CN107586330B

CN107586330B - 替度鲁肽串联多肽及替度鲁肽制备方法

Info

Publication number: CN107586330B
Application number: CN201610537328.6A
Authority: CN
Inventors: 许俊; 路建光; 黄宗庆; 姜旖旎; 郭新昆
Original assignee: Shanghai Duomirui Biotechnology Co ltd; Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Duomirui Biological Technology Co ltd
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2036-07-08
Also published as: CN107586330A

Abstract

本发明提供了一种替度鲁肽串联多肽，所述替度鲁肽串联多肽包含两个或更多个替度鲁肽多肽通过接头肽连接而成，在接头处包含酸切和酶切位点。本发明还提供了包含所述替度鲁肽串联多肽序列的质粒及宿主细胞，以及使用所述替度鲁肽串联多肽制备替度鲁肽的方法。

Description

替度鲁肽串联多肽及替度鲁肽制备方法

技术领域

本发明涉及替度鲁肽串联多肽，包含所述替度鲁肽串联多肽序列的质粒及宿主细胞，以及制备替度鲁肽的方法。

背景技术

GLP-2由33个氨基酸组成，是胰高血糖素原经过酶切得到的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复，用于治疗短肠综合症。但是天然的GLP-2半衰期短，易被DPPIV水解。替度鲁肽是GLP-2的N端Ala²被替代成Gly²，丙氨酸被替代以后，使得半衰期延长。

中国专利CN1244872A公布了替度鲁肽及其类似物的固相合成制备方法。对固相合成较长的多肽而言，无论是通过顺序偶联还是片段偶联方法，都存在合成成本高、环境污染大、且易产生缺失肽和各种异构体杂质。这些杂质在后期纯化中很难去除，也是影响收率的重要因素。专利CN1244872A公布的制备方法总收率为13％。而专利104045707A公开了一种替度鲁肽纯化方法，其收率为20％。由此可见，目前尚缺乏一种高收率的替度鲁肽制备方法。

中国专利CN103159848A公开了GLP-2二串体蛋白及制备方法。它涉及利用重组技术直接制备GLP-2二聚体蛋白，并且在二聚体蛋白中保留有两个小的氨基酸残基Gly-Ser接头，并不是用来生产替度鲁肽。

综上所述，目前尚缺乏一种高效制备替度鲁肽的方法。

发明简述

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种高效生产替度鲁肽的方法，具体而言，本发明的方法是通过重组表达含有一系列串联替度鲁肽结构的蛋白质来实现。本发明所述的方法可以使得替度鲁肽的产率提高25～60％。与其它以融合蛋白形式表达多肽的方式相比，该方法能明显提高目的多肽在总蛋白中的比例，降低“废弃”蛋白的比例，从而提高生物转化率和目的多肽产量。

目标蛋白质的氨基酸组成结构通式为：C₁₉₇H₃₀₇N₅₀O₇₂S₂(C₁₉₇H₃₀₅N₅₀O₇₂S₁)_n，其中n＝1～9等。

氨基酸序列(SEQ ID NO:10)为：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n，其中n＝1～9等。

后文用ted2、ted5和ted10代替n＝1、n＝4和n＝9。本文优选n＝1，n＝4，n＝9，更优选n＝4。ted是基于人的GLP-2蛋白序列。

根据本申请的一个方面，本申请提供了一种替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述替度鲁肽串联多肽包含两个或更多个替度鲁肽多肽通过接头肽连接而成，在接头处包含酸切和酶切位点。

根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽串联多肽经过酸切和酶切后，生成替度鲁肽分子。

根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽串联多肽的氨基酸组成结构通式为：C₁₉₇H₃₀₇N₅₀O₇₂S₂(C₁₉₇H₃₀₅N₅₀O₇₂S₁)_n，其中n＝1～9。

根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽串联多肽的氨基酸序列为MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n，其中n＝1～9。

根据本申请的某些实施方式，所述n＝1，4或者9。

根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽串联多肽包含与BKT的相同性为至少约70％的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述酸切位点是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、或醋酸/HCl进行酸切的位点。

根据本申请的某些实施方式，所述酸切位点是使用醋酸/HCl进行酸切的位点天冬氨酸-脯氨酸连接(D-P键)。

根据本申请的某些实施方式，所述酶切位点是使用肠激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶进行酶切的位点。

根据本申请的某些实施方式，所述酶切位点是使用肠激酶进行酶切的位点DDDDK。

根据本申请的一个方面，本申请提供了一种包含如权利要求1-10中任一项所述的替度鲁肽串联多肽的序列的表达载体。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是在大肠杆菌中表达的载体。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是pET28a。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含Ted2，Ted5或Ted10的序列。

