ES2333413T3 - Un metodo para producir polipeptido glp-1 (7-36) insulinotropico y/o analogos de gpl-1. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir polipéptido GLP-1 (7-36) insulinotrópico y/o análogos de GLP-1 que consiste en: (a) Introducir dos puntos con división de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el polipéptido GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1; (b) Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1, o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32; (c) Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped. (d) Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora; (e) Partir la proteína de fusión; (f) Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1.
Description
Un método para producir polipéptido
GLP-1 (7-36) insulinotrópico y/o
análogos de GLP-1.
La invención describe un método para producir
péptido GLP-1 (7-36) polipéptido
similar al glucagón o análogos de péptido-1 similar
a glucagón ligando genes de una manera conjunta. La administración
exógena de GLP-1 (7-36) o análogos
de GLP-1 puede estimular la secreción de
insulina.
\vskip1.000000\baselineskip
GLP-1 (péptido-1
similar a glucagón) es una hormona peptídica segregada por células
intestinales humanas, que se desarrolla a partir de la división
proteolítica de proglucagón por una proteasa producida por célula
L, y es por lo tanto llamada péptido-1 similar al
glucagón. Múltiples estudios han demostrado que la administración
exógena de GLP-1 aumenta los efectos de secreción
de insulina. Por ejemplo, cuando la glucosa en sangre supera 6
mmol/L, una concentración muy baja de GLP-1 puede
jugar un significativo papel en el aumento de secreción de
insulina. Una vez que se restablece la glucosa en sangre en un
nivel normal, la posterior adición de GLP-1 no
tiene más efectos en la secreción de insulina.
GLP-1 está presente en dos
formas en el cuerpo humano, una es GLP-1
(7-36)-NH_{2} que consiste en 30
residuos de aminoácidos con su terminal C convertida en amida. La
otra es GLP-1 (7-37) que consiste
en 31 residuos de aminoácidos. Tanto GLP-1
(7-36)-NH_{2} como
GLP-1 (7-37) pueden tener fuertes
efectos para el aumento o mejora de secreción de insulina. En lo
relativo a los efectos mejorados de GLP-1
(7-36)-NH_{2} se ha descubierto
que la conversión a amida de la terminal C no se requiere
necesariamente, porque el péptido GLP-1
(7-36)-OH (referido de ahora en
adelante como GLP-1 (7-36) posee
efectos mejorados similares en la secreción de insulina.
Estudios previos han demostrado que
GLP-1 tiene más ventajas que la insulina en el
tratamiento de diabetes mellitus tipo II ya que
GLP-1 puede: 1) aumentar la regulación de la
transcripción y traslación de gen de proinsulina; 2) aumentar la
secreción de insulina y C-péptido, 3) aumentar la
sensibilidad del receptor celular de insulina, 4) aumentar el total
de células \beta. Además, GLP-1 también puede
disminuir: 1) la resistencia a la insulina, 2) la cantidad de
glicohemoglobina (HbA1c), fructosamina, glucagón y ácidos grasos
(Nielsen J. H. et al., Regulación de masa celular beta por
hormonas y factores del crecimiento, Diabetes, 50, supl. 1:
S25-9, 2001; Hui H. et al., Péptido 1
similar al glucagón produce diferenciación de células pancreáticas
positivas 1 de homeobox duodenal en islote en células segregadoras
de insulina, Diabetes, 50(4): 785-96,
2001.
Más notablemente, se observa que
GLP-1 es capaz de mejorar la división de célula
\beta y por lo tanto aumentar el total de células \beta, que no
se ha encontrado en otras medicinas empleadas para tratamiento de
diabetes hasta la fecha. Además, GLP-1 es efectivo
en aquellos pacientes que no han respondido al tratamiento con
administración de sulfonilurea. Además, la administración de
GLP-1 no aumenta la secreción de insulina cuando la
concentración de glucosa en sangre se restablece a un nivel normal.
Por lo tanto, no da como resultado la hipoglucemia. Por todas las
razones mencionadas, se considera que GLP-1 es una
medicina deseable para tratar diabetes mellitus. Sustanciales
estudios clínicos también han verificado este hecho (Rachman J.
et al., Normalización de respuesta de insulina a glucosa
mediante infusión nocturna de péptido similar a glucagón 1
(7-36) amida en pacientes con NIDDM, Diabetes,
45(11):1524-30, 1996; Doyle M. E. et
al., péptido 1 similar a glucagón, Progreso reciente en
Investigación de Hormonas, 56:377-99, 2001; Daniel
J. Drucker, Minireview: Los Péptidos similares a glucagón,
Endocrinología, 142(2):521-527,
2001).
2001).
WO 98/08873 está relacionada con un método para
mejorar la recuperación tras operación evitando la reacción
catabólica y resistencia a la insulina provocada por el trauma
quirúrgico. Los autores de esta publicación proponen el uso de
péptido-1 (GLP-1) similar a
glucagón o análogo para eliminar los cambios catabólicos tras
cirugía.
WO 99/43341 está relacionada con una composición
que contiene un derivado de GLP-1 con solubilidad
y/o estabilidad mejorada, y/o un método para mejorar la solubilidad
y/o estabilidad de un GLP-1 o un fragmento o un
análogo del mismo. En particular, se proporcionan los derivados de
GLP-1 con un contenido de hélice que excede el 25%
que parcialmente forma agregados estructurales del tipo
micelar.
WO 99/43705 describe derivados con terminal N de
péptido-1 (GLP-1 ) similar a
glucagón humano y análogos del mismo que tiene un perfil prolongado
de acción, así como el uso de tales derivados en composiciones
farmacéuticas para el tratamiento de obesidad, diabetes mellitus
dependiente de insulina o no dependiente de insulina. Los derivados
de GLP-1 tiene un sustituyente lipofílico unido a,
al menos, un residuo de aminoácido.
Sin embargo, el coste de las síntesis química de
GLP-1 es bastante alto. El precio al por menor de
GLP-1 con calidad de reagente es 400
\textdollar/mg, lo que restringe en gran medida su aplicación en
clínicas. Algunos investigadores han intentado usar métodos de
ingeniería genética para producir GLP-1 recombinante
ya sea como proteína de fusión o como proteína segregadora. La
producción y el coste de esta técnica para producir
GLP-1 siguen siendo aún poco satisfactorios, lo que
provoca que la producción a gran escala de GLP-1 a
un coste bajo resulte imposible en este momento. Esta invención
está dirigida a desarrollar un método nuevo para producir
GLP-1 (7-36) y/o análogos de
GLP-1 ligando genes de una manera conjunta. El
método de la presente invención puede usarse para simplificar el
proceso, para disminuir el coste de producción, y posibilitando de
este modo la producción de GLP-1
(7-36) y/o análogos de GLP-1 a gran
escala.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención está relacionada con un método
para producir polipéptido insulinotrópico GLP-1
(7-36) y/o análogos de GLP-1 que
consiste en:
- (a)
- Introducir dos puntos con división de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1;
- (b)
- Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1. o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32;
- (c)
- Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped.
- (d)
- Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora;
- (e)
- Partir la proteína de fusión;
- (f)
- Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1.
Las endonucleasas restrictivas anteriormente
mencionadas capaces de formar híbridos pueden incluir, aunque no se
limitan a, Bgl II y BamH I, Sal y Xho I.
El vector en el método de acuerdo con la
presente invención puede contener genes unidos a N series o genes
de GLP-1 (7-36) unidos
interactivamente y/o genes análogos de GLP-1, donde
N es un número entero entre 2 y 32. Preferiblemente, N es un número
entero de 8 a 32. Más preferiblemente, N debería ser 16 o 32.
Las células huéspedes usadas en el método de
acuerdo con la presente invención pueden expresar una proteína de
fusión que contiene N copias de polipéptido GLP-1
(7-36) y/o análogos de GLP-1, en
las cuales N es un número entero de 2 a 32. La proteína de fusión
puede contener N copias de polipéptido GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1. También
puede contener múltiples copias de polipéptido
GLP-1 (7-36) y análogos de
GLP-1 con los números totales de copias igual a N.
Preferiblemente, N es un número entero de 8 a 32. Más
preferiblemente, N es un número entero de 16 o 32.
Preferiblemente, las células huéspedes de esta
invención que expresan GLP-1 (7-36)
y/o análogos de GLP-1 son células
procarióticas.
El péptido GLP-1
(7-36) producido por el método de esta invención
tiene la secuencia de aminoácido tal y como se muestra en la
fórmula 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 muestra el proceso de construcción de
un vector de expresión que contiene una copia del gen que codifica
el polipéptido GLP-1 (7-36).
