TW202307010A - 單體融合肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種融合肽，其包含GLP1變異體、及至少一種脂聯素(adiponectin)促效劑肽，該脂聯素促效劑肽經由間隔子化學連接至該GLP1變異體。該GLP1變異體部分可包含相對於該天然GLP1之一或多種取代。該脂聯素促效劑肽可在不同連接位點連接至該GLP1變異體。亦提供一種使用該融合肽治療代謝病症或病狀之方法。

Description

單體融合肽及其使用方法
本發明係關於具有雙重促效劑活性之單體肽，特別是包含經修飾之升糖素樣1促效劑及脂聯素受體促效劑之肽、及其在治療糖尿病中之用途。
2型糖尿病對全球公共健康造成嚴重威脅。目前，用於代謝疾病諸如糖尿病之大多數可用治療方案靶向單一態樣，諸如增強胰島素產生。然而，對能量穩衡擾動之抗性與人類代謝病症之異質病理生理學之組合限制目前藥理學選項之持續性及功效。新出現的對失調能量消耗、及胰島素抗性之細胞特徵之洞察表明，協同靶向多個信號路徑可能係必要的以相當大的改良以逆轉此等疾病之進展超過僅靶向葡萄糖動態。
升糖素樣肽-1，本文亦稱為GLP1或GLP1(7-36)醯胺，具有胺基酸序列[游離胺基端-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-醯胺(SEQ ID NO:1)]，為30個胺基酸殘基的激素，其藉由控制食物攝入後由胰臟之β細胞釋放胰島素來調節葡萄糖穩態作用。該激素在營養劑/食物消耗後從胃腸道釋放且刺激餐後胰島素之急性釋放以調節血糖。此外，GLP1藉由充作飽食因子來減慢胃腸道中之消化作用且藉由延遲清空胃腸道中之經消化食物的時間來減少食物攝入之量且可減少體重。具有GLP1促效劑活性之肽藥物已經修飾以減少蛋白水解降解，特別是藉由二肽基肽酶4 (DPP-4)，且延長半衰期。然而，GLP1類似物本身不具有抗發炎或抗纖維變性作用且不影響靶組織中之胰島素抗性。
GLP1與激素類似物之組合已經描述且包括GLP1與膽囊收縮素、肽YY、升糖素、GLP2、胃抑制多肽(GIP)、胃泌素、神經緊張素(neurotensin)、纖維母細胞生長因子21 (FGF21)、黑素皮質素受體4 (MC4R)促效劑、胰島素及SGLT2抑制劑之組合。
作為由脂肪細胞分泌的最豐富肽，脂聯素為脂肪過多、胰島素抗性及發炎之間相互關係的關鍵調節因子。中央型肥胖(Central obesity)伴随胰岛素抗性係發展進展至2型糖尿病及其併發症之一個關鍵因素。
脂聯素在循環中以單體、三聚體、六聚體、或高至18聚體之高分子量複合體之蛋白質聚集體存在。AdipoR1及AdipoR2係其介導活體內及細胞作用之主要受體。脂聯素受體訊號AMP (腺苷單磷酸)激酶(AMPK)活化，從而發揮直接效應來調節多個器官(包括脂肪組織、肌肉、肝臟及胰臟)內的能量穩衡作用以改良胰島素敏感性。此等受體在實質上所有組織及細胞類型上普遍表現。此外，脂聯素受體信號之活化影響多個細胞內信號路徑，從而導致寬廣範圍之有益作用，包括：抑制肝臟及肌肉中之重新脂質生成及脂質氧化增加；減少發炎介體，包括抑制發炎細胞介素(諸如IL-6、TNF-α及IL-1b)以及抑制單核細胞活化；損傷後之抗細胞凋亡及細胞再生作用；及抑制促纖維變性路徑。
包含GLP1及脂聯素之作用之分子或藥物可提供單獨提供時無法見到的益處。特別地，GLP1類似物可有效增加餐後胰島素產生，而脂聯素可有效增加胰島素敏感性。此兩種作用之組合導致於葡萄糖處理上之更大效應。已嘗試將GLP1及脂聯素之作用組合之一種方法係建立含有GLP1與球狀脂聯素之融合蛋白。Gao等人基於GLP1及球狀脂聯素之分子特性設計該融合蛋白(Mingming Gao、Yue Tong、Wen Li、Xiangdong Gao & Wenbing Yao (2013)，Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology，41:3，159-164)。質體構築體在細菌中表現且所得大蛋白質經提取並純化，且顯示保留降葡萄糖活性。然而，此方法之一種限制係使用昂貴但低效之表現系統來產生必須仔細加工以保留結構完整性之大蛋白質。
