JP2023531168A - インスリンデグルデク誘導体およびその製造方法と使用 - Google Patents

インスリンデグルデク誘導体およびその製造方法と使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、インスリンデグルデク誘導体およびその製造方法を提供する。具体的に、本発明は、緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位およびインスリンデグルデク前駆体またはその活性断片を含む融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、発現量が顕著に向上し、融合タンパク質におけるインスリンデグルデク前駆体のタンパク質のフォールディングが正確で、生物活性を有する。そして、本発明の融合タンパク質における緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はプロテアーゼによって小さい断片に消化され、分子量が標的のタンパク質と大きく異なり、分離しやすい。また、本発明は、当該融合タンパク質を利用してインスリンデグルデクを製造する方法およびその中間体を製造する方法を提供する。

Description

技術分野
本発明は、生物医薬の分野に関し、より具体的に、インスリンデグルデク誘導体およびその使用に関する。
背景技術
糖尿病は、全世界の範囲内で人類の健康を脅かす疾患の一つである。中国では、人々の生活スタイルの変化および老齢化の加速とともに、糖尿病の罹患率は急速に上昇する傾向にある。糖尿病の急・慢性合併症、特に慢性合併症は複数の臓器に及び、障害につながり、致死率が高く、患者の心身の健康に大きく影響し、そして個人、家庭および社会に重い負担を背負わせる。
デンマークのノボノルディスク社によって創薬された組み換えインスリンデグルデク注射液「Ｔｒｅｓｉｂａ」は、新規な長時間作用型インスリンアナログである。２０１３年１月に欧州連合によって１型および２型糖尿病患者の治療への使用が許可された。インスリンデグルデクは、構造上の特徴が一つのＬ－γ－Ｇｌｕリンカーを介して組み換えヒトインスリン（Ｂ鎖３０位のトレオニンが削除されたもの）のＢ鎖２９位のリシンの側鎖のε－ＮＨ２基を修飾剤のヘキサデカン二酸とカップリングさせてなることである。このような設計は、作用時間を延ばす独特な機序を提供する。当該インスリンアナログは、超長時間作用、低変異性、速効型インスリンと複合製剤にすることが可能といった利点があり、皮下注射されると六量体の構造になり、当該構造は貯蔵庫としてインスリンデグルデクの単量体を徐放することができ、これらの単量体はゆっくり持続的に吸収して利用される。
国内では、インスリンデグルデクの製造に関する報告が多く、一般的に、遺伝子組み換え技術によってインスリンデグルデクの主鎖（主鎖）を得た後、さらに液相合成方法によってｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕという物質を連結してインスリンデグルデクを得るが、インスリンデグルデクの主鎖は保護されていない状態にあり、連結の過程において側鎖がＮ末端のアミノ基に結合しやすいため、不純物が発生し、精製が困難で収率が低いといった問題につながり、プロセスが複雑である。
そのため、当業者は新しい、より持効的なインスリン誘導体の開発に取り組んでいる。
発明の概要
本発明の目的は、インスリンデグルデク誘導体およびその使用を提供することにある。
本発明の第一の側面では、インスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端へ、式ＩＩＩで表される構造を有するものを提供する。
Ａ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－Ｇ （ＩＩＩ）
（式中において、
「－」はペプチド結合を表す。
Ａは無しか、リードペプチドである。
ＦＰは緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位である。
ＴＥＶは第一の酵素切断部位で、好ましくはＴＥＶ酵素の酵素切断部位である。
Ｒは酵素切断のためのアルギニンまたはリシンである。
Ｇはインスリンデグルデクの主鎖またはその活性断片である。
ここで、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位は２－６個の以下の群から選ばれるβシート単位を含む。）
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はｕ２－ｕ３、ｕ４－ｕ５、ｕ１－ｕ２－ｕ３、ｕ３－ｕ４－ｕ５またはｕ４－ｕ５－ｕ６である。
もう一つの好適な例において、前記のＧはＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデク前駆体で、式ＩＶで表される構造を有する。
ＧＢ－Ｘ－ＧＡ （ＩＶ）
（式中において、
「－」はペプチド結合を表す。
ＧＢは２９番目がＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
Ｘは連結ペプチドで、好ましくは、前記連結ペプチドのアミノ酸配列がＲ、ＲＲ、ＲＲＲ、あるいは配列番号４－７で示される。
ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。）
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はｕ３－ｕ４－ｕ５である。
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位のアミノ配列が配列番号９で示される。
もう一つの好適な例において、前記のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質のアミノ配列が配列番号１で示される。
もう一つの好適な例において、前記ＧＢの２９番目のリシンがＮ－ε－（ｔ－ブトキシカルボニル）－リシンである。
もう一つの好適な例において、前記インスリンデグルデクの主鎖に含まれるインスリンデグルデクのＢ鎖は側鎖を含まない。
もう一つの好適な例において、前記ＧＢは側鎖を含まない。
本発明の第二の側面では、インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端へ、式Ｉで表される構造を有するものを提供する。
Ａ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－Ｄ （Ｉ）
（式中において、
「－」はペプチド結合を表す。
Ａは無しか、リードペプチドである。
ＦＰは緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位である。
ＴＥＶは第一の酵素切断部位で、好ましくはＴＥＶ酵素の酵素切断部位（たとえば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１０）で示されるもの）である。
Ｒは酵素切断のためのアルギニンまたはリシンである。
ＤはＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖で、式ＩＩで表される構造を有する。