Figura 2 muestra la secuencia de ADN resultante
que codifica el polipéptido GLP-1
(7-36) tras la ligadura de fragmentos (1), (2), (3)
y (4).
Figura 3 muestra la secuencia de ADN resultante
que codifica el polipéptido GLP-1
(7-36) tras la ligadura de fragmentos (1'), (2'),
(3') y (4').
Figura 4 muestra el proceso de construir un
plásmido que contiene de 2 a 32 copias de genes
GLP-1(7-36)
conjuntamente.
Figura 5 muestra la curva de crecimiento de
células bacterianas construidas genéticamente durante el proceso de
fermentación.
Figura 6 muestra el resultado del análisis HPLC
del polipéptido recombinante GLP-1
(7-36) que no forma parte de la presente
invención.
Figura 7 muestra los resultados del análisis de
aminoácido del polipéptido recombinante GLP-1
(7-36) que no forma parte de la presente
invención.
Figura 8 muestra los resultados del análisis por
espectrometría de masa del polipéptido recombinante
GLP-1 (7-36) que no forma parte de
la presente invención.
Figura 9 muestra la variación de concentración
de insulina en sangre de ratones después de inyectar a los ratones
con polipéptido GLP-1 (7-36) que no
forma parte de la presente invención.
Figura 10 muestra la variación de la
concentración de C-péptido en sangre de ratones
después de inyectar a los ratones con polipéptido
GLP-1 (7-36) que no forma parte de
la presente invención.
Figura 11 muestra la variación de la
concentración en glucosa en sangre de ratones después de inyectar a
los ratones con polipéptido GLP-1
(7-36) que no forma parte de la presente
invención.
Esta invención proporciona un diseño delicado de
secuencias de ADN que presentan las zonas híbridas para ligar
múltiples copias de genes que codifican GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1
conjuntamente. La expresión de los fragmentos de ADN resultantes
unidos en serie o interactivamente enlazados puede producir una
proteína de fusión que contiene múltiples copias de
GLP-1 (7-36) y/o análogos de
GLP-1. Tras la partición de la proteína de fusión y
de purificaciones adicionales, pueden obtenerse grades cantidades
de GLP-1 (7-36) y/o análogos de
GLP-1.
"Análogos de GLP-1" aquí
empleados hacen referencia a aquellos polipéptidos que pueden
obtenerse por alteración, sustitución o modificación de uno o más
residuos de aminoácidos en la secuencia mostrada en la Fórmula I, o
en la secuencia de aminoácido del polipéptido que naturalmente
ocurre GLP-1
(7-37)-OH.
Estudios previos han mostrado que muchos
análogos de GLP-1 presentan características
similares en el aumento de secreción de insulina. Representantes de
análogos de GLP-1 incluyen aquellos descritos en US
5,545,618 y WO 01/98331 A2. Estos análogos se obtienen mediante
alteración de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido
que naturalmente ocurre GLP-1
(7-37)-OH en la posición 8, 11, 12,
16, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 33, 34 0 35. Representantes de análogos
de GLP-1 pueden incluir, aunque no se limitan a:
Gly^{8}-GLP-1(7-36),
Val^{8}-GLP-1(7-36),
Asp^{11}-GLP-1(7-36),
Ala^{16}-GLP-1(7-36),
Glu^{22}-GLP-1(7-36),
His^{23}-GLP-1(7-36),
Glu^{24}-GLP-1(7-36),
Trp^{26}-GLP-1(7-36),
Ala^{27}-GLP-1(7-36),
Glu^{30}-GLP-1(7-36),
Asp^{33}-GLP-1(7-36),
Glu^{34}-GLP-1(7-36),
Thr^{35}-GLP-1
(7-36), Gly^{8}
-Glu^{24}-GLP-1(7-36),
Leu^{8}-Ala^{33}-GLP-1
(7-36),
Thr^{36}-Arg^{37}-GLP-1(7-37),
Ser^{36}-Arg^{37}-GLP-1(7-37)
etc.
Los análogos de GLP-1 contienen
residuos de aminoácidos de sustitución conservadora. Así mismo,
estos análogos de GLP-1 pueden contener residuos de
aminoácidos de elevada sustitución conservadoras.
Una "sustitución conservadora" es la
sustitución de un aminoácido que tiene la misma carga electrónica
neta y aproximadamente el mismo tamaño y misma forma.
Una "sustitución elevadamente conservadora"
es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene el
mismo grupo funcional en cada lateral y casi el mismo tamaño y la
misma forma. Por ejemplo, aminoácidos con cadenas laterales de
aminoácidos alifáticos o alifáticos sustituidos tienen casi el mismo
tamaño cuando el número total de carbonos y heteroátomos en sus
cadenas laterales no difiere en más de dos. Tienen casi la misma
forma cuando tienen el mismo número de ramas en sus cadenas
laterales. Ejemplos de sustitución elevadamente conservadora
incluyen valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico
por ácido glutámico y fenilglicina por fenilalanina. Ejemplos de
sustituciones que no son elevadamente conservadoras incluyen
alanina por valina, alanina por serina y ácido aspártico por
serina.
Por lo tanto, la presente invención trata sobre
un método para producir polipéptido insulinotrópico de
GLP-1 (7-36) y/o análogos de
GLP-1 que consiste en:
- (a)
- Introducir dos puntos con división o partición de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1;
- (b)
- Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1, o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32;
- (c)
- Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped.
- (d)
- Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora;
- (e)
- Partir la proteína de fusión;
- (f)
- Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1.
Las endonucleasas restrictivas anteriormente
mencionadas capaces de formar híbridos pueden incluir, aunque no se
limitan a, Bgl II y BamH I, Sal y Xho I. Por ejemplo, la secuencia
base reconocida por Bgl II es A|GA TCT, mientras que la
reconocida por BamH I es G|GA TCC. Tras la digestión de las dos
secuencias con las correspondientes enzimas restrictivas, la
ligadura de los extremos cohesivos complementarios resultantes
puede formar una secuencia de AGA TCC o GGA TCT, que no puede
diseccionarse ni por parte de Bgl II ni por BamH I. Dicha secuencia
se denomina "zona híbrida" que puede usarse para ligar
múltiples copias de ciertos genes en conjunto.
La proteína de fusión está compuesta por
múltiples copias de GLP-1 (7-36)
y/o análogos de GLP-1. Entre los dos péptidos unidos
(dos polipéptidos GLP-1 (7-36), dos
polipéptidos análogos GLP-1, o un polipéptido
GLP-1 (7-36) y un polipéptido
análogo GLP-1), hay uno o más residuos de
aminoácidos. Con el fin de la partición, el enlace de polipéptido
formado entre la terminal N de cada uno de los polipéptidos
deseados (GLP-1 (7-36) o análogo
GLP-1) y los residuos mencionados debe haber un
"enlace de polipéptido específicamente divisible".
Un "enlace de polipéptido específicamente
divisible" aquí usado hace referencia a un enlace de polipéptido
que puede ser específicamente reconocido y partido por ciertos
reagentes químicos o proteasas. Como resultado de la partición, la
cadena peptídico se rompe. Los residuos de aminoácidos aquí
empleados para formar en enlace peptídico específicamente divisible
con la terminal N de GLP-1 (7-36) o
análogo GLP-1 son llamados "aminoácidos que
forman enlace (BFAA)". BFAA pueden incluir, aunque no se limitan
a, Met que puede ser reconocido por bromuro de cinógeno, Arg que
puede ser reconocido por proteasa alcalina, y la secuencia de
aminoácido de Asp Asp Asp Lys que puede ser reconocida por
Enteroquinasa.
Una proteína de fusión puede partirse en los
"enlaces de péptido específicamente divisibles" usando métodos
adecuados. Tras la partición, la proteína de fusión puede romperse
en múltiples copias de polipéptidos GLP-1
(7-36) y/o polipéptidos análogos de
GLP-1, teniendo cada polipéptido varios aminoácidos
unidos a su terminal N. El proceso arriba descrito se denomina
partición terminal N del péptido objetivo.