因此，開發適合於人類投與之脂聯素之重組形式已證明具挑戰性，此係由於其大尺寸、廣泛轉譯後修飾、及傾向於自聚集、及與哺乳動物蛋白質產生系統相關之費用。另一種方法係識別能夠結合至脂聯素受體且證實促效劑活性之較小肽類似物。此一促效劑肽，一種10個胺基酸的化學合成肽，稱為ALY688 (亦稱為ADP355) [(H- DAsn-Ile-Pro-Nva-Leu-Tyr- DSer-Phe-Ala- DSer-NH 2) (其中H表示游離胺基端D以斜體顯示給定胺基酸具有D-構形及在末端的NH 2顯示羧基端經醯胺化，及Nva係指L-正纈胺酸(SEQ ID NO:2))，似乎以特異性方式結合至且活化脂聯素受體。
在一個態樣中，本發明提供一種包含GLP1變異體及至少一種脂聯素促效劑肽之融合肽，其中該至少一種脂聯素促效劑肽經由間隔子化學連接至該GLP1變異體。在一些實施例中，該GLP1變異體包含在位置8經Gly之取代。在一些實施例中，該GLP1變異體包含在位置18經Lys之取代。在一些實施例中，該GLP1變異體包含在位置22經Lys之取代。在此等實施例中，該位置對應於SEQ ID NO:1之位置。在一些實施例中，該GLP1變異體具有選自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6組成之群之序列。
在一些實施例中，該至少一種脂聯素促效劑肽在GLP1變異體之位置26利用間隔子連接。
在一些實施例中，該至少一種脂聯素促效劑肽在GLP1變異體之位置34利用間隔子連接。
在一些實施例中，該至少一種脂聯素促效劑肽包含第一脂聯素促效劑肽及第二脂聯素促效劑肽，該第一脂聯素促效劑肽及該第二脂聯素促效劑肽為相同或不同且各自在GLP1變異體之兩個不同位置利用間隔子連接。該兩個不同連接位點可包含GLP1變異體之位置26及位置34，其中該等位置對應於SEQ ID NO:1之位置。
在一些實施例中，該至少一種脂聯素促效劑肽包含ALY688。
在一些實施例中，該間隔子包含GGG。
在另一個態樣中，本發明提供一種治療患有2型糖尿病的患者之方法，該方法包括對該患者投與有效量之本文所揭示之融合肽。
本發明提供藉由第一部分GLP1變異體與第二部分(其為基於脂聯素受體促效劑之短肽)經適宜化學連接子或間隔子結合形成之融合肽。
由於不同作用機制，因此GLP1與脂聯素類似物之組合係朝向增強病狀中之一系列期望效應之新穎方法，該等病狀中代謝失調與發炎及/或纖維化相關。在2型糖尿病中，GLP1作用以刺激餐後胰島素釋放結合脂聯素作用以改良肌肉及肝臟中胰島素敏感性將為改良整體血糖控制之互補方法。
由於肽一般需要注射(例如靜脈內或皮下)，因此期望能夠最小化獨立藥療之注射次數。因此，保持其組分之活性且可調配成單次注射之融合肽將優於投與兩次單獨注射。此外，單一融合肽比兩種肽在相同時間更容易到達靶組織使得在接種物中單一化學實體優於兩種肽之物理混合物。與該等個別肽中之至少一者相比，該融合肽亦可具有優異之藥物動力學及穩定性性質。此外，單一調配物可優於含有兩種個別肽之組合物調配物，每種肽具有其自身的穩定性要求，諸如pH、需要穩定化賦形劑、及需要維持溶解度之組分。
整合脂聯素蛋白而非完全球狀脂聯素(gAd)或全長脂聯素(fAd)之活性位點可提供在治療情境下與gAd或fAd相比具有ALY688之所有優點之全肽藥物。本文所述的融合肽維持其個別組分之活性，同時將融合肽之整體作用加寬超過該等組分。
本文中使用的術語「融合肽」係指肽或肽衍生物，其含有融合或化學結合在一起的至少兩個肽部分。該融合肽可採用具有一或多個分支之分支排列。本文中使用的術語「肽」係指在鏈中較佳經醯胺鍵連接之兩個或更多個胺基酸，但亦指此種結構之衍生物，其中某些天然胺基酸殘基改由非天然殘基置換。該融合肽可藉由固相或固相及液體肽合成方法之組合來製備，且因此，該等非天然胺基酸可選自彼等市面上可以易於大規模肽合成之形式獲得者。
本文使用的術語「GLP1變異體」 (或「GLP1v」)係指其中GLP1中之一或多個胺基酸經其他胺基酸或化學品(諸如脂質)置換/取代之經修飾GLP1。此類取代之位點根據天然GLP1之序列(SEQ ID NO:1)中之位置編號，且取代類型亦係基於GLP1。當用於人類或獸醫藥物情境中時，此類取代增加治療功效。描述於本申請案中之GLP1變異體維持基於結合至GLP1受體之GLP1功能及降低適宜模型中葡萄糖含量之能力。
在一些實施例中，該GLP1變異體可包含在殘基8 (例如Ala8Gly)、在殘基18 (例如Ser18Lys)、在殘基22 (例如Gly22Lys)等之取代。可進行許多另外修飾。
