溶存酸素を 連続的に、校正酸素モニターを用いて監視する。酸素濃度を、攪拌速度を調整す ることによって保持する。通気は４０Ｌ／ｍｉｎに保持する。全ての系が正常に 作動したら、滅菌法による６００ｍＬの接種物を添加して接種を行う。 濁度、溶存酸素およびグルコースレベルを発酵の間中、監視する。該濁度が１ ５ないし２０のＯＤ（５５０）に達したら、該媒体を３００ｇの酵母抽出物およ び１２００ｇのカサミノ酸で補足する。攪拌速度が５００ｒｐｍに達したら、純 粋酸素を空気供給管に５Ｌ／ｍｉｎの速度で補足し、通気速度を２０Ｌ／ｍｉｎ まで低下させて、溶存酸素を４０％に保持する。 該濁度が３０ＯＤ₅₅₀単位に達したら、該発酵媒体をイソプロピルチオールガ ラクトシドについて２ｍＭにして、該プラスミドの発現を誘導する。加えて、十 分なＺｎＣｌ₂を添加して、最終濃度が１００μＭになるようにし、２２５ｇの Ｌ−ＳｅｒならびにＬ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｔｒp、 Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−ＰｒｏおよびＬ −Ｈｉｓそれぞれ７５ｇを含有する滅菌アミノ酸溶液を該媒体に添加する。導入 ２時間後、細胞サンプルを分析のために抜き出す。乾燥重量測定およびＳＤＳ− ＰＡＧＥ蛋白質分析を、導入時およびその後３０分毎に抜き出したサンプルにつ いて行う。 発酵の最後に、該媒体を滅菌条件下で、滅菌保存タンクに移し、８℃に冷却す る。廃媒体を、２００ｋＤ分子量カットオフメンブレインを装着したミリポアプ ロスタック（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏ Ｓｔａｃｋ）を用いたクロスフロー ろ過によって該細胞から分離する。該細胞を５Ｌに濃縮し、次いで、すぐに処理 するか、または１Ｌ分割量でプラスチックバッグに詰めて、後で処理するため、 ２０℃で保存する。 濃縮細胞（５Ｌ）を３２Ｌの溶菌バッファー（５０ｍＭトリス、 １ｍＭ ＥＴＤＡ、０．５％トリトン−Ｘ１００、ｐＨ７．８、０．０５ｍＭ フッ化フェニルメタンスルホニルを含有）で希釈し、次いで、１２、０００ｐｓ ｉ，４-１５℃で作動しているゴーリン（Ｇａｕｌｉｎ）ＡＰＶの試験規模ホモ ジナイザーに２回通す。該溶液を、次いで、リゾチームについて、１．３μＭに し、 １５分間（４−１５℃）インキュベートし、次いで、もう一度、ホモジナイザー に通す。約５０％の溶解Ｅ．ｃｏｌｉ蛋白質はｈＣＡ−ＥＣＦ２−ａａを表わし 、それは、Ｖｅｒｐｏｏｎｅら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２，４２２１− ４２２９，１９６７］に従い、該融合蛋白質のヒト炭酸脱水酵素部位の酵素活性 を測定することにより評価される。 ２．３ ｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質の精製 実施例２．２で得られた該溶菌液（３２Ｌ）を１：１で溶菌バッファーで希釈 し、フッ化フェニルメタンスルホニルは添加せず、ポリエチレンイミンを添加し て、最終濃度を０．３５％にする。全体を２０分間、攪拌し、次いで、１０、０ ００×ｇで遠心分離して、沈殿したＤＮＡ、ＲＮＡ、非必須蛋白質および膜ベシ クルを除去し、次いで、ポールプロフィール（Ｐａｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ）フィ ルター（１．０μｍ）を用いてろ過する。 該可溶性融合蛋白質を引き続き、アフィニティークロマトグラフィーによって 精製する。該ろ過蛋白質溶液のｐＨをトリス塩基の添加によって８．７に調整し 、ｐ−アミノメチルベンゼンスルホンアミドアフィニティー樹脂 ［ｖａｎ Ｈｅｅｋｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ、，３６， ２４５−２６０，１９９４］の１Ｌカラム上に２００ｍＬ／ｍｉｎのフローレー トで負荷する。