Tomando como ejemplo una proteína de fusión
consistente en múltiples copias de GLP-1
(7-36), la partición terminal N de la proteína de
fusión puede generar múltiples copias de GLP-1
(7-36)-Xaa- \cdot \cdot \cdot
Xaa, donde Xaa \cdot \cdot \cdot Xaa
representa uno o más residuos de aminoácidos conectados entre sí. Debido a que el residuo de aminoácido en la terminal C de GLP-1 (7-36) es Arg, usando cierta proteasa que puede reconocer de manera específica el enlace peptídico formado en el carboxilo de ARg, la partición de GLP-1 (7-36)-Xaa \cdot \cdot \cdot Xaa dará como resultado múltiples moléculas de polipéptido GLP-1 (7-36). El proceso que tiene lugar en la terminal C del péptido objetivo se llama partición en terminal C.
representa uno o más residuos de aminoácidos conectados entre sí. Debido a que el residuo de aminoácido en la terminal C de GLP-1 (7-36) es Arg, usando cierta proteasa que puede reconocer de manera específica el enlace peptídico formado en el carboxilo de ARg, la partición de GLP-1 (7-36)-Xaa \cdot \cdot \cdot Xaa dará como resultado múltiples moléculas de polipéptido GLP-1 (7-36). El proceso que tiene lugar en la terminal C del péptido objetivo se llama partición en terminal C.
La orden para el proceso de partición en la
terminal N y el proceso de partición en la terminal C pueden
intercambiarse.
Normalmente, el residuo Arg se añade a la
terminal C de GLP-1 (7-36), y se
usa una proteasa adecuada para la partición, que específicamente
reconoce el enlace peptídico formado en el carboxilo de Arg. Por lo
tanto, la proteína de fusión puede cortarse en múltiples moléculas
de polipéptido GLP-1 (7-36) sin unir
otro residuo ya que el residuo de aminoácido en el aminoácido en
terminal C de GLP-1 (7-36) es Arg.
También es posible añadir Met a la terminal C de
GLP-1 (7-36). El enlace peptídico
formado con este Met puede dividirse en primer lugar con CNBr y a
continuación el péptido resultante se parte por la acción de una
proteasa adecuada para producir múltiples moléculas de péptido
GLP-1 (7-36) ya que el aminoácido
en terminal C de GLP-1 (7-36) es
Arg. La orden para la partición en la terminal N y el proceso de
partición en terminal C pueden intercambiarse. También es factible
añadir la secuencia de aminoácido Asp Asp Asp Asp Lys a la terminal
N de GLP-1 (7-36), estando esta
secuencia específicamente partida por proteasa enteroquinasa. La
partición proteolítica por enteroquinasa puede también producir
múltiples moléculas de péptido GLP-1
(7-36).
Es preferible añadir un residuo Arg a la
terminal N de polipéptido GLP-1
(7-36) y análogos GLP-1.
En base a la secuencia de aminoácido de
GLP-1 (7-36) o análogos de
GLP-1, el gen que codifica GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1 también
puede sintetizarse con la adición de un codón que codifica "el
aminoácido que forma péptido" en la terminal 5' del fragmento
sintético. La secuencia de enlace y la secuencia reconocida por la
enzima restrictiva también se incluyen en los dos extremos del gen
sintético. Tras esta modificación, puede formarse un fragmento de
ADN que contiene el codón codificador de GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1 y las
parejas base en los dos extremos que son reconocidos por las
endonucleasas restrictivas. Este fragmento puede usarse para enlazar
múltiples copias de GLP-1 (7-36) o
análogos de GLP-1 de manera conjunta y por lo tanto
se denomina "gen para conexión en serie".
También es posible modificar la secuencia de ADN
de GLP-1 que ocurre de manera natural para generar
el "gen para conexión en serie". Es preferible emplear métodos
sintéticos para preparar el gen en la presente invención.
Se conoce muy bien que un aminoácido puede
codificarse por múltiples codones. Un experto en la técnica puede
deducir y sintetizar varias secuencias de ADN y combinaciones de
secuencias codificadoras de GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1. En esta
invención, los codones con elevada frecuencia en E. coli son
preferentes.
El gen codificador del péptido
GLP-1 (7-36) o análogos de
GLP-1 puede generarse de dos maneras. Una manera es
ligando varios fragmentos sintéticos mediante extremos cohesivos o
extremos sin punta para generar el gen objetivo, y la otra es
sintetizar todo el gen objetivo mediante síntesis química. Es
preferible sintetizar varios fragmentos y a continuación generar el
gen objetivo mediante ligadura.
Las zonas de partición de endonucleasa
restrictiva que pueden formar zonas híbridas en los extremos 5' y
3' de los genes codificadores de GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1 con el
fin de enlazar múltiples copias de genes en conjunto requieren una
cuidadosa selección y un delicado diseño. La selección de zonas de
reconocimiento de endonucleasas restrictivas con el fin de clonar
basado en las zonas de endonucleasas en un vector y la selección de
zonas de reconocimiento disponibles es relativamente abundante.
En una realización preferente de esta invención,
los inventores eligen codones con elevada frecuencia en E.
coli para sintetizar cuatro fragmentos de gen. Tras la
ligadura, el gen resultante recombinante GLP-1
(7-36) tiene zonas de endonucleasas restrictivas de
Bgl II y BamH I en sus dos extremos, respectivamente, que son
requeridas para la inserción en el vector. Las posiciones para las
zonas de reconocimiento de Bgl II y BamH I pueden
intercambiarse.
En otra realización preferente de esta
invención, los inventores eligen codones con elevada frecuencia en
E. coli para sintetizar cuatro fragmentos de gen. Tras la
ligadura, el gen resultante GLP-1
(7-36) tiene zonas de endonucleasas restrictivas de
Sal I y XhoI I, que son requeridas para el enlace de genes en
conjunto. Las zonas de clonación de EcoR I y Hind III son requeridas
para la inserción en el vector.
Múltiples copias de genes codificadores de
GLP-1 (7-36) o análogos de
GLP-1 pueden unirse de manera conjunta usando las
zonas de endonucleasa arriba mencionadas, y a continuación pueden
clonarse en un vector. Estos genes unidos en conjunto también
pueden mezclarse y unirse. El término "mezcla y unión" hace
referencia a un número de fragmentos mezclados de ADN codificadores
de GLP-1 (7-36) y/o análogos de
GLP-1 unidos en conjunto en cualquier orden. Los
vectores que son adecuados para este fin pueden derivarse de
cromosomas, no derivarse de cromosomas o pueden ser vectores
sintéticos de ADN. Estos vectores pueden incluir, aunque sin
limitar a, ADN micrófago, virus bacillus, plásmido bacterial,
plásmido de levadura, y vectores derivados de combinaciones de
fago, plásmido y ADN viral. El ADN viral puede incluir, aunque no
se limita a, virus de la viruela bovina y aviar, adenovirus y virus
de pseudo rabia. Muchos de los vectores adecuados son bien
conocidos por los expertos en la técnica. Cualquier plásmido o
vector que exista y replique de manera estable en células huéspedes
puede usarse en esta
invención.
invención.
Los ejemplos representativos pero ilimitados de
vectores de expresión incluyen los usados en sistemas bacteriales,
como los plásmidos comercialmente disponibles
pKK233-2, pKK223-3, pEZZ18, pUC18,
pUC19 y pT7 (Amersham Pharmacia Biotech).
El gen objetivo se une con un promotor apropiado
en un vector de expresión. Un promotor es una secuencia que puede
regular y controlar la expresión del gen. Ejemplos representativos
de promotor incluyen lac, trp, tac de E. coli; T7 de
fago; P_{L} de fago \lambda y otros promotores conocidos
existentes en células procarióticas y eucarióticas para controlar
la expresión del gen. Merece la pena mencionar que estos promotores
en bacterias incluyen lac I, lac Z, T3, T7, Proteína
A señal péptida, gpt, \lambdaP_{R}, P_{L} y trp.
La selección de los promotores apropiados resulta obvia para un
experto en la técnica.
Además, el vector de expresión preferente puede
tener uno o más genes marcadores de selección para hacer que las
células huéspedes se puedan analizar. Los representantes incluyen
genes resistentes a la tetracilina y penicilina en E. Coli,
genes resistentes a dihidrofolato reductasa y neomicina en sistemas
eucarióticos de expresión.
Los vectores de expresión en esta invención
pueden contener N copias de los genes unidos en conjunto, donde N
es un número entero entre 2 y 32. Preferiblemente, N debería ser un
número entero entre 8 y 32. Más preferiblemente, N debería ser 16
o 32.
En otra realización preferente de esta
invención, el vector de expresión contiene 2 copias del gen
GLP-1 (7-36) unidas
conjuntamente.
En otra realización preferente de ejemplo
presentada en esta invención, el vector de expresión contiene 4
copias del gen GLP-1 (7-36) unidas
conjuntamente.
En otra realización preferente de esta
invención, el vector de expresión contiene 8 copias del gen
GLP-1 (7-36) unidas
conjuntamente.
En otra realización preferente de esta
invención, el vector de expresión contiene 12 copias del gen
GLP-1 (7-36) unidas
conjuntamente.