（式中において、

はジスルフィド結合を表す。
ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
Ｘは連結ペプチドである。
ＧＢは２９番目がＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
ここで、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位は２－６個の以下の群から選ばれるβシート単位を含む。）
もう一つの好適な例において、前記のＲはトリプターゼおよびカルボキシペプチダーゼによる酵素切断のためのものである。
もう一つの好適な例において、前記インスリンデグルデクのＢ鎖のＣ末端は連結ペプチドを介してインスリンデグルデクのＡ鎖のＮ末端と連結している。
もう一つの好適な例において、前記連結ペプチドのアミノ酸配列がＲ、ＲＲ、ＲＲＲ、あるいは配列番号４－７で示される（ＲＲＧＳＫＲ、ＲＲＡＡＫＲ、ＲＲＹＰＧＤＶＫＲまたはＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲ）。
もう一つの好適な例において、前記インスリンデグルデクのＢ鎖の７番目とＡ鎖の７番目（Ａ７－Ｂ７）、Ｂ鎖の１９番目とＡ鎖の２０番目（Ａ２０－Ｂ１９）の間に鎖間ジスルフィド結合が形成している。
もう一つの好適な例において、前記インスリンデグルデクのＡ鎖の６番目とＡ鎖の１１番目（Ａ６－Ａ１１）の間に鎖内ジスルフィド結合が形成している。
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はｕ２－ｕ３、ｕ４－ｕ５、ｕ１－ｕ２－ｕ３、ｕ３－ｕ４－ｕ５またはｕ４－ｕ５－ｕ６である。
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はｕ３－ｕ４－ｕ５である。
もう一つの好適な例において、前記のＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖はＡ鎖およびＢ鎖を含み、かつＡ鎖とＢ鎖は鎖間ジスルフィド結合で連結し、好ましくは２つのジスルフィド結合で連結している。
もう一つの好適な例において、前記のＡ鎖は鎖内ジスルフィド結合を含む。
もう一つの好適な例において、前記リードペプチドの配列は配列番号８で示される。
本発明の第三の側面では、Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデク前駆体であって、式ＩＶで表される構造を有するものを提供する。
ＧＢ－Ｘ－ＧＡ （ＩＶ）
（式中において、
「－」はペプチド結合を表す。
ＧＢは２９番目がＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
Ｘは連結ペプチドで、好ましくは、前記連結ペプチドのアミノ酸配列がＲ、ＲＲ、ＲＲＲ、あるいは配列番号４－７で示される。
ＧＡはインスリンデグルデクＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。）
本発明の第四の側面では、Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩで表される構造を有するものを提供する。

（式中において、

はジスルフィド結合を表す。
ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
ＧＢはインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示され、かつ前記Ｂ鎖の２９番目がＮ－ε－（ｔ－ブトキシカルボニル）－リシンである。
本発明の第五の側面では、Ｂｏｃ修飾およびＦｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩで表される構造を有するものを提供する。

（式中において、

はジスルフィド結合を表す。
ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
ＧＢはインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示され、かつ前記Ｂ鎖の２９番目がＮ－ε－（ｔ－ブトキシカルボニル）－リシンである。
そして、前記Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端がいずれもＦｍｏｃ修飾されている。）
もう一つの好適な例において、前記のＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル基である。
本発明の第六の側面では、Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩで表される構造を有するものを提供する。

