KR20230016155A

KR20230016155A - 대장균을 이용한 글루카곤 호르몬 생산 시스템

Info

Publication number: KR20230016155A
Application number: KR1020220090106A
Authority: KR
Inventors: 원형식; 이기빈; 윤경현
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2023-02-01

Abstract

본 발명은 재조합 글루카곤을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면, 대장균에서 글루카곤을 포함하는 융합 단백질을 가용성으로 균질하게 생산 가능하며, 융합 태그를 효소로 제거하여 재조합 글루카곤을 안정적으로 생산할 수 있으므로, 의약품의 생산원가를 낮추고, 동위원소 표지를 통한 핵자기공명 분석 등의 다양한 연구에 활용될 수 있는 효과가 있다.

Description

대장균을 이용한 글루카곤 호르몬 생산 시스템{Recombinant glucagon production in Escherichia coli}

본 발명은 재조합 글루카곤을 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

단백질 의약품을 대신할 수 있는 유망한 치료제로서 부각되고 있는 펩타이드는 주로 다양한 화학 합성법에 의해 생산되고 있다. 하지만, 그 방법이 복잡하고 부산물이 생성되며, 생산 단가가 높다는 단점이 있다. 최근 재조합 DNA 기술의 발달로 재조합 방법으로 아미노산 50개 수준의 펩타이드 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 단백질을 합리적인 비용으로 대량 생산할 수 있게 되었다. 그러나 이러한 재조합 방법을 이용하면, 크기가 작은 일부 호르몬, 사이토카인 등과 같은 펩타이드들을 숙주 세포에서 발현시켰을 때, 숙주세포의 단백질 분해효소 등으로 인해 자연적인 형태의 펩타이드를 얻기 어렵다. 이러한 문제는 생산하려는 단백질 또는 펩타이드를 특정 단백질과의 융합 단백질로서 재조합적으로 생산함으로써 해결될 수 있다. 일반적으로, 많은 외부 단백질 및 펩타이드는 박테리아 및 동물세포 내에서 높은 발현 수율을 나타내는 유전자와, 단백질 또는 펩타이드 유전자의 융합 유전자를 이용하여 얻어지는 융합단백질의 형태로 생산된다. 이러한 융합 단백질 발현 방법은 단백질 또는 펩타이드를 높은 수준으로 발현하여 대량 생산할 수 있게 하고, 단백질 및 펩타이드의 안정성 및 수용성을 높여 주고, 융합 단백질 자체의 친화도에 의한 분리 및 정제를 가능하게 해 준다.

재조합 단백질(펩타이드 포함)은 동물, 식물, 효모, 박테리아 등에서 유래한 고부가 가치의 유전 산물을 암호화하고 있는 유전자를 발현이 용이한 숙주에 이식하여 대량의 산물이 생산될 수 있도록 유전자 조작을 거친 단백질을 지칭한다. 특히, 재조합 미생물 기술을 이용하여 유용한 재조합 단백질을 생산할 때, 유전공학 관련 기술이 보편화 되어 있고 대량 배양이 용이한 대장균이 널리 사용되고 있다.대장균에서 재조합 단백질을 생산하기 위하여 다양한 발현시스템이 현재까지 개발되었다. 그러나 숙주세포로 대장균을 이용하는 경우, 재조합 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되기 때문에 재조합 단백질의 수율이 저하되는 경우가 많으며, 특히 분자량이 10 kDa 이하의 펩타이드의 발현 시 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 재조합 단백질을 대장균에서 과다 발현 시, 응집체(inclusion body)로 알려진 불용성 구조물을 형성하는 경우가 많아 단백질을 활성형으로 되돌려야 하는 과정이 필요하다 (Marston FA, Biochem J 240(1):1-12, 1986). 대장균에서 활성형의 재조합 단백질을 고수율로 얻기 위해 유전공학 기술 및 발현조건을 최적화하는 다양한 방법이 시도되고 있으며, 정제와 목적 단백질의 접힘(folding)을 돕는 융합 파트너(fusiom partner)와의 융합 발현이 일반적으로 사용되고 있다.

