KR20040097114A - 글루카곤 유사 펩타이드 1 glp-1(7-36)과 glp-1 유사체를 생산하는 방법 - Google Patents

글루카곤 유사 펩타이드 1 glp-1(7-36)과 glp-1 유사체를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한줄로 유전자를 연결시킴으로써 글루카곤 유사 펩타이드 1 GLP-1(7-36)과 GLP-1 유사체를 생산하는 방법에 관한 발명이다. 또한 이러한 방법에 의해 생산된 재조합 폴리펩타이드에 관한 발명이다. 본 발명에 있어서, GLP-1(7-36)및/또는 GLP-1 유사체의 1 내지 32개의 복제가 한줄로 발현될 수 있다. 바람직한 폴리펩타이드는 융합 단백질의 개열와 분리, 정제과정을 거친후에 얻어질 수 있다. 본 발명은 비용을 크게 줄이면서 재조합 GLP-1(7-36)및/또는 GLP-1 유사체를 대량으로 생산하는 것을 가능하게 한다.

Description

글루카곤 유사 펩타이드 1 GLP-1(7-36)과 GLP-1 유사체를 생산하는 방법{A Method of Producing Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)7-36 And An GLP-1 Analogue}
GLP-1(글루카곤 같은 펩타이드-1 )은 인간의 장세포에 의해 분비되는 펩타이드 호르몬이고, 이것은 프로테이즈를 생산하는 L-세포에 의해 프로글루카곤의 단백질가수분해(proteolytic) 개열(cleavage)로부터 생겨나며, 그래서 글루카곤 같은 펩타이드-1으로 명명되었다. 다방면의 연구는 GLP-1의 외인성 조절이 인슐린 분비 효과를 자극시켜 준다고 알려주었다. 예를 들어, 혈액 글루코스가 6mmol/L을 넘어서면, GLP-1이 매우 낮은 농도가 되어도 인슐린 분비를 증가 시키는데 상당한 역할을 할 수 있다. 한번 혈액 글루코스가 정상 수준으로 저장되면, GLP-1의 추가는인슐린 분비에 더 이상 어떤 효과도 보일 수 없다.
GLP-1은 현재 인간의 몸 안에서 두 가지 형태로 존재하는데, 그중 하나는 아미드화된 C-말단을 가지고 30개의 아미노산 잔기로 구성된 GLP-1(7-36)-NH2이다. 다른 하나는 31개의 아미노산 잔기로 구성된 GLP-1(7-37)이다. 두 GLP-1(7-36)-NH2와 GLP-1(7-37)은 인슐린 분비에 강한 상승효과를 가져올 수 있다. GLP-1(7-36)-NH2의 상승효과에 관해서는, GLP-1(7-36)-OH 펩타이드(이후부터 GLP-1(7-36)이라 한다)가 인슐린 분비에 비슷한 상승효과를 가지기 때문에, C-말단의 아미드화가 필수적으로 요구 되지는 않는다고 발견되었다.
지금까지의 연구는 GLP-1가 타입 II 당뇨병의 치료에 인슐린보다 효과적이라는 사실을 보여주고 있다. 왜냐하면 GLP-1이 1) 프로인슐린 유전자의 전사와 번역의 규칙성을 증가 시켜주고, 2) 인슐린과 C-펩타이드 분비를 촉진 시켜주고, 3) 세포성 인슐린 수용기의 민감성을 촉진시켜주고, 4) ß-세포 수를 증가 시킬 수 있기 때문이다. 더욱이, GLP-1은 1) 인슐린에 대한 저항성, 2) 글리코헤모글로빈(HbAlc)과 프럭토사민, 글루카곤, 지방산의 양을 낮게 하거나 감소시킬 수 있다. (Nielsen J.H., et al., 호르몬과 성장인자에 의해 베타-세포의 질량 조절, Diabetes, 50, suppl.,1:S25-9, 2001; Hui H., et al., 글루카곤 같은 펩타이드 1은 인슐린 분비 세포속으로 랑게르한스섬 십이지장의 homobox-1-positive 판크레아틴 도관 세포의 분화를 유도한다. Diabetes, 50(4):785-96,2001)
더욱 두드러지게, GLP-1은 β-세포의 분할을 강화시키고, 그로 인해 β-세포수를 증가시킬 수 있는 것으로 관찰되었는데, 이것은 지금까지 당뇨병 치료에 사용된 어떤 다른 약에서도 발견되지 않은 것이다. 게다가, GLP-1은 술포닐루레아(sulfonylurea)를 사용한 치료법에도 성공하지 못한 환자들에게 효과적이다. 더욱이, 혈중 글루코스의 농도가 정상수준일 때에는 GLP-1의 조절이 인슐린 분비를 강화하지 못한다. 그러므로 이것은 저혈당증을 유발하지는 않는다. 위에서 언급한 모든 이유들로 인해, GLP-1은 당뇨병 치료에 있어서 바람직한 약물로 간주된다. 이것은 신뢰할 만한 의학 연구에 의해서도 입증된 바 있다.(Rachman J., et al., NIDDM 환자에게 글루카곤과 같은 펩타이드 1(7-36)아마이드의 하루 주입에 의한 글루코스에 인슐린 반응의 정상화., Diabetes, 45(11),:1524-30, 1996; Doyle M.E., et al., 글루카곤 같은 펩타이드 1, 호름몬 분야에서 최근의 발전, 56:377-99,2001;Daniel J Drucker, Minireview: 글루카곤과 같은 펩타이드,Endocrinology,142(2):521-527,2001)
그러나, GLP-1의 화학적 합성 비용은 매우 높다. 시약 GLP-1의 소매가는 $400/mg이고, 이것은 임상실험을 크게 제약하는 요소가 된다. 일부 실험자는 합성 단백질 또는 분비 단백질중 하나로써 재조합 GLP-1을 생산하기 위해 유전학적인 기술방법을 사용하려고 시도해왔다. 그러나 아직 GLP-1을 생산하기 위한 이러한 방법의 결과물과 비용이 만족스럽지 못하기 때문에 이 단계에서는 가장 낮은 비용에서 대량으로 GLP-1을 만들어 내고 있다. 본 발명은 한줄로 유전자를 연결시킴으로써 GLP-1(7-36)및/또는 GLP-1 유사체를 생산하는 일반적인 방법을 개선 하고자 함이다. 본 방법 발명은 더 낮은 비용을 위해 생산과정을 단순화 시키는데 사용되어질 수 있고, 그로 인해 GLP-1(7-36)및/또는 GLP-1를 대량으로 생산하는 것을 가능하게 한다.
이 발명은 유전자를 한줄로 연결시킴으로서 글루카곤과 같은 펩타이드 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 글루카곤과 같은 펩타이드-1 유사체를 생산하는 방법이다. 또한 이 방법에 의해 생산되는 재조합 폴리펩타이드에 대한 것이다. GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체의 외인성 투여를 통해 인슐린 분비를 자극할 수 있다.
도 1은 GLP-1(7-36)폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 하나의 복제본을 포함하는 발현 벡터를 만드는 과정을 나타내고 있다.
도 2는 구성요소 (1), (2), (3)과 (4)의 연결 후에 GLP-1(7-36)폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열 결과를 나타낸다.
도 3은 구성요소 (1‘), (2’), (3‘)과 (4’)의 연결 후에 GLP-1(7-36)폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열 결과를 나타낸다.
도 4는 나란한 GLP-1(7-36) 유전자 2개에서 32개의 복제본을 포함하는 플라스미드를 만드는 과정을 나타낸다.
도 5는 발효과정 동안 일반적으로 작용하는 박테리아 세포의 성장곡선을 나타낸다.
도 6은 재조합 GLP-1(7-36)폴리펩타이드의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 GLP-1(7-36)폴리펩타이드의 아미노산 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 GLP-1(7-36)폴리펩타이드의 질량 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 쥐에 GLP-1(7-36)폴리펩타이드를 주입한 후 쥐 혈액속의 인슐린 농도 변화를 나타낸다.
도 10은 쥐에 GLP-1(7-36)폴리펩타이드를 주입한 후 쥐 혈액속의 C-펩타이드 농도 변화를 나타낸다.
도 11은 쥐에 GLP-1(7-36)폴리펩타이드를 주입한 후 쥐 혈액속의 글루코스 농도 변화를 나타낸다.
본 발명은 다음과 같은 과정을 포함하여 인슐리노트로픽(insulinotropic) GLP-1(7-36) 폴리펩타이드와 GLP-1 유사체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
(가) GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩할 수 있는 유전자 두 말단에 혼성 부위을 형성할 수 있는 별도의 두개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열 부위을 근접시키는 과정;
(나) 제한효소 엔도뉴클레아제를 세절시킨 후에 혼성 부위을 형성하기 위해서 접합성 있는 말단을 연결 시키는 과정과, 일련으로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자, GLP-1 유사체 유전자, 또는 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드나 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자와 상호 연관된 벡터 N 복제으로 클로닝 하는 과정, 여기서 N은 1에서 32까지 정수이다.;
(다) 숙주 세포로 일련의 연관된 유전자를 포함하는 벡터를 전이하는 과정;
(라) 1내지 32까지 정수인 폴리펩타이드 N 하나의 복제본을 포함하는 복합 단백질을 숙주세포로 발현시키는 과정으로, 여기서 복합 단백질은 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드, GLP-1 유사체 또는 이들의 조합을 포함하지만, 어떤 캐리어 단백질을 포함하지는 않는다.;
(마) 합성 단백질을 개열하는 과정;
(바) GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 및/또는 GLP-1 유사체를 분리하고 정화하는 과정;
위에서 언급한 혼합물을 형성할 수 있는 두 개의 제한적인 엔도뉴클레아제는, 여기에 제한되는 것은 아니지만, Bgl Ⅱ와 BamH Ⅰ, Sal과 Xho Ⅰ을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 벡터는 일련의 연관과 또는 GLP-1(7-36) 유전자 및/또는 GLP-1 유사체 유전자가 상호적으로 연관된 N을 포함할 수 있는데, 여기서 N은 1부터 32까지의 정수이고, 정확하게 N은 8부터 32까지의 정수이며, 더 정확하게 하자면, N은 16이나 32가 되어야 한다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 숙주 세포는 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드및/또는 GLP-1 유사체의 N 복제본을 포함하는 혼합 단백질을 표현할 수도 있는데, 여기서 N은 1부터 32까지의 정수이다. 혼합 단백질은 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드나 GLP-1 유사체의 N 복제본을 포함할 수도 있다. 또한 그것은 합계 복제 수가 N과 같은 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드와 GLP-1 유사체 두개의 복합 복제본을 포함할 수도 있다. 정확하게는 N이 8부터 32까지의 정수이다. 더 정확하게 하자면, N은 16이나 32이다.