（式中において、

はジスルフィド結合を表す。
ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
ＧＢはインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
そして、前記Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端がいずれもＦｍｏｃ修飾されている。）
もう一つの好適な例において、前記のＦｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル基である。
本発明の第七の側面では、インスリンデグルデクを製造する方法であって、
（Ａ） 組み換え菌を利用して発酵を行い、インスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質を製造する工程、
（Ｂ） 前記のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質を利用し、インスリンデグルデクを製造する工程を含み、
ここで、前記のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質は本発明の第一の側面に記載の通りであることを特徴とする方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の工程（Ｂ）は、さらに、
（ｉａ） 前記組み換え菌の発酵液から分離してインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質の封入体を得、前記の封入体を変性・再生した後、インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質を得る工程、
（ｉｂ） 前記のインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質に対して酵素切断処理を行うことにより、Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
（ｉｉ） 前記のＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖に対してＦｍｏｃ修飾を行うことにより、ＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
（ｉｉｉ） 前記のＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖に対して脱Ｂｏｃ処理を行うことにより、脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
（ｉｖ） 前記脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖をインスリンデグルデクの側鎖と反応させることにより、Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクを得る工程、ならびに
（ｖ） 前記のＦｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクに対して脱Ｆｍｏｃ処理および側鎖の脱ＯｔＢｕ処理を行うことにより、インスリンデグルデクを得る工程を含む。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｂ）では、トリプターゼおよびカルボキシペプチダーＢを利用して酵素切断を行う。
もう一つの好適な例において、前記のＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖は本発明の第四の側面に記載の通りである。
もう一つの好適な例において、前記のＦｍｏｃ修飾はインスリンデグルデクのＢ鎖およびＡ鎖のＮ末端に対する修飾である。
もう一つの好適な例において、前記のインスリンデグルデクの側鎖は以下の通りである。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｉ）では、Ｆｍｏｃ－Ｏｓｕ、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）およびＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）を入れることにより、Ｆｍｏｃ修飾を行う。
もう一つの好適な例において、入れるＦｍｏｃ－ＯＳｕとＤＩＰＥＡとＢｏｃ修飾されるインスリンデグルデクの主鎖のモル比が（３－６）：（１０－１４）：（０．８－１．２）、好ましくは（３．５－５．５）：（１１－１３）：（０．８－１．２）である。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の間に、さらに、製造されたＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を精製する工程、好ましくは、メチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテルの混合液を利用して精製する工程を含む。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｉｉ）では、さらに、
（ａ） 冷却しておいた０±５℃のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に化合物２を入れ、撹拌し、脱Ｂｏｃ処理を行い、脱Ｂｏｃ産物を製造する工程、
（ｂ） 脱Ｂｏｃ産物に対して精製処理を行い、好ましくはメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテルの混合液を利用して精製することにより、固体の脱Ｂｏｃ産物、すなわち、脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程を含む。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｖ）では、ＤＩＰＥＡの存在下で、室温で前記反応を行う。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｖ）では、ＤＭＦの中で前記反応を行う。
もう一つの好適な例において、前記脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖とインスリンデグルデクの側鎖とＤＩＰＥＡのモル比が（０．８－１．２）：（２－５）：（４－１０）、好ましくは１：２．５：１０である。
もう一つの好適な例において、工程（ｖ）では、ピぺリジンを含有するＤＭＦ溶液を入れ、脱Ｆｍｏｃ処理を行うことにより、前記のインスリンデグルデクを製造する。
もう一つの好適な例において、工程（ｖ）では、製造されたインスリンデグルデクを精製する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖は遺伝子組み換え技術を利用して製造される。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｂ）の後に、さらに、２ステップの精製工程を含む。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｂ）では、前記トリプターゼとインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質の質量比が１：３０００－１：１００００である。
もう一つの好適な例において、工程（ｉｂ）では、カルボキシペプチダーとインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質の質量比が１：５０００－１：１５０００である。
もう一つの好適な例において、前記の組み換え菌にインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質を発現する発現カセットが含まれているか、組み込まれている。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、以下の通りである。
もう一つの好適な例において、前記方法は、
（ｉ） 本発明の第二の側面に記載のインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質を提供し、酵素切断して化合物１を得る工程、
（ｉｉ） 化合物１に対してＦｍｏｃ修飾を行うことにより、化合物２を製造する工程、
（ｉｉｉ） 前記の化合物２に対して脱Ｂｏｃ処理を行うことにより、化合物３を製造する工程、
（ｉｖ） 化合物３をインスリンデグルデクの側鎖と反応させることにより、化合物４を製造する工程、ならびに
（ｖ） 化合物４に対して脱Ｆｍｏｃ処理および側鎖の脱ＯｔＢｕ処理を行うことにより、化合物６で示されるインスリンデグルデクを製造する工程を含む。
本発明の第八の側面では、本発明の第七の側面に記載の方法によって製造されるインスリンデグルデク製剤を提供する。
もう一つの好適な例において、製造されるインスリンデグルデクは生物活性を有する。
本発明の第九の側面では、単離されたポリヌクレオチドであって、本発明の第一の側面に記載のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載のインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質、本発明の第三の側面に記載のインスリンデグルデク前駆体、あるいは本発明の第四、五、六の側面に記載のインスリンデグルデクの主鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の第十の側面では、本発明の第九の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第十一の側面では、本発明の第十の側面に記載のベクターを含有するか、あるいは染色体に外来の本発明の第九の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞またはこれらの組み合わせである。
本発明の第十二の側面では、本発明の第一の側面に記載のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載のインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質、本発明の第三の側面に記載のインスリンデグルデク前駆体、あるいは本発明の第四、五、六の側面に記載のインスリンデグルデクの主鎖と、薬学的に許容される担体とを含む製剤または薬物組成物を提供する。
本発明の第十三の側面では、Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩ’で表される構造を有するものを提供する。

（式中において、

はジスルフィド結合を表す。
ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
ＧＢ’はインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示され、かつ前記Ｂ鎖の２９番目のリシンにインスリンデグルデクの側鎖が連結している。
そして、前記Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端がいずれもＦｍｏｃ修飾されている。）
もう一つの好適な例において、前記のインスリンデグルデクの側鎖は以下の通りである。