한편, 글루카곤은 약물 치료 또는 질병, 호르몬이나 효소 결핍 등의 원인으로 혈당이 떨어지기 시작하면 췌장에서 생산된다. 글루카곤은 간에 신호하여 글리코겐을 분해하여 글루코스를 방출하도록 유도하고, 혈당 수준을 정상 수준까지 높이는 역할을 한다. 뿐만 아니라, 글루카곤은 혈당 상승효과 이외에 동물과 사람에서의 식욕억제 및 지방세포의 호르몬 민감성 리파제(hormone sensitive lipase)를 활성화시켜 지방 분해를 촉진 및 에너지대사(energy expenditudre)를 촉진하여 항-비만 효과를 나타냄이 보고되었다. 이러한 이유로 글루카곤은 당뇨병 환자의 중증 저혈당을 치료하기 위한 약물의 사용뿐만 아니라 새로운 기능성 약물 후보로 연구되고 있으나 (Muller TD et al. 2017), 생리학적 pH 값 근처에서 수용액에 대한 용해도가 낮고 (Chabenne JR et al. 2010), 높은 pH에서 화학적 분해가 발생하고 낮은 pH에서 피브릴이 형성된다 (Gelenter MD et al. 2019). 특히, 질병과의 연관성은 아직 밝혀지지 않았으나 낮은 pH에서 형성되는 글루카곤 피브릴은 프리온, 아밀린, 베타 아밀로이드와 같은 병리학적 피브릴과 유사한 구조를 형성하므로 글루카곤 피브릴에 대한 구조적 연구가 중요하므로 (Haya K et al. 2020), 피브릴 형성 모델 시스템으로 연구되고 있다 (Pedersen JS 2010). 단백질 및 펩타이드의 구조 연구에는 ¹⁵N 및 ¹³C 동위원소 표지 시료를 이용한 이핵(heteronuclear) 핵자기공명(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)법이 유용하게 사용될 수 있는데, 이를 위해서는 동위원소를 표지하여 생산할 수 있는 재조합 생산법이 필요하다.

본 발명의 목적은 글루카곤을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 융합 태그, 글루카곤 또는 이의 유사체, 및 글루카곤 또는 이의 유사체와 융합태그를 연결시켜주는 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

아울러, 본 발명은 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 대장균에서 글루카곤을 포함하는 융합 단백질을 가용성으로 균질하게 생산 가능하며, 융합 태그를 효소로 제거하여 재조합 글루카곤을 안정적으로 생산할 수 있으므로, 의약품의 생산원가를 낮추고 이핵 핵자기공명 (heteronuclear NMR) 측정을 가능하게 함으로써 다양한 연구에 활용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 MBP-Glucagon 형태의 융합 단백질의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 TRX-Glucagon 형태의 융합 단백질의 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 TRX-글루카곤 융합 단백질의 정제를 확인한 도이다;
A: Ni²⁺ 친화 컬럼으로 정제한 융합 단백질;
B: HiTrap QHP 컬럼으로 정제한 융합 단백질; 및
C: Superdex 75 컬럼 (Hiload 16/600)으로 정제한 융합 단백질.
도 4는 MBP-글루카곤 융합 단백질의 정제를 확인한 도이다;
A: MBP 친화 컬럼으로 정제한 융합 단백질; 및
B: Superdex 75 컬럼 (Hiload 16/600)으로 정제한 융합 단백질.
도 5는 정제된 TRX-글루카곤 융합 단백질에 엔테로카이네이즈를 처리한 결과를 나타낸 도이다:
A: 정제된 TRX-글루카곤 융합 단백질에 엔테로카이네이즈를 처리한 결과; 및
B: 정제된 TRX 대조군 (pET32a)에 엔테로카이네이즈를 처리한 결과.
도 6은 정제된 MBP-글루카곤 융합 단백질에서 MBP 태그를 factorXa로 절단/제거한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 MBP 태그를 제거하고 Superdex 75 컬럼을 이용한 GPC(겔 침투 크로마토그래피)로 정제하여 (A), 웨스턴 블롯 분석으로 클루카곤을 확인 (B)한 도이다.
도 8은 정제된 재조합 글루카곤의 순도를 분석한 도이다:
A: GPC 정제한 본 발명의 재조합 글루카곤의 순도;
B: 3k Amicon tube를 이용하여 여과된 재조합 글루카곤의 순도; 및
C: 역상 크로마토그래피로 추가 정제한 재조합 글루카곤의 순도.
도 9는 재조합 글루카곤의 분자량을 MALDI-Mass로 확인한 도이다:
A: pH 2.0 조건에서 보관된 글루카곤; 및
B: pH 8.0 조건에서 보관된 글루카곤.
도 10은 ¹³C 및 ¹⁵N으로 동위원소 표지하여 생산한 재조합 글루카곤을 이용하여 측정한 NMR 스펙트럼이다:
A: [¹H-¹⁵N] HSQC 스펙트럼; 및
B: 4 가지의 서로 다른 triple resonance 스펙트럼.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:

알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.

일 측면에서, 본 발명은 융합 태그, 글루카곤(Glucagon) 또는 이의 유사체, 및 글루카곤 또는 이의 유사체와 융합태그를 연결시켜주는 링커(linker)를 포함하는, 융합 폴리펩타이드를 제공한다.

일 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 융합 태그, 링커 및 글루카곤이 순차적으로 연결될 수 있다.

일 구현예에서, 융합 태그는 글루카곤 또는 이의 유사체의 N-말단에 위치할 수 있으며, TRX(Thioredoxin protein) 또는 말토스 결합 단백질(Maltose-binding protein, MBP)일 수 있으나, 말토스 결합 단백질인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 링커는 프로테이즈 인식 서열을 포함할 수 있고, 프로테이즈 인식 서열은 상기 링커의 C-말단에 위치할 수 있다.

일 구현예에서, 프로테이즈 인식 서열은 담배 식각 바이러스 프로테이즈 인식 서열, 트립신 인식 서열, 트롬빈 인식 서열, TEV 프로테이즈 인식 서열, PreScission 프로테이즈 인식 서열, 엔테로카이네이즈 인식 서열, 유비퀴틴 가수분해 효소 인식 서열, factorXa 프로테이즈 인식 서열, 퓨린 인식 서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, factorXa 프로테이즈 인식 서열인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, factorXa 프로테이즈 인식 서열은 서열번호 7의 아미노산을 포함할 수 있으며, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

일 구현예에서, 말토스 결합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

일 구현예에서, 글루카곤(Glucagon)은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

일 구현예에서, 링커는 서열번호 9의 아미노산 서열인 "NSSSNNNNNNNNNNLGLER"을 포함할 수 있으며, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 MBP-링커-글루카곤의 융합 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

일 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 S 태그, His 태그 또는 c-Myc 태그를 추가로 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드, 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.

일 구현예에서, 숙주세포는 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속(Salmonellae sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 속(Proteus sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.)의 박테리아일 수 있으며, 에스케리치아 속의 Escherichia coli인 것이 융합 폴리펩타이드의 대량 생산에 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 말토스 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 4), 글루카곤을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 6) 및 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 factorXa 프로테이즈 인식 서열을 코딩하는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 T7 프로모터를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 pCold1 벡터 또는 pET28a 벡터일 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 박테리아인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.) 박테리아인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).