負荷後、該カラムを、５カラム体積分の０．１Ｍ トリス−硫酸 塩バッファー（ｐＨ９．０、０．２Ｍ Ｋ₂ＳＯ₄および０．５ｍＭ ＥＤＴＡを 含有する）で洗浄する。該樹脂を次いで、５カラム体積分の０．１Ｍ トリス− 硫酸塩バッファー（ｐＨ７．０，１Ｍ ＮａＣｌを含有する）で洗浄する。該組 換え的に生成したｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質を、５カラム体積分の０ ．１Ｍ トリス−硫酸塩バッファー（ｐＨ６．８、０．４ｍＭ チオシアン酸カ リウムおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する）を用いて、該アフィニティー材 から溶出する。ｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質を含有する画分を合わせて 、酢酸で処理してｐＨ４．０にし、生成物を沈殿させる。それを引き続き、遠心 分離によって収集する。得られたペースト状物質を凍結し、凍結乾燥する。この 工 程における収率は８５％である。３． ＥＣＦ２−Ａｌａを与えるｈＣＡ-ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質の切断 ３．１ ヒドロキシルアミンを用いたｈＣＡ-ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質 の切断 該融合蛋白質をヒドロキシルアミンを用いて、ＡｓｎおよびＧｌｙの間で切断 して、ｈＣＡＩＩ含有フラグメントおよび該ポリペプチドフラグメントＥＣＦ２ −Ａｌａ（配列番号：２３）にする。１Ｌのヒドロキシルアミンバッファー(２ Ｍ ヒドロキシルアミン塩酸塩、５Ｍ 塩酸グアニジン、５０ｍＭ ３-（シク ロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、水酸化リチウ ムでｐＨ１０に調整する。)に溶解した４０ｇのｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａを４ 時間、インキュベートすることによって、切断は達成される。一時間ごとに１分 割量を抜き出し、該融合蛋白質がＥＣＦ２−Ａｌａに切断された程度をＨＰＬＣ 分析（Ｃ１８ Ｖｙｄａｃ，４．６×３００ｍｍ、バッファーＡ：０．１％トリ フルオロ酢酸、５体積％のアセトニトリル、９５体積％の水、バッファーＢ：０ ．１％トリフルオロ酢酸、５体積％の水、９５体積％のアセトニトリル；５％バ ッファーＡから６８％バッファーＢへの直線勾配；フローレート１ｍＬ／ｍｉｎ ）によって決定する。該反応物を１５％酢酸で４Ｌに希釈し、それから、得られ た沈殿ｈＣＡＩＩ含有フラグメントを、１００００×Ｇでの遠心分離によって除 去する。 ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）を含有する遠心物から得られた上澄み液 を次いで、１０ｍＭ 酢酸を用いて、５０ｍＬ／ｍｉｎのフローレートで平衡化 した分離用Ｃ８カラム（５×５．１ｃｍ）上に負荷することによって、脱塩する 。負荷に続いて、該カラムを１０％アセトニトリル中の１０ｍＭ酢酸で洗浄し、 該ＥＣＦ２Ａｌａを４５％アセトニトリル中の１０ｍＭ 酢酸で溶出する。ＥＣ Ｆ２−Ａｌａを含有する画分（上と同様に、分析ＨＰＬＣによって同定）を貯め て、凍結乾燥する。合計で、１．１４ｇのＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３） を得、８２％の収率に対応する。 ３．２ ＥＣＦ２−Ａｌａの精製 ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）のさらなる精製のため、セクション５． ３に詳しく記載したごとく、半分離用ポリスルホエチルアスパルトアミドＨＰＬ Ｃを用いる。