もう一つの好適な例において、前記のインスリンデグルデクの側鎖はｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕである。
図面の説明
図１は、プラスミドｐＢＡＤ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）のマップを示す。 図２は、プラスミドｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴのマップを示す。 図３は、封入体の変性・再生後のＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動パターンを示す。 図４は、Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の逆相精製収集液のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。 図５は、本発明のインスリンデグルデクの精製の最終産物のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。
図６は、実施例４におけるＢｏｃデグルデクの主鎖（化合物１）のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。 図７は、実施例４におけるＢｏｃデグルデクの主鎖（化合物１）のＬＣＭＳ検出スペクトルを示す。ここで、実測分子量は５８０７．８で、理論分子量は５８０６．６である。 図８は、実施例５におけるＦｍｏｃ、Ｂｏｃで保護された主鎖（化合物２）のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。ここで、ＨＰＬＣスペクトルの純度は８６．２６％である。 図９は、実施例５におけるＦｍｏｃ、Ｂｏｃで保護された主鎖（化合物２）のＬＣＭＳ検出スペクトルを示す。ここで、実測分子量は６１５０．３で、理論分子量は６２５１．１である。
図１０は、実施例５におけるＦｍｏｃで保護されたインスリンデグルデクの主鎖（化合物３）のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。ここで、ＨＰＬＣスペクトルの純度は８３．０２％である。 図１１は、実施例５におけるＦｍｏｃで保護されたインスリンデグルデクの主鎖（化合物３）のＬＣＭＳ検出スペクトルを示す。ここで、実測分子量は６１５０．７で、理論分子量は６２５１．１である。 図１２は、実施例５におけるＦｍｏｃ、側鎖ＯｔＢｕのインスリンデグルデク（化合物４）のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。ここで、ＨＰＬＣスペクトルの純度は６６．６４％である。 図１３は、実施例５におけるＦｍｏｃ、側鎖ＯｔＢｕのインスリンデグルデク（化合物４）のＬＣＭＳ検出スペクトルを示す。ここで、実測分子量は６６６０．０で、理論分子量は６６６０．８である。
図１４は、実施例５における側鎖ＯｔＢｕのインスリンデグルデク（化合物５）のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。ここで、ＨＰＬＣスペクトルの純度は７４．３７％である。 図１５は、実施例５における側鎖ＯｔＢｕのインスリンデグルデク（化合物５）のＬＣＭＳ検出スペクトルを示す。ここで、実測分子量は６２１７．３で、理論分子量は６２１６．３である。 図１６は、実施例５におけるインスリンデグルデク（化合物６）のＨＰＬＣ検出スペクトルを示す。ここで、ＨＰＬＣスペクトルの純度は６３．１２％である。 図１７は、実施例５におけるインスリンデグルデク（化合物６）のＬＣＭＳ検出スペクトルを示す。ここで、実測分子量は６１０４．０で、理論分子量は６１０４．９である。
具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究したところ、インスリンデグルデク誘導体およびその製造方法を見出した。具体的に、本発明は、緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位およびインスリンデグルデク前駆体またはその活性断片を含む融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、発現量が顕著に向上し、融合タンパク質におけるインスリンデグルデク前駆体のタンパク質のフォールディングが正確である。そして、本発明の融合タンパク質における緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はプロテアーゼによって小さい断片に消化され、分子量が標的のタンパク質と大きく異なり、分離しやすい。また、本発明は、当該融合タンパク質を利用してインスリンデグルデクを製造する方法および中間体を製造する方法を提供する。これに基づき、本発明を完成させた。
インスリンデグルデク
インスリンデグルデクは、新規な長時間作用型インスリンアナログである。２０１３年１月に欧州連合によって１型および２型糖尿病患者の治療への使用が許可された。インスリンデグルデクは、構造上の特徴が一つのＬ－γ－Ｇｌｕリンカーを介して組み換えヒトインスリン（Ｂ鎖３０位のトレオニンが削除されたもの）のＢ鎖２９位のリシンの側鎖のε－ＮＨ２基を修飾剤のヘキサデカン二酸とカップリングさせてなることである。このような設計は、作用時間を延ばす独特な機序を提供する。当該インスリンアナログは、超長時間作用、低変異性、速効型インスリンと複合製剤にすることが可能といった利点があり、皮下注射されると六量体の構造になり、当該構造は貯蔵庫としてインスリンデグルデクの単量体を徐放することができ、これらの単量体はゆっくり持続的に吸収して利用される。
インスリンデグルデク発現プラスミドの構築
標的遺伝子を持つＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）断片を合成し、断片の両末端に制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識部位がある。当該配列はコドン最適化が行われ、機能タンパク質の大腸菌における高レベルの発現が実現できる。発現後、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで発現ベクター「ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（ＫａｎａＲ）」および「ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）」標的遺伝子を含有するプラスミドを酵素切断し、酵素切断産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、さらにアガロースゲルＤＮＡ回収キットによって抽出し、最後にＴ４ ＤＮＡリガーゼによって２つのＤＮＡ断片を連結した。前記連結産物を化学法によって大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換させ、前記形質転換された細胞を５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有ＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ酵母トリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．５％寒天）において一晩培養した。３つの生存集落を取り、５ ｍＬの５０μｇ／ｍＬカナマイシン含有液体ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ酵母トリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）において一晩培養し、プラスミドミニプレップキットによってプラスミドを抽出した。その後、前記抽出されたプラスミドをシーケンシングオリゴヌクレオチドプライマーである５’－ＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ－３’でシーケンシングすることにより、正確に挿入したか、確認した。最終的に得られたプラスミドを「ｐＢＡＤ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）」と名付けた。
融合タンパク質
本発明では、緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位を利用し、２種類の融合タンパク質、すなわち、本発明の第一の側面に記載の１本鎖インスリンデグルデクを含むインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質および本発明の第二の側面に記載の２本鎖インスリンデグルデクを含むインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質を構築した。実は、本発明の２種類の融合タンパク質の保護範囲は一部が重なることがあり、たとえば、融合タンパク質に含まれる２本鎖の様態のインスリンデグルデクは、Ｂ鎖のＣ末端が連結ペプチドを介してＡ鎖のＮ末端と連結してもよく、鎖内ジスルフィド結合を含む１本鎖とされてもよい。
本発明の融合タンパク質に含まれる緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位ＦＰは２－６個、好ましくは２－３個の以下の群から選ばれるβシート単位を含む。
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位ＦＰは、ｕ８、ｕ９、ｕ２－ｕ３、ｕ４－ｕ５、ｕ８－ｕ９、ｕ１－ｕ２－ｕ３、ｕ２－ｕ３－ｕ４、ｕ３－ｕ４－ｕ５、ｕ５－ｕ６－ｕ７、ｕ８－ｕ９－ｕ１０、ｕ９－ｕ１０－ｕ１１、ｕ３－ｕ５－ｕ７、ｕ３－ｕ４－ｕ６、ｕ４－ｕ７－ｕ１０、ｕ６－ｕ８－ｕ１０、ｕ１－ｕ２－ｕ３－ｕ４、ｕ２－ｕ３－ｕ４－ｕ５、ｕ３－ｕ４－ｕ３－ｕ４、ｕ３－ｕ５－ｕ７－ｕ９、ｕ５－ｕ６－ｕ７－ｕ８、ｕ１－ｕ３－ｕ７－ｕ９、ｕ２－ｕ２－ｕ７－ｕ８、ｕ７－ｕ２－ｕ５－ｕ１１、ｕ３－ｕ４－ｕ７－ｕ１０、ｕ１－Ｉ－ｕ２、ｕ１－Ｉ－ｕ５、ｕ２－Ｉ－ｕ４、ｕ３－Ｉ－ｕ８、ｕ５－Ｉ－ｕ６、またはｕ１０－Ｉ－ｕ１１から選ばれてもよい。
もう一つの好適な例において、前記の緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位はｕ３－ｕ４－ｕ５である。
もう一つの好適な例において、本発明の融合タンパク質は、下記式で表される構造を有する。
Ａ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－Ｇ
（式中において、
「－」はペプチド結合を表す。
Ａは無しか、リードペプチドである。
ＦＰは緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位である。
ＴＥＶは酵素切断部位で、好ましくはＴＥＶ酵素の酵素切断部位（配列はＥＮＬＹＦＱＧで、配列番号４である）である。
Ｒは酵素切断部位である。
ＧはＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデク前駆体で、下記式で表される構造を有する。
（Ｂ１Ｆ～Ｂ２９Ｂｏｃ－Ｋ）－ Ｘ－（Ａ１Ｇ～Ａ２１Ｎ）
（式中において、
Ｘは連結ペプチドで、好ましくは、前記連結ペプチドのアミノ酸配列がＲ、ＲＲ、ＲＲＲ、あるいは配列番号４－７で示される（ＲＲＧＳＫＲ、ＲＲＡＡＫＲ、ＲＲＹＰＧＤＶＫＲまたはＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲ）。））
本明細書で用いられるように、用語「融合タンパク質」は、さらに、上記活性を有する変異様態を含む。これらの変異様態は、１～３個（通常は１～２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端における１個または複数個（通常は３個以内、好ましくは２個以内、より好ましくは１個以内）のアミノ酸の付加または欠失を含むが、これらに限定されない。たとえば、本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。また、Ｃ末端および／またはＮ末端における１個または複数個のアミノ酸の付加または欠失により、通常、蛋白質の構造および機能が変わることもない。また、前記用語は、単量体と多量体の様態の本発明のポリペプチドを含む。当該用語は、さらに、線形および非線形のポリペプチド（たとえば、環状ペプチド）を含む。