根据本申请的一个方面，本申请提供了一种包含所述的表达载体的大肠杆菌。

根据本申请的一个方面，本申请提供了一种使用如权利要求1-10中任一项所述的替度鲁肽串联多肽在宿主细胞中表达替度鲁肽串联多肽的方法。

根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是大肠杆菌。

根据本申请的某些实施方式，所述大肠杆菌是BL21。

根据本申请的一个方面，本申请提供了一种使用如权利要求1-10中任一项所述的替度鲁肽串联多肽制备替度鲁肽的方法，所述方法包括：

构建包含所述替度鲁肽串联多肽序列的表达载体；

将所述表达载体在宿主细胞中表达；

将所得的表达产物进行酸切和酶切处理；

分离纯化以获得替度鲁肽。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是pET28a

根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是大肠杆菌。

根据本申请的某些实施方式，所述将所述表达载体在宿主细胞中表达包括将所述表达载体转化进入大肠杆菌。

根据本申请的某些实施方式，所述酸切是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、或醋酸/HCl进行。

根据本申请的某些实施方式，所述酸切是使用50％醋酸/HCl进行。

根据本申请的某些实施方式，所述酶切是使用肠激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶进行。

根据本申请的某些实施方式，所述酶切是使用肠激酶进行。

根据本申请的某些实施方式，所述分离纯化是通过HPLC进行。

根据本申请的某些实施方式，所述方法包括：(a)将菌体加入含(或不含)TritonX-100的水溶液，通过加热使表达产物释放出来；(b)采用沉淀的方法对表达产物进行粗分离，粗分离产品为沉淀；(c)粗分离产品经过先高温酸切，去除酸溶液，用酶切反应缓冲液溶解后加肠激酶酶切；或先用肠激酶酶切，去除酶切反应缓冲液后高温酸切获得替度鲁肽粗品；(d)替度鲁肽粗品上样于反相层析介质，用含TFA的乙腈溶液洗脱，采用色谱分析，收集并合并含替度鲁肽的洗脱液；(e)取上述步骤中的合并液，去除TFA和(或)有机溶剂；(f)干燥，即得替度鲁肽

根据本申请的一个方面，本申请提供了所述替度鲁肽串联多肽在制备治疗肠道疾病的药物中的应用。

附图说明

图1显示了pGHn的质粒图谱；

图2显示了pET-28a的质粒图谱；

图3显示了ted2、ted5和ted10的SDS-PAGE电泳结果；和

图4显示了替度鲁肽的HPLC分析结果。

发明详述

除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。

定义

胰高血糖素样肽2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)是肠上皮特异性生长因子，包含33个氨基酸。GLP-2有多种作用，例如促进小肠生长，保护肠粘膜，增加食欲，抑制细胞凋亡等。因此临床上使用GLP-2治疗小肠短小综合症，以及其他的肠道疾病，例如结肠炎等。天然的GLP-2半衰期很短(一般小于5min)，容易被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ)水解而失活。

替度鲁肽(Teduglutide，Ted)是GLP-2类似物，是将GLP-2多肽链上N端的第2位的Ala²替换成Gly²，使得在某正程度上掩盖了DPP-Ⅳ酶切的位点。由于丙氨酸被替代以后，使得替度鲁肽的半衰期延长，半衰期一般可达到1.5-2小时。Ted是基于人的GLP-2序列，但是把第2位的Ala²替换成Gly²。

替度鲁肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为：

His¹-Gly²-Asp³-Gly⁴-Ser⁵-Phe⁶-Ser⁷-Asp⁸-Glu⁹-Met¹⁰-Asn¹¹-Thr¹²-Ile¹³-Leu¹⁴-Asp¹⁵-Asn¹⁶-Leu¹⁷-Ala¹⁸-Ala¹⁹-Arg²⁰-Asp²¹-Phe²²-Ile²³-Asn²⁴-Trp²⁵-Leu²⁶-Ile²⁷-Gln²⁸-Thr²⁹-Lys³⁰-Ile³¹-Thr³²-Asp³³。

替度鲁肽可以通过大肠杆菌重组表达获得，这样不仅能提高产量，降低成本，还能避免产生难去除的异构体杂质。但是小分子多肽在大肠杆菌中表达易被水解，通常的解决方案是多肽和一段大分子融合表达，这种表达策略目标多肽的占比较低。通过设计特异性酶切位点或酸切位点，经过酶切和/或酸切将大分子融合蛋白去除。