収率は８５％。４． ＥＣＦ２−ＡｌａのＥＣＦ−アミドへの転換 ＷＯ９２／０５２７１に記載の方法に従って、ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号： ２３）のアミド化を行う。ＥＣＦ２−Ａｌａ（1２．８ｇ）を１ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ モルホリノエタンスルホン酸、ｐＨ７．０に溶解し、次い で、これに７２ｍｇのｏ−ニトロフェニルグリシンアミド（ＯＮＰＧＡ）を添加 する。ｐＨを５Ｍ ＮａＯＨで６．０に調整し、カルボキシペプチダーゼ（１２ ０μｇ）を添加する。暗所で約４８時間、攪拌後、アセトニトリル（１ｍＬ）を 添加し、ＥＣＦ２−ＯＮＰＧＡ（配列番号：２８）生成物を、セクション５．２ のごとく、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、該生成物を凍結乾燥する。１０ 、６０、１２０および１８０分後に分析用サンプルを抜き取り、ＷＯ９２／０５ ２７１のごとく、分析Ｃ１８ＨＰＬＣによって、アミド化反応の進行を追跡する 。 続く光分解のために、凍結乾燥ＥＣＦ２−ＯＮＰＧＡ(１２ｍｇ)を５ｍＬ ５ ０％エタノールに溶解する。この溶液にＮａＨＳＯ₃（２６ｍｇ）および安息香 酸ナトリウム（７．２ｍｇ）を添加し、ｐＨを５Ｍ ＮａＯＨで９．５に調整す る。窒素を次いで、該反応混合物に、１５分間、通気する。続く光分解、反応進 行の分析および得られたＥＣＦ２−アミド（配列番号：６）の同定を、ＷＯ９２ ／０５２７１に記載の方法に従って、行う。５． ミニ融合蛋白質を生成するｈＣＡ-ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質の切断 ５．１ 臭化シアンを用いたｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質の化学的 切断 酵素的ではなくて化学的フラグメントカップリングを用いた場合、該ＭＦＰを 先ず、該融合蛋白質（配列番号：１２）Ｍｅｔ₂₄₀−Ｖａｌ₂₄₁連結（ＥＣＦ２− Ａｌａの起点に先立つ配列中の２４アミノ酸）から切断するために、４０ｍｇ／ ｍＬのｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質（配列番号：１２）を７０％ギ酸中 の０．０２Ｍ 臭化シアンを用いて、室温中６時間、アルゴン雰囲気下、暗所で 処理する。メチオニン（０．０３Ｍ）を次いで、添加して最終濃度を０．０３Ｍ にし、切断反応を停止し、得られた溶液を３０分間、攪拌する。該反応物の２倍 体積量の、１０％酢酸および１１２ｇ／Ｌの硫酸ナトリウムを含有する溶液をこ の反応混合物に添加して、ｈＣＡＩＩ含有フラグメントを沈殿させ、混合物を２ ０分間、攪拌する。該沈殿物質を遠心分離（１０分間、１０、０００×Ｇ）によ って除去する。該ミニ融合蛋白質（配列番号：２４）は、上澄み液に溶解して残 っている。用いたｈＣＡ−ＥＣＦ２−Ａｌａ融合蛋白質（配列番号：１２）に比 較して、５８％の回収率でＭＦＰ（配列番号：２４）を得る。 ５．２ ミニ融合蛋白質の脱塩 該酸沈殿物の上澄み（４．５ｇのミニ融合蛋白質）を、０．１％トリフルオロ 酢酸および５％アセトニトリルで平衡化したＣ８Ｖｙｄａｃ半分離用カラム（２ ２×２５０ｍｍ）上に負荷する。該蛋白質を０．１％トリフルオロ酢酸および２ ５％アセトニトリルを用いて溶出し、続いて、凍結乾燥する。合計で、４．０５ ｇの８５％純度のミニ融合蛋白質を得、９０％の収率に対応する。 ５．３ ポリスルホエチルアスパルトアミドＨＰＣＬを用いたミニ融合蛋白 質の精製 ポリスルホニルエチルアスパルトアミドクロマトグラフィーをミニ融合蛋白質 （配列番号：２４）、ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）およびＥＣＦ２−ア ミド（配列番号：６）の精製に使用する。