KR100959549B1 - 글루카곤 유사 펩타이드 1 glp-1(7-36)과 glp-1 유사체를 생산하는 방법 - Google Patents
글루카곤 유사 펩타이드 1 glp-1(7-36)과 glp-1 유사체를 생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(나) 엔도뉴클레아제 제한효소를 사용하여 상기 두 개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열부위에서 상기 유전자를 개열하는 단계;
(다) 벡터를 사용하여 상기 개열된 유전자를 연결하여 혼성부위와 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자 복제본을 포함하는 벡터를 형성하는 단계;
(라) 상기 (나)단계를 반복하는 단계;
(마) 상기 (다)단계에서 얻은 벡터를 사용하여 상기 (라)단계에서 얻은 개열된 유전자를 연결하여, 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 벡터를 형성하는 단계;
(바) 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계;
(사) 상기 숙주세포를 배양하여, 어떠한 운반 단백질도 함유하지 아니한 채로, GLP-1(7-36) 폴리펩타이드, GLP-1 유사체 또는 이들의 조합의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;
(아) 프로테아제를 사용하여 상기 융합 단백질을 개열시키는 단계; 그리고
(자) 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 분리하고 정제하는 단계.
(나) 엔도뉴클레아제 제한효소를 사용하여 상기 두 개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열부위에서 상기 유전자를 개열하는 단계;
(다) 벡터를 사용하여 상기 개열된 유전자를 연결하여 혼성부위와 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자 복제본을 포함하는 벡터를 형성하는 단계;
(라) 상기 (나)단계를 반복하는 단계;
(마) 상기 (다)단계에서 얻은 벡터를 사용하여 상기 (라)단계에서 얻은 개열된 유전자를 연결하여, 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 벡터를 형성하는 단계;
(바) 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계;
(사) 상기 숙주세포를 배양하여, 어떠한 운반 단백질도 함유하지 아니한 채로, GLP-1(7-36) 폴리펩타이드, GLP-1 유사체 또는 이들의 조합의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;
(아) 프로테아제를 사용하여 상기 융합 단백질을 개열시키는 단계; 그리고
(자) 상기 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 분리하고 정제하는 단계.
Claims (18)
- (가) 혼성부위를 형성할 수 있는 별도의 두 개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열부위를, 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체를 인코딩할 수 있는 유전자의 두 개의 말단에 도입하는 단계;(나) 엔도뉴클레아제 제한효소를 사용하여 상기 두 개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열부위에서 상기 유전자를 개열하는 단계;(다) 벡터를 사용하여 상기 개열된 유전자를 연결하여 혼성부위와 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체를 인코딩하는 유전자 복제본을 포함하는 벡터를 형성하는 단계;(라) 상기 (나)단계를 반복하는 단계;(마) 상기 (다)단계에서 얻은 벡터를 사용하여 상기 (라)단계에서 얻은 개열된 유전자를 연결하여, 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체를 인코딩하는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 벡터를 형성하는 단계(여기에서, N은 2 내지 32 사이의 정수);(바) 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체를 인코딩하는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계;(사) 상기 숙주세포를 배양하여, 어떠한 운반 단백질도 함유하지 아니한 채로, 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드, 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체 또는 이들의 조합의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;(아) 프로테아제를 사용하여 상기 융합 단백질을 개열시키는 단계; 그리고(자) 상기 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체를 분리하고 정제하는 단계를 포함하는, 인슐린분비성 글루카곤 유사 펩타이드-1(7-36) 폴리펩타이드, 또는 Gly8-GLP-1(7-36), Val8-GLP-1(7-36), Asp11-GLP-1(7-36), Ala16-GLP-1(7-36), Glu22-GLP-1(7-36), His23-GLP-1(7-36), Glu24-GLP-1(7-36), Trp26-GLP-1(7-36), Ala27-GLP-1(7-36), Glu30-GLP-1(7-36), Asp33-GLP-1(7-36), Glu34-GLP-1(7-36), Thr35-GLP-1(7-36), Gly8-Glu24-GLP-1(7-36), Leu8-Ala33-GLP-1(7-36), Thr36-Arg37-GLP-1(7-37) 및 Ser36-Arg37-GLP-1(7-37)로 이루어진 군으로부터 선택되는 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체를 생산하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혼성부위를 형성할 수 있는 상기 엔도뉴클레아제 제한효소가 Bgl II 및 BamH I인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 혼성부위를 형성할 수 있는 상기 엔도뉴클레아제 제한효소가 Sal I 및 Xhol I인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 (마)단계에서 얻는 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 4 내지 32의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 8 내지 32의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 16의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 32의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 벡터가 CGMCC 기탁번호 제0599호의 기탁물 속에 포함된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 폴리펩타이드의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 4 내지 32의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 폴리펩타이드의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 8내지 32의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 폴리펩타이드의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 16의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 폴리펩타이드의 복제본 N개를 포함하는 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 32의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항 내지 청구항 12항 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주세포가 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균 JM103, JM109, HB101 또는 DH5α인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CGMCC 기탁번호 제0599호에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질을 개열하는데 사용되는 상기 프로테아제가 클로스트리스판(Clostrispan) 또는 트립신(Trysin)인 것임을 특징으로 하는 방법.
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- 2004-01-20 US US10/761,717 patent/US7544512B2/en not_active Expired - Lifetime
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