本発明は、さらに、上記融合タンパク質の活性断片、誘導体および類似体を含む。本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、基本的に本発明の融合タンパク質の機能または活性を維持するポリペプチドをいう。本発明のポリペプチドの断片、誘導体および類似体は、（ｉ）１個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、あるいは（ii）１個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、あるいは（iii）ポリペプチドと別の化合物（たとえば、ポリエチレングリコールのようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）が融合してなるポリペプチドでもよく、あるいは（iv）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合してなるポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または６Ｈｉｓなどのタグ配列と融合してなる融合タンパク質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。
一部の好適な活性誘導体は、本発明のアミノ酸配列と比較すると、３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
表Ａ
また、本発明は、本発明の融合タンパク質の類似体を提供する。これらの類似体と本発明のポリペプチドの違いは、アミノ酸配列の違いでもよく、配列に影響を与えない修飾形態の違いでもよく、あるいは両者でもよい。類似体は、さらに、天然Ｌ－アミノ酸と異なる残基（たとえばＤ－アミノ酸）を有する類似体、および非天然または合成のアミノ酸（たとえばβ、γ－アミノ酸）を有する類似体を含む。もちろん、本発明のポリペプチドは、上記で挙げられた代表的なポリペプチドに限定されない。
また、本発明の融合タンパク質を修飾してもよい。修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外のポリペプチドの化学的に誘導された形態、例えばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、たとえばポリペプチドの合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行ったポリペプチドも含む。このような修飾は、ポリペプチドをグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（たとえばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させたポリペプチドまたは溶解性を改善したポリペプチドを含む。
用語「本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
本発明は、さらに、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは融合タンパク質の断片、類似体および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの代替形態で、１つまたは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入でもよいが、実質的にそれによってコードされる融合タンパク質の機能が変わることはない。
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ２つの配列の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（１）低いイオン強度および高い温度、たとえば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（２）ハイブリダイズ時変性剤、たとえば４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ胎児血清／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌなどを入れること、あるいは（３）２つの配列の間の相同性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の時だけハイブリダイズすることである。
本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドは、好ましくは分離された形態で提供し、より好ましくは均質に精製される。
本発明のポリヌクレオチドの全長配列は、通常、ＰＣＲ増幅法、組み換え法または人工合成の方法で得られる。ＰＣＲ増幅法について、本発明で公開された関連のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、２回または２回以上のＰＣＲ増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
現在、本発明のタンパク質（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。
本発明のポリヌクレオチドを得るには、ＰＣＲ技術でＤＮＡ／ＲＮＡを増幅する方法が好適に使用される。特にライブラリーから全長のｃＤＮＡを得ることが困難な場合、好適にＲＡＣＥ法（ＲＡＣＥ－ｃＤＮＡ末端快速増幅法）を使用し、ＰＣＲに使用されるプライマーはここで公開された本発明の配列情報によって適切に選択し、かつ通常の方法で合成することができる。通常の方法、たとえばゲル電気泳動によって増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡ断片を単離、精製することができる。
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたは本発明の融合タンパク質コード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞、ならびに組み換え技術によって本発明に係るポリペプチドを生成する方法にも関する。
通常の組み換えＤＮＡ技術によって、本発明のポリヌクレオチド配列で組み換えの融合タンパク質を発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む：
（１）本発明の本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（または変異体）を使用し、あるいはこのポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する；
（２）適切な培地において宿主細胞を培養する；
（３）培地または細胞からタンパク質を分離し、精製する。
本発明において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は組み換え発現ベクターに挿入してもよい。用語「組み換え発現ベクター」とは、本分野でよく知られている細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルスまたはほかのベクターである。宿主体内で安定して複製することができれば、どんなプラスミドおよびベクターでも使用できる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御エレメントを含むことである。
本発明の融合タンパク質のコードＤＮＡ配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築に当業者によく知られている方法を使用することができる。これらの方法は、体外組み換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、体内組み換え技術などを含む。前記のＤＮＡ配列は、有効に発現ベクターにおける適切なプロモーターに連結し、ｍＲＮＡ合成を指導することができる。これらのプロモーターの代表的な例として、大腸菌のｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、λファージのＰＬプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーターを含む真核プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲｓやほかの既知の制御可能な遺伝子の原核または真核細胞あるいはそのウイルスにおける発現されるプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、さらに、翻訳開始用リボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含む。
また、発現ベクターは、好ましくは１つまたは２つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、たとえば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、あるいは大腸菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供する。
上記の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現するようにすることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、植物細胞（たとえばオタネニンジン細胞）がある。
本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞において発現される場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入すると転写が強化される。エンハンサーは、ＤＮＡのシスエレメントで、通常、約１０～３００ｂｐで、プロモーターに作用して遺伝子の転写を強化する。例を挙げると、複製起点の後期側にある１００～２７０ｂｐのＳＶ４０エンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどを含む。
当業者は、どうやって適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞を選択するか、よくわかる。
ＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行ってもよい。宿主が原核細胞、たとえば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（たとえば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
Ｆｍｏｃ修飾
生物医薬の分野において、ポリペプチドの用途が広がっており、アミノ酸がポリペプチド合成技術の基本の原料で、アミノ酸のいずれにもα－アミノ基およびカルボキシ基が含まれ、一部には、さらに、たとえば、ヒドロキシ基、アミノ基、グアニジル基や複素環など、側鎖の活性基が含まれているため、アミノ基および側鎖の活性基はペプチド連結反応においていずれも保護し、ポリペプチドの合成後、さらに保護基を脱離させる必要があり、そうしないと、アミノ酸の間違った連結および多くの副反応が生じることがある。
フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）は塩基に敏感な保護基で、濃アンモニア水またはジオキサン－メタノール－４Ｎ ＮａＯＨ（３０：９：１）およびピぺリジン、エタノールアミン、シクロヘキシルアミン、１，４－ジオキサン、ピロリジンなどのアミン類の５０％ジクロロメタン溶液において脱離させることができる。
炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムなどの弱塩基性の条件において、一般的に、Ｆｍｏｃ－ＣｌまたはＦｍｏｃ－ＯＳｕでＦｍｏｃ保護基を導入する。Ｆｍｏｃ－Ｃｌよりも、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕのほうが反応条件の制御がしやすく、かつ副反応が少ない。Ｆｍｏｃは強い紫外線の吸収を有し、最大吸収波長が２６７ｎｍ（ε１８９５０）、２９０ｎｍ（ε５２８０）、３０１ｎｍ（ε６２００）であるため、紫外線吸収によって検出することができ、機器によるポリペプチドの自動合成に便利をもたらす。また、幅広い溶媒、試薬と兼用でき、機械的安定性が高く、多くのベクターおよび多くの活性化手段に使用できる。そのため、現在、ポリペプチドの合成において、最も使用されるのはＦｍｏｃ保護基である。
Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ （９－フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート）
インスリンデグルデクの側鎖
ｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕはインスリンデグルデクの側鎖である。

ｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕ
インスリンデグルデクの製造は、まず遺伝子組み換え技術によって２９位のリシンがＢｏｃで保護されたインスリンデグルデクの主鎖を得、さらにインスリンデグルデクの側鎖であるｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕを連結することにより、インスリンデグルデクを得る。
インスリンデグルデクの製造
本発明によって提供されるインスリンデグルデクの合成経路は以下に示すように、Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖（化合物１）からＦｍｏｃ修飾された化合物２を製造し、化合物２を脱Ｂｏｃ保護した後、化合物３を得、化合物３を活性化されたインスリンデグルデクの側鎖であるｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕと反応させ、化合物４を得、さらに脱Ｆｍｏｃ反応して化合物５を得、側鎖からＯｔＢｕ保護基を脱離させ、最後に化合物６であるインスリンデグルデクを得る。
具体的に、本発明では、インスリンデグルデクを製造する方法であって、
（ｉ） Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を提供する工程、
（ｉｉ） 前記のＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖に対してＦｍｏｃ修飾を行うことにより、ＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
（ｉｉｉ） 前記のＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖に対して脱Ｂｏｃ処理を行い、そしてそれをインスリンデグルデクの側鎖と反応させることにより、Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクを得る工程、ならびに
（ｉｖ） 前記のＦｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクに対して脱Ｆｍｏｃ処理および側鎖の脱ＯｔＢｕ処理を行うことにより、インスリンデグルデクを得る工程
を含む方法を提供する。
本発明の主な利点は以下の通りである。
（１） 本発明によって生産されるＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖は、希釈、限外ろ過・液置換などの方法によって発酵液の上清における過剰な無機塩を除去する必要がない。次に、標的のペプチドを製造する過程において臭化シアンによる分解、酸化スルフィトリシス（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｓ）および関連する精製工程が必要ではない。
（２） 本発明の方法では、融合タンパク質に含まれるインスリンデグルデクの主鎖の比率が高く（融合比が増加し）、融合タンパク質におけるＦＰまたはＡ－ＦＰにアルギニン、リシンが含まれ、プロテアーゼによって小さい断片に消化され、分子量が標的のタンパク質と大きく異なり、分離が容易で、クロマトグラフィーによるＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖または類似体の前駆体の分離では、ワンステップの収率が７０％以上で、通常の方法よりも３倍高く、そしてほとんどの色素が除去され、Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の収量が約１．５－１．８ ｇ／Ｌである。本発明の合成プロセスでは、工程が三分の二以上簡略化され、プロセス時間および設備投資コストが低下する。
（３） ２９位のＢｏｃ－リシンの保護により、本発明では、直接Ｆｍｏｃ保護との直交反応を利用し、インスリンデグルデクを合成することができる。
（４） 本発明の方法によって合成されるインスリンデグルデクはＮ末端の脂肪酸がアシル化する不純物がなく、下流の精製に有利で、コストが低下する。
（５） 固相合成と比べ、本発明の方法では、ラセミ体の不純物のポリペプチドが発生せず、そして大量の修飾アミノ酸を使用する必要がなく、大量の有機溶媒を使用することがなく、環境に対する汚染が小さく、コストがより低い。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、あるいはメーカーの薦めの条件で行われた。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。
実施例１ インスリンデグルデク発現菌株の構築および発現
インスリンデグルデク発現ベクターの構築は中国特許出願番号２０１９１０２１０１０２．９における実施例の記載を参照する。融合タンパク質ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）のＤＮＡ断片を、発現ベクターであるプラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ Ａ（ＮＴＣＣ社から購入、カナマイシン耐性）のａｒａＢＡＤプロモーターの下流のＮｃｏＩ－ＸｈｏＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＢＡＤ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）を得た。プラスミドのマップは図１に示す。
さらに、ｐｙｌＲｓのＤＮＡ配列を、発現ベクターであるプラスミドｐＥｖｏｌ－ｐＢｐＦ（ＮＴＣＣ社から購入、クロラムフェニコール耐性）のａｒａＢＡＤプロモーターの下流のＳｐｅＩ－ＳａｌＩ部位にクローニングし、同時にｐｒｏＫプロモーターの下流に、ＰＣＲ方法によってリジル－ｔＲＮＡ合成酵素のｔＲＮＡ（ｐｙｌＴｃｕａ）のＤＮＡ配列を挿入した。当該プラスミドはｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴと名付けられた。プラスミドのマップは図２に示す。
構築されたプラスミドｐＢＡＤ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）およびｐＥｖｏｌ－ｐｙｌＲｓ－ｐｙｌＴを大腸菌ＴＯＰ１０菌株に共形質転換させ、クリーニングしてインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）を発現する組み換え大腸菌株を得た。