該ペプチドをバッファーＡ（２５ｍＭ 酢酸、３５％アセトニトリル）に溶かして、最終濃度を５ｍｇ／ｍＬにして、次 いで、ポリスルホニルエチルアスパルトアミドＨＰＬＣカラム(２．２×２５ｃ ｍ）上に２０ｍＬ／ｍｉｎのフローレートで負荷する。次いで、該蛋白質を、 １０％バッファーＢ（２５ｍＭ 酢酸、４００ｍＭ 酢酸ナトリウム、３５％ア セトニトリル）から４７％バッファーＢへの直線勾配を用いて、３０分間かけて 溶出することができる。収率は、典型的には５０％以上である。図８は、ＥＣＦ ２−アミド（配列番号：６）を含有するサンプルの代表的なＨＰＬＣトレースを 示している。ＥＣＦ２−アミドに対するピークは１４．５ないし１６．３分に現 れる。 ５．４ ポリスルホエチルアスパルトアミドＨＰＬＣに続く脱塩 凍結乾燥に引き続き、該蛋白質を、脱塩のために、Ｃ８カラム（５×２０ｃｍ 、９５％エタノールで平衡化）上に負荷する。該カラムを次いで、４カラム体積 分の水および４カラム体積分の、１％酢酸を含有する５％エタノールで洗浄する 。該ペプチドを次いで、２カラム体積分の９０％エタノールで洗浄する。該分画 をＨＰＬＣで分析する。収率は、典型的に８０％以上である。６． ミニ融合蛋白質への保護基の結合 一般的な計画： 組換えＭＦＰ（配列番号：２４）内のＥＣＦ２フラングメント（配列番号：６ ）のα−アミノ基は、生物学的に保護されている、すなわち、Ｎ-末端ｈＣＡＩ Ｉ”フラグメントの存在によって保護されている。ＭＦＰ中のＬｙｓ基のε−ア ミノ基は、Ｚ、ＢＯＣ、ＡＤＯＣまたはＦＭＯＣのごとき、アシルドナーで保護 されている。アルギニン−グアニド基とＺ−ＯＳＵとの反応は、ＨＣｌとの塩形 成によって妨げられている。Ｈｉｓ窒素とＺ−ＯＳＵとの反応は、Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミドのごとき試薬の添加によって抑制される。 実験手法 ＭＦＰ（配列番号：２４）（２７０ｍｇ）を水（２０ｍＬ）に溶解し、ジオキ サン（４ｍＬ）および６８０μＬの０．１Ｎ ＨＣｌ（２つのアルギニン−グア ニド基における塩形成を保証するため）を添加する。反応に先立って、７８ｍｇ の Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１０４．７ｍＬのトリエチルアミンを添加 し、Ｈｉｓ窒素を保護し、１６９ｍｇのＺ−ＯＳＵ、１４６ｍｇのＢＯＣ−ＯＳ Ｕ，１３５ｍｇのフッ化ＡＤＯＣまたは２２９ｍｇのＦＭＯＣ−ＯＳＵのいずれ かを次いで、全体に冷却しながら添加する。 反応混合物を次いで、室温で２４時間、攪拌し、続いて、真空乾燥する。得ら れた残渣を慎重に、ジクロロメタン（２回）で、次いで、アセトニトリル（２回 ）でトリチュレートする。生成物をろ過により収集し、真空乾燥する。Ｚ−保護 ミニ融合蛋白質の収量は３００ｍｇ、ＢＯＣ−保護蛋白質の収量は２９５ｍｇ、 ＡＤＯＣ−保護およびＦＭＯＣ−保護蛋白質のそれは３１０ｍｇである。 ミニ融合蛋白質のそれぞれの保護基との反応完了の確認を、保護および非保護 ペプチドを用いた薄層クロマトグラフィーによって行う。反応の完了を、薄層シ リカ板上（溶出液：フェノール：Ｈ₂Ｏ、７７５：２２５）で確認する。５４０ ｍｇのＭＦＰ（配列番号：２４）を使用した場合、Ｚ−ＯＳＵ反応の収率は７５ ％で、他のブロッキング試薬について観察される典型的な値である。７． 保護ＥＣＦ２−Ａｌａフラグメントを生成する保護ミニ融合蛋白質の切断 ７．１ ヒドロキシルアミンを用いた切断 アミノ酸配列によって生物学的に保護されているα−アミノ基を遊離するため に、該保護ミニ融合蛋白質を、ヒドロキシルアミンを用いてＡｓｎおよびＧｌｙ の間で、Ｚ−保護ＥＣＦ２−Ａｌａフラグメント（配列番号：２３）および２４ アミノ酸長Ｔｒｐ−含有フラグメントに切断する。ヒドロキシルアミンバッファ ーの組成はセクション３．１と同じである。 ヒドロキシルアミンバッファーを（２６ｍＬ）を２６０ｍｇのＺ−保護ミニ融 合蛋白質（配列番号：２４）に添加し、全体に、次いで、超音波をかけ（２０秒 ）、ｐＨを４Ｍ 水酸化リチウムでｐＨ１０．