最初是在牛谷氨酸脱氢酶氨基酸序列分析中发现D-P键在酸性条件下不稳定(M.Landon,M.D.Melamed和E.L.Smith,J.Biol.Chem.246,2360.1971)。此外D-P键在自然界中很少，这也有利于它作为工具，因为在切割反应中不需要考虑目标分子因含此键而断裂。Piszkiewicz等(D.Piszkiewicz,M.Landon和E.L.Smith,Biochem.Biophys.Res.Commun.40,1173.1970)证明了D-P键在温和的酸性条件下，当温度升高时能特异性断裂。Piszkiewicz在实验中考察了不同的底物浓度(0.5～10mg/ml)，不同的酸(甲酸、醋酸、盐酸)以及酸浓度和反应时间及反应温度。由于反应过程中会产生其他肽键的非特异性断裂，因而不同的蛋白有不同的反应条件，这需要通过实验摸索。D-P键断裂的特异性以及反应条件简单，已被应用于兔抗体轻链(K.J.Fraser,K.Poulsen和E.Haber,Biochemistry.11,4974.1972)、马奶溶菌酶(J.Jauregui-Adell和J.Marti,Anal.Biochem.69,468.1975)、马铃薯羧肽酶抑制剂(G.M.Hass,H.Nau,K.Biemann,D.T.Grahn,L.H.Ericsson和H.Neurath,Biochemistry.14,1334.1975)、烟草花叶病毒蛋白(J.Jauregui-Adell和J.Marti,Anal.Biochem.69,468.1975)等的序列分析。Hermann Gram等(Nature Biotechnology杂志，1994,12,1017～1023)公开了一种重组人甲状旁腺激素的制备方法，它是将gp55蛋白与重组人甲状旁腺激素融合，在二者之间引入Asp-Pro-Pro序列，首先利用酸将Asp-Pro之间的酰胺键断裂，然后利用重组表达的DPPⅣ酶将N末端的Pro-Pro切除,但该研究只涉及重组人甲状旁腺激素单体的表达和制备。

就酶而言，肠激酶因为能高度识别DDDDK序列而被广泛使用于基因工程中融合蛋白的切割并已在多数药用蛋白的大规模生产中应用，如白介素1(IL-1)、人生长因子(GH)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(tPA)。和所有的酶切反应一样，为了减少酶切反应中出现的非特异性切割，同样需要优化酶切反应条件，包括温度、pH、酶浓度和底物浓度等。

在本发明的某些实施方式中，所述替度鲁肽在大肠杆菌中重组表达。在本发明的某些实施方式中，所述替度鲁肽在大肠杆菌BL21中重组表达。在本发明的某些实施方式中，所述替度鲁肽也可以在真核细胞中重组表达，例如SF9。在本发明的某些实施方式中，所述替度鲁肽也可以在哺乳动物细胞中重组表达，例如HEK293细胞、HeLa细胞等。

在本发明的某些实施方式中，所述方法通过重组表达含有一系列替度鲁肽串联的蛋白质来实现。在本发明的某些实施方式中，本发明的串联是把两个或更多个替度鲁肽多肽通过接头连接而成，在接头处设置酸切和酶切位点。在本发明的某些实施方式中，本发明的串联是把两个或更多个替度鲁肽多肽通过接头首尾顺序连接而成，在接头处设置酸切和酶切位点。

目标蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)为：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n

其中n＝1～9等，例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8或9。本申请中，优选n＝1，n＝4，n＝9，更优选n＝4。

在本申请的优选实施方式中，使用ted2来表示n＝1时的串联替度鲁肽。n＝1时，串联替度鲁肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)为：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。

在本申请的优选实施方式中，使用ted5来表示n＝4时的串联替度鲁肽。n＝4时，串联替度鲁肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)为：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)₄。

在本申请的优选实施方式中，使用ted10来表示n＝9时的串联替度鲁肽。n＝9时，串联替度鲁肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)为：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)₉。

“修饰”是指对天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列进行一种或多种改变。所述修饰包括在蛋白的N末端或C末端加入多肽序列，在蛋白的N末端或C末端删除一段氨基酸序列，或者在不改变蛋白功能的情况下蛋白序列中的一种或多种氨基酸取代、插入、重复或缺失等，例如将甘氨酸取代为丙氨酸。

“突变”是指天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列发生改变，包括但不限于单个碱基改变所引起的点突变，或者多个碱基的缺失、重复和插入。“突变蛋白”又称为“突变体蛋白”或“蛋白突变体”是指序列中包含突变的蛋白。突变可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于体外定点诱变、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。

本申请的某些实施方式中，可以对替度鲁肽的氨基酸序列进行修饰或者突变而不改变替度鲁肽的活性。

“嵌合蛋白”又称为“融合蛋白”，是指通过DNA重组技术获得的将两个或多个基因重组后表达的蛋白。“截短蛋白”又称为“截短体蛋白”或“蛋白截短体”，是指通过DNA重组技术，特异性表达蛋白中一个或多个片段的蛋白。“蛋白结构域”是蛋白分子中具有相对特定的结构和相对独立的功能的区域。嵌合蛋白、融合蛋白或蛋白结构域可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于PCR扩增和重组、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。