融合肽之該第二部分可為小分子脂聯素受體促效劑肽，諸如10聚體ALY688、或脂聯素蛋白之全18個殘基的活性結合位點[(胺基酸149至166，H-Lys-Phe-His-Cys-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Ile-Thr-Val-NH 2(SEQ ID NO:3) (Otvos等人，BMC Biotechnol 11, 90 (2011))、或其任何片段、以及其具有ALY688類似取代或其他非天然胺基酸殘基之取代之片段。
融合肽之該第一及第二肽部分利用連接子/間隔子連接。例如，該第二肽部分可在沿著其長度的某一位置(例如GLP1變異體之18、22、26、34)連接至該第一肽部分(例如在其N端或C端)。該第一肽部分上的此類位點亦稱為連接位點。該等連接位點可與取代位點重合且亦可與取代位點不同。
連接該第一部分及第二部分之連接子不會干擾該第一肽或第二肽組成分之活性。該間隔子可由肽或非肽構成。例如，該間隔子肽可包括形成β-或γ-迴彎之殘基，才不會迫使該等組成分之構形成為α-螺旋或β-褶板(pleated sheets)。由甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸或類似之形成迴彎之殘基製成之三至四個殘基間隔子通常在融合肽之組成分之間形成適宜迴彎。
此類融合肽可包含該第一肽與該第二肽之超過一個(例如2個、3個、4個或甚至更多個)分子之結合產物，其中該第二肽中的各分子在相應連接位點利用(相同或不同)化學連接子連接至GLP1變異體。
在本發明之融合肽之一個實施例中，在GLP1之第8位置的丙胺酸(Ala 8)經甘胺酸(Gly 8)置換(SEQ ID NO:4)。應注意，Ala 8係二肽基肽酶-4 (DPP-IV)之裂解位點，其導致蛋白質降解，且Ala 8經Gly 8置換導致藉由防止該裂解而延長半衰期及受體結合功效降低。
在另一個實施例中，在GLP1之第18位置的該絲胺酸經離胺酸取代(SEQ ID NO:5)。該第二部分可利用間隔子(例如-GGG- (或G3)間隔子)連接至Lys 18。Ser 18係中性內肽酶24.11 (NEP24.11)之裂解位點，因此Ser 18經龐大側鏈置換降低蛋白水解降解。此外，Ser 18在受體結合及活化中不發揮作用，因此Ser 18經Lys 18置換不影響受體結合功效。
在另一個實施例中，在GLP1之第22位置的甘胺酸(Gly 22)經離胺酸(Lys 22)置換(SEQ ID NO:6)。該第二部分可利用間隔子(例如G3間隔子)連接至Lys 22。Gly 22係連接GLP1中之兩個螺旋的二肽之一部分且因此不具有功能或結構意義。因此，Gly 22經離胺酸(Lys 22)置換不會影響受體結合功效。
在一個實施例中，Lys 26用作該GLP1變異體的連接位點以連接該第二部分。Lys 26為遠離Phe 28的兩個胺基酸，該Phe 28為受體活化所需，因此預期側鏈在Lys 26的該連接不會干擾受體結合功效。此外，在利拉魯肽(Liraglutide)及司美格魯肽(Semiglutide)中，Lys 26攜帶脂肪酸且可經自由修飾以獲得不同功能改良而不改變受體結合能力。
在另一個實施例中，Lys 34用作連接位點以連接第二部分。Lys 34係GLP1之C端螺旋中的最後殘基，且不具有特定功能。此外，在3至4位置上游沒有帶負電殘基，因此Lys 34不透過離子相互作用來使該螺旋穩定。因此，Lys 34可連接有龐大側鏈基團而不影響GLP1變異體之結合能力。
在一個實施例中，該融合肽採取以下形式(SEQ ID NO:5在Lys 18經-G3-間隔子與ALY688連接)： H-[GLP1-Gly 8(7-36)Lys 18]-(Gly-Gly-Gly- DSer-Ala-Phe- DSer-Tyr-Leu-Nva-Pro-Ile- DAsn-H)-NH 2。其結構說明於圖1A中。
在一個實施例中，該融合肽採取以下形式(SEQ ID NO:6在Lys 22經-G3-間隔子與ALY688連接)：H-[GLP1-Gly 8(7-36)Lys 22]-(Gly-Gly-Gly- DSer-Ala-Phe- DSer-Tyr-Leu-Nva-Pro-Ile- DAsn-H)-NH 2。其結構說明於圖1B中。
在一個實施例中，該融合肽採取以下形式(SEQ ID NO:4在Lys 26經-G3-間隔子與ALY688連接)：H-[GLP1-Gly 8(7-36)Lys 26]-(Gly-Gly-Gly- DSer-Ala-Phe- DSer-Tyr-Leu-Nva-Pro-Ile- DAsn-H)-NH 2。其結構說明於圖1C中。