（配列番号１）
シード培地を調製し、接種し、二次培養を経て二次シード液を調製し、２０ ｈ培養し、ＯＤ６００が１８０程度になり、発酵を終了させ、約３ Ｌの発酵液を得、遠心して約１５０ ｇ／Ｌの湿潤菌体を得た。発酵液を遠心した後、破砕緩衝液を入れ、高圧ホモジナイザーで２回菌を破砕させ、遠心後、ツイン８０およびＥＤＴＡ－２Ｎａなどを入れて洗浄し、そして水で１回洗浄し、遠心して沈殿を収集し、封入体を得た。発酵液１リットルあたりで最終的に湿重量が約４０ ｇの封入体を得ることができ、封入体に含まれるのはインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質である。
実施例２ Ｂｏｃ－インスリンデグルデク前駆体封入体の変性・再生および酵素切断
実施例１で得られた封入体に重量体積比１：１０（ｍ／ｖ）の比率で７．５－９．０ ｍｏｌ／Ｌの尿素溶解液を入れ、室温で撹拌して溶解させ、封入体溶解液の合計タンパク質濃度が１０－２５ ｍｇ／ｍＬになるように制御し、ＮａＯＨでｐＨが１１．０－１１．８になるように調整し、２－１５ ｍｍｏｌ／Ｌのβ－メルカプトエタノールを入れて均一に撹拌した。封入体溶解液を０．２～１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－シスチン、５～２０ ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム、５～２０ ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、０．３～１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－２Ｎａを含有する再生緩衝液に滴下し、封入体溶解液を５－１０倍希釈して再生させ、融合タンパク質再生液のｐＨ値が１０．５－１１．８になるように維持し、温度が４－８℃になるように制御し、再生時間が１０－２０ ｈで、再生率が６０％以上で（電気泳動検出は図３を参照する）、インスリンデグルデクのＡ鎖とインスリンデグルデクのＢ鎖の間にジスルフィド結合が含まれるインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質を得た。
Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質の再生液を取り、ｐＨが８．０－９．５になるように調整し、組み換えトリプターゼと再生液の合計タンパク質量の比が１：３０００－１：１００００になるように組み換えトリプターゼを入れ、組み換えカルボキシペプチダーＢと再生液の合計タンパク質量の比が１：５０００－１：１５０００になるように組み換えカルボキシペプチダーＢを入れ、１５－２５℃で２０－４０ ｈ酵素切断を行い、最終的にＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖を得たが、酵素切断率が７０％超であった。
実施例３ Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の初歩的精製
限外ろ過で酵素切断液における不溶混合物を除去し、タンパク質の等電点の差より、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー技術によって実施例２で得られたＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖に対して初歩的精製を行うことで、大半の不純物を除去し、Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖のフィラー結合担持量が５０ ｍｇ／ｍＬ未満になるように制御し、勾配溶離してＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖を収集し、初歩的精製後のＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の純度が７０％以上に達し、収率が８５％超であった。
実施例４ Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の逆相クロマトグラフィー
実施例３で得られたＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の溶液は、Ｃ８クロマトグラフィーによって分離して精製した。トリフルオロ酢酸を含有する水溶液を移動相Ａとし、トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液を移動相Ｂとした。Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖はＣ８フィラーと結合し、Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の仕込み量＜１０ｍｇ／ｍＬになるように制御し、勾配溶離し、Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖を収集した。実験結果から、逆相クロマトグラフィーによって収集されたＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖の純度が≧９０％で（ＨＰＬＣ検出図は図４を参照する）、収率が６０％超であったことが示された。
実施例５ Ｂｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖を利用したインスリンデグルデクの製造
実施例４で得られたＢｏｃ－インスリンデグルデクの主鎖である化合物１の乾燥品を取り（本例は仕込みモル比が３０ ｍｇの例である）、表１の比率でＦｍｏｃ－Ｏｓｕ、ＤＩＰＥＡおよびＤＭＦを入れ、８－１２時間反応させ、ＦｍｏｃおよびＢｏｃで保護されたインスリンデグルデクの主鎖を得た。その後、反応系に０±５℃のメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（３：１）の混合溶媒を入れ、固体を沈殿させて遠心で分離し、メチル－ｔ－ブチルエーテルと石油エーテル（３：１）の混合溶媒で沈殿を２－３回洗浄し、Ｆｍｏｃで保護された化合物２：ＤｉＦｍｏｃ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９Ｂｏｃ）を得た。
表１ 仕込みのモル比
冷却しておいた０±５℃のＴＦＡ溶液に化合物２を入れ、０．５－２．０ ｈ撹拌し、反応混合物に冷却しておいた０±５℃のメチル－ｔ－ブチルエーテルと石油エーテ（３：１）の混合溶液を入れ、沈殿させて遠心した。固体を３０ ｍｇ／ｍｌのメチル－ｔ－ブチルエーテルで２－３回洗浄し、乾燥し、Ｂｏｃが脱離した固体化合物３：ＤｉＦｍｏｃ－インスリン（ＤｅｓＢ３０、Ｌｙｓ２９ ＮＨ２）を得た。
Ｂｏｃが脱離した化合物３を取り、ＤＭＦ溶液に溶解させ、１２ ｅｑのＤＩＰＥＡを入れ、ｐＨ８．０－９．０の条件において２．５ ｅｑの側鎖化合物ｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ（ＯＳｕ）－ＯｔＢｕを入れ、反応混合物を室温でやさしく２－３時間撹拌した。反応終了後、０±５℃のメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（３：１）の混合溶媒を入れて固体産物を沈殿させ、２－３回洗浄し、乾燥し、白色の化合物４：ＤｉＦｍｏｃ－インスリン（ ｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ－（Ｌｙｓ２９ＮＨ）－ＯｔＢｕ、ＤｅｓＢ３０）を得た。
化合物４を取り、２０％ピぺリジンを含有するＤＭＦ溶液を入れ、室温で０．５－２．０ ｈ反応させた。そして、反応系に冷却した０±５℃のメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（３：１）のの混合溶液を入れて産物を沈殿させ、固体を遠心してメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（３：１）で３－５回洗浄し、乾燥し、Ｆｍｏｃが脱離した化合物５：インスリン（ ｔＢｕＯ－Ｐａｌ－Ｇｌｕ－（Ｌｙｓ２９ＮＨ）－ＯｔＢｕ、ＤｅｓＢ３０）を得た。
Ｆｍｏｃが脱離した化合物５を取り、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）およびＤＣＭ（ジクロロメタン）の混合溶液（（９０％ＴＦＡ：１０％ＴＩＳ）：ＤＣＭ＝１：２）を入れ、室温で振とうして２－４ ｈ反応させ、側鎖のＯｔＢｕ保護基を脱離させ、反応系に１０－２０倍体積の冷却した０±５℃のメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（３：１）の混合溶媒を入れ、沈殿を遠心し、固体をメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテル（３：１）の混合溶媒で３回以上洗浄し、吸引乾燥し、最終的にインスリンデグルデクを得た。
合成されたインスリンデグルデクはツーステップＣ８高圧逆相クロマトグラフィーにかけ、最終的に純度が９９％超のインスリンデグルデクを得た（図５を参照する）。
比較例
実施例１のような方法によって融合タンパク質発現菌株の構築および発現を行ったが、相違点が発現のための融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２２で示されることのみである。