根据本申请的某些实施方式，可以将替度鲁肽序列与其他蛋白质连接组成“嵌合蛋白”。

“相同性”是指两个或多个核酸或多肽序列按照本领域常用的计算方法(例如BLASTN或BLASTP或本领域已知的其他方法)进行比较或比对时，相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。“高度同源”是指与靶标核苷酸序列或氨基酸序列比较，相同性为至少约70％的核苷酸序列或氨基酸序列，例如相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。

根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽包含与替度鲁肽高度同源的序列。根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽包含与替度鲁肽序列的相同性为至少约70％的序列，例如相同性为至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或100％。

根据本申请的某些实施方式，所述替度鲁肽的核苷酸序列包含由于遗传密码的简并性而衍生的序列。

“聚合酶链反应”缩写为PCR，指通过酶促合成来扩增特异核酸序列的体外方法。“引物”指可以与靶标核酸序列杂交，从而生成在合适条件下DNA合成起始位点的寡核苷酸。这种引物可用于PCR扩增反应或DNA测序。“下游”指在核苷酸序列3’的核苷酸序列。“上游”指在核苷酸序列5’的核苷酸序列。术语“限制性内切核酸酶”或者“限制性酶”，指可以结合双链DNA，并且剪切特异DNA序列的酶。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是NcoⅠ和EcoRⅠ。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是XhoⅠ。

“宿主细胞”又称“受体细胞”，是使用分子生物方法转化核酸片段时，接受被转化核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是原核细胞，包括但不限于大肠杆菌。根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是大肠杆菌。根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是大肠杆菌BL21。根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是真核细胞，例如SF9。在本发明的某些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如HEK293细胞、HeLa细胞等。

“载体”指在基因操作过程中，用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞的运载工具。根据本申请的某些实施方式，所述载体是用于基因克隆的载体。根据本申请的某些实施方式，所述载体是用于基因克隆的载体pGH。

术语“表达载体”指能表达所插入的核酸序列的载体或质粒。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是大肠杆菌表达载体。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是大肠杆菌表达载体pET28a。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是真核细胞表达载体，例如pcDNA3.1。

“选择标记”指可以根据标记的基因来用于选择的鉴定因子。选择标记通常是抗生素或化学抗性基因。本领域已知并使用的选择标记基因的示例包括但不限于：青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、G418等基因。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含抗生素抗性基因。

“转化”指将核酸片段转移到宿主生物中的分子生物学过程。经转化后包含核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物或“转化”的生物。载体可以通过本领域已知的转化方法转移到宿主生物中。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是大肠杆菌。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是真核细胞。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电转化法、化学介导法等本领域已知的方法。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法是电转化法。

本申请所用术语“酸切”是指在酸性条件下，切断肽链中的某些连接。根据本申请的某些实施方式，所述酸切是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、或醋酸/HCl，优选使用50％醋酸/HCl。根据本申请的某些实施方式，所述酸切是使用醋酸含60mmol/L HCl溶液切断肽链中的天冬氨酸-脯氨酸连接(D-P键)。

本申请所用术语“酶切”是指使用酶来切断肽链中的某些连接。所述酶切是使用肠激酶。根据本申请的某些实施方式，所述酶切位点是肠激酶位点DDDDK序列，所述肠激酶的酶切位点是在赖氨酸的C末端。根据本申请的某些实施方式，所述酶切是使用本领域已知的其他的酶，例如木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶等。在本申请的某些实施方式中，所述酶切位点是本领域已知的其他酶的酶切位点，例如木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶等的酶切位点。

根据本申请的实施方式，酸切和酶切的先后顺序可以调整。根据本申请的实施方式，所述替度鲁肽串联多肽可以先经过酸切，再经过酶切。根据本申请的实施方式，所述替度鲁肽串联多肽可以先经过酶切，再经过酸切。

根据本申请的实施方式，所述替度鲁肽串联多肽经过酸切和/或酶切后，生成替度鲁肽分子。根据本申请的实施方式，所述替度鲁肽串联多肽经过酸切和/或酶切后，生成游离的替度鲁肽分子。

替度鲁肽是一种天然存在的人胰高血糖素肽-2(GLP-2)的类似物，远端小肠L-细胞分泌的多肽。已知GLP-2增加小肠和门静脉血流，和抑制胃酸分泌。替度鲁肽与位于小肠肠内分泌细胞，皮下肌纤维母细胞和肠道黏膜下和肌间神经丛的神经元亚群胰高血糖素肽-2受体结合。激活这些受体导致多种介质包括胰岛素样生长因子(IGF)-1，一氧化氮和角质细胞生长因子(KGF)的局部释放。