在一個實施例中，該融合肽採取以下形式(SEQ ID NO:4在Lys 34經-G3-間隔子與ALY688連接)：H-[GLP1-Gly 8(7-36)Lys 34]-(Gly-Gly-Gly- DSer-Ala-Phe- DSer-Tyr-Leu-Nva-Pro-Ile- DAsn-H)-NH 2。其結構說明於圖1D中。
在一個實施例中，該融合肽採取以下形式(SEQ ID NO:4分別在Lys 26及Lys 34經-G3-間隔子與ALY688連接)。其結構說明於圖1E中。
在另一個態樣中，本發明提供一種包含本文所述的融合肽及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。
在另一個態樣中，本發明提供一種藉由對個體(例如人類患者)投與包含治療有效量之本文所述融合肽之組合物來預防、治療或改善2型糖尿病之方法。 實例：實例1. 人類血漿中ALY688-GLP1v融合肽之穩定性研究
在37℃下，在人類血漿中培養後評估許多ALY688-GLP1v融合肽之穩定性及對蛋白水解降解之抗性。
將GLP1肽或ALY688-GLP1v融合肽(N=3/時間點)與K2EDTA抗凝劑在人類血漿中培養指定時間且然後分析殘餘內容物。使用HPLC (利用緩慢梯度之Supelco Discovery BIO Wide Pore C5-3 (2.1 X 50 mm)以分離可能降解產物)以定量每種肽。使用高解析度質譜法(Thermo Q Exactive) Plus以收集全掃描及MS2光譜以表徵任何可能降解物。手動地及使用Proteome Discoverer數據挖掘軟體評估數據。 表1
      GLP1v肽
時間(小時) 反應面積 平均值 標準偏差 時間0的%
0.00 7,793,534 8,553,114 573,466 100
0.00 8,686,788
0.00 9,179,020
1.00 7,442,318 7,292,410 185,441 85
1.00 7,031,101
1.00 7,403,812
8.00 5,007,493 3,494,879 1,151,774 41
8.00 3,261,903
8.00 2,215,242
22.00 2,100,712 2,094,668 15,037 24
22.00 2,109,303
22.00 2,073,988
表2
      ALY688-GLP1v (LYS26)
時間(小時) 反應面積 平均值 標準偏差 時間0的%
0.00 11,283,498 10,533,523 1,458,797 100
0.00 8,494,117
0.00 11,822,953
1.00 9,887,900 10,390,392 399,143 99
1.00 10,418,931
1.00 10,864,345
8.00 7,424,321 7,807,537 271,112 74
8.00 7,988,576
8.00 8,009,713
22.00 4,818,782 4,196,958 595,883 40
22.00 3,393,486
22.00 4,378,606
表3
      ALY688-GLP1v (LYS34)
時間(小時) 反應面積 平均值 標準偏差 時間0的%
0.00 17,842,282 16,089,042 2,447,925 100
0.00 17,797,594
0.00 12,627,250
1.00 14,976,839 15,289,758 1,868,882 95
1.00 13,173,412
1.00 17,719,021
8.00 12,992,258 11,836,948 879,750 74
8.00 10,859,437
8.00 11,659,150
22.00 9,036,370 7,922,840 957,088 49
22.00 6,699,694
22.00 8,032,456
在上表中，溫度 = 37℃，濃度 = 1000 ng/ml，及N=3/時間點。
結果：如以上表1至3中所顯示，ALY688-GLP1v (Lys26)及ALY688-GLP1v (Lys34)(其中該GLP1v含有相對於GLP1之Gly8取代(當提及特異性ALY688-GLP1v融合肽時，在末端的下標用於指示連接位點))融合肽提供當在37℃下在人類血漿中培養時更佳的對蛋白水解降解之抗性，藉由在培養8及22小時後與GLP1肽相比完整肽之比例更高所顯示。 實例2. 藉由ALY688-GLP1v融合肽之GLP1受體活化之活體外分析。