En otra realización preferente de esta
invención, el vector de expresión contiene 16 copias del gen
GLP-1 (7-36) unidas
conjuntamente.
En otra realización preferente de ejemplo
presentada en esta invención, el vector de expresión contiene 32
copias del gen GLP-1 (7-36) unidas
conjuntamente.
Los inventores han depositado una cepa
bacteriana que transporta el vector de expresión recombinante
pKK223-3 que contiene 32 copias de genes
GLP-1 (7-36) unidas conjuntamente.
El número en el depósito de la cepa es CGMCC Nº 0599.
El vector presentado en esta invención que
transporta múltiples copias de genes y promotores apropiados u
otros componentes reguladores en la expresión del gen pueden
transformarse en células huéspedes apropiadas para expresar la
proteína de fusión en las células huéspedes.
El vector de expresión puede introducir en las
células huéspedes mediante métodos de ingeniería genética como
transformación, transfección o infección, por ejemplo,
transformación con cloruro cálcico, transfección en presencia de
dextrano DHAE como portador o electro perforación. Estos métodos
pueden transferir de manera eficiente el vector que contiene
múltiples copias de gen a las células huéspedes. El vector aquí
referido puede ser plásmido, partícula viral o fago bacteriano.
Las células huéspedes adecuada pueden incluir,
aunque no se limitan a, células bacterianas como E. coli,
estreptococo y salmonella, y células eucarióticas como levadura
etc. La selección de las células huéspedes apropiadas es obvia para
el experto en la técnica.
Con el fin de disminuir los costes, las células
procarióticas son preferentemente células huéspedes. Ejemplos
representativos incluyen muchas cepas de Escherichia coli,
como JM103, JM109, HB101 y DH5\alpha.
La célula huésped transporta un vector de
expresión que contiene N copias de gen codificador de
GLP-1 (7-36) y/o análogos de
GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32. En
consecuencia, las células huéspedes expresan proteínas de fusión
que contienen N copias de péptidos GLP-1
(7-36) y/o análogos de GLP-1 unidos
de manera conjunta, donde N es un número entero entre 2 y 32,
preferiblemente N debería ser un número entero entre 8 y 32, y más
preferiblemente, N debería ser un número entero
\hbox{entre 16
y 32. La proteína de fusión no contiene otras proteínas
portadoras.}
En otra realización preferente de esta
invención, el plásmido de expresión que contiene 2 copias de gen
GLP-1 (7-36) se transforma en
células de E. Coli JM103. Las células JM103 creadas
genéticamente pueden expresar la proteína de fusión que contiene
dos polipéptidos GLP-1 (7-36).
En otra realización preferente de esta
invención, el plásmido de expresión que contiene 4 copias de gen
GLP-1 (7-36) se transforma en
células de E. Coli JM103. Las células JM103 creadas
genéticamente pueden expresar la proteína de fusión que contiene
cuatro polipéptidos GLP-1
(7-36).
En otra realización preferente de esta
invención, el plásmido de expresión que contiene 8 copias de gen
GLP-1 (7-36) se transforma en
células de E. Coli JM103. Las células JM103 creadas
genéticamente pueden expresar la proteína de fusión que contiene 8
polipéptidos GLP-1 (7-36).
En otra realización preferente de esta
invención, el plásmido de expresión que contiene 12 copias de gen
GLP-1 (7-36) se transforma en
células de E. Coli JM103. Las células JM103 creadas
genéticamente pueden expresar la proteína de fusión que contiene 12
polipéptidos GLP-1 (7-36).
En otra realización preferente de esta
invención, el plásmido de expresión que contiene 16 copias de gen
GLP-1 (7-36) se transforma en
células de E. Coli JM103. Las células JM103 creadas
genéticamente pueden expresar la proteína de fusión que contiene 16
polipéptidos GLP-1 (7-36).
En otra realización preferente de esta
invención, el plásmido de expresión que contiene 32 copias de gen
GLP-1 (7-36) se transforma en
células de E. Coli JM103. Las células JM103 creadas
genéticamente pueden expresar la proteína de fusión que contiene 32
polipéptidos GLP-1 (7-36).
De acuerdo con el "Tratado de Budapest sobre
el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a
los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes", una cepa
bacteriana genéticamente producida que puede expresar la proteína de
fusión que contiene 32 polipéptidos GLP-1
(7-36) se ha depositado en el Centro General Chino
de Colección de Cultivos Microbiológicos (CGMCC). La fecha del
depósito es el 11 de Julio de 2001 y el número del depósito es
CGMCC Nº 0599.
La cepa depositada transporta un plásmido que
contiene 32 copias unidas en serie del gen GLP-1
(7-36). El depósito es para comodidad de aquel
experto en la técnica. Cualquier reproducción, uso o venta del
microorganismo depositado requiere el permiso particular por parte
de los inventores. Tales permisos aquí no se han concedido.
La cepa genéticamente producida depositada en
esta invención puede cultivarse bajo condiciones apropiadas para
producir y acumular las proteínas compuestas por N copias de los
polipéptidos enlazados. Las condiciones de cultivo como el medio de
cultivo, temperatura, humedad y valor pH resultan obvias para los
expertos en la técnica.
Después de que las células huéspedes hayan
crecido en una densidad apropiada, pueden normalmente cosecharse
mediante centrifugación. Las células se rompen mediante métodos
físicos o químicos. El producto resultante de la operación
mencionada se recoge y se somete a otra purificación.
Las células de microorganismos que expresan
proteínas recombinantes pueden romperse a través de cualquier medio
convencional, que puede incluir, pero sin limitar, ciclos de
congelación y deshielo, tratamientos ultrasónicos o mecánicos y
agentes para lisis celular. La selección del protocolo apropiado
para romper las células huéspedes es obvia para aquel experto en la
técnica.
Las proteínas de fusión presentes en esta
invención están compuestas por múltiples polipéptidos. Los
polipéptidos pueden ser GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1 o una
mezcla de estos dos. Hay varios residuos de aminoácido entre los
dos péptidos vecinos. Estos dos péptidos pueden ser dos péptidos
GLP-1 (7-36), dos péptidos análogos
de GLP-1, o un polipéptido GLP-1
(7-36) y un análogo de GLP-1. Los
aminoácidos unidos a la terminal N de cada GLP-1
(7-36) y análogo GLP-1 son
"aminoácidos que forman péptidos", tal y como se ha descrito
anteriormente, que forman un "enlace peptídico específicamente
divisible" con el residuo aminoácido en terminal N de cada
péptido GLP-1 (7-36) o péptido
análogo de GLP-1. Bajo condiciones adecuadas para la
partición y con sustancias apropiadas, las proteína de fusión puede
partirse en la terminal N de cada péptido GLP-1
(7-36) o péptido análogo de GLP-1,
produciendo múltiples péptidos GLP-1
(7-36) o análogos GLP-1 con varios
aminoácidos de unión en su terminal C. Por ejemplo, la proteína de
fusión compuesta por N copias de polipéptido GLP-1
(7-36) se parte para producir
GLP-1(7-36)-Xaa...Xaa,
donde Xaa \cdot \cdot \cdot Xaa representa uno o más residuos
de aminoácidos en conjunto. Además, debido a que la terminal C de
GLP-1 (7-36) es un residuo Arg, el
enlace peptídico formado entre el Arg y Xaa \cdot \cdot \cdot
Xaa puede partirse de manera específica por la proteasa apropiada
para producir GLP-1
(7-36).
(7-36).
Como solución para simplificar el proceso de
partición, Arg se elige como "aminoácido que forma el
péptido". La proteasa se usa para partir de manera específica el
enlace peptídico formado a través del grupo carboxilo de Arg. De
esta manera, la proteína de fusión puede hidrolizarse en múltiples
moléculas del polipéptido únicamente con el paso de partición.
En una realización preferente de esta invención,
Met se elige como el aminoácido que forma el péptido. CNBr se usa
para romper el enlace peptídico formado por la participación del
grupo carboxilo de Met, seguido de proteasa (por ejemplo,
clostripaína) que específicamente reconoció el enlace peptídico
formado por la participación del grupo carboxilo de Arg. Este
proceso produce múltiples péptidos GLP-1
(7-36) sin modificación de amidas en la terminal C.
El orden de los dos pasos mencionados puede intercambiarse. En otra
realización preferente, se elige Arg como "aminoácido que forman
el péptido". Tripsina de proteasa pancreática puede
específicamente partir el enlace peptídico formado pro la
participación del grupo carboxilo de Lys o Arg. Se usan algunos
anhídridos en este proceso para proteger Lys. Como resultado, la
tripsina puede usarse para partir de manera específica el enlace
peptídico formado por la participación del grupo carboxilo de Arg.