정확하게 말하자면, 본 발명에서 GLP-1(7-36)과 GLP-1 유사체를 표현하는 숙주 세포는 원핵생물 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 산출된 GLP-1(7-36)과 GLP-1 유사체의 폴리펩타이드와 관련이 있다.
본 발명의 방법에 의해 산출된 GLP-1(7-36) 펩타이드는 다음 식Ⅰ에서 보여지는 아미노산 서열을 가지고 있다.
7 10 15 20
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu
22 25 30 35 36
Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg_OH_
(식 1) (서열번호 1)
본 발명은 한줄로 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자의 복합 복제본을 연결 시키기 위해서 혼성부위를 표시하는 미세한 DNA 서열을 보여준다. 결과적으로 일련으로 연결되거나 상호 링크된 DNA 파편의 발현은 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체 복합 복제본을 포함하는 복합 단백질을 만들어 낼 수 있다. 복합 단백질의 개열과 정화과정 후에, 많은 양의 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체를 얻을 수 있을 것이다.
본 발명의 GLP-1(7-36)은 식 I에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 가지고 있다. “GLP-1 유사체”는 식 I에서 보여진 서열이나 GLP-1(7-37)폴리펩타이드를 자연스럽게 만드는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 변형, 치환, 수정에 의해 얻어질 수 있는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해서 사용된다.
이전의 연구는 많은 GLP-1 유사체가 인슐린 분비를 상승 시키는데 있어서 유사한 특성을 가진다는 것을 보여주고 있다. GLP-1 유사체의 전형은 US 5,545,618과 WO 01/98331에서 나타난 것을 포함한다. 이러한 유사체들은 8,11,12,16,22,23,24,26,27,30,33,34 또는 35번 위치에서 자연발생적으로 생겨나는 GLP-1(7-37)OH 폴리펩타이드 내에 하나 또는 그이상의 아미노산 잔기를 변형 시킴으로써 얻어진다. GLP-1 유사체의 전형은, 제한되지 않지만,
Gly8-GLP-1(7-36), Val8-GLP-1(7-36), Asp11-GLP-1(7-36), Ala16-GLP-1(7-36), Glu22-GLP-1(7-36), His23-GLP-1(7-36), Glu24-GLP-1(7-36), Trp26-GLP-1(7-36),
Ala27-GLP-1(7-36), Glu30-GLP-1(7-36), Asp33-GLP-1(7-36), Glu34-GLP-1(7-36), Thr35-GLP-1(7-36), Gly8-Glu24-GLP-1(7-36), Leu8-Ala33-GLP-1(7-36), Thr36-Arg37-GLP-1(7-37), Ser36-Arg37-GLP-1(7-37) 등을 포함할 수 있다.
오히려, 본 발명의 GLP-1 유사체는 보존치환된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 더욱이, 이들 GLP-1 유사체은 고도의 보존치환된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
“보존치환”은 같은 전기부호를 가지고 대략 같은 크기와 형태를 가진 아미노산의 대체를 말한다.
“고도의 보존치환”은 한쪽 사슬에 같은 작용기를 가지며 거의 같은 크기와형태를 가진 또다른 아미노산과 아미노산의 대체를 말한다. 예를 들어, 지방성 또는 치환된 지방성 사슬을 가진 아미노산은 그것들의 사슬에 탄소와 이형원자의 전체수가 두개 이하로 차이가 날 때 거의 같은 크기를 가진다. 그것들은 한쪽 사슬에 같은 수의 가지를 가질때 거의 같은 모양을 가진다. 고도의 보존치환 예는 루신의 발린, 세린의 뜨레오닌, 글루타민산의 아스파르트산, 페닐알라닌의 페닐글라이신 이다. 고도의 보존치환이 아닌 예는, 발린의 알라닌, 세린의 알라닌과 세린의 아스파르트산 이다.
그러므로, 본 발명은 인슐리노트로픽을 가지는 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 및/또는 GLP-1 유사체를 생산하는 방법에 관련된 것으로 아래의 과정을 포함한다.
(a) GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1 유사체를 인코딩할 수 있는 유전자 두 말단에 혼성 부위을 형성할 수 있는 두 개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열 부위을 근접시키는 과정;
(b) 제한적인 분해효소를 분해시킨 후에 혼성 부위을 형성하기 위해서 접합성 있는 말단을 연결 시키는 과정과, 일련으로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자, GLP-1 유사체 유전자, 또는 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드나 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자와 상호 연관된 벡터 N 복제본으로 클로닝 하는 과정, 여기서 N은 1에서 32까지 정수이다.;
(c) 숙주 세포로 일련의 연관된 유전자를 포함하는 벡터를 전이하는 과정;
(d) 1에서 32까지 정수인 폴리펩타이드 N 복제본을 포함하는 복합 단백질을숙주세포로 발현시키는 과정인데, 여기서 복합 단백질은 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드, GLP-1 유사체 또는 이들의 조합을 포함하지만, 어떤 캐리어 단백질을 포함하지는 않는다.;
(e) 합성 단백질을 개열하는 과정;
(f) GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 및/또는 GLP-1 유사체를 분리하고 정화하는 과정;
“혼성부위”를 형성하기 위해 사용될 수 있는 두가지의 제한적인 엔도뉴클레아제는, 이에 제한 되는 것은 아니지만, Bgl II와 BamH I, Sal과 Xho I을 포함할 수 있다. 예를 들어, Bgl II에 의해 인지되는 기본 서열은 AGA TCT이고, 반면에 BamH I 에 의해 인지되는 것은 GGA TCC 이다. 부합하는 제한 효소로 두 서열을 분해시킨 후에, 결과적으로 상보적으로 접합 말단의 연결은 AGA TCC 또는 GGA TCT 서열을 형성할 수 있으며, 이것은 Bgl II나 BamH I에 의해서 나누어질 수 없다. 이런 부위는 한줄로 어떤 유전자 복합 복제본을 연결 시키는데 사용되어질 수 있기 때문에 “혼성 부위”라고 불리어 진다.
본 발명의 복합 단백질은 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체 복합 복제본을 포함한다. 두개의 연관된 펩타이드(두개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드, 두개의 GLP-1 유사체 펩타이드, 또는 하나의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드과 하나의 GLP-1 유사체 펩타이드)사이에는, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 있다. 개열을 위해서는 각각의 이상적인 폴리펩타이드(GLP-1(7-36)와 GLP-1 유사체)의 N-말단과 위에서 언급한 잔기 사이에 형성된 펩타이드 결합은 “특별하게 개열할 수 있는 펩타이드 결합”이어야 한다.
여기서 사용되는 “특별하게 개열할 수 있는 펩타이드 결합”이란 어떤 화학 반응물이나 단백질 분해효소에 의해 특별하게 인지되고 개열될 수 있는 펩타이드 결합을 가르킨다. 개열의 결과로, 펩타이드 사슬은 개열된다. 여기서 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체의 N-말단과 특별하게 개열될 수 있는 펩타이드 결합을 형성하는데 사용되는 아미노산 잔기는 “결합 형성 아미노산(BFAA)"으로 불리어진다. BFAA는, 여기에 제한 되는 것은 아니지만, 사이노겐 브로마이드에 의해 인지될 수 있는 Met, 알카린 분해효소에 의해 인지될 수 있는 Arg, 그리고 엔테로키나아제에 의해 인지될 수 있는 Asp Asp Asp Asp Lys 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
복합 단백질은 적절한 방법을 사용하여 “특별하게 개열할 수 있는 펩타이드 결합”에서 개열될 수 있다. 개열 후에, 복합 단백질은 그것의 C-말단에 부착된 몇 개의 아미노산을 가진 각각의 폴리펩타이드를 가진채 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 폴리펩타이드 복합 복제으로 분해될 수 있다. 위에 서술된 과정은 타겟 펩타이드의 N-말단 개열이라고 불리어진다.
GLP-1(7-36) 복합 복제본을 구성하는 복합 단백질을 예로 들면, 복합 단백질의 N-말단 개열은 복합 복제의 GLP-1(7-37)-Xaa```Xaa를 만들어낼 수 있고, 여기서 Xaa```Xaa는 서로 연결된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 발현시킨다. GLP-1(7-36)의 C-말단에 있는 아미노산 잔기는 Arg으로, Arg의 카르복실기에서 형성된 펩타이드결합을 특별하게 인식할 수 있는 어떤 단백질 분해효소를 사용하기 때문에, GLP-1(7-36)-Xaa```Xaa 개열은 결과적으로 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 여러 분자를 만들어 낼 것이다.
N-말단 개열 순서와 C-말단 개열 과정의 순서는 바뀔 수 있다.