為了測定ALY688-GLP1v融合肽中之一者或多者是否保留其活化GLP1受體之能力，使用活體外報告子細胞系來定量GLP1活化之程度。使用GLP1本身及四種不同ALY688-GLP1v融合肽來評估GLP1受體之活化以測定該等融合肽是否保留其GLP1受體活化之能力。在此四種不同融合肽中，ALY688分別連接至GLP1v序列上的殘基18、22、26、34，且所有GLP1v部分均具有Gly8取代。當ALY688經連接至殘基18時，殘基18經Lys取代；當ALY688經連接至殘基22時，殘基22經Lys取代；對於在GLP1v (其已經具有Lys殘基)之位置26及34連接的ALY688，該GLP1v上的Ser18及Gly22未經取代。此四種ALY688-GLP1v融合肽之序列如下： ALY688-GLP1v (Lys18)(或在本發明之附圖中簡單地表示為「Lys 18」或「Lys18 sub」)：
Figure 02_image001
ALY688-GLP1v (Lys22)：(或在本發明之附圖中簡單地表示為「Lys 22」或「Lys22 sub」)
Figure 02_image003
ALY688-GLP1v (Lys26)：(或在本發明之附圖中簡單地表示為「Lys 26」或「Lys26 sub」)
Figure 02_image005
ALY688-GLP1v (Lys34)：(或在本發明之附圖中簡單地表示為「Lys 34」或「Lys34 sub」)
Figure 02_image007
此等序列亦用於本文其他實例中。
源自於人類胚胎腎臟293 (HEK293)之生物感測器報導子細胞模型HEK-hGLP1R-Luc允許基於以下原理來篩選GLP1受體依賴性信號傳導之活化：GLP1受體或相應地GIP受體之活化導致環一磷酸腺苷(cAMP)之產生及螢光素酶基因之表現，這指示配位體之活性。
結果：如圖2A-2C中所證實，GLP1顯示此等細胞中螢光素酶活性之典型劑量依賴性活化(EC50 54 nM)，該等細胞經工程改造以生物標誌GLP1受體依賴性信號傳導且選擇50 nM及100 nM濃度以測試ALY688-GLP1v融合肽(ALY688在GLP1v之18、22、26及34位置連接，其結構已在上文描述)之效應。各融合肽維持活化GLP1受體之能力。GLP1標準及不同ALY688-GLP1v融合物間不存在顯著的反應差異，這顯示在ALY688肽連接至GLP1v後該等融合物活化GLP1之能力得以保留。 實例3：ALY688-GLP1v融合肽之脂聯素信號傳導效應之活體外分析。
已顯示單獨ALY688在L6鼠類骨骼肌細胞中誘導脂聯素樣信號傳導，包括增加之P38MAPK (T180/Y182)磷酸化，經由ELISA分析偵測到且藉由磷酸化依賴性易位至核之免疫螢光成像確認。P38MAPK係一種涉及脂聯素之有益代謝效應的已知脂聯素受體信號傳導激酶。此用於評估該四種不同ALY688-GLP1v融合肽是否保留如先前以單獨ALY688所顯示的脂聯素樣信號傳導活性。
結果：觀測到所有四種融合肽(與實例2中之彼等四種融合肽相同)對p38MAPK之活化。如圖3中所顯示，回應於融合所觀測到的p38MAPK之活化類似於單獨ALY688且至少如重組球狀(gAd)或全長(fAd)脂聯素蛋白般強效。因此，該等ALY688-GLP1v融合肽保留其類似於單獨ALY688的活化脂聯素信號傳導之能力。 實例4. 動物模型(小鼠)中單次靜脈內注射對於血糖含量之效應
為了測定ALY688-GLP1v融合肽是否保留GLP1於整個生物機體中之生理作用，對小鼠投與單劑量之每種肽且評定血糖以評估藉由GLP1活化誘導之降糖活性。
圖4示意性地顯示分組及測試程序，其中小鼠禁食4小時且然後在時間口服葡萄糖耐受性測試前10分鐘時經靜脈內注射媒劑、單獨GLP1v (具有Gly8取代)、GLP1v融合肽、艾塞那肽(exenatide)或ALY688。口服葡萄糖負荷為1 g葡萄糖/kg體重。在時間口服葡萄糖負荷後的-30分鐘、0 (正好在口服葡萄糖負荷前)、15、30、60及90分鐘時用血糖計測量血糖含量。在時間90分鐘後將小鼠安樂死。