일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 융합 폴리펩타이드를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명에서, 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) 융합 태그, 글루카곤 또는 이의 유사체, 및 글루카곤 또는 이의 유사체와 융합태그를 연결시켜주는 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계; (c) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; (d) 상기 숙주세포에서 발현된 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계; (e) 정제된 융합 폴리펩타이드에서 융합 태그를 절단하는 단계; 및 (f) 글루카곤 또는 이의 유사체를 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 단계 (d)의 정제는 MBP 친화 컬럼, 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 또는 Ni²⁺ 친화 컬럼으로 수행될 수 있고, 단계 (e)의 융합 태그 절단은 factorXa 프로테이즈를 이용하여 수행될 수 있으며, 단계 (f)의 정제는 GPC(Gel Permiation Chromatography)를 이용하여 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단계 (f) 이후에 추가로 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 추가로 정제하는 단계는 원심분리 여과(centrifugal filter) 또는 역상 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 방법으로 생산된 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체는 산성 조건에서 피브릴(fibrils)을 형성할 수 있으며, 산성 조건은 pH2 내지 4일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 방법으로 생산된 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체는 프리온, 아밀린 또는 베타 아밀로이드와 같은 병리학적 피브릴과 유사한 구조를 가지므로, 이를 β-시트 피브릴(β-sheet fibrils) 형성과 관련된 질병 연구 용도로 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 방법으로 생산된 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체는 생산 단계에서 동위원소 표지가 가능하며, 동위원소 표지된 시료에 NMR 기술을 적용하여 단백질의 구조 연구 용도로 사용할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 융합 단백질 제작

글루카곤은 매우 불안정하며, 중성 pH에서 불용성이고 산성 조건에서는 원섬유를 형성하며 염기성 조건에서는 화학적 분해가 일어나므로, 대장균에서 이를 발현시키고 용해도를 향상시키고 이의 정제를 용이하게 하기 위해, 대장균에서 글루카곤의 발현 동안 봉입체 형성 및 응집을 방지하기 위한 태그로서 말토스 결합 단백질(Maltose-binding protein, MBP) (서열번호 3)를 글루카곤 (서열번호 5)과 융합하였고, MBP 태그를 제거할 수 있도록, MBP 태그와 글루카곤 사이에 "NSSSNNNNNNNNNNLGLER" 링커 (서열번호 9) 및 factorXa 프로테아제의 절단 부위 (서열번호 7)를 포함하는 융합 단백질(융합 폴리펩타이드)을 제작하였다. 구체적으로, 도 2의 TRX-글루카곤 벡터 (한국기초과학지원연구원 이영호 박사 제공)를 주형으로 하여, 글루카곤 코딩서열 (서열번호 6: stop codon 포함 90개 뉴클레오티드)의 처음 5개 서열(CATAG)을 제외한 6번째부터 90번째까지의 서열을 PCR로 증폭하였고, 이를 위한 forward 프라이머(5'-GGAATTC CATATG CCAGGGCACCTTTAC-3')에는 Nde1 절단 부위(CATATG)가 포함되었으며, reverse 프라이머(5'-CCG CTCGAG CGGTTAGGTATTCATCAG-3')에는 Xho1 절단 부위(CTCGAG)가 포함되었다. 증폭한 DNA를, Factor-Xa 인식서열을 가지고 있는 pCold-1 벡터의 Nde1-Xho1 사이에 삽입한 뒤, Nde1 절단부위 서열 CATATG를 CATAG로 결손(deletion) 돌연변이함으로써 Nde1 인식 서열을 제거함과 동시에 완전한 글루카곤 코딩서열이 완성되도록 하였다. 돌연변이된 플라스미드에서 Factor-Xa 인식 부위 서열 (서열번호 8)부터 이어지는 글루카곤 코딩 서열 (서열번호 6) 까지를 다시 PCR로 증폭한 뒤, MBP-linker 코딩 서열을 가지고 있는 pCold-1-Mv 플라스미드 (Hyun J-W et al., Process Biochem. 111:87-94, 2021)의 Xho1-BamH1 사이 지역에 삽입하고, pCold-1-Mv 플라스미드에 존재하던 FactorXa 인식 서열을 돌연변이시켜 제거함으로써, 최종적으로 MBP-Linker-Glucagon 형태의 융합 단백질 (서열번호 1)을 발현하는 플라스미드를 제작하였다 (도 1).