전형적으로, Arg 잔기는 GLP-1(7-36) 의 N-말단에 더해지고, 적절한 단백질 분해효소가 개열에 사용되며, 이것은 Arg의 카르복실기에서 형성된 펩타이드 결합을 특별하게 인식한다. 그러므로, 복합 단백질은 GLP-1(7-36)의 C-말단에 있는 아미노산 잔기가 Arg이기 때문에 다른 첨가된 잔기 없이 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 여러 분자로 개열될 수 있다. 그것은 또한 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 N-말단에 Met를 더할 수 있게 한다. 이 Met에 의해 형성된 펩타이드 결합은 먼저 CNBr에 의해 개열될 수 있고 이렇게 만들어진 펩타이드는 GLP-1(7-36)의 C-말단 아미노산이 Arg이기 때문에 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 여러 분자를 만들기 위해서 적절한 단백질 분해효소에 의해 개열된다. N-말단 개열과 C-말단 개열의 순서는 바뀔 수 있다. GLP-1(7-36)의 N-말단에 Asp Asp Asp Asp Lys 아미노산 서열을 첨가 시킬 수 있고, 이 서열은 단백질 분해효소 엔테로키나아제에 의해 특별하게 개열 될 수 있다, 엔테로키나아제에 의한 단백질 가수분해 개열은 또한 GLP-1(7-36) 펩타이드 여러 분자를 만들어 낼 수 있다.
GLP-1(7-36) 폴리펩타이드와 GLP-1 유사체의 N-말단에 Arg 잔기를 더하는 것이 바람직하다.
GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체의 아미노산 서열을 기초로 하여,GLP-1(7-36)와 GLP-1 유사체를 인코딩 하는 유전자는 합성 구성요소 5‘말단에서 “아미노산을 형성하는 펩타이드”를 인코딩 하는 코돈의 첨가로 합성되어 질 수 있다. 연관된 서열과 제한효소에 의해 인지된 서열은 또한 합성 유전자의 두 끝에 포함된다. 이러한 수정 이후에, DNA 단편조각은 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 코돈을 포함하고 제한적인 엔도뉴클레아제에 의해 인지되는 두 끝에 쌍을 형성할 수 있다. 이 단편조각은 한줄로 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체의 복합 복제본을 연결 시키는데 사용되어질 수 있고 그래서 “일련의 연결된 유전자”라고 불리어진다.
또한 “일련의 연결된 유전자 만들어내기 위해 자연적으로 생겨나는 GLP-1 의 DNA 서열을 수정하는 것이 가능하다. 본 발명에서 유전자를 준비하기 위해서는 합성 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
하나의 아미노산은 복합 코돈에 의해 인코딩 될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이 분야에서 당업자는 다양한 DNA 서열과 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 서열조합을 줄이고 합성할 수 있다. 본 발명에서는,E. Coli안에서 높은 빈도를 갖는 코돈이 사용되었다.
GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 펩타이드를 인코딩하는 유전자는 두가지 방법으로 생겨날 수 있다. 한가지 방법은 타겟 유전자를 생산하기 위해 상보적이거나 무딘 말단에 의해 몇 개의 합성 조각을 연결시키는 것이고, 다른 하나는 화학적 합성에 의해 전체 타겟 유전자를 합성하는 것이다. 여러가지 단편조각들을 합성하고 나서 라이게이션으로 타겟 유전자를 만들어내는 방법이 선호된다.
한줄로 유전자 복합 복제본을 연결 시킬 목적으로 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1를 인코딩하는 유전자의 5‘과 3’ 말단에 혼합 부위를 형성할 수 있는 제한적인 엔도뉴클레아제 개열 부위는 신중한 선택과 정돈된 디자인을 필요로 한다. 클로닝을 목적으로 제한적인 엔도뉴클레아제의 인지부위 선택은 벡터 안에 있는 엔도뉴클레아제 부위를 기초로 하고 인지부위 선택은 비교적으로 풍부하게 이용이 가능하다.
이 발명에서 언급된 실시예 안에서, 발명자는 4개의 유전자 단편조각을 합성하기 위해서E. Coli안에서 높은 빈도를 가진 코돈을 선택한다. 연결 후에, 결과적으로 생겨난 재조합 GLP-1(7-36) 유전자는 그것의 양끝에 각각으로 Bgl II과 BamH I의 제한적인 엔도뉴클레아제 부위를 가진며, 이것은 나란한 유전자 연결을 위해 요구되는 것이다. EcoR I와 Hind III의 클로닝 부위는 벡터 안으로 삽입을 위해 필요하다. Bgl II과 BamH I의 인식부위를 위한 위치는 서로 교환될 수 있다.
본 발명에서 언급된 다른 실시예에서, 발명자는 4개의 유전자 단편조각을 합성하기 위해서E. Coli안에서 높은 빈도를 가진 코돈을 선택한다. 연결 후에, 결과적으로 생겨난 GLP-1(7-36) 유전자는 Sal I와 Xho I의 제한적인 엔도뉴클레아제 부위를 가지며, 이것은 나란한 유전자 연결을 위해서 요구되는 것이다. EcoR I와 Hind III의 클로닝 부위는 벡터 안으로 삽입을 위해 필요하다.
GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자 복합 복제은 위에서 언급된 엔도뉴클레아제 부위를 사용함으로써 한줄로 연결될 수 있고, 그래서 벡터안으로 클로닝 될 수 있다. 한줄로 연결된 이러한 유전자들은 또한 섞이고 어울릴 수 있다. “섞이고 혼합”이라는 용어는 서로 한줄로 함께 연결된 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 많은 섞여진 DNA 조각을 가르킨다. 이러한 목적에 적합한 벡터는 염색체에서 유래되거나 비염색체에서 유래되거나 또는 합성 DNA 벡터로부터 유래될 수 있다. 이러한 벡터는, 여기에 제한되는 것은 아니지만, 마크로파지 DNA, 바실루스 바이러스, 박테리아 플라스미드, 효모 플라스미드, 그리고 파지 조합으로부터 유래되는 벡터를 포함한다. 바이러스 DNA는, 여기에 제한되는 것은 아니지만, 소와 가금의 작은 천연두 바이러스, 아데노바이러스, 수도라비스 바이러스를 포함한다. 많은 적절한 벡터는 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 숙주세포에 존재하거나 안정하게 복제하는 일부 플라스미드와 벡터는 이 발명에 사용될 수 있다.
발현벡터의 대표적인 예는, 여기에 제한되는 것은 아니지만, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pKK233-2, pKK223-3, pEZZ18, pUC18, pUC19와 pT7(Amersham pharmacia Biotech)같이 박테이라계에서 사용되는 것을 포함한다.
타겟 유전자에는 발현벡터위에 적절한 프로모터가 연결되어진다. 프로모터는 유전자 전사를 조절하고 컨트롤 할 수 있는 서열이다. 프로모터의 대표적인 예는lac. trp, tac of E. Coli; 파지 T7; λ파지의 PL와 유전자 발현을 조절하기위해 진핵세포나 원핵세포 안에 존재하는 다른 알려진 프로모터를 포함한다. 박테리아에서 그런 프로모터는lacI,lacZ, T3, T7, 단백질 A 시그날 펩타이드, gpt, λPR, PL그리고trp를 포함하고 있다는 것을 특별히 언급하는 것은 의미있는 일이다. 적절한 프로모터 선택은 이 기술 분야의 당업자에게는 명백한 일이다.
덧붙여서, 언급된 발현 벡터는 숙주세포를 스크린할 수 있도록 만들기 위해 하나 또는 그 이상의 선택 마커(marker)를 가질 수 있다. 대표적인 것으로E. Coli안에 있는 테트라시이클린과 페니실린 저항성 유전자, 진핵생물의 발현 체계에서 디하이드로폴레잇(dehydrofolate) 리덕테이즈(reductase)와 네오마이신 저항성 유전자를 포함한다.
본 발명에서 나타나는 발현벡터는 한줄로 연결된 유번자의 N 복제본을 포함할 수 있고, 여기서 N은 1과 32사이의 정수이다. 더욱이 N은 8과 32사이의 정수이다. 더 정확하게 하면, N은 16 이나 32가 되어야 한다.
본 발명에서 언급된 하나의 실시예에 의하면, 발현벡터는 GLP-1(7-36) 유전자 하나의 복제본을 포함한다.
본 발명에서 언급된 다른 실시예에 의하면, 발현벡터는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자 2개의 복제본을 포함한다.
본 발명에서 예로 언급된 다른 실시예에 의하면, 발현벡터는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자 4개의 복제본을 포함한다.
본 발명에서 예로 언급된 다른 실시예에 의하면, 발현벡터는 한줄로 연결된GLP-1(7-36) 유전자 8개의 복제본을 포함한다.
본 발명에서 예로 언급된 다른 실시예에 의하면, 발현벡터는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자 12개의 복제본을 포함한다.
본 발명에서 예로 언급된 다른 실시예에 의하면, 발현벡터는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자 16개의 복제본을 포함한다.
본 발명에서 예로 언급된 다른 실시예에 의하면, 발현벡터는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자 32개의 복제본을 포함한다.
발명자는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자 32개의 복제본을 포함하는 재조합 발현 벡터 pKK223-3을 가지고 있는 박테리아 품종을 기탁하였다. 품종의 기탁번호는 CGMCC No.0599이다.
유전자 복합 복제과 적절한 프로모터 또는 다른 유전자 발현 조절 요소를 가지고 있는 본 발명에서 나타난 벡터는 숙주세포에서 복합단백질을 발현시키기 위해 적절한 숙주세포속으로 전이될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 펩타이드를를 발현시킬 수 있는 숙주세포와 관련이 있다. 발현벡터는 형질전환, 트랜스펙션, 주입과 같은 유전공학적 방법으로 숙주세포에 삽입될 수 있고, 예를 들면, 칼슘 클로라이드에 의한 형질전환과, 캐리어나 전기주입법과 같이 DHAE-덱스트란하에 트랜스펙션하는 방법이 있다. 이들 방법은 숙주세포내로 유전자 복합 복제본을 포함하는 벡터를 효과적으로 전이시킬 수 있다. 여기서 언급된 벡터에는 플라스미드, 바이러스성 미립자 또는 박테리아 파지가 될 수 있다.