結果：如圖5A至圖5B中所顯示，所投與的所有ALY688-GLP1v融合肽急性地顯示葡萄糖負荷後血糖含量顯著降低。與媒劑相比，ALY688顯示無葡萄糖效應，而GLP1v (具有Gly8取代)及艾塞那肽均顯示預期降糖活性。所有四種ALY688-GLP1v融合肽(與彼等實例2至3中者相同)亦證實，至少相比擬於GLP1v之降糖作用，具有Lys26及Lys34取代之融合肽顯示與單獨GLP1v相比更大的降糖作用。因此，藉由投與ALY688-GLP1v融合肽保留並改良GLP1活化之降糖作用。 實例5. 小鼠中GLP1v及融合肽之藥物動力學型態
為了評定ALY688-GLP1v融合肽是否證實由於共價連接所致的藥物動力學行為方面的差異，將三種ALY688-GLP1v融合肽之藥物動力學型態與GLP1v肽進行比較。
GLP1v肽(具有Gly8取代)及GLP1v融合肽藉由皮下注射(濃度 = 10 mg/kg)投與一次。將血液收集至含有蛋白酶抑制劑(DPP-4及抑肽酶(Aprotinin))之混合物的K2EDTA管中。使用生物分析方法BAM.0634.01以定量K2EDTA小鼠血漿中之GLP1v及GLP1v融合肽。其係基於蛋白質沉澱提取，接著係LC-MS/MS儀器分析及涵蓋1.00至1000 ng/mL之測量範圍。基於經與Thermo Scientific TSQ Vantage三重四極質譜儀與ESI電離相連接的Waters Acquity液相層析來分析樣品。
結果：如圖6中所顯示(下表中亦總結其數據)，在單次注射每種肽後觀測到在暴露方面之顯著差異性，其中ALY688-GLP1v (Lys26)融合肽顯示AUC增加兩倍及Tmax從5分鐘增加至10分鐘，而ALY688-GLP1v (Lys34)及ALY688-GLP1v (Lys26,34)均證實總暴露量減少，但其中Tmax進一步增加，這指示血液之吸收延遲及血液含量擴展。
處理 Cmax (ng/mL) Tmax (分鐘) AUC 0-t(ng*min/mL)
具有Gly8取代之GLP1v 781 5 31500
ALY688-GLP1v( Lys26) 1610 10 61100
ALY688-GLP1v( Lys34) 267 15 10600
ALY688-GLP1v ( Lys26,34) 372 15 21500
ALY688-GLP1v (Lys26,34)之序列如下：
Figure 02_image009
儘管已出於清晰理解之目的藉由說明及實例略為詳細地描述上述發明，但熟習此項技術者當明瞭將實施某些改變及修改。因此，該描述及實例不應解釋為限制所揭示發明之範疇。 序列表SEQ ID NO:1 (GLP1、或GLP1(7-36)醯胺)
Figure 02_image011
Figure 02_image013
圖1A至1E示意性地顯示根據本發明之一些實施例之某些融合肽的結構。
圖2A至2C顯示HEK-hGLP1R-Luc細胞中藉由本發明之某些ALY688-GLP1v融合肽之GLP1受體活化。HEK-hGLP1R-Luc細胞經100 μl之具有gly8取代之GLP1v (2A)處理以評估GLP1受體活化之劑量依賴性；或經在50 nM (2B)及100 nM (2C)之濃度下之ALY688-GLP1v融合肽(連接至GLP1v之殘基18、22、26、34之ALY688)處理以評估其之GLP1受體信號傳導之活化(n=3)。
圖3顯示使用pP38MAPK ELISA篩選L6骨骼肌細胞中本發明之某些ALY688-GLP1v融合肽之時間-及濃度-依賴性脂聯素信號傳導效應。將L6骨骼肌細胞與四種不同ALY688-GLP1v融合肽(0、100、300、500 nM)、gAd (1 μg/ml)、fAd (10 μg/ml)、ALY688 (100 nM)及茴香黴素(Anisomycin) (0.2、1 μg/mL)培養15或30分鐘，接著經由pP38MAPK ELISA評估脂聯素样信號傳導。
圖4描繪用於本發明之一個實例中之測試程序。
圖5A至5B顯示本發明之一個實例中葡萄糖負荷之前及之後之血糖(5A)及AUC (5B)。*p＜0.05，**p＜0.01及***p＜0.001，利用雙因子ANOVA及邦弗朗尼事後檢驗(Bonferonni’s post-test)，媒劑對所有其他組。**p＜0.01，利用Kruskal-Wallis及杜納事後檢驗(Dunns post-test)，媒劑對所有其他組。
圖6顯示小鼠中本發明之GLP1及某些融合肽之藥物動力學曲線。
 
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          His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 