Por lo tanto, un paso de la participación puede producir múltiples
péptidos GLP-1 (7-36) sin
modificación de amidas en la terminal C.
Tras la partición de la proteína de fusión, el
polipéptido elevadamente puro puede obtenerse a través de una serie
de pasos de separación y purificación como los métodos
cromatográficos. Los métodos cromatográficos pueden incluir, aunque
no se limitan a, cromatografía con intercambio de ión,
cromatografía hidrofóbica, con exclusión de tamaño y fase inversa.
El medio empleado en estas cromatografías puede adquirirse en los
vendedores comerciales, como Amersham Pharmacia Biotech, Whatman,
Merk KGaA y Grace Vydac, etc. Una única cromatografía o pasos con
combinaciones de múltiples cromatografías pueden usarse en los
procesos de purificación. En general, se usa HPLC como medio de
purificación. Normalmente se usa la cromatografía en fase inversa
C18 con sistema TFA-CH_{3}CN con fase móvil. Estos
métodos cromatográficos son bien conocidos por los expertos en
la
técnica.
técnica.
Debería señalarse que, aunque el método para
producir polipéptido GLP-1 (7-36)
se describe de ahora en adelante para ilustrar la presente
invención, el experto en la técnica considerará aparente el hecho
de que este método también puede usarse para producir análogos de
GLP-1, siempre y cuando el residuo de aminoácido en
la terminal N y C de un análogo de GLP-1 puede
formar un "enlace peptídico específicamente divisible" con los
residuos de aminoácido vecinos, mientras que la partición no
ocurrirá internamente en el polipéptido. Por lo tanto, los métodos
para producir análogos de GLP-1 ligando genes de
manera conjunta se encuentran en el alcance de lo que se reivindica
en la presente invención.
Normalmente, un análogo de GLP-1
contiene Arg en su terminal C, pero no contiene Arg en ninguna otra
posición de la secuencia de aminoácido del análogo. Estos análogos
GLP-1 pueden incluir, aunque no se limitan a,
Gly^{8}-GLP-1
(7-36),
Val^{8}-GLP-1
(7-36), Asp^{11} -GLP-1
(7-36),
Ala^{16}-CLP-1(7-36),Glu^{22}-GLP-1(7-36),
-His^{23}-GLP-1(7-36),
Glu^{24}-GLP-1(7-36),
Trp^{26}-GLP-1(7-36),
Ala^{27}-GLP-1(7-36),
Glu^{30}-GLP-1(7-36),
Asp^{33}-GLP-1(7-36),
Glu^{34}-GLP-1(7-36),
Thr^{35}-GLP-1(7-36),
Gly^{8}-Glu^{24}-GLP-1(7-36),
Leu^{8}-Ala^{33}-GLP-1(7-36),
Thr^{36}-Arg^{37}-GLP-1(7-37),
Ser^{36}-Arg^{37}-GLP-1(7-37),
etc.
En comparación con otros métodos de producción
de GLP-1 (7-36) y análogos de
GLP-1, el método de la presente invención presenta
varios méritos. La síntesis química de GLP-1 es
técnicamente exigente y el costo es elevado. Los métodos para
producir GLP-1 recombinante por medio de técnicas de
ingeniería genética han tenido muy poco éxito. Generalmente se
describen de la siguiente manera:
- (1)
- Un polipéptido consistente en 20 a 60 residuos de aminoácidos expresado en células huéspedes se degrada fácilmente. Por lo tanto, la expresión directa de tal polipéptido no es factible. La fusión de dicho polipéptido con una proteína portadora para formar cuerpos de inclusión insoluble da como resultado una pequeña degradación. El polipéptido, bajo la mayoría de circunstancias, sólo cuenta el diez por ciento de la proteína de fusión en términos de producción. Después de la expresión de la proteína de fusión, se lleva a cabo la separación y purificación de los cuerpos de inclusión. La siguiente partición de la proteína de fusión normalmente se lleva a cabo con bromuro de cianógeno en 70% de solución de ácido fórmico. Normalmente, la proteína portadora también se parte en múltiples piezas polipeptídicas cuando la partición se realiza sobre una proteína de fusión. Estas piezas añaden pasos de procesos y costos adicionales en el siguiente proceso de separación y purificación de proteína. Si GLP-1 (7-36)NH_{2} es el producto final deseado, la transformación a amida tiene que llevarse a cabo en la terminal C del péptido recombinante. En resumen, la producción del polipéptido recombinante usando el método descrito es baja, el coste es elevado y el proceso de producción puede causar más contaminación ambiental.
- (2)
- Los métodos para producir GLP-1 descritos en US 5,512,459, 5,655,456, 5,707,826, 6,037,143, 6,403,361 tienen algunas cuestiones principales que deberían resolverse en primer lugar: la partición selectiva de la proteína de fusión seguida de una eficiente purificación, el requisito de sustratos de dipéptido y tripéptido en el proceso de transpeptidación y la seguridad de que solamente Lys^{34} en GLP-1 (7-34)-Ala-Phe-Ala participa en la transpeptidación, pero no Lys^{26}. Por consiguiente, esta metodología es complicada y difícil de controlar.
- (3)
- Unir un péptido señalizador a GLP-1 para producirlo como proteína segregadora. Este método normalmente produce una baja cantidad de GLP-1 recombinante.
En la presente invención, los inventores
introducen de manera maestra zonas híbridas en los dos extremos del
gen codificador de GLP-1 (7-36) o
análogos de GLP-1 para enlazar de 1 a 32 copias de
tal gen en conjunto. La proteína de fusión expresada contiene
múltiples monómeros de polipéptidos GLP-1
(7-36) o análogos de GLP-1 que son
específicamente divisibles. Este método de producción puede
disminuir en gran medida los costes de producción, hacer más
eficiente el proceso, y generar una elevada producción de
polipéptidos recombinantes GLP-1
(7-36) y/o análogos de GLP-1. Esta
invención hace posible proporcionar elevadas cantidades de
GLP-1 (7-36) a clínicas y es un
remedio de bajo coste para pacientes con diabetes mellitus tipo
II.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no
pretenden de ningún modo limitar el alcance de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se diseñan cuatro fragmentos de ADN de acuerdo
con la secuencia de aminoácido de GLP-1
(7-36) tras la selección de codones que E.
Coli frecuentemente usa. El codón Arg se añade a la terminal 5'
del gen GLP-1 (7-36) con el fin de
crear una zona de partición de la proteína de fusión resultante. En
la terminal 5' y 3', las zonas de partición para endonucleasas
restrictivas Bgl II y BamH I se introducen respectivamente, y por
lo tanto extremos cohesivos complementarios aparecen de la
digestión restrictiva de Bgl II y BamH I, lo que facilita la
ligadura de fragmentos de ADN en conjunto. El proceso de
construcción para crear el plásmido de expresión que contiene una
copia de gen GLP-1 (7-36) se muestra
en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cuatro fragmentos se sintetizan con el
sintetizador de ADN ABI 3900® (Applied Biosystems). Las secuencias
de fragmentos se muestran respectivamente del siguiente modo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento (1) contiene en su terminal 5' las
zonas que son reconocidas por EcoR I y Bgl II, y contiene un codón
CGT que codifica Arg. El fragmento (2) tiene la secuencia que es
complementaria a la del fragmento (1). El fragmento (4) contiene
las zonas que pueden ser reconocidas por Hind III y BamH I en su
terminal 5'. El fragmento (3) tiene la secuencia que es
complementaria a la del fragmento (4). La zona AGA TCC reconocida
por Bgl II en el fragmento (1) puede intercambiarse con CGA TCC tal
y como la reconoce BamH I en el fragmento (4).
\vskip1.000000\baselineskip
La ligadura se lleva a cabo tal y como se
describe en "Molecular Cloning" (2ª edición por Sam Brook
et al., publicado por Cold Spring Harbor Press). A
continuación sigue una breve descripción: Los cuatro fragmentos de
ADN (contenido de cada uno: A_{260nm}=5) se disolvieron en 50
\mul de agua doblemente destilada en cuatro tubos para
micro-centrifugado, respectivamente, los cuatro
tubos se marcaron individualmente como Nº 1 (A), Nº 2 (B), Nº 3 (C)
y Nº 4 (D). 1 \mul de solución de los tubos Nº 1 y Nº 2 se retiró
respectivamente en un tubo para micro-centrifugado
de 1.5 ml y se mezcló. De manera similar, 1 \mul de solución de
los tubos Nº 3 y Nº 4 se recogió con pipeta y se mezcló en otro
tubo para micro-centrifugado. Se añadieron 1 \mul
de 10 \times búfer de polinucleótido quinasa, 1 \mul de 1 mM
ATP y 1 \mul de polinucleótido quinasa a los dos tubos
respectivamente. Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora y a
continuación se incubaron a 90ºC durante 5 minutos para desactivar
la quinasa. Después los tubos fueron gradualmente enfriados a
temperatura ambiente (RT). Después, los tubos se mezclaron con la
adición de 1 \mul de 1 mM ATP, 1 \mul de 10 \times T_{4}ADN
búfer ligasa y 1 \mul de T_{4}ADN ligasa. La mezcla se incubó a
16ºC durante la noche. La finalización de la ligadura se verificó
comprobando el tamaño del fragmento sobre 1% gel de agarosa con
bromuro de etidio
(EB).