적절한 숙주세포는, 여기에 한정되는 것은 아니지만,E. Coli,스트렙토코쿠스와 살모넬라 같은 박테리아 세포, 그리고 효모 같은 진핵세포 등을 포함한다. 적절한 숙주세포의 선택은 이 분야의 기술자에게는 명백하다.
생산 비용을 낮추기 위해서는 원핵세포가 언급된 숙주세포이어야 한다. 대표적인 예로는 JM103, JM109, HB101 그리고 DH5α 같은E. Coli계통의 많은 부분을 포함한다.
본 발명의 숙주세포는 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자 N 복제본을 포함하는 발현벡터를 가지고 있으며, 여기서 N은 1에서 32사이의 정수이다. 이에 따라서, 숙주세포는 본 발명의 숙주세포는 한줄로 연결된 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체 펩타이드의 N 복제본을 포함하는 복합 단백질을 발현시키고 있으며, 여기서 N은 8에서 32사이의 정수이다. 더 정확하게, N은 16과 32사이의 정수가 되어야한다. 복합 단백질은 다른 어떤 캐리어 단백질을 포함하지 않는다.
본 발명에서 언급된 하나의 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 하나의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 하나의 GLP-1(7-36) 유전자를 가진다.
본 발명에서 언급된 다른 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 2개의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 2개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있다.
본 발명에서 언급된 다른 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 4개의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 4개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있다.
본 발명에서 언급된 다른 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 8개의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 8개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있다.
본 발명에서 언급된 다른 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 12개의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 12개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있다.
본 발명에서 언급된 또 다른 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 16개의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 16개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있다.
본 발명에서 언급된 또 다른 실시예에 의하면, GLP-1(7-36) 유전자 32개의 복제본을 가지고 있는 발현 플라스미드는E. ColiJM103 세포로 형질전환 된다. 유전공학적 작업을 거친 JM103 세포는 32개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있다.
“특허절차를 목적으로 미생물 기탁에 대해 국제적 인식에 관한 부다페스트 조약”에 따라 32개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 가지고 있는 복합 단백질을 발현 시킬 수 있게 유전공학적 작업을 거친 박테리아 계통이 China General Microbiological Culture Colleltion Center(CGMCC)에 기탁되었다. 기탁날짜는 2001년 7월 11일이고, 기탁번호는 CGMCC No.0599이다. 기탁된 계통은 GLP-1(7-36) 유전자 32개가 일련으로 연결된 복제본을 포함하는 플라스미드를 가지고 있다. 기탁은 이 분야 당업자의 편의를 위한 것이다. 기탁된 미생물의 배포, 사용이나 판매는 발명자의 특별한 허락을 필요로 한다. 그런 허락은 여기에 인증되어 있지 않다.
본 발명에 나타난 유전공학적 작업을 거친 박테리아 계통은 연결된 폴리펩타이드의 N 복제본을 구성하는 복합 단백질을 생산하고 축적하는데 적합한 조건하에서 배양될 수 있다. 배양 배지, 온도, 습도, ph와 같은 배양조건은 이 분야 당업자에게 명백하다.
숙주세포가 적절한 농도로 자란 후에, 그것들은 원심 분리기로 걸러질 수 있다. 세포는 물리적 또는 화학적 방법에 의해 찢어질 수 있다. 위의 처리로부터 생겨난 결과물은 모여지고 정화작업을 거치게 된다.
재조합 단백질을 발현시키는 미생물 세포는 전통적인 방법에 의해 찢어질 수 있고, 여기에 제한되는 것은 아니지만, 냉동과 해동과정의 반복, 초음파나 기계적인 취급 또는 세포 용해 물질을 포함할 수 있다. 숙주세포를 찢기 위한 적절한 선택은 이 분야 당업자에게 명백하다.
본 발명에서 나타난 복합 단백질은 복합 펩타이드로 구성된다. 폴리펩타이드는 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 또는 이 둘의 혼합을 포함할 수 있다. 두개의 이웃한 펩타이드사이에는 몇 개의 아미노산 잔기가 있다. 이 두 펩타이드는 두개의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드, 두개의 GLP-1 유사체 폴리펩타이드, 또는 하나의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드와 하나의 GLP-1 유사체일 수 있다. 각 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1(7-36) 유사체의 N-말단에 연결된 아미노산은 “펩타이드를 형성하는 아미노산"으로, 위에서 서술된 바와 같이, 이것은 각각의 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 또는 GLP-1(7-36) 유사체 펩타이드의 N-말단 아미노산 잔기를 가진 “특별하게 개열 할 수 있는 펩타이드 결합”을 형성한다. 적당한 개열 조건 아래서 적절한 물질이 있다면, 복합 단백질은 각각의 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 펩타이드의 N-말단에서 개열 될 수 있으며, 그것의 C-말단에 몇 개의 연관된 아미노산을 가진 복합 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 펩타이드를 만들어낼 수 있다. 예를 들어, GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 N 복제본을 구성하는 복합 단백질은 GLP-1(7-36)-Xaa```Xaa를 만들어 내기 위해 개열되고, 여기서 Xaa```Xaa는 한줄로 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 나아가, GLP-1(7-36)의 C-말단은 Arg 잔기가기 때문에 Arg과 Xaa```Xaa 사이에서 형성되는 펩타이드 결합은 GLP-1(7-36)를 만들어 내기 위해 적절한 프로테이즈에 의해 특별하게 개열될 수 있다.
개열 과정을 단순화 시킨 결과로, Arg는 “펩타이드를 형성하는 아미노산”으로써 선택 되었다. 프로테이즈는 특별하게 Arg의 카르복실기를 통해서 형성되는 펩타이드 결합을 개열하기 위해서 사용된다. 이렇게, 복합 단백질은 개열이라는 한 단계 만으로 복합 분자형태의 폴리펩타이드로 가수분해 된다.
본 발명에서 나타난 하나의 실시예에 의하면, Met는 펩타이드를 형성하는 아미노산으로 선택 되었다. CNBr은 Met의 카르복실기 부가로 형성되는 펩타이드 결합을 개열하는데 사용되고, 이어서 Arg의 카르복실기 부가로 형성되는 펩타이드 결합을 특별하게 인식하는 프로테이즈가 뒤따른다. 이 과정은 C-말단 아미드화에 어떤 수정도 없이 복합 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 만들어 낸다. 위에서 언급된 개열의 순서는 바뀌어 질 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, Arg가 펩타이드를 형성하는 아미노산“으로 선택 되었다. 판크레아틱 단백질 분해효소인 트립신은 Lys 또는 Arg의 카르복실기 부가로 형성되는 펩타이드 결합을 특별하게 개열할 수 있다. 어떤 무수물(anhydride)은 Lys을 보호하기 위해 이 과정에서 사용된다. 그 결과, 트립신은 Arg의 카르복실기 부가로 형성되는 펩타이드 결합을 특별하게 개열하는데 사용될 수 있다. 그러므로 개열의 한단계는 C-말단 아미드화에 어떤 수정도 없이 복합 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 만들어 낼 수 있다.
복합 단백질의 개열후에, 고도로 순수한 폴리펩타이드는 크로마토픽(chromatographic) 방법과 같은 일련의 분리와 정제단계를 통해서 얻어질 수 있다. 크로마토픽 방법은, 여기에 제한되는 것은 아니지만, 이온-교환, 물에 대한 비친화성, 배타적인 크기 그리고 역 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 이런 크로마토그래피에 사용되는 배지는 Amersham Pharmacia Biotech, Whatman, Merk KGaA 그리고 grace Vydac 등과 같은 상업적 회사로부터 구매할 수 있다. 하나의 크로마토그래피 또는 복합 크로마토그래피 단계의 조합이 정제단계에서 사용될 수 있다. 일반적으로는 HPLC가 정제 수단으로 사용된다. 전형적으로 이동 면에서는 TFA-CH3CN 시스템을 가진 C18 역 크로마토그래피가 이용 된다. 이 크로마토그래피 방법은 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
GLP-1(7-36) 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 본 발명을 설명하기 위해서 여기에 기재되었지만, 이 기술분야의 당업자에게 그런 방법은 또한 GLP-1(7-36) 유사체를 생산하기 위해서 사용되어질 수 있다는 점은 명백하고, GLP-1 유사체의 N-말단과 C-말단에 위치한 아미노산 잔기가 “특별하게 개열할 수 있는 펩타이드 결합”을 형성할 수 있는 한, 개열은 폴리펩타이드 안에서 내부적으로 일어날 것이다. 그러므로 한줄로 유전자를 연결시킴으로써 GLP-1 유사체를 생산하는 방법은 본 발명 안에서 청구되어진 범위에 속한다.
전형적으로, GLP-1 유사체는 C-말단에 Arg을 포함하지만, 그러나 유사체의 아미노산 서열 다른 어떤 부위에 Arg을 포함하지 않는다. 이들 GLP-1 유사체는, 여기에 제한되는 것은 아니지만, Gly8-GLP-1(7-36), Val8-GLP-1(7-36), Asp11-GLP-1(7-36), Ala16-GLP-1(7-36), Glu22-GLP-1(7-36), His23-GLP-1(7-36),Glu24-GLP-1(7-36), Trp26-GLP-1(7-36), Ala27-GLP-1(7-36), Glu30-GLP-1(7-36), Asp33-GLP-1(7-36), Glu34-GLP-1(7-36), Thr35-GLP-1(7-36), Gly8-Glu24-GLP-1(7-36), Leu8-Ala33-GLP-1(7-36), Thr36-Arg37-GLP-1(7-37), Ser36-Arg37-GLP-1(7-37) 등을 포함한다.