                      20                  25                  30  
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<222>  (10)..(10)]]>
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          <![CDATA[<400>  2]]>
          Xaa Ile Pro Xaa Leu Tyr Xaa Phe Ala Xaa 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  3]]>
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          <![CDATA[<222>  (18)..(18)]]>
          <![CDATA[<223>  在位置18處的C端胺基酸視需要經醯胺化]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val 
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          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 
                      20                  25                  30  
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          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 
                      20                  25                  30  
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 
                      20                  25                  30
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (12)

  1. 一種包含GLP1變異體及至少一種脂聯素促效劑肽之融合肽，其中該至少一種脂聯素促效劑肽經由間隔子化學連接至該GLP1變異體。
  2. 如請求項1之融合肽，其中該GLP1變異體包含在位置8經Gly之取代，其中該位置對應於SEQ ID NO:1之位置。
  3. 如請求項1之融合肽，其中該GLP1變異體包含在位置18經Lys之取代，其中該位置對應於SEQ ID NO:1之位置。
  4. 如請求項1之融合肽，其中該GLP1變異體包含在位置22經Lys之取代，其中該位置對應於SEQ ID NO:1之位置。
  5. 如前述請求項中任一項之融合肽，其中該至少一種脂聯素促效劑肽在該GLP1變異體之位置26利用該間隔子連接。
  6. 如請求項1至4中任一項之融合肽，其中該至少一種脂聯素促效劑肽在該GLP1變異體之位置34利用該間隔子連接。
  7. 如請求項1至4中任一項之融合肽，其中該至少一種脂聯素促效劑肽包含第一脂聯素促效劑肽及第二脂聯素促效劑肽，該第一脂聯素促效劑肽及該第二脂聯素促效劑肽為相同或不同且各自在GLP1變異體之兩個不同位置利用間隔子連接。
  8. 如請求項7之融合肽，其中該兩個不同連接位點包括該GLP1變異體之位置26及位置34，其中該等位置對應於SEQ ID NO:1之位置。
  9. 如前述請求項中任一項之融合肽，其中該至少一種脂聯素促效劑肽包含ALY688。
  10. 如前述請求項中任一項之融合肽，其中該間隔子包含GGG。
  11. 如請求項1之融合肽，其中該GLP1變異體具有選自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6組成之群之序列。
  12. 一種治療患有2型糖尿病之患者之方法，該方法包括對該患者投與有效量之如前述請求項中任一項之融合肽。
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