(EB).
\vskip1.000000\baselineskip
Plásmido pKK223-3 (Amersham
Pharmacia Biotech) en primer lugar se digirió doblemente con EcoR I
y Hind III bajo condiciones apropiadas. A continuación, se añadió
fenol-cloroformo y la fase acuosa se lavó dos veces
con cloroformo. El ADN plásmido digerido se precipitó por
isopropanol a temperatura ambiente durante una hora antes de la
centrifugación. El disolvente orgánico en el precipitado se retiró
mediante vaporización.
El gen ligado GLP-1
(7-36) se mezcló con la solución de plásmido
doblemente digerida y se añadió 1 \mul de 1 mM ATP, 1 \mul de
10 \times T_{4}ADN búfer ligasa y 1 \mul de T_{4}ADN ligasa.
La mezcla se incubó a 18ºC durante la noche.
\vskip1.000000\baselineskip
Se eligió una única colonia JM103 y a
continuación se cultivó en 50 ml de medio líquido LB a 37ºC hasta
que la absorción espectral a 600 nm (A_{600nm}) de cultivo
bacteriano alcanzó 0.6. Tras la centrifugación del cultivo
bacterial líquido, la masa bacterial se cosechó y a continuación se
suspendió en 10 ml de solución enfriada con hielo de CaCl_{2}
(CaCl_{2} 60 mM, glicerol 15%, 10 mum PIPES, pH 7.0). La
suspensión se centrifugó a 3000 rpm y la masa bacteriana se volvió
a suspender en 2 ml de solución enfriada con hielo de CaCl_{2} y
se mantuvo en un baño con hielo hasta su posterior uso. Se
mezclaron 50 \mul de células competentes con 5 \mul de plásmido
clonado. La mezcla se calentó a 42ºC durante 2 minutos y a
continuación se fue enfriando. Después de añadir 100 \mul de medio
LB, esta mezcla se incubó a 37ºC durante una hora. La mezcla se
extendió a continuación sobre una placa de agarosa LB que contenía
50 \mug/ml de ampicilina. La placa se incubó durante la noche a
37ºC. Se recogieron las monocolonias que aparecieron en la placa y
se cultivaron para extracción de plásmido. El plásmido resultante
pG1 se digirió dos veces con EcoR I y Hind III y los genes clonados
fueron sometidos a pruebas de electroforesis sobre 1% gel
agarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencia de ADN del gen
GLP-1 (7-36) transportada por el
plásmido recombinante se analizó con el secuenciador automatizado
310 ABI PRISM® (Applied Biosystems). El resultado del análisis es
idéntico al mostrado en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Tras la sustitución de la zona Bgl II en el
fragmento (1) del Ejemplo 1 por la zona Sal I, el fragmento (1') se
sintetizó. De manera similar, el fragmento (4') se sintetizó tras
la sustitución de la zona BamH en el fragmento (4) del Ejemplo 1
por la zona Xho I. La secuencia del fragmento (2') es
complementaria a la del fragmento (1'), mientras que la secuencia
del fragmento (3') es complementaria a la del fragmento (4'). Las
secuencias de los fragmentos (1') y (4') son de la siguiente
manera:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con los procedimientos descritos en
el Ejemplo 1, se llevaron a cabo la ligadura de los cuatro
fragmentos, la digestión del vector, la inserción del gen
GLP-1 (7-36), la transformación del
vector de expresión (en E. Coli JM109) y el análisis de la
secuencia de ADN. El resultado del análisis se encuentra de acuerdo
con lo mostrado en la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Sustituir codón Arg en el fragmento (1) en el
Ejemplo 1 por codón Met para sintetizar el fragmento (1''). La
secuencia del fragmento (2'') es complementaria a la del (1''). Las
secuencias del fragmento (3) y fragmento (4) permanecen iguales.
Las secuencias de (1'') y (2'') se muestran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La digestión del vector, la inserción del gen
GLP-1 (7-36), la transformación del
vector de expresión (en E. Coli JM109) y el análisis de la
secuencia de ADN se llevaron a cabo tal y como se describe en el
Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Método
1
Tal y como se muestra en la Figura 4, 5 \mul
de plásmido producido en el Ejemplo 1 se añadieron a un tubo de 0.5
ml para microcentrifugación, y a continuación se añadieron 1 \mul
de 10 \times Bgl II, 1 \mul de Bgl II y 1 \mul de Hind III al
tubo, respectivamente. La mezcla se incubó a 37ºC durante una hora.
El fragmento de gen GLP-1 (7-36)
liberado se recuperó mediante electroforesis sobre un gel 1%
agarosa.
1 \mul de plásmido producido en el Ejemplo 1
se mezcló con 1 \mul de búfer BamH I, 1 \mul de BamH y 1 \mul
de Hind III. La mezcla se incubó a 37ºC durante una hora. A
continuación, se añadió fenol-cloroformo y la fase
acuosa se lavó dos veces con cloroformo. El ADN plásmido digerido
se precipitó por 60% isopropanol a temperatura ambiente durante una
hora antes de la centrifugación. El disolvente orgánico en el
precipitado se retiró mediante vaporización. El gránulo se disolvió
en 10 \mul de agua.
El fragmento de gen
GLP-1(7-36) doblemente
digerido de Bgl II y Hind III se mezcló con el plásmido doblemente
digerido de Hind III y BamH I. A continuación, se añadieron \mul
de 1 mM ATP, 1 \mul de 10x T_{4}ADN búfer ligasa y 2 \mul de
T_{4}ADN búfer ligasa. La mezcla se incubó durante la noche a
18ºC.
Las células competentes de JM103 E. Coli
se transformaron tal y como se describe en el Ejemplo 1. La
suspensión bacteriana se extendió a continuación sobre una placa LB
agarosa que contenía penicilina de 50 \mug/ml. La placa se
mantuvo durante la noche a 37ºC. El plásmido resultante se digirió
dos veces con EcoR I y Hind III. Se seleccionaron aquellos con dos
copias de gen GLP-1 (7-36) enlazado
en conjunto mediante electroforesis sobre gel 1% agarosa. Se
abasteció la cepa bacteriana que albergaba el plásmido deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
2
Uso de plásmido producido en el Ejemplo 2 en
lugar de en el Ejemplo 1, y sustitución de las endonucleasas de
restricción Bgl II y BamH I descritas en el Método 1 por Sal I y
Xho I respectivamente. Se llevaron a cabo otros procedimientos como
los descritos en el Método 1 para construir una cepa bacteriana
mediante ingeniería genética que albergaba dos copias del gen
GLP-1 (7-36).