GLP-1(7-36)와 GLP-1 유사체를 생산하는 다른 방법과 비교해서, 본 발명의 방법은 명백한 장점을 가지고 있다. GLP-1의 화학적 합성은 기술이 요구되고 많은 비용이 필요하다. 유전공학적인 접근으로 재조합 GLP-1을 생산하는 방법은 성공률이 낮다. 이것들은 일반적으로 아래와 같다.
(1) 숙주세포에서 발현되는 20에서 60개의 아미노산 잔기를 구성하는 폴리펩타이드는 쉽게 퇴화한다. 그러므로 그러한 폴리펩타이드의 직접적인 발현은 있을 꺼 같지 않다. 그런 폴리펩타이드와 불용성 세포함유체를 형성하기 위한 운반 단백질의 결합물은 거의 퇴화 되지 않는다. 대부분 환경에서 폴리펩타이드는 생산의 관점에서 볼 때 복합 단백질의 단지 10 퍼센트만을 기여한다. 복합 단백질의 발현후에 세포 함유체의 분리와 정제가 수행된다. 이어지는 복합 단백질의 개열은 대개 70%의 포르만 용액 안에서 시아노겐 브로마이드와 함께 진행된다. 대개, 운반 단백질은 또한 복합 단백질이 개열될 때 복합 폴리펩타이드 조각으로 개열된다. 이러한 조각들은 이어지는 단백질 분리와 정제 과정에서 특별한 처리단계와 정제를 추가한다. GLP-1(7-36)NH2가 바람직한 최종 결과물이라면, 아미드화가 재조합 펩타이드의 C-말단에서 수행되어야 한다. 요약하면, 서술된 방법을 사용한 재조합 폴리펩타이드의 결과물은 작고, 비용은 높으며, 그 생산과정에서 환경오염을 더 일으킬 수 있다.
(2) 미합중국 특허 5,512,459, 5,655,456, 5,707,826, 6,037,143, 6,403,361에 서술된 GLP-1을 생산하는 방법은 우선적으로 해결되어야 하는 문제를 안고 있다: 복합 단백질의 선택적인 개열과 이어지는 효율적인 정제와, 트랜스 펩티데이션(transpeptidation) 과정에서 디펩타이드(dipeptide)와 트리펩타이드(tripeptide)의 필요, GLP-1(7-34)-Ala-Phe-Ala 안에 있는 Lys34만이 유일하게 트랜스펩티데이션에 기여 할 수 있고, Lys36은 그렇지 않다는 것에 대한 확인이 문제이다. 그러므로 이 방법론은 다루기에 복잡하고 어렵다.
(3) 분비되는 단백질처럼 그것을 생산하기 위해 GLP-1에 시그날 펩타이드를 부착한다. 이 방법은 대게 재조합 GLP-1를 적은 양으로 생산한다.
다음의 실시예들은 예시적인 것이며 켤코 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
[실시예 1]: 유전자 GLP-1(7-36) 복제본 한 개를 포함하는 유전공학적 박테리아 균주 제조 공정
종종E.Coli로 쓰이는 코돈을 선택한 후에 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열에따라 네 개의 DNA 단편조각을 디자인한다. 이어지는 융합 단백질의 개열 부위를 만들기 위해 Arg의 코돈이 유전자 GLP-1(7-36)DML 5'말단에 첨가 된다. 5' 및 3' 말단에서, 엔도뉴클레아제 제한효소 Bgl II 및 BamH I 에 대한 개열부위가 각각 유도됨으로써 상보적 접착 말단이 Bgl II 및 BamH I의 제한 세절로부터 발생하고, 이것이 한줄로 DNA 단편조각의 연결을 촉진한다. 유전자 GLP-1(7-36)의 한 개의 복사를 포함하는 유전자 발현 플라즈미드를 생성하는 제작 공정이 도1에 도시되어 있다.
1. DNA 단편조각 합성
ABI 3900ⓡ DNA 합성기(Applied Biosystems사)로 네 개의 단편조각을 합성한다. 단편조각 서열은 각각 다음과 같다:
(1): 5'-AATTCC AGATCTATGCGTCAC GAA GGT ACC TTC ACC
EcoRI BglII Arg
AGC GAT GTGAGC AGC TAT CTG -3' (서열번호 2)
(2): 5'-ACC TTC CAT ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGT ACC TTC
CGC GTG ACG GAT AGA TCT GG -3' (서열번호 3)
(3): 5'-GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGG CTG GTG AAA
GGT CGT GGA TCC TAG A -3' (서열번호 4)
(4): 5'-AG CTTCTAGGA TCCACG ACC TTT CAC CAG CCA CGC CAT
HindI II BamH I
AAA TTC TTT GGT CGC CGC CTG -3' (서열번호 5)
단편조각(1)은 5' 말단에 EcoR I 및 Bal II에 의해 인식될 수 있는 부위와 Arg를 인코딩하는 코돈 CGT를 포함한다. 단편조각(2)는 단편조각(1)의 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 단편조각(4)는 5' 말단에 Hind III 및 BamH I에 의해 인식될 수 있는 부위를 포함한다. 단편조각(3)은 단편조각(4)의 서열과 상보적인 서열을 갖는다. 단편조각(1)의 Bgl II에 의해 인식되는 AGA TCT 부위는 단편조각(4)의 BamH I에 의해 인식되는 CGA TCC와 상호 교환 할 수 있다.
2. 유전자 GLP-1(7-36)의 하나의 복사를 형성하기 위한 DNA 단편조각 연결과정
연결과정이 "분자 클로닝"(Cold Spring Harbor Press 출판, Sam Brook외 다수, 제2판)에서 설명된 바와 같이 수행된다. 다음은 간단하게 설명된 내용이다: 네 개의 DNA 단편조각들(각각 내용물: A260nm=5)이 네 개의 초소형 원심분리기 튜브 각각에 두 번씩 증류제조된 물 50 μl에 용해되고, 대응되는 네 개의 튜브는 No.1(A), No.2(B), No.3(C) 및 No.4(D)라고 표시한다. 튜브번호 No.1 및 No.2 로부터 1 μl의 용액을 1.5ml의 초소형 원심분리기 튜브에 각각 옮겨 섞는다. 유사한 방법으로, 튜브번호 No.3 및 No.4 로부터 1 μl의 용액을 각각 피펫으로 계량해서 또다른 초소형 원심분리기 튜브에 넣어 섞는다. 1 μl의 10x 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액, 1 μl의 1 mM ATP 그리고 1 μl의 폴리뉴클레오티드 키나아제를두 개의 튜브에 각각 첨가한다. 튜브를 37℃ 에서 한시간 동안 배양하고, 다음으로 키나아제를 불활성화 시키기 위하여 90℃ 에서 5분간 배양한다. 그 다음 튜브를 실온(RT)까지 점차적으로 냉각시킨다. 이들 두 개의 튜브 안의 내용물을 1 μl의 1mM ATP, 1 μl의 10x T4DNA 리가아제 완충액 그리고 1 μl의 T4DNA 리가아제를 첨가해서 함께 섞는다. 이 혼합물을 16℃에서 밤새 배양한다. 연결반응의 완결을 에티듐 브롬화물(EB)로 염색한 1%의 아가로스 젤 위의 단편조각 크기를 확인함으로써 증명할 수 있다.
3. 유전자 GLP-1(7-36)을 유전자발현 벡터로 클로닝하는 과정.
pKK223-3 플라즈미드(Amersham Pharmacia Biotech)가 적당한 조건 하에서 EcoR I 과 Hind III와 함께 처음과 두번 세절된다. 그 다음 페놀 클로로포름이 첨가되고 수용액상을 클로로포름으로 두번 세척한다. 세절된 플라즈미드 DNA가 원심분리 전에 한시간 동안 RT에서 이소프로판올에 의해 침전물을 형성하게 된다. 증발로 침전물 내의 유기용매를 제거한다. 연결된 유전자 GLP-1(7-36)을 세절된 플라즈미드 용액과 함께 섞고 1 μl의 1mM ATP, 1 μlDML 10x T4DNA 리가아제 완충액과 1 μl의 T4DNA 리가아제를 첨가한다. 이 혼합물을 18℃ 에서 밤새 배양한다.
4. 형질전환
단일 군체 JM103을 선택해서 그 다음 600 nm(A600nm)의 박테리아 배양에서 스펙트럼 흡수가 0.6에 이를 때까지 37℃ 50 ml의 LB 액체 배지에서 배양한다. 액체 박테리아 배양를 원심분리한 다음, 박테리아 군체를 수확하게 되고 그 다음 10 ml의 얼음으로 냉각된 CaCl2용액(CaCl260mM, 15% 글리세롤, 10mM PIPES, pH 7.0) 에서 현탁한다. 현탁액을 3000rpm에서 원심분리하고 박테리아 군체를 2ml 얼음냉가된 CaCl2용액 내에서 다시 현탁하고 차후 사용을 위해 얼음욕조 속에 보관한다. 50 μl의 컴피턴트 세포를 5 μl의 복제된 플라즈미드와 함께 섞는다. 이 혼합물을 42℃에서 2분간 가열하고, 그 다음 냉각시킨다. 100 μl의 LB 배지를 첨가한 후, 이 혼합물을 37℃에서 한시간 동안 배양한다. 그 다음 이 혼합물을 50 μg/ml 암피실린을 포함하는 LB 아가로스 평판위에 뿌린다. 이 평판을 37℃에서 밤새 배양한다. 이 평판 위에 나타나는 단일군체들을 채집하고 플라즈미드 추출용으로 배양한다. 결과물 플라즈미드 pG1이 EcoR I 및 Hind III와 함께 이중 세절되고 복제된 유전자가 1%의 아가로스 젤 위에서 전기영동에 의해서 분석된다.