０にする。得られた混合物を３０ ℃でｐＨ１０．０において５時間までインキュベートする。ｐＨを次いで、濃酢 酸で６．０にする。 毎時間、１分割量を抜き出し、Ｚ-保護融合蛋白質がＺ−保護ＥＣＦ２−Ａｌ ａに切断された程度をＨＰＬＣ分析（Ｃ１８ Ｖｙｄａｃカラム、５×３００ｍ ｍ、バッファーＡ：０．１％トリフルオロ酢酸;バッファーＢ：０．１％トリフ ルオロ酢酸、５体積％Ｈ２、９５体積％アセトニトリル;溶出液：５％バッファ ーＡから６８％バッファーＢへの直線勾配；１ｍＬ／ｍｉｎ）によって決定する 。ヒドロキシルアミン切断の停止は、３．１と同じである。 Ｃ８カラムから得られた画分をＶｙｄａＣ１８カラムを用いたＨＰＬＣによっ て、分析する。ＨＰＬＳのバッファーは、前に記載したものである。フローレー トは１ｍＬ／ｍｉｎである。該蛋白質を、４１％バッファーＡから７１％バッフ ァーＢへの直線勾配で溶出する。検出は２１０ｎｍで行う。合計で、１５６ｍｇ のＺ−保護ＥＣＦ２−Ａｌａ（「Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａ」(配列番号：２３)）を得 、６０％の収率に対応する。７．２ Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａの精製 Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）を半分離用Ｃ８ＨＰＬＣを使用して 精製する。Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａ（１６０ｍｇ）を５Ｍ 酢酸（５ｍＬ）に溶解 し、バッファーＡ（１００ｍＭ 酢酸、５％アセトニトリル）（５ｍＬ）を、続 いて、添加する。サンプルを次いで、半分離用ＨＰＬＣＣ８カラム上に負荷する (詳細は３．２同様)。ヒドロキシルアミンの切断および精製の後、１２０ｍｇの Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）を得、Ｃ８精製工程に関して、７５％ の収率に対応する。Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａ（配列番号：２３）のさらなる精製の ため、セクション５．３に記載したごとく、半分離用ポリスルホエチルアスパル トアミドＨＰＬＣを使用する。この方法を用いて、５９ｍｇの９５−９８％純度 のＺ−ＥＣＦ２−Ａｌａを得、８５．５％の収率に対応する。８． ＥＣＦ２−アミドおよびＥＣＦ１−Ｍｅの縮合 実施例４により生成したアミド化ＥＣＦ２（配列番号：６）および環状エルカ トニン−フラグメントＥＣＦ１（配列番号：７）を、非酵素カップリング試薬の 存在下で結合することができる。例えば、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）お よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）を、ベンジルエーテルのごとき 、保護されたＳｅｒおよびＴｈｒの側鎖ヒドロキシル基を有するＥＣＦ１（配列 番号：３）および保護されたＬｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒおよび／またはＧｌｕ残基 の反応性側鎖基を有するＥＣＦ２−アミド（配列番号：２）の溶液に添加するこ とができる。反応物を約０℃で８時間、攪拌する。この時間中、フラグメント縮 合をＨＰＬＣ分析によって追跡する。反応停止後、該混合物を１％トリフルオロ 酢酸を添加することによって、希釈することができる。生成物エルカトニン（配 列番号：１３）を分離用ＨＰＬＣによって精製することができる。未反応ＥＦＣ ２−アミド（配列番号：２）をＨＰＬＣによって単離精製し、再利用することが できる。