실시예 2. 융합 단백질의 발현 및 정제

2-1. TRX-Glucagon

도 2의 TRX(Thioredoxin protein)-글루카곤 벡터를 E.coli BL21(DE3) 균주에 형질전환한 뒤 OD₆₀₀ 값이 0.5~0.7에 도달할 때까지 배양하고 15℃에서 1 M IPTG를 처리하여 발현을 유도하였다. 발현 유도 하룻밤 후, 8000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 파쇄 버퍼 (50 mM Tris, pH 7.4)에 재부유하였다. 세포를 초음파 처리하여 파쇄하고 10000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 0.22 ㎛ 시린지 필터 (ADVANTEC)로 여과하였다. 그 후 상등액을 Ni²⁺ 친화 컬럼 (도 3A), HiTrap QHP 컬럼 (도 3B) 및 Superdex 75 컬럼 (도 3C)으로 순차적으로 정제하고, TRX-글루카곤 융합 단백질을 포함하는 시료를 12% 글리신 젤에서 분석하였다. 그 결과 도 3C에서와 같이 최종적으로 Trx-glucagon이 정제되었다.

2-2. MBP-Glucagon

상기 실시예 1에서 제작한 MBP-Linker-Glucagon (Linker: factorXa 프로테아제의 절단 부위 포함) 형태의 융합 단백질을 발현하는 도 1의 벡터로 E.coli BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)한 뒤 OD₆₀₀ 값이 0.6~0.8에 도달할 때까지 배양하고 15℃에서 1 M IPTG를 처리하여 발현을 유도하였다. 발현 유도 24시간 후, 8000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 파쇄 버퍼 (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0)에 재부유하였다. 세포를 초음파 처리하여 파쇄하고 10000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 상등액을 0.22 ㎛ 시린지 필터 (ADVANTEC)로 여과하고 MBP Trap HP (GE Healthcare) 컬럼을 이용한 MBP 친화도 크로마토그래피(도 4A)와 Superdex 75 컬럼을 이용한 GPC (겔 침투 크로마토그래피)법(도 4B)을 순차적으로 수행함으로써, MBP-글루카곤 융합 단백질이 정제되었다.

실시예 3. 태그 제거

3-1. TRX-Glucagon

엔테로카이네이즈(Enterokinase) 프로테이즈를 이용하여 상기 실시예 2-1에서 정제된 TRX-글루카곤 (T-G)의 TRX 태그 절단을 수행하였다. 엔테로카이네이즈 프로테이즈는 50 ㎕의 반응 버퍼 (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ pH 7.4)와 함께 100 ㎍ TRX-글루카곤 당 0.001 유닛으로 21℃에서 반응시켰다. 반응 시간별로 샘플링하여 태그 절단 정도를 15% 트리신(tricine) 젤 상에서 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 글루카곤으로 예측되는 3.5 kDa 사이즈 부근에 밴드가 나타나지 않았으며, 절단이 두 개로 일어나는 것으로 확인되었다 (도 5A). 이에, 다양한 방법으로 절단 조건을 변경하였으나, 두 개로 절단되는 결과가 나타났고, 대조군으로써 pET32a 벡터의 TRX 컨스트럭트를 동일한 조건으로 정제 및 절단한 경우 (ctrl)에도 동일한 패턴을 나타냈다 (도 5B). 따라서, TRX가 엔테로카이네이즈에 의해 비특이적으로 절단된 것을 알 수 있으며, 글루카곤을 엔테로카이네이즈로 처리하면 불안정한 것을 알 수 있었다.