\newpage
Método
3
Uso de plásmido producido en el Ejemplo 3 para
construir una cepa bacteriana mediante ingeniería genética que
albergaba dos copias del gen GLP-1
(7-36). Se llevaron a cabo otros procedimientos
como los descritos en el Método 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Siguiendo los procedimientos descritos en el
Ejemplo 4, se realizó la ligadura de genes GLP-1
(7-36) de manera conjunta. Se transformó la línea
celular bacteriana apropiada con el plásmido que transportaba 4
copias del gen GLP-1 (7-36) y se
seleccionó la cepa bacteriana que albergaba un plásmido de
expresión que transportaba 4 copias del gen GLP-1
(7-36) de manera conjunta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Siguiendo los procedimientos descritos en el
Ejemplo 4, se realizó la ligadura de genes GLP-1
(7-36) de manera conjunta. Se transformó la línea
celular bacteriana apropiada con el plásmido que transportaba 8
copias del gen GLP-1 (7-36) y se
seleccionó la cepa bacteriana que albergaba un plásmido de
expresión que transportaba 8 copias del gen GLP-1
(7-36) de manera conjunta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se usó el plásmido que transportaba 4 copias del
gen GLP-1 (7-36) y el plásmido que
transportaba 8 copias del gen GLP-1
(7-36). Se realizó una doble digestión de estos dos
tipos de plásmidos, respectivamente. Después de los procedimientos
descritos en el Ejemplo 4, se llevó a cabo la ligadura en conjunto y
se obtuvo el plásmido que transportaba 12 copias de gen
GLP-1 (7-36). Se transformó la
línea celular bacteriana apropiada con el plásmido y se seleccionó
la cepa bacteriana que albergaba un plásmido de expresión que
transportaba 12 copias del gen GLP-1
(7-36) de manera conjunta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Siguiendo los procedimientos descritos en el
Ejemplo 4, se repitió la ligadura de genes GLP-1
(7-36) de manera conjunta. Se transformó la línea
celular bacteriana apropiada con el plásmido que transportaba 16
copias del gen GLP-1 (7-36) y se
seleccionó la cepa bacteriana que albergaba un plásmido de
expresión que transportaba 16 copias del gen GLP-1
(7-36) de manera conjunta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Siguiendo los procedimientos descritos en el
Ejemplo 4, se repitió la ligadura de genes GLP-1
(7-36) de manera conjunta. Se transformó la línea
celular bacteriana apropiada con el plásmido que transportaba 32
copias del gen GLP-1 (7-36) y se
seleccionó la cepa bacteriana que albergaba un plásmido de
expresión que transportaba 32 copias del gen GLP-1
(7-36) de manera conjunta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La fermentación de cepa bacteriana producida
genéticamente que transportaba el gen GLP-1
(7-36) se llevó a cabo de acuerdo con el método
descrito por Aizhen Wu et al. En "Un estudio de proceso de
fermentación de un E. Coli genéticamente producido"
(Chinese Journal of Biotechnology, Vol. 12, suplemento, páginas
53-57, 1996).
\vskip1.000000\baselineskip
El medio de cultivo de las bacterias de siembra
contiene 10 g/L peptona, 5 g/L extractos de levadura (de Difen,
Sigma u Oxoid), 20 ml de 0.2M búfer de fosfato a pH7.0 y
CaCl_{2}, Ni(NO_{4})_{3}, CoCl_{3},
MgSO_{4} así como FeCl_{3} (cada uno de la sal: 1 mg/L). El
medio se sometió a la acción del autoclave durante 20 minutos a
120ºC. Tras enfriarse hasta 37ºC, se añadieron ampicilina 50 mg/L,
20 ml de desespumador, 20 ml de semillas y 5 ml de 20% glucosa. El
valor del pH se ajustó a 6.8-7.2 con 2 M NaOH y 2 M
HCl. A continuación se llevó a cabo la fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
La fermentación se llevó a cabo en un birreactor
de 5 L o 15 L o 150 L (B. Braun Biostat). Las condiciones para la
fermentación fueron las siguientes: temperatura de 37ºC, P_{L}
30\rightarrow42ºC, velocidad de agitación de 500 rpm, pH de
6.8-7.2, ventilación de 5 L/minuto o 15 L/minuto o
150 L/minuto respectivamente, y D_{O2} (CO_{2}?) 50%.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración bacteriana se midió cada hora
tomando 1 ml de cultivo en fermentación. Después de centrifugar el
cultivo a 8000 rpm durante 10 minutos, se retiró el sobrenadante y
se pesó la masa bacteriana mojada. De manera alternativa, la
concentración puede medirse detectando la densidad en
OD_{600nm}.
Tal y como se muestra en la Figura 5, después de
12-16 horas de fermentación, la densidad de
bacterias en el organismo que causa la fermentación fue 150 g/L
(masa mojada). Se alcanzó la fase de inactividad y la fermentación
se completó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Tras la fermentación, el medio de cultivo se
centrifugó a 4000 rpm. La masa bacteriana se cosechó y homogenizó
dos veces para evitar trastornos a una presión de 50 MPa en un
homogenizador. La suspensión con los restos celulares de centrifugó
a 6000 rpm y se retiró el sobrenadante resultante. Con otra vuelta
de centrifugación a 10.000 rpm, se recogió el cuerpo de inclusión y
a continuación se lavó dos veces con 20 mM de búfer de fosfato (pH
7.0) que contenía 10 mM de EDTA y 1% de NaCl. Después de disolver
el cuerpo de inclusión en 8M de solución de urea, se retiraron las
impurezas no disueltas mediante centrifugación. Se usó
ultra-filtración para retirar la urea en el
sobrenadante, y a continuación el cuerpo de inclusión se cosechó
mediante centrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Los cuerpos de inclusión, que fueron el
resultado de la fermentación de la cepa bacteriana genéticamente
construida con el Método 1 o 2 en el Ejemplo 4, pueden partirse por
medio de los siguientes procedimientos.
\vskip1.000000\baselineskip
La clostripaína puede específicamente partir el
enlace peptídico formado por la participación de carboxilo de
residuo Arg.
El cuerpo de inclusión producido en el Ejemplo
11 se suspendió en 20 mM búfer de fosfato (pH 7.5). La clostripaína
de proteasa se añadió en un radio de 1000:1 (peso en seco de la
proteína: la cantidad de clostripaína). La mezcla se incubó a 37ºC
y se probó y controló de manera continua por HPLC hasta que los
cuerpos de inclusión finalmente se partieron. Se eliminaron las
impurezas de las moléculas grandes con ultrafiltración (MWCO de
10.000). GLP-1 (7-36) se purificó
con HPLC a escala de la preparación y se liofilizó para producir el
péptido deseado con más del 99% de impureza.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteasa tripsina pancreática puede partir el
enlace peptídico formado por la participación de carboxilo de
residuo Lys o residuo Arg. Cuando el residuo Lys está protegido por
anhídrido, el enlace peptídico formado por la participación de
carboxilo de Arg puede específicamente partirse por la acción de
tripsina.
Se disolvieron 200 gramos (peso neto) de los
cuerpos de inclusión resultantes del Ejemplo 11 en 5 litros de 20 mM
solución NaHCO_{3} con 1 gramo de anhídrido citracónico para
llevar a cabo la reacción de acilación en pH de 8.0 durante 2
horas. Se retiraron las moléculas pequeñas con ultrafiltración
(10.000 MWCO). Se añadió tripsina en un radio de 1000/1 (la
proteína en peso en seco a la proteasa). La reacción proteolítica
se llevó a cabo a 37ºC y se controló con HPLC hasta que se completó
la partición de los cuerpos de inclusión.
GLP-1 (7-36) se
purificó posteriormente con HPLC a escala de preparación y se
liofilizó para producir el péptido deseado con más del 99% de
impureza.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cuerpos de inclusión, que resultaron de la
fermentación de la cepa bacteriana genéticamente producida, se
construyeron con el Método 3 en el Ejemplo 4, pueden dividirse
mediante el siguiente método.
El cuerpo de inclusión/proteína de fusión se
disolvió en 70% ácido fórmico u 8M solución de urea para llegar a
un rango de concentración de aproximadamente 2.100 mg/mL (peso en
seco). Se añadió bromuro de cianógeno (CNBr) en un radio de mol de
1:100 (proteína de fusión con bromuro de cianógeno). La mezcla se
agitó en la oscuridad durante 8-24 horas. Bajo estas
condiciones, CNBr específicamente parte el enlace peptídico formado
por el carboxilo de Met. Este fue el primer paso del proceso de
partición en dos pasos.
La solución de la primera partición se filtró
con una membrana 1000 MWCO para retirar las pequeñas moléculas. A
continuación le siguieron los procedimientos en el Ejemplo 12 para
llevar a cabo la segunda partición con una proteasa en el enlace
peptídico formado por el carboxilo de Arg para producir péptido
GLP-1 (7-36). GLP-1
(7-36) se purificó posteriormente con HPLC a escala
de preparación y se liofilizó para producir el péptido deseado con
más del 99% de impureza.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se usó Agilent 1100 HPLC y una columna de
cromatografía Zorbax SB C18 con un diámetro interno de 4.6 mm y una
longitud de 150 mm. La fase móvil A fue 0.1% TFA y la fase móvil B
fue 0.1% TFA/80% CH_{3}CN. Se formó un gradiente
10-80% en un intervalo de 20 minutos. La velocidad
del flujo fue 1 ml/min.