９． Ｚ−ＥＣＦ２のＥＣＦ１との化学的カップリング Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａフラグメント（すなわち、カルボベンジルオキシ基で保 護された側鎖アミノ基を有するＥＦＣ２−Ａｌａ）の遊離アミノ基とペプチドフ ラグメントＥＦＣ１の遊離Ｃ−末端α−カルボキシル基とのカップリングを、カ ルボジイミドまたはアジド法[例えば、Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎら，ｉｎ アミノ 酸の化学，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ.８０ ４ｆｆ，１０１６ｆｆ（１９６１）参照。]のいずれかによって行うことができ る。カップリング反応は、典型的には、ＥＣＦ１フラグメントのＣ−末端α−カ ルボン酸から生成した活性化エステルへ、Ｚ−ＥＣＦ２−Ａｌａフラグメントを 添加することによって行われる。カップリング生成物からのＣｂｚ保護基除去を 、水素分解により行ってもよく、得られた生成物を分離ＨＰＬＣで精製して、エ ルカトニン−Ａｌａ（すなわち、「ＥＣＦ１−ＥＣＦ２−Ａｌａ」；配列番号：３ １）を得ることができる。１０． エルカトニン−Ａｌａのエルカトニン−アミドへの転換 セクション９により生成したエルカトニン−Ａｌａ（配列番号：３１）ペプチ ドを、セクション４に記載した方法を用いて、アミド化してもよい。該アミド化 エルカトニン（配列番号：１３）を、セクシヨン５．３および５．４に記載の方 法の用いて精製し、続いて、脱塩してもよい。 本発明は、種々の特別のおよび好ましい具体例ならびに技術に関して記載され た。しかしながら、多くの変形および修正をなすことができ、それらも本発明の 精神および範囲のうちににあるものと理解されるべきである。 本明細書に引用された刊行物は、本発明の属する分野の通常の技術レベルを示 し、各々個別の刊行物が明確に、かつ個々に示されているのと同じ程度で、出典 明示して本明細書に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ヘンリクセン，デニス・ビー アメリカ合衆国68503ネブラスカ州リンカ ーン、ノース・フォーティフォース・スト リート343番、アパートメント723 (72)発明者 パートリッジ，ブルース・イー アメリカ合衆国68502ネブラスカ州リンカ ーン、サウス・トゥエンティフィフス・ス トリート1209番 (72)発明者 ホルムクイスト，バート アメリカ合衆国68528ネブラスカ州リンカ ーン、ウエスト・レイクショアー・ドライ ブ442番 (72)発明者 フランク，ジュリー・エイ アメリカ合衆国68502ネブラスカ州リンカ ーン、バー・ストリート1680番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(ａ)切断部位を介してカルボニックアンヒドラーゼに結合した標的配列を 含む融合蛋白質を組換え形成し；次いで、 （ｂ）融合蛋白質を切断試薬で切断して、標的配列を含む第１のポリペプチ ドを生成させることよりなり、 ここに、該標的配列が式： ［式中、A₁₀はGlyまたはSerであり、A₁₁はLys、ThrまたはAlaであり、A₁₂はLeu またはTyrであり、A₁₃はSer、ThrまたはTrpであり、A₁₄はGln、LysまたはArgで あり、A₁₅はGlu、AspまたはAsnであり、A₁₆はLeuまたはPheであり、A₁₇はHisま たはAsnであり、A₁₈はLysまたはAsnであり、A₁₉はLeu、TyrまたはPheであり、A_{2 0} はGlnまたはHisであり、A₂₁はThrまたはArgであり、A₂₂はTyrまたはPheであり 、A₂₃はProまたはSerであり、A₂₄はArg、GlyまたはGlnであり、A₂₅はThrまたはM etであり、A₂₆はAsp、Ala、GlyまたはAsnであり、A₂₇はVal、Leu、Ile、Pheまた はThrであり、A₂₉はAla、Val、ProまたはSerであり、A₃₀はGly、ValまたはGluで あり、A₃₁はThr、ValまたはAlaであって、−Xxxは−ＯＨ、−ＮＨ₂、アミノ酸残 基またはポリペプチド基である］ で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするカルシトニン・フラグメントを 合成する組換え法。 ２．−Xxxが、α−Ｃ(Ｏ)ＮＨ₂基を有するアミノ酸残基である請求項１記載の 方法。 ３．A₁₀がGlyであり；切断部位がAsn−A₁₀を含み；かつ、切断工程が融合蛋白 質とヒドロキシルアミンとを接触させることを含む請求項１記載の方法。 ４．−Xxx が−ＯＨであり；かつ、さらに、第１のポリペプチドとアミド化剤 とを反応させて−Xxx が−ＮＨ₂である第２のペプチドを形成させることよりな る請求項１記載の方法。 ５．−Xxxがアミノ酸残基を含み；さらに、Pro−XXX配列をＣ−末端Pro−ＮＨ₂ 残基に変換させることよりなる請求項１記載の方法。 ６．変換工程が、ｏ−ニトロベンジルアミンで−Xxxをアミド基転移させて第 ３のペプチドを形成させ；該第３のペプチドを光分解させて式： で示されるアミノ酸配列を含む第２のペプチドを形成させることよりなる請求項 ５記載の方法。 ７．A₁₀−A₁₁−A₁₂−A₁₃−A₁₄−A₁₅−A₁₆−A₁₇−A₁₈−A₁₉−A₂₀−A₂₁−A₂₂−A₂₃ −A₂₄−A₂₅−A₂₆−A₂₇−Gly−A₂₉−A₃₀−A₃₁−Pro−Xxx (配列番号：１)配列 が、 Gly−Lys−Leu−Ser−Gln−Glu−Leu−His−Lys−Leu−Gln−Thr−Tyr−Pro−Ar g−Thr−Asp−Val−Gly−Ala−Gly−Thr−Pro−Xxx（配列番号：６）である請求 項１記載の方法。 ８．さらに、融合蛋白質を保護試薬と反応させて、保護アミノ、ヒドロキシル またはカルボキシ反応性側鎖基を有するアミノ酸残基を含む保護融合蛋白質を形 成させることよりなる請求項１記載の方法。 ９．融合蛋白質を保護試薬と反応させて、保護側鎖アミノ基を有するLys残基 を含む保護融合蛋白質を形成させることよりなる請求項８記載の方法。 １０．切断工程が、融合蛋白質を切断剤と接触させて、式： を有するアミノ酸配列を含むミニ融合蛋白質を形成させることを含む請求項１記 載の方法。 １１．ミニ融合蛋白質が式： を有する請求項１０記載の方法。 １２．カルボニックアンヒドラーゼがヒト・カルボニックアンヒドラーゼＩＩ であって、切断剤が臭化シアンを含む請求項１１記載の方法。 １３．さらに、ミニ融合蛋白質をヒドロキシルアミンで切断して、式： で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを形成させることよりなる請求項１１記 載の方法。 １４．さらに、ミニ融合蛋白質を保護試薬と反応させて、保護アミノ、ヒドロ キシルまたはカルボキシ反応性側鎖基を有するアミノ酸残基を含む保護ミニ融合 蛋白質を形成させることよりなる請求項１０記載の方法。 １５．カルボニックアンヒドラーゼがヒト・カルボニックアンヒドラーゼＩＩ であり；標的配列が式： ［式中、−Ala_cはＣ−末端残基である］ で示されるアミノ酸配列を含み；かつ、 さらに、−Ala_cをｏ−ニトロフェニルグリシンアミドでペプチド転移させて第３ のペプチドを形成させ；第３のペプチドを光分解させて、式： で示されるアミノ酸配列を含む第２のペプチドを形成させることよりなる請求項 １記載の方法。 １６．切断部位がAsn−A₁₀を含み；かつ、切断工程が融合蛋白質とヒドロキシ ルアミンとを接触させることを含む請求項１５記載の方法。 １７.式： で示される配列を含む核酸配列。 １８．