（配列番号２２）
上記融合タンパク質には、インスリンデグルデクのＢ鎖およびＡ鎖、そしてｇＩＩＩシグナルペプチドが含まれている。
結果から、２０ ｈ培養し、ＯＤ６００が１４０程度になり、発酵を終了させ、約３ Ｌの発酵液を得、遠心して約１０５ ｇ／Ｌの湿潤菌体を得たことが示された。発酵液を遠心した後、破砕緩衝液を入れ、高圧ホモジナイザーで２回菌を破砕させ、そして遠心で沈殿を収集し、封入体を得た。発酵液１リットルあたりで最終的に湿重量が約３０ ｇの封入体を得ることができ、封入体に含まれるのはインスリンデグルデクの融合タンパク質である。
上記結果から、通常の構造の融合タンパク質の発現と比べ、本発明の融合タンパク質は、発現量が顕著に向上し、そして融合タンパク質におけるインスリンデグルデクのタンパク質のフォールディングが正確で、生物活性を有することが示された。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (15)

  1. インスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端へ、式ＩＩＩで表される構造を有することを特徴とする、前記融合タンパク質。
    Ａ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－Ｇ （ＩＩＩ）
    （式中において、
    「－」はペプチド結合を表す。
    Ａは無しか、リードペプチドである。
    ＦＰは緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位である。
    ＴＥＶは第一の酵素切断部位で、好ましくはＴＥＶ酵素の酵素切断部位である。
    Ｒは酵素切断のためのアルギニンまたはリシンである。
    Ｇはインスリンデグルデクの主鎖またはその活性断片である。
    ここで、緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位は２－６個の以下の群から選ばれるβシート単位を含む。）
  2. 緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位が、ｕ２－ｕ３、ｕ４－ｕ５、ｕ１－ｕ２－ｕ３、ｕ３－ｕ４－ｕ５またはｕ４－ｕ５－ｕ６であることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. Ｇが、Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデク前駆体で、式ＩＶで表される構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
    ＧＢ－Ｘ－ＧＡ （ＩＶ）
    （式中において、
    「－」はペプチド結合を表す。
    ＧＢは２９番目がＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
    Ｘは連結ペプチドである。
    