3-2. MBP-Glucagon

factorXa 프로테이즈를 이용하여 상기 실시예 2-2에서 정제된 MBP-글루카곤의 MBP 태그 절단을 수행하였다. factorXa 프로테이즈는 반응 버퍼 (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0)와 함께 50μM MBP-글루카곤 1 ㎖ 당 1 유닛(unit)으로 23℃에서 반응시켰다. 반응 시간별로 샘플링하여 태그 절단 정도를 15% 트리신(tricine) 젤 상에서 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, 45 kDa 및 5 kDa 크기 위치에 밴드가 관찰되었으며 (도 6), 이를 통해, factorXa가 MBP-글루카곤 융합 단백질을 시간에 비례하여 절단하며, 글루카곤을 파괴하지 않고 MBP 태그를 절단하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, Trx-글루카곤 (실시예 3-1)과 달리, MBP-글루카곤은 tag이 제거된 재조합 글루카곤을 생산하는 데에 적합한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 태그 제거된 글루카곤 확인

상기 실시예 3-2에서 MBP 태그를 제거한 글루카곤을 GPC(Gel Permiation Chromatography)로 정제하고 (도 7A) 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, 글루카곤 항체가 상기 정제된 글루카곤에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났으며, 이는 농도 의존적으로 증가하였다 (도 7B). 따라서, 상기 실시예 3-2의 방법에 의해 MBP 태그가 제거된 저분자량 산물이 글루카곤임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 추가적인 고순도 정제

5-1. 순도 확인

GPC로 정제한 글루카곤의 순도를 역상 크로마토그래피(Reverse phase chromatography)로 확인하고 추가적인 고순도 정제 과정을 진행하였다. 구체적으로, 역상 크로마토그래피는 SunFire C18 column (Waters)를 이용하여 수행되었으며, A 버퍼 (DW, 0.05% TFA) 및 B 버퍼 (Acetonitrile, 0.05% TFA)를 이동상으로 이용하였다. 농도구배 조건 하에서, 시작 농도는 95% a 및 5% b로 시작하였고, 30분 후 최종 농도는 10% a 및 90% b이였으며, 유속은 1.5 ㎖/min으로 설정하였다. 그 결과, 시료의 순도는 70.7%이고 머무름 시간(retention time)은 20.00 min이었다 (도 8A).

5-2. 추가 정제

GPC로 정제된 글루카곤 용액을 3k Amicon tube (Millipore)를 이용한 원심분리 여과(centrifugal filter)함으로써 저분자량 불순물을 제거한 뒤 역상 크로마토그래피로 확인한 결과, 순도는 92.6%로 나타났고 머무름 시간은 20.13 min로 나타났다 (도 8B). 20.13 min 용출액을 따로 모음으로써 최종 정제된 글루카곤 용액을 분석한 결과 순도는 97.5%로 나타났고 머무름 시간은 20.01 min로 나타났다 (도 8C).

실시예 6. 재조합 글루카곤의 질량 확인

실시예 5에서 정제한 글루카곤을 MALDI-Mass를 이용하여 단백질의 분자량(molecular weight)을 확인하였다. 구체적으로, MALDI-Mass는 UltrafleXtreme (Bruker)를 이용하여 수행하였고, MS 검출 범위(Detection range): 500-5000, 표준(standard): 고질량 표준(High Mass standard) (sigma), Matrix: CHCA, SA 및 Reflector, 및 선형 양이온 모드(Linear positive ion mode)의 조건으로 설정하였으며, pH 2.0 또는 pH 8.0에서 보관된 시료를 이용하였고 ZipTip C4, C18로 탈염하였다. 그 결과, pH 2.0의 버퍼에서 보관된 재조합 글루카곤의 질량은 3482.323 Da로 나타났으며 (도 9A), pH 8.0의 버퍼에서 보관된 재조합 글루카곤의 질량은 3482.536 Da로 나타났다 (도 9B). 공지된 글루카곤의 분자량은 3482 내지 3485 Da이므로 본 발명의 방법으로 발현 및 정제하고 MBP를 제거한 재조합 글루카곤이 글루카곤이 맞는 것으로 확인되었다.