非−酵素的カップリング試薬存在下にて、式： ［式中、A₂はGly、SerまたはAlaであり；A₃はAsnまたはSerであり；A₈はValまた はMetであり；R²は−(ＣＨ₂)₄−または−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＨ₂Ｓ−Ｓ−であって； ＹはＯＨまたはＯＲ¹(ここに−Ｒ¹は低級アルキル基)である］ で示されるＮ−末端フラグメントを、式： ［式中、A₁₀はGlyまたはSerであり、A₁₁はLys、ThrまたはAlaであり、A₁₂はLeu またはTyrであり、A₁₃はSer、ThrまたはTrpであり、A₁₄はGln、LysまたはArgで あり、A₁₅はGlu、AspまたはAsnであり、A₁₆はLeuまたはPheであり、A₁₇はHisま たはAsnであり、A₁₈はLysまたはAsnであり、A₁₉はLeu、TyrまたはPheであり、A_{2 0} はGlnまたはHisであり、A₂₁はThrまたはArgであり、A₂₂はTyrまたはPheであり 、A₂₃はProまたはSerであり、A₂₄はArg、GlyまたはGlnであり、A₂₅はThrまたはM etであり、A₂₆はAsp、Ala、GlyまたはAsnであり、A₂₇はVal、Leu、Ile、Pheまた はThrであり、A₂₉はAla、Val、Proまたは Serであり、A₃₀はGly、ValまたはGluであり、A₃₁はThr、ValまたはAlaであって 、−Xxxは−ＯＨ、−ＮＨ₂、アミノ酸またはポリペプチド基である］ で示される組換え形成ポリペプチドと縮合させて、式： を有するカルシトニン誘導体を形成させることよりなるカルシトニンカルバ・ア ナログの製法。 １９．非−酵素的カップリング試薬が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ− ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはカルボジイミドを含む請求項１８記載の方 法。 ２０．非−酵素的カップリング試薬が、(ｉ)Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドお よびジクロロヘキシルカルボジイミド;(ｉｉ)Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドお よびＮ−エチル−Ｎ'−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド;または(ｉｉｉ) Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびジクロロヘキシルカルボジイミドを含 む請求項１８記載の方法。 ２１．非−酵素的カップリング試薬存在下にて、式： ［式中、A₂はGly、SerまたはAlaであり；A₃はAsnまたはSerであり；A₈はValまた はMetであって；ＹはＯＨまたはＯＲ¹にこに−Ｒ¹は低級アルキル基)である］ で示されるデスアミノノナペプチドを、式： ［式中、A₁₀はGlyまたはSerであり、A₁₁はLys、ThrまたはAlaであり、A₁₂はLeu またはTyrであり、A₁₃はSer、ThrまたはTrpであり、A₁₄はGln、LysまたはArgで あり、A₁₅はGlu、AspまたはAsnであり、A₁₆はLeuまたはPheであり、A₁₇はHisま たはAsnであり、A₁₈はLysまたはAsnであり、A₁₉はLeu、TyrまたはPheであり、A_{2 0} はGlnまたはHisであり、A₂₁はThrまたはArgであり、A₂₂はTyrまたはPheであり 、A₂₃はProまたはSerであり、A₂₄はArg、GlyまたはGlnであり、A₂₅はThrまたはM etであり、A₂₆はAsp、Ala、GlyまたはAsnであり、A₂₇はVal、Leu、Ile、Pheまた はThrであり、A₂₉はAla、Val、ProまたはSerであり、A₃₀はGly、ValまたはGluで あり、A₃₁はThr、ValまたはAlaであって、−Xxxは−ＯＨ、−ＮＨ₂、アミノ酸ま たはポリペプチド基である］ で示される組換え形成したポリペプチドと縮合させて、式： を有するカルシトニン誘導体を形成させることよりなるカルシトニンまたは関連 アナログの製法。