5. DNA 서열 분석
재조합 플라즈미드에 의해 수행되는 유전자 GLP-1(7-36)의 DNA 서열을 ABI PRISMⓡ310 자동 서열기(Applied Biosystems)로 분석한다. 이 분석 결과는 도2에서 도시한 것과 동일하다.
[실시예2]: 유전자 GLP-1(7-36)의 하나의 복사를 포함하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
실시예 1의 단편조각(1) 내의 Bgl II 부위를 Sal I 부위로 대체한 후, 단편조각(1')을 합성한다. 유사한 방식으로, 단편조각(4')을 실시예 1의 단편조각 (4) 내의 BamH I 부위를 Xho I 부위로 대체한 후 합성한다. 단편조각(2)의 서열은 단편조각(1')의 서열과 상보적이고, 반면 단편조각(3')의 서열은 단편조각(4')의 서열과 상보적이다. 단편조각(1') 및 단편조각(4')의 서열은 다음과 같다:
(1'): 5'-AAT TCC GTC GACATGCGTCAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC
EcoRI SalI Arg10
AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG 　3' (서열번호 6)
(4'): 5'-AG CTTCTACTC GAGACG ACC TTT CAC CAG CCA CGC GAT
HindIII XhoI
AAA TTC TTT GGT CGC CGC CTG -3' (서열번호 7)
실시예 1에 기술된 과정에 따라, 네 개의 단편조각들의 연결과정, 벡터의 세절과정, 유전자 GLP-1(7-36) 삽입과정, 유전자발현 벡터(E.ColiJM109으로)의 형질전환과정 그리고 DNA 서열의 분석과정이 수행된다. 분석 결과는 도3에 도시된 것과 일치한다.
[실시예3]: 유전자 CLP-1(7-36)의 하나의 복사를 포함하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
실시예 1의 단편조각(1) 내의 Arg 코돈을 단편조각(1'')를 합성하기 위해 Met 코돈으로 대체한다. 단편조각(2'')의 서열은 단편조각(1'')의 서열과 상보적이다. 단편조각(3) 및 단편조각(4)의 서열은 동일하게 유지된다. (1'') 및 (2'')의 서열을 아래에 도시하였다.
(1"): 5'-AAT TCC AGA TCTATGATGCAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC
EcoR I Bgl II Met
AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG -3' (서열번호 8)
(2"): 5'- ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGT ACC TTC CGC GTG CAT AGA TCT GG -3' (서열번호 9)
벡터의 세절과정, 유전자 GLP-1(7-36)의 삽입과정, 유전자 발현 벡터(E. ColiJM109으로)의 형질전환과정 그리고 DNA 서열의 분석과정이 실시예 1에 설명한 대로 수행된다.
[실시예4]: 유전자 GLP-1(7-36)의 두 개의 복사를 함유하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
방법 1:
도4에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 수득된 5 μl의 플라즈미드가 0.5ml의 초소형 원심분리기 튜브 내로 첨가 되고, 그 다음 1 μl의 10x Bgl II, 1 μl의 Bgl II 그리고 1 μl의 Hind III가 튜브에 각각 첨가된다. 이 혼합물은 37℃에서 한시간 동안 배양된다. 유리된 유전자 GLP-1(7-36) 단편조각은 1% 아가로스 젤 위에서 전기영동에 의하여 회복된다.
실시예 1에서 수득된 1 μl의 플라즈미드를 1 μl의 10x BamH I 완충액, 1 μl의 BamH I 그리고 1 μl의 Hind III와 함께 섞는다. 이 혼합물을 37℃에서 한시간 동안 배양시킨다. 그 다음 페놀 클로로포름을 첨가하고 수용액상을 클로로포름으로 두번 세척한다. 세절된 플라즈미드 DNA가 원심분리 하기 전에 RT에서 한시간 동안 60% 이소프로판올에 의해 침전된다. 침전물 내의 유기용매가 증발로 제거된다. 펠렛을 10 μl의 물로 용해 시킨다.
Bgl II 및 Hind III의 이중 세절된 유전자 GLP-1(7-36) 단편조각을 Hind III 및 BamH I 이중 세절된 플라즈미드와 함께 섞는다. 그 다음 1 μl의 1mM ATP, 1 μlD의 10x T4DNA 리가아제 완충액 그리고 2 μl의 T4DNA 리가아제를 첨가한다. 이 혼합물을 18℃에서 밤새 배양 시킨다.
컴피턴트 JM103E. Coli세포들을 실시예 1에 묘사된 것과 같이 형질전환시킨다. 그 다음 이 박테리아 현탁액을 암페실린 50 μg/ml를 포함하는 LB 아가로스 평판 위에 뿌린다. 이 평판을 37℃에서 밤새 그대로 둔다. 이 평판이에 나타나는 단일 군체를 채집하고 플라즈미드 추출용으로 배양한다. 결과물 플라즈미드는 EcoR I 및 Hind III와 함께 이중 세절된다. 1%의 아가로스 젤 위에서 전기영동에 의하여 직렬 연결 유전자 GLP-1(7-36)의 두 개의 복사를 이들과 함께 선택한다. 원하는 플라즈미드를 함유하는 박테리아 균주가 쌓이게 된다.
방법 2:
실시예 1 대신에 실시예 2에서 수득된 플라즈미드를 사용하고, 방법 1에서 설명한 엔도뉴클레아제 제한효소 Bgl II 및 BamH I을 Sal I 및 Xho I으로 각각 대체한다. 다른 공정들을 유전자 GLP-1(7-36)의 두 개의 복사를 함유하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하기 위하여 방법 1에서 설명된 대로 진행한다.
방법 3:
유전자 GLP-1(7-36)의 두개 복사를 함유하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하기 위하여 실시예3 으로부터 플라즈미드를 사용한다. 다른 공정은 방법 1에서 설명한 대로 수행된다.유전자 GLP-1(7-36)의 두개 복사를 함유하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하기 위하여 실시예3 으로부터 플라즈미드를 사용한다. 다른 공정은 방법 1에서 설명한 대로 수행된다.
[실시예5]: 유전자 GLP-1(7-36)의 네개 복사를 포함하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
실시예 4에서 설명된 과정 다음으로, 유전자 GLP-1(7-36)의 직렬 연결과정이 수행된다. 적당한 박테리아 세포계통(cell line)을 유전자 GLP-1(7-36)의 네개의 복사를 운반하는 플라즈미드로 형질전환하고, 한줄로 연결된 유전자 GLP-1(7-36)의 네개의 복사를 운반하는 유전자발현 플라즈미드를 품는 박테리아 균주를 선택한다.
[실시예6]: 유전자 GLP-1(7-36)의 여덟개 복사를 포함하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
실시예 4에서 설명한 과정 다음으로, 유전자 GLP-1(7-36)의 직렬 연결과정이 수행된다. 적당한 박테리아 세포계통을 여덟개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 플라즈미드로 형질전환하고, 한줄로 연결된 여덟개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 유전자발현 플라즈미드를 함유하는 박테리아 균주를 선택한다.
[실시예7]: 열두개 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 포함하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
네개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 플라즈미드와 여덟개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 플라즈미드를 사용한다. 이들 두가지 종류의 플라즈미드를 각각 이중 세절하는 과정을 수행한다. 실시예 4에서 설명된 과정 다음으로, 직렬 연결과정을 수행하고 12개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 플라즈미드를 얻는다. 적당한 박테리아 세포계통을 프라즈미드로 형질전환하고, 직렬 연결된 12개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 유전자 발현 플라즈미드를 함유하는 박테리아 균주를 선택한다.
[실시예8]: 16개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 포함하는 유전공학적 박테리아 균주 제조과정
실시예 4에서 설명된 과정들 그 다음으로, 직렬 유전자 GLP-1(7-36)연결과정을 반복한다. 적당한 박테리아 세표계통을 16개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)를 운반하는 플라즈미드로 형질전환하고 한줄로 연결된 16개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)들을 운반하는 유전자 발현 플라즈미드를 함유하는 박테리아 균주를 선택한다.
[실시예9]: 32개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 포함하는 유전공학적 박테리아 균주를 제조하는 과정
실시예 4에서 설명된 바와 같은 과정들 다음으로, 한줄로 유전자 GLP-1(7-36)의 연결을 반복한다. 적당한 박테리아 세포계통을 32개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 플라즈미드로 형질전환하고 한줄로 연결된 32개의 복사 유전자 GLP-1(7-36)을 운반하는 유전자 발현 플라즈미드를 함유하는 박테리아 균주를 선택한다.
[실시예10]: 유전자 GLP-1(7-36)을 함유하는 유전공학적 박테리아 균주를 발효하는 과정
유전자 GLP-1(7-36)을 함유하는 유전공학적 박테리아 균주를 발효하는 과정이 Aizhen Wu et.al. 의 “유전공학적E. Coli의 발효과정에 대한 연구”(Chinese Journal of Biotechnology, 부록 Vol.12, pp53-57, 1996)에서 언급된 방법에 따라 수행된다.
1. 박테리아 종자 배양
종자 박테리아의 배양배지는 10g/L, 5g/L 효모 추출물(Difen, Sigma 또는 Oxoid로부터), pH7.0에서 20ml의 0.2M 인산염 완충액 그리고 FeCl3(각각의 소금:1mg/L) 뿐만 아니라 CaCl2, Ni(NO4)3, CoCl3, MgSO4를 포함한다. 이 배지를 120℃에서 20분간 고압증기로 멸균시킨다. 37℃로 냉각시킨 후에, 암피실린 50mg/L, 포제지제 20ml, 종자 20ml 그리고 20% 글루코스 5ml를 첨가시킨다. pH 값이 NaOH 2M과 HCl 2M로 6.8-7.2로 맞추어 진다. 그 다음 발효가 진행된다.