替度鲁肽适用为治疗有短肠综合征(SBS)依赖肠外支持的成年患者。

本发明提供的制备方法包括如下步骤：(a)菌体加含(或不含)Triton X-100的水溶液，通过加热使表达产物释放出来；(b)采用沉淀的方法对表达产物进行粗分离，粗分离产品为沉淀；(c)粗分离产品经过先高温酸切，去除酸溶液，用酶切反应缓冲液溶解后加肠激酶酶切或先用肠激酶酶切，去除酶切反应缓冲液后高温酸切获得替度鲁肽粗品；(d)替度鲁肽粗品上样于反相层析介质，用含TFA的乙腈溶液洗脱，采用色谱分析，收集并合并含替度鲁肽的洗脱液；(e)取上述步骤中的合并液，去除TFA和(或)有机溶剂；(f)干燥，即得替度鲁肽。

一种优选的制备方法包括如下步骤：(a)菌体加含(或不含)Triton X-100的水溶液，通过加热使表达产物释放出来；(b)采用等电点沉淀的方法对表达产物进行粗分离，粗分离产品为沉淀；(c)粗分离产品先用盐酸或(和)醋酸高温酸切，等电点沉淀去除酸溶液，用酶切反应缓冲液溶解后加肠激酶酶切或先用肠激酶酶切，等电点沉淀去除酶切反应缓冲液后加盐酸或(和)醋酸高温酸切获得替度鲁肽粗品；(d)替度鲁肽粗品上样于已处理好的反相层析介质，用含TFA的乙腈溶液洗脱，采用色谱分析，收集并合并含替度鲁肽的洗脱液；(e)取上述步骤中的合并液，为去除TFA和乙腈可以先使用减压蒸馏再调等电点沉淀，经过洗涤去除残留TFA，若仅为去除乙腈可以单独使用减压蒸馏；(f)采用常规干燥技术，如真空干燥，把上述得到的替度鲁肽溶液干燥，即得到替度鲁肽。

本发明所提供的制备方法，其中步骤(a)中的Triton X-100的浓度为0、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％，优选0.5％。加热时的温度一般在60-75℃，例如60-70℃、60-65℃、65-75℃、70-75℃，优选65-70℃。水浴时间为2-10min，例如2-5min、5-10min，优选水浴时间为4min、5min或6min。表达产物以可溶形式释放出来。

步骤(b)中所说的沉淀方法可以是等电点沉淀，盐析，有机溶剂沉淀等蛋白沉淀方法。本发明所使用的等电点沉淀是用盐酸调pH至5.0后，部分杂蛋白沉淀，而表达产物存在于上清中，从而达到粗分离效果。用盐酸调pH至3.0-4.0，例如3.0-3.5或3.5-4.0，优选pH为3.5，通过离心(4000×g)得到沉淀。

步骤(c)中粗分离产品可用无机酸和/或有机酸，如盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、甲酸、三氟乙酸等、醋酸/盐酸、醋酸/硫酸、醋酸/磷酸、醋酸/三氟乙酸；其中优选盐酸、硫酸、磷酸、醋酸/盐酸、醋酸/硫酸、醋酸/磷酸；其中优选20-200mM盐酸、20-200mM硫酸、20-200mM磷酸、10～60％醋酸/20-200mM盐酸、10～60％醋酸/20-200mM硫酸、10～60％醋酸/20-200mM磷酸。

样品溶解后加热至40-90℃，例如40-80℃、40-70℃、40-60℃、40-50℃、50-90℃、50-80℃、60-90℃、60-80℃、60-70℃、70-90℃、70-80℃、或80-90℃，优选50-70℃，更优选50-60℃。

酸切结束后用NaOH调pH至3.0-4.0(例如3.0-3.5或3.5-4.0)，沉淀，pH优选为3.5。离心(4000×g)得到的沉淀用酶切反应缓冲液溶解，酶切反应缓冲液为50mM Tris，1mMCaCl₂，pH6.0-9.0，优选为pH7.0-pH8.0的缓冲液，反应温度为15-37℃，例如15-30℃、15-28℃、15-25℃、15-20℃、20-37℃、20-30℃、20-28℃、20-25℃、25-37℃、25-30℃、25-28℃、28-37℃、28-30℃、30-37℃，优选20-28℃，更优选18℃、19℃、20℃、21℃或22℃。反应结束后调pH至3.0-4.0沉淀，例如3.0-3.5或3.5-4.0，pH优选为3.5。本发明所使用的肠激酶(在25-35℃(优选30℃)条件下，每分钟产生1μg 7-37所需要的酶量为1IU)由本实验室制备所得。或粗分离产品先用酶切反应缓冲液溶解，酶切反应结束后，加盐酸调pH至3.0-4.0沉淀，例如3.0-3.5或3.5-4.0，pH优选为3.5，沉淀再用酸溶解进行高温酸切，所选溶液以及反应条件参考前述内容。