Se disolvió 1 mg de polvo GLP-1
(7-36) liofilizado (más del 99% de pureza) en 1 ml
de 0.1% TFA. Se cargaron 10 \mul de la muestra en la columna. El
resultado se muestra en la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 100 \mug de
GLP-1 (7-36) en 0.5 ml de 5.7 N de
HCl doblemente destilado. La solución resultante se selló de manera
hermética en un envase y se incubó a 110ºC durante 20 horas. HCI se
retiró mediante evaporación con vacío. El proceso de evaporación se
repitió dos veces con agua doblemente destilada. El volumen se
midió y se retiró una muestra para llevar a cabo el análisis de
composición de aminoácido con Analizador de Aminoácido Hitachi
L-8800 (Hitachi Scientific Instrument). Los valores
observados fueron consistentes con los valores teóricos, tal y como
se muestra en la Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una pequeña muestra de péptido
GLP-1 (7-36) para realizar un
análisis HPLC-MS con un Sistema API 2000 LC/MS/MS
(Applied Biosystems). El resultado se muestra en la Figura 8. El
péptido GLP-1 (7-36) resultante de
la metodología en esta invención posee un peso molecular de
3297.12. La diferencia entre el peso molecular calculado de 3298.68
y el valor medido fue aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra se preparó con el método descrito en
el análisis de la composición anterior. La secuencia de péptido en
la terminal N de GLP-1 (7-36)
producida a partir del mismo fue determinada por un analizador de
secuencia automatizado Procise®cLC (Applied Biosystems). Los
resultados indican que la secuencia de los 15 primeros aminoácidos
de GLP-1 (7-36) producidos del mismo
fue correcta (este análisis fue llevado a cabo por la Escuela de
Biociencia, Universidad de Pekín).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Se compraron ratones sanos C_{57}/BL/6J del
Centro Animal en el Laboratorio de Shangai de la Academia China de
Ciencias. Los ratones se dividieron en tres grupos con 6 ratones en
cada grupo. El grupo de ratones placebo recibió 200 \mul de
salina inyectada en su cavidad abdominal, mientras que el grupo del
test recibió 10 \mug de GLP-1
(7-36) y el grupo de control positivo recibió 10
\mug de GLP-1 (7-36) NH_{2}
(Sigma). El momento en el que los animales recibieron la inyección
se estableció como tiempo cero. Se extrajeron 50 \mul de sangre
de las venas en el ángulo del ojo con un capilar graduado que se
había enjuagado con heparina y posteriormente secado. Las muestras
de sangre se extrajeron a continuación a los 5, 15, 30 y 60
minutos. Las muestras de sangre se mezclaron inmediatamente con 50
\mul de salina en un tubo de micro-centrifugado.
La mezcla se centrifugó a 3000 rpm para retirar los eritrocitos. El
suero se usó para medir la concentración de insulina.
El kit de radioinmunoensayo (Instituto de
Shangai de Productos Biológicos, Ministerio Chino de Salud) para
insulina se usó para medir el efecto de GLP-1
(7-36) sobre la secreción de insulina. Tal y como
se muestra en la Figura 9, no hubo un cambio significativo en la
concentración de insulina en el grupo placebo y los dos grupos que
recibieron GLP-1 (7-36) y
GLP-1 (7-36) NH_{2}
respectivamente mostraron un aumento significativo en la
concentración de insulina en suero. Esta observación indica que la
administración de GLP-1 (7-36) y
GLP-1 (7-36) NH_{2} aumenta la
secreción de insulina en ratones. Por lo tanto, este resultado
confirma que GLP-1 (7-36) muestra un
perfil similar al de GLP-1 (7-36)
NH_{2} en términos de aumento de la secreción de insulina en
ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Tal y como se describe en el Ejemplo 14, los
ratones C57/BL/6J se dividieron en dos grupos con el grupo de
ratones placebo recibiendo 200 \mul de salina inyectada en la
cavidad abdominal y el grupo del test recibiendo 10 \mug de
GLP-1 (7-36). Se usó un kit de
radioinmunoensayo (Instituto de Shangai de Productos Biológicos,
Ministerio Chino de Salud) para péptido C para medir el efecto de
GLP-1 (7-36) sobre la secreción de
péptido C.
Tal y como se muestra en la Figura 10, no se
observó un cambio significativo en la concentración de péptido C en
el grupo de placebo y los grupos que recibieron
GLP-1 (7-36) ha mostrado un aumento
significativo en la concentración de péptido C en suero. Esta
observación indica que la administración de GLP-1
(7-36) aumenta la secreción de péptido C en los
ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Se compraron ratones sanos C_{57}/BL/6J del
Centro Animal en el Laboratorio de Shangai de la Academia China de
Ciencias. Los ratones se dividieron en cuatro grupos con 6 ratones
en cada grupo. A los ratones que ayunaron durante la noche se les
suministró la inyección por la cavidad abdominal. Al grupo placebo
se le inyectó 200 \mul de solución 40% glucosa, al grupo del test
se le inyectó 200 \mul de solución 40% glucosa más 10 \mug de
GLP-1 (7-36), al grupo de control
positivo (1) se le inyectó 200 \mul de solución 40% glucosa más
10 \mug de GLP-1 (7-36) NH_{2}
(Sigma), y al grupo de control positivo (II) se le inyectó 200
\mul de solución 40% glucosa más 10 \mug de
GLP-1 (7-37) (Sigma) El momento en
el que los animales recibieron la inyección se estableció como
tiempo cero. Después de la inyección, se extrajeron inmediatamente
20 \mul de la muestra de sangre del seno óptico de cada ratón con
un capilar tratado con heparina. Las muestras de sangre se
mezclaron inmediatamente con 300 \mul de salina en un tubo de
microcentrifugado. La mezcla se centrifugó a 3000 rpm para retirar
los eritrocitos. El suero se usó para medir la concentración de
glucosa en suero. Este procedimiento se repitió en el minuto 30, 60
y 120.
La concentración de glucosa en sangre y suero se
midió con un kit comercial (Instituto de Shangai de Productos
Biológicos, Ministerio Chino de Salud). Tal y como se muestra en la
Figura 11, se observó un aumento significativo en la concentración
de glucosa en sangre del grupo placebo (inyectado solamente con
glucosa) y un descenso gradual en el nivel normal. Para los otros
tres grupos de ratones, las concentraciones de glucosa en sangre y
suero no sufrieron un aumento significativo con respecto al nivel
normal durante el proceso de medición. Esta observación indica que
la administración de GLP-1 (7-36),
de GLP-1 (7-36) NH_{2} o
GLP-1 (7-37) puede aumentar la
secreción de insulina en ratones para evitar una dramática
fluctuación de concentración de glucosa en sangre. Por lo tanto,
los resultados confirman que GLP-1
(7-36) muestra un perfil similar al
GLP-1 (7-36) NH_{2} o
GLP-1 (7-37) en términos de
descenso de glucosa en sangre.
\newpage
- 1.
- Nombre y Dirección de la Institución Depositaria:
- \quad
- Nombre: Comité de China para la Colección de Cultivo del Centro de Cultivo Microbiológico General de Microorganismos.
- \quad
- Dirección: Zhong-guan-cun, Pekín, China.
- 2.
- Fecha del Depósito del Material Biológico con la Institución: 11 de julio del 2001.
- 3.
- Número de Acceso expedido por la Institución Depositaria: CGMCC Nº 0599.
- 4.
- Nombre y Dirección del Solicitante
- \quad
- Nombre: Shanghai Hua-Yl Bio-Tech Lab.
- \quad
- Dirección: Caobao Road, nº 36, Shangai, China.
Claims (16)
1. Un método para producir polipéptido
GLP-1 (7-36) insulinotrópico y/o
análogos de GLP-1 que consiste en:
- (a)
- Introducir dos puntos con división de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el polipéptido GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1;
- (b)
- Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1, o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32;
- (c)
- Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped.
- (d)
- Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora;
- (e)
- Partir la proteína de fusión;
- (f)
- Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde las dos endonucleasas de restricción capaces de formar un
híbrido son Bgl II y BamH I.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde las dos endonucleasas de restricción capaces de formar un
híbrido son Sal I y Xhol I.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde
N es un número entero de 2 a 32.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4
donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde
N es un número entero de 8 a 32.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5
donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde
N es 16.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5
donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde
N es 32.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6
donde dicho vector es el contenido en el depósito de CGMCC con
Número de Acceso 0599.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de fusión
que contiene N copias de un polipéptido, donde N es un número
entero de 2 a 32.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de fusión
que contiene N copias de un polipéptido, donde N es un número
entero de 8 a 32.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de
fusión que contiene N copias de un polipéptido, donde N es 16.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
10, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de
fusión que contiene N copias de un polipéptido, donde N es 32.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 9-12 donde dicha célula huésped es
una célula procariótica.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13 donde dicha célula huésped es Escherichia coli JM103,
JM109, HB101 o DH5\alpha.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14 donde dicha célula huésped es la contenida en depósito de CGMCC
con Número de Acceso 0599.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 1
donde la proteasa usada para partir la proteína de fusión es
Clostrispan o Tripsina.
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