2. 발효
5L 또는 15L 또는 150L 의 생체반응기(B. Braun Biostat) 내에서 발효가 진행된다. 발효조건은 다음과 같다: 37℃의 온도, PL30→42℃, 교반속도 500rpm, pH6.8-7.2, 환기속도가 각각 5L/min 또는 15L/min 또는 150L/min, 그리고 DO250%.
3. 발효과정동안 박테리아 농도 측정
매시간 발효배양 1ml를 취해서 박테리아 농도를 측정한다. 배양을 8000rpm에서 10분간 원심분리 한 후, 탈리액을 제거하고 박테리아군의 습식질량을 단다. 아니면 광밀도 OD600nm에서의 밀도를 측정함으로써 농도를 측정할 수 있다.
도5에 되시된 바와 같이, 12-16시간 발효 후에, 발효조 내에 있는 박테리아 밀도는 150g/L(습식 질량)이다. 정지기에 이르고 발효는 완성된다.
[실시예11]: 포함체 추출
발효 후에, 배양배지를 4000rpm에서 원심분리 한다. 박테리아군을 수확하고 균질화기 내 압력 50MPa로 분열을 위해 두 번 균질화 된다. 세포 조직파편 현탁액이 6000rpm에서 원심분리 되고 결과물 탈리액을 제거한다. 10,000rpm으로 한번 더 원심분리한 채, 포함체를 수집하고 그 다음 EDTA 10mM과 NaCl 1%를 포함하는 인산염 완충액(pH7.0) 20mM로 두 번 세척한다. 포함체가 요소 수용액 내로 용해된 후에, 용해되지 않은 불순물들을 원심분리에 의해 제거한다. 탈리액 내의 요소를 제거하기 위해 한외여가를 사용하고, 그 다음 원심분리로 포함체를 수확한다.
[실시예12]: 포함체 개열
1단계 단백질 가수분해(proteolysis)
실시예 4의 방법1 또는 방법2로 제조되는 유전공학적 박테리아 균주의 발효로부터 얻는 포함체를 다음의 과정에 의해 개열할 수 있다.
I. 클로스트라이패인 프로테아제 사용
클로스트라이패인은 특정적으로 Arg 잔류물의 카르복실 침전에 의해 형성된 펩타이드 결합을 개열할 수 있다.
실시예 11로부터 수득된 포함체가 인산염 20mM 완충액(pH7.5) 내에서 현탁된다. 클로스트라이패인 프로테아제가 1000:1(단백질 건조중량:클로스트라이패인 양)의 비율로 첨가된다. 이 혼합물이 37℃에서 배양되고 계속 샘플을 채취하고 모든 포함체가 완전히 개열되기 까지 HPLC에 이해 모니터링 된다. 큰 분자들의 분순물들이 한외여과(MWCO 10,000)에 의해 제거된다. GLP-1(7-36)이 전처리계 HPLC로 정제되고 99%이상의 순도를 갖는 원하는 펩타이드를 수득하기 위해 냉동건조 시킨다.
II. 트립신 프로테아제 사용
췌장 프로테아제 트립신은 Lys 잔류물 또는 Arg잔류물의 카르복실 침전에 의해 형성된 펩타이드 결합을 개열 할 수 있다. Lys 잔류물을 무수물로 보호하게 되면, Arg의 카르복실 침전에 의해 형성된 펩타이드 결합을 트립신에 의해 특정적으로 개열 할 수 있다.
2시간 동안 pH8.0에서 아실화 반응을 수행하기 위하여 실시예 11로부터 얻은 포함체 200그램(습식 중량)을 1그램의 시트라코닐 무수물을 갖는 5리터의 20mM NaHCO3수용액 내로 용해 시킨다. 작은 분자들을 한외여과(10,000 MWCO)로 제거한다. 트립신이 1000/1(프로테아제에 대한 건조 중량의 단백질)의 비율로 첨가된다. 단백질 가수분해 반응이 37℃에서 이루어 지고 포함체의 개열이 완성되기 까지 HPLC로 모니터링 한다. GLP-1(7-36)을 전처리계 HPLC로 좀더 정제하고 99%이상의 순도를 갖는 원하는 펩타이드를 얻기 위해 냉동 건조 시킨다.
2단계 개열
실시예 4의 방법3으로 제조되는 유전공학적 박테리아 균주의 발효로부터 얻는 포함체를 다음의 방법으로 개열할 수 있다.
약 2-100mg/mL(건조 중량)의 농도범위에 도달하기 위하여 포함체/융합 단백질을 70%의 포름산 또는 8M의 요소 수용액 내로 용해시킨다. 시안화 브롬화물(CNBr)을 1:100(융합 단백질 대 시안화 브롬화물)의 몰비율로 첨가한다. 이 혼합물을 어두운 곳에서 8-24시간동안 교반시킨다. 이러한 조건 하에서, CNBr은 특정적으로 Met카르복실에 의해 형성된 펩타이드 결합을 개열한다. 이것이 2단계 개열공정 중 제 1 단계이다.
제 1단계 개열으로부터 수용액을 작은 분자들을 제거하기 위하여 1000MWCO막으로 여과 시킨다. 그 다음 GLP-1(7-36) 펩타이드를 얻기 위해 Arg 카르복실에 의해 형성된 펩타이드 결합 위에 프로테아제를 갖는 제 2단계 개열과정을 행하기 위하여 실시예 12 과정을 밟는다. GLP-1(7-36)을 전처리계 HPLC로 좀더 정제하게 되고 99%이상의 순도를 갖는 원하는 펩타이드를 얻기 위해 냉동 건조 시킨다.
[실시예13]: GLP-1(7-36) 폴리펩타이드의 화학적 분석
1. 순도 분석
아질런트 1100HPLC와 안지름 4.6mm 및 길이 150mm를 갖는 조르박스 SB C18 크로마토그래피 칼럼을 사용한다. 유동 상태 A는 TFA0.1%이고 유동상태 B는 0.1%TFA/80%CH3CN이다. 10-80%B의 기울기가 20분 내에 형성된다. 유속은 1ml/min이다.
1mg의 냉동건조된 GLP-1(7-36) 파우더(99%이상의 순도)를 1ml 0.1%TFA 내로 용해 시킨다. 10μl의 표본을 컬럼에 적재한다. 그 결과를 도6에 나타내었다.
2. 아미노산 조성 분석
100μgdml GLP-1(7-36)을 0.5mldml 5.7N의 이중 증류HCL 내로 용해 시킨다. 결과물 수용액을 용기내에 완전히 봉하고 110℃에서 20시간동안 배양시킨다. 진공증발에 의해 HCl을 제거한다. 이중으로 증류된 물을 갖고 증발과정을 두 번 반복한다. 부피를 측정하고 그 다음 표보늘 꺼내어 Hitachi L-8800 아미노산 분석기(Hitachi Scientific Instrument)로 아미노산 조성 분석을 행한다. 관측값들과 도7에 나타낸 것과 같이, 이론값들이 일치한다.
3. 질량 스펙트럼 분석
API 2000 LC/MS/MS 시스템으로(Applied Biosystem) HPLC-MS 분석을 하기 위해 작은 표본 GLP-1(7-36) 펩타이드를 사용한다. 그 결과를 도8에 나타 내었다. 본 발명에서 방법론으로 얻는 GLP-1(7-36)은 분자량 3297.12를 갖는다. 계산값 MW 3298.68과 측정값 간의 오차는 받아들일 수 있다.
4. 펩타이드 서열 분석
상기 조성 분석에서 언급된 방법으로 표본을 준비한다. 이로부터 생산된 GLP-1(7-36)의 N 말단 펩타이드 서열이 ProciseⓡcLC 자동화 단백질 서열 분석기(Applied Biosystems)에 의해 결정된다. 이로부터 얻는 GLP-1(7-36)의 첫 번째 15 아미노산의 서열을 가르키는 결과는 정확하다(이러한 분석은 School of Life Science, 북경대학교에서 행해졌다).
[실시예14]: 인슐린 분비를 촉진하는 GLP-1(7-36)의 효과
건강한 C57/BL/6J 쥐들은 Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences에서 구입할 수 있다. 쥐들을 각 그룹에 6마리씩 세그룹으로 구분한다. 대조군은 복강에 200 μl의 식염수를 주입하고, 반면에 실험군은 10μg의 GLP-1(7-36)을 받고 양성 제어군은 10μg의 GLP-1(7-36) NH2(시그마)를 받는다. 이 동물들에 주사를 주입하는 시간을 시간0으로 셋팅한다. 헤파린으로 세척하고 그 다음 건조시킨 눈금을 모세혈관을 갖는 안각에 있는 정맥으로부터 50μl의 혈액을 추출한다. 혈액 표본을 지체없이 50μl의 식염수와 함께 초소형 원심분리기 튜브에 넣고 섞는다. 적혈구를 제거할 목적으로 이 이 혼합물을 3000rpm속도로 원심분리한다.
GLP-1(7-36)이 인슐린 분비에 주는 영향을 측정하기 위하여 인슐린에 대한 방사선 면역 측정 키트(Shanghai Institute of Biological Products, Chinese Ministry of Health)를 사용한다. 도9에 나타낸 바와 같이, 인슐린 농도의 중대한 변화가 대조군에서는 나타나지 않고 각각 GLP-1(7-36) 및 GLP-1(7-36) NH2를 받은 두개 그룹에서는 혈청 인슐린 농도에 현저한 증가를 보여준다. 이러한 관찰로부터 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1(7-36)의 투여로 쥐내 인슐린 분비를 촉진한다는 사실을 알 수 있다. 그러므로 이러한 결과는 GLP-1(7-36)은 쥐내 인슐린 분비의 증가에 의한 GLP-1(7-36) NH2와 같은 유사한 이력을 나타낸다는 사실을 증명한다.