步骤(d)中选用的反相层析介质为以二氧化硅(硅胶)或聚合物为骨架的反相层析介质，反相硅胶可由链长在C₁-C₃₀(C₄、C₈和C₁₈最为常见)的直链烷烃基或其它疏水配基(如苯基或氰基)衍生而来，以聚合物为骨架的反相层析介质，通常指以聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架并键合苯基的反相层析介质

步骤(e)中的等电点沉淀用NaOH调pH至3.0-4.0沉淀，例如3.0-3.5或3.5-4.0，pH优选为3.5。

步骤(f)中的常规干燥技术为生化产品常用的干燥技术如喷雾干燥、真空干燥及低温冷冻干燥等。

缩写：

Ted：替度鲁肽(teduglutide)

Ted5：5个重复替度鲁肽

Ted10：10个重复替度鲁肽

PCR反应：聚合酶链式反应

BL21：大肠杆菌B株大肠杆菌BL21(DE3)

IPTG：异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

TFA：三氟乙酸(trifluoroacetic acid)。

在本申请中当“约”用于修饰某个数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。

除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。

具体实施方式

本申请描述了优选的实施方式和实施例，本领域技术人员在阅读本申请的基础上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请包括法律允许范围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。

实施例

下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是为了举例说明的目的，不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

优化例1：酸切条件优化

本实施例中针对Ted5进行酸切条件的优化。

Ted5的沉淀按6％(w/v)配置成均一的混悬水溶液，分别考察60mM HCl、30mMH₂SO₄、30mM H₃PO₄、50％醋酸/60mM HCl、50％醋酸/30mM H₂SO₄和50％醋酸/30mM H₃PO₄的酸切效果，60℃酸切11h，结果如下表所示，其中产量以酸切后溶液经HPLC分析后的峰面积表示：

酸种类	产物纯度	产量(峰面积)
			60mM HCl	36.9％	19837642
30mM H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	31.5％	15471642
			30mM H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>	38.2％	14694533
50％醋酸/60mM HCl	45.4％	25173342
			50％醋酸/30mM H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	41.7％	23004218
50％醋酸/30mM H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>	40.2％	22183912

由上表中可以看出，含50％醋酸的60mM HCl的酸切效果较佳。

上述样品考察50％醋酸/30mM HCl、50％醋酸/60mM HCl、50％醋酸/90mM HCl、50％醋酸/120mM HCl和50％醋酸/150mM HCl对酸切效果的影响，60℃酸切11h，结果如下表：

不同盐酸浓度	产物纯度	产量(峰面积)
			50％醋酸/30mM HCl	51.4％	23910322
50％醋酸/60mM HCl	45.4％	25173342
			50％醋酸/90mM HCl	42.5％	26356874
50％醋酸/120mM HCl	35.1％	27273452
			50％醋酸/150mM HCl	32.6％	26591816

可以看出，含50％醋酸的30～90mM HCl的酸切效果较佳，优选60mM HCl。

沉淀按6％(w/v)配置成均一的混悬水溶液，在50％醋酸/60mM HCl的条件下，考察40℃、50℃、60℃和70℃对酸切效果的影响，结果如下表：

可以看出，当温度为40～70℃时，酸切反应均可进行。当温度为50～60℃时，产物产量较高，纯度相对较高。

优化例2：酶切条件优化

本实施例中针对Ted5进行酶切条件的优化。

Ted5的沉淀用50mM Tris,1mM CaCl₂溶解，浓度为3mg/ml，用HCl调pH，考察pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0对酶切效果的影响，按1mg底物加1.5IU肠激酶，28℃反应。结果如下表：

pH	反应时间	产物纯度	产量(峰面积)
				6.0	10h	62.2％	13612254
7.0	10h	59.7％	15495641
				7.5	10h	52.1％	17537854
8.0	10h	47.3％	16943214
				9.0	10h	42.5％	14834073

当pH为6.0～9.0时，酶切反应均可进行。当pH为7.0～8.0时，产物产量和纯度较高。pH为6时，反应速度较慢。

沉淀用50mM Tris、1mM CaCl₂、pH8.0溶解，浓度为3mg/ml，按1mg底物加1IU肠激酶，考察不同温度对酶切效果的影响。结果如下表所示：

温度	时间	产物纯度	产量(峰面积)
				37℃	6h	53.4％	15101487
28℃	12h	59.8％	15191145
				20℃	19h	62.3％	15432396

由上表得到，温度降低反应速度变慢，但产品纯度提高，本发明的实验中优选使用20～28℃。

实施例1：Ted2的质粒构建

本实施例构建包含Ted2的表达载体。本实施例中，使用大肠杆菌表达载体pET28a。

根据Ted的氨基酸序列，设计成Ted2的DNA序列，并在5’端和3’端分别含有NcoⅠ和EcoRⅠ的限制性酶切位点。Ted2的DNA序列送上海捷瑞生物工程有限公司合成，连接在pGHn质粒(上海捷瑞生物工程有限公司)上，即pGH-Ted2。编码Ted2的DNA序列用下述引物扩增：

5’-CACACAGGAAACAGCTATGACCATG-3’SEQ ID NO:6

5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’SEQ ID NO:7

使用来自北京全式金生物技术有限公司的EasyPfu DNA聚合酶(产品货号：AP211-01)进行常规PCR反应。Ted2片段从NcoⅠ和EcoRⅠ位点被引入大肠杆菌表达载体pET28a(Novagen公司，货号：69864-3)中。通过测序确认质粒pET28a-Ted2的序列。然后把质粒pET28a-Ted2电转化入BL21中。

Ted2的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD

实施例2：Ted5的质粒构建

本实施例构建包含Ted5的表达载体。本实施例中，使用大肠杆菌表达载体pET28a。

根据Ted的氨基酸序列，设计成Ted5的DNA序列，并在5’端和3’端分别含有NcoⅠ和EcoRⅠ的限制性酶切位点。Ted5的DNA序列送上海捷瑞生物工程有限公司合成，连接在pGH质粒上，即pGH-Ted5。编码Ted5的DNA序列用下述引物扩增：

5’-CACACAGGAAACAGCTATGACCATG-3’SEQ ID NO:6

5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’SEQ ID NO:7

使用来自北京全式金生物技术有限公司的EasyPfu DNA聚合酶进行常规PCR反应。Ted5片段从NcoⅠ和EcoRⅠ位点被引入载体pET28a(Novagen公司，货号：69864-3)中。通过测序确认质粒pET28a-Ted5的序列。然后把质粒pET28a-Ted5电转化入BL21中。

Ted5的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD

实施例3：Ted10的质粒构建

以质粒pGH-Ted5为模板，分别扩增Ted10的左边Ted5和右边Ted5。编码Ted10的DNA序列用下述引物扩增：

左边Ted5和右边Ted5的引物SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6都含有XhoⅠ限制性酶切位点。使用来自北京全式金生物技术有限公司的EasyPfu DNA聚合酶进行常规PCR反应。左边Ted5片段从NcoⅠ和XhoⅠ位点，右边Ted5片段从XhoⅠ和EcoRⅠ位点共同被引入载体pET28a(Novagen)中。通过测序确认质粒pET28a-Ted10的序列。然后把质粒pET28a-Ted10电转化入BL21中。

Ted10的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDPGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD

实施例4：发酵

本实施例是将实施例1-3中获得的质粒pET28a-Ted2、pET28a-Ted5或pET28a-Ted10的大肠杆菌进行发酵培养。

3L发酵培养基成分为：甘油90g，酵母提取物30g，蛋白胨48g，磷酸氢二钾32.88g，磷酸二氢钠10.32g，氯化钠1.5g，氯化钾3g，硫酸铵9g。补料为50％甘油(v/v)。121℃灭菌30min。冷却后将已灭菌的20ml 0.63mol/L硫酸镁，20ml 0.15mol/L氯化钙在无菌条件下加入培养基中。

发酵罐为磁力搅拌发酵罐5BG-900(上海保兴生物有限公司)，发酵的初始条件为：温度37℃，空气通量为3L/min，pH约为7.0(6.8～7.3)，转速为300rpm。

将300ml种子液，OD₆₀₀为3，在无菌条件下接入发酵罐中。发酵开始，通过调整转速和罐压保持溶氧不低于20％，pH通过2N硫酸和50％氨水调节，加消泡剂消泡。OD₆₀₀达到40时，补加50％甘油，控制溶氧在20％以上。OD₆₀₀达到90时，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L。

发酵36h后结束，5000rpm离心20min，收集菌体。-20℃保存。

实施例5：菌体破胞和样品处理

本实施例是将实施例4中获得的大肠杆菌菌体进行破胞处理。

按每克菌体加10mL溶液(含0.5％Triton X-100的水溶液)，将菌体混悬。菌体混悬液加热至70℃(65-75℃)，持续搅拌5min。离心(4000×g，10min)收集上清。

上清用6N HCl调pH至5.0，离心(4000×g，10min)收集上清。上清继续用6N HCl调pH3.5(3.0-4.0)，离心(4000×g，10min)收集沉淀。

将上述实施例1-3中获得的Ted2、Ted5、Ted10分别进行SDS-PAGE电泳验证，结果示于图3。由图3可以看出，所获得的ted5(左)、ted10(中)和ted2(右)在SDS-PAGE电泳结果上显示了正确的分子量。

实施例6-1：先酸切后酶切反应

本实施例是将实施例5中获得的沉淀物先进行酸切，再进行酶切处理。本实施例中所述酸切是使用50％醋酸含60mmol/L HCl溶液，所述酶切是使用肠激酶。本申请的实施方式中，酸切和酶切的先后顺序可以调整。

沉淀按3％(w/v)加入酸切溶液(50％醋酸含60mmol/L HCl)混匀溶解，60℃水浴24h后结束。加去离子水稀释3倍后用5N NaOH调pH至3.5沉淀，离心(4000×g，10min)收集沉淀。

沉淀用50mM Tris,1mM CaCl₂，pH8.0溶解，浓度为3mg/ml，按1mg底物加1.5IU肠激酶，20℃反应8h结束。用6N HCl调pH至3.5沉淀，离心(4000×g，10min)收集沉淀。

实施例6-2：先酶切后酸切反应

本实施例是将实施例5中获得的沉淀物先进行酶切，再进行酸切处理。本实施例中所述酶切是使用肠激酶，所述酸切是使用50％醋酸含60mmol/L HCl溶液。本申请的实施方式中，酸切和酶切的先后顺序可以调整。

实施例7：替度鲁肽的制备

本实施例是使用HPLC分离从实施例6中获得的沉淀物，以制备替度鲁肽。

沉淀在50℃条件下溶于50％醋酸，制成每mL含50mg的溶液，上色谱柱分离，分离条件如下：

色谱柱：C₁₈SunFire Prep OBD(10μm)；19×150mm，购自美国WATERS公司；

柱体积(CV)：42.5mL；

流速：10.0mL/min；

洗脱条件：用含10％-30％乙腈的水溶液(含0.1％TFA)梯度洗脱3CV，再用30％-50％乙腈的水溶液(含0.1％TFA)梯度洗脱20CV。

上样量：10ml

收集：5mL/管。

收集样品的分析及处理：用分析型HPLC分析(流动相A：0.1％TFA/水，流动相B：0.1％/乙腈)，合并纯度为98％以上的洗脱液，进行减压蒸馏除去乙腈后，低温冷冻干燥即得。替度鲁肽的HPLC分析图谱见图4，图4中的AU表示吸光度单位。

质谱分析所获得的替度鲁肽分子量为3751.79，与理论值相符。

当n＝2、4、9时，通过以上方法制备替度鲁肽，总收率分别为25％，32％，28％。收率是根据最终得到的产量和包涵体所含替度鲁肽的理论产量的比值所得到。专利104045707A公开的替度鲁肽纯化方法中，收率为20％。与现有技术的报道相比，本发明所述的方法可以使得替度鲁肽的产率提高25～60％。

以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。

Claims

1.一种替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述替度鲁肽串联多肽包含两个或更多个替度鲁肽多肽通过接头肽连接而成，在接头处包含酸切和酶切位点；所述替度鲁肽串联多肽的氨基酸序列为MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n，所述n＝1，4或者9；

所述酸切位点是天冬氨酸-脯氨酸连接D-P键；所述酶切位点是DDDDK。

2.根据权利要求1所述的替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述替度鲁肽串联多肽的氨基酸组成结构通式为：C₁₉₇H₃₀₇N₅₀O₇₂S₂(C₁₉₇H₃₀₅N₅₀O₇₂S₁)_n，其中n＝1，4或者9。

3.根据权利要求1所述的替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述酸切位点是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸进行酸切的位点。

4.根据权利要求1所述的替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述酶切位点是使用肠激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶进行酶切的位点。

5.一种包含表达如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽的核苷酸序列的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是在大肠杆菌中表达的载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是pET28a。

8.一种包含如权利要求5-7中任一项所述的表达载体的大肠杆菌。

9.一种使用表达如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽的核苷酸序列在宿主细胞中表达替度鲁肽串联多肽的方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是BL21。

12.一种使用如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽制备替度鲁肽的方法，所述方法包括：

构建包含如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽序列的表达载体；

将所述表达载体在宿主细胞中表达，所述宿主细胞是大肠杆菌，所述表达载体是在大肠杆菌中表达的载体；

将所得的表达产物进行酸切和酶切处理，其中所述酸切是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸；所述酶切是使用肠激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶进行；

分离纯化以获得替度鲁肽，通过HPLC进行分离。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酸切是使用50％醋酸/HCl进行；所述酶切是使用肠激酶进行。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)将菌体加入含或不含Triton X-100的水溶液，通过加热使表达产物释放出来；(b)采用沉淀的方法对表达产物进行粗分离，粗分离产品为沉淀；(c)粗分离产品经过先高温酸切，去除酸溶液，用酶切反应缓冲液溶解后加肠激酶酶切；或先用肠激酶酶切，去除酶切反应缓冲液后高温酸切获得替度鲁肽粗品；(d)替度鲁肽粗品上样于反相层析介质，用含TFA的乙腈溶液洗脱，采用色谱分析，收集并合并含替度鲁肽的洗脱液；(e)取上述步骤中的合并的洗脱液，去除TFA和/或有机溶剂；(f)干燥，即得替度鲁肽。