실시예 7. 재조합 글루카곤의 동위원소 표지 및 서열 확인

실시예 2-2의 세포 배양 과정에서, MBP-글루카곤 벡터를 포함하는 세포를 [¹⁵N] 암모늄 클로라이드 및 [¹³C] 글루코스가 각각 유일한 질소와 탄소 공급원으로 보충된 M9 최소 배지에서 배양함으로써 [¹⁵N/¹³C] 이중 동위원소 표지된 MBP-글루카곤 단백질을 생산한 뒤, 실시예 2-2, 3-2, 4, 및 5의 과정으로 MBP 태그가 제거된 글루카곤을 정제하여 핵자기공명(NMR) 측정을 수행한 결과, 2차원 ¹⁵N-HSQC (heteronuclear single quantum coherence) (도 10A) 및 triple resonance 스펙트럼 (도 10B)에서 뚜렷한 신호과 관측되어, 동위원소 표지가 잘 되었음을 확인하였다. Triple resonance를 바탕으로 ¹³C chemical shift 연결성을 이용하여 backbone NMR assignments를 수행한 결과, ¹⁵N-HSQC 상의 각 피크들을 해당 아미노산 잔기에 할당할 수 있었고, 이를 통해 생산된 펩타이드의 서열이 글루카곤과 일치함을 확인하였다 (도 10A).

Claims

융합 태그, 글루카곤(Glucagon) 또는 이의 유사체, 및 글루카곤 또는 이의 유사체와 융합태그를 연결시켜주는 링커를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
제 1항에 있어서, 융합 태그는 글루카곤 또는 이의 유사체의 N-말단에 위치하는, 융합 폴리펩타이드.
제 2항에 있어서, 융합 태그는 말토스 결합 단백질(Maltose-binding protein, MBP)인, 융합 폴리펩타이드.
제 1항에 있어서, 링커는 프로테이즈 인식 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
제 4항에 있어서, 프로테이즈 인식 서열은 상기 링커의 C-말단에 위치하는, 융합 폴리펩타이드.
제 4항에 있어서, 프로테이즈 인식 서열은 담배 식각 바이러스 프로테이즈 인식 서열, 트립신 인식 서열, 트롬빈 인식 서열, TEV 프로테이즈 인식 서열, PreScission 프로테이즈 인식 서열, 엔테로카이네이즈 인식 서열, 유비퀴틴 가수분해 효소 인식 서열, factorXa 프로테이즈 인식 서열, 퓨린 인식 서열 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 폴리펩타이드.
제 1항에 있어서, 링커는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
제 1항의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드.
제 8항의 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제 9항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
제 10항에 있어서, 숙주세포는 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속(Salmonellae sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 속(Proteus sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.)의 박테리아인, 숙주세포.
(a) 융합 태그, 글루카곤 또는 이의 유사체, 및 글루카곤 또는 이의 유사체와 융합태그를 연결시켜주는 링커를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 벡터를 숙주세포에 형질도입하는 단계;
(c) 상기 숙주세포를 배양하는 단계;
(d) 상기 숙주세포에서 발현된 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계;
(e) 정제된 융합 폴리펩타이드에서 융합 태그를 절단하는 단계; 및
(f) 글루카곤 또는 이의 유사체를 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법.
제 12항에 있어서, 단계 (d)의 정제는 MBP 친화 컬럼, 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 또는 Ni²⁺ 친화 컬럼으로 수행되는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법.
제 12항에 있어서, 단계 (e)의 융합 태그 절단은 factorXa 프로테이즈를 이용하여 수행되는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법.
제 12항에 있어서, 단계 (f)의 정제는 GPC(Gel Permeation Chromatography)를 이용하여 수행되는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법.
제 12항에 있어서, 단계 (f) 이후에 추가로 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법.
제 16항에 있어서, 추가로 정제하는 단계는 원심분리 여과(centrifugal filter) 또는 역상 크로마토그래피를 이용하여 수행되는, 재조합 글루카곤 또는 이의 유사체의 생산 방법.