[실시예15]: GLP-1(7-36)이 C펩타이드 분비에 주는 영향
실시예14에 설명된 바와 같이, C57/BL/6J쥐들을 복강에 200μl의 식염수 주입을 받은 대조군과 10μg의 GLP-1(7-36)을 받은 실험군의 2개 그룹으로 구분한다. C펩타이드 분비에 대한 GLP-1(7-36)의 영향을 측정하기 위하여 C펩타이드에 대한 방사선 면역 측정 키트(Shanghai Institute of Biological Products, ChineseMinistry of Health)를 사용한다.
도10에 나타낸 바와 같이, 대조군내에 C펩타이드 농도의 중대한 변화는 없고 GLP-1(7-36)을 받은 그룹은 혈청 C펩타이드 농도에 중대한 증가를 보여준다. 이러한 결과로부터 GLP-1(7-36)의 투여로 쥐내의 C펩타이드의 분비를 촉진한다는 사실을 알 수 있다.
[실시예16]: 혈당 수준을 감소시키기 위한 GLP-1(7-36)의 영향
건강한 C57/BL/6J 쥐들은 Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences에서 구입할 수 있다. 쥐들을 각 그룹에 6마리씩 네그룹으로 구분한다. 밤새 절식한 쥐들에게는 복강에 주입한다. 대조군에는 200μl의 40%포도당액을 주입하고, 실험군에는 200μl의 40% 포도당액에 10μg의 GLP-1(7-36)NH2(시그마)더하여 주입하고, 양성 제어군(II)에는 200μl의 40%포도당액에 10μg의 GLP-1(7-37)(시그마)를 더하여 주입한다. 동물들이 주사를 맞는 시점을 기준시간으로 셋팅한다. 주입후에, 20μl의 혈액 표본을 지체없이 헤파린으로 처방된 모세혈관을 갖는 각 쥐의 만곡부(optic sinus)로부터 추출한다. 혈액 표본들을 바로 300μl의 식염수와 함께 초소형 원심분리기 튜브에 넣고 섞는다. 이 혼합물에서 적혈구를 제거하기 위해 3000rpm으로 원심분리 한다. 혈청 포도당 농도를 측정하기 위해 혈청을 사용한다. 이러한 과정을 30, 60 그리고 120분마다 반복한다.
혈청 혈당 농도를 상업적 키트(Shanghai Institute of Biological Products, Chinese Ministry of Health)로 측정한다. 도11에 나타낸 바와 같이, (포도당만주입한)대조군의 혈당 농도에 현저한 증가가 있었고 정상수준으로 점차적으로 떨어지는 것이 관찰 되었다. 쥐들의 기타 다른 그룹에 대해서는, 측정기간 동안 혈청 혈당 농도에는 정상수준으로부터의 뚜렷한 증가는 없었다. 이러한 결과로부터 GLP-1(7-36), GLP-1(7-36)NH2또는 GLP-1(7-37)중 어느 하나를 주입하면 혈당 농도의 급격한 변동을 막기 위하여 쥐들 내에서는 인슐린의 분비를 촉진한다는 사실을 알 수 있다. 따라서 이러한 결과는 GLP-1(7-36)이 혈당을 낮추는 면에 있어서 GLP-1(7-36)NH2 또는 GLP-1(7-37)과 유사한 이력을 보여준다는 것을 증명한다.
비록 본 발명의 바람직한 실시예와 도면등이 전의 단락에서 설명이 되었지만, 본 발명을 개량하고 대체물이 가능한 그 기술분야의 당업자에게는 자명하고, 실질적으로 동일한 방법들과 물질들이 여전히 본 발명의 범위 내에 있고, 이것은 다음의 청구항에서 개시될 것이다.
생물학적 수탁물에 대한 간단한 설명
1. 수탁기관의 명칭 및 주소
명칭: China Committe for Culture Collection of Microorganisms General Microbiogical Culture Center
주소: Zhong-guan-cun, Beijing, China
2. 기관에 생물학제의 기탁일
2001년 7월 11일
3. 기탁기관에 의해 발행된 접근 번호
CGMCC NO.0599
4. 출원인의 성명 및 주소
성명: Shanghai Hua-Yi Bio-Tech Lab
주소: No.36 Caobao Road,Shanghai, China
본 발명에서, 발명가는 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 유전자의 두 끝에 혼성 부위를 능숙하게 결합시키면 한줄로 유전자의 1 내지 32 복제이 연결된다. 발현된 복합 단백질은 특별하게 개열 할 수 있는 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체 폴리펩타이드의 복합 단량체를 포함한다. 이런 생산 방법은 생산비용을 크게 줄일 수 있고, 다운-스트림(down-stream) 과정을 효과적으로 할 수 있으며, 재조합 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체 폴리펩타이드를 다량으로 만들어 낼 수 있다. 이 발명은 환자에게 GLP-1(7-36)를 다량으로 제공할 수 있게 해주고 타입 II 형 당뇨병 환자에게는 비용을 효과적으로 줄일 수 있는 방법이다.
<110> SHANGHAI HUA-YI BIO-TECH LAB <120> A METHOD OF PRODUCING GLUCAGON-LIKE PEPTIDE 1(GLP-1)7-36 AND AN GLP-1 ANALOGUE <150> CN01126278.8 <151> 2001-07-19 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 2 aattccagat ctatgcgtca cgcggaaggt accttcacca gcgatgtgag cagctatctg 60 60 <210> 3 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 3 accttccaga tagctgctca catcgctggt gaaggtacct tccgcgtgac gcatagatct 60 gg 62 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 4 gaaggtcagg cggcgaaaga atttatcgcg tggctggtga aaggtcgtgg atcctaga 58 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 5 agcttctagg atccacgacc tttcaccagc cacgcgataa attctttggt cgccgcctg 59 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 6 aattccgtcg acatgcgtca cgcggaaggt accttcacca gcgatgtgag cagctatctg 60 60 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 7 agcttctact cgagacgacc tttcaccagc cacgcgataa attctttggt cgccgcctg 59 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 8 aattccagat ctatgatgca cgcggaaggt accttcacca gcgatgtgag cagctatctg 60 60 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 synthetic sequence <400> 9 accttccaga tagctgctca catcgctggt gaaggtacct tccgcgtgca tagatctgg 59

Claims (18)

  1. (가) 폴리펩타이드 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩할 수 있는 유전자의 두 개의 말단에 혼성부위를 형성할 수 있는, 별도의 두 개의 엔도뉴클레아제 제한효소 개열부위를 유도하는 과정과;
    (나) 접합성의 말단을 엔도뉴클레아제 제한효소에 의해 개열 시킨후, 혼성부위를 형성하도록 연결하고, 일렬로 연결된 GLP-1(7-36) 유전자, GLP-1 유사체 유전자, 폴리펩타이드 GLP-1(7-36) 또는 GLP-1 유사체를 인코딩하는 상호 활성 결합 유전자들을 1 내지 32의 정수개의 벡터로 클로닝하는 과정과;
    (다) 직렬 연결 유전자를 포함하는 상기 벡터를 숙주 세포로 전이시키는 과정과;
    (라) 폴리펩타이드 GLP-1(7-36), GLP-1 유사체 또는 이들의 조합을 포함하지만, 어떠한 운송 단백질도 함유하지 아니하는, 1 내지 32의 정수개의 폴리펩타이드 복제본을 포함하는 융합 단백질을 숙주세포에 발현시키는 과정과;
    (마) 상기 융합 단백질을 개열시키는 과정과;
    (바) 폴리펩타이드 GLP-1(7-36) 및/또는 GLP-1 유사체를 분리하고 정제하는 과정;
    을 포함하는 인슐리노트로픽 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 및/또는 GLP-1 유사체를 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 혼성부위를 형성할 수 있는 상기 엔도뉴클레아제 제한효소가 Bgl II 및 BamH I인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 혼성부위를 형성할 수 있는 상기 엔도뉴클레아제 제한효소가 Sal I 및 Xhol I인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 1 내지 32의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 8 내지 32의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 16의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 일렬로 연결된 유전자의 N개의 복제본을 포함하는 상기 벡터에 있어서, N이 32의 정수값을 갖는 정수인 것임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 벡터가 CGMCC 기탁번호 제0599호의 기탁물 속에 포함된 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, N 개의 폴리펩타이드 복제본을 포함하는 융합 단백질을 발현 시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 1내지 32의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, N 개의 폴리펩타이드 복제본을 포함하는 융합 단백질을 발현 시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 8내지 32의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, N 개의 폴리펩타이드 복제본을 포함하는 융합 단백질을 발현 시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 16의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, N 개의 폴리펩타이드 복제본을 포함하는 융합 단백질을 발현 시킬 수 있는 숙주세포에 있어서, N이 32의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9항 내지 청구항 12항 중의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주세포가 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균 JM103, JM109, HB101 또는 DH5α인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CGMCC 기탁번호 제0599호에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질을 개열하는데 사용되는 상기 프로테아제가 클로스트리스판(Clostrispan) 또는 트립신(Trysin)인 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 GLP-1(7-36) 폴리펩타이드 및/또는 GLP-1 유사체.
  18. 제 17항에 있어서, 하기 식 I의 아미노산 배열로 도시되는 것임을 특징으로 하는 폴리펩타이드 GLP-1(7-36):
    His-Ala-Glu-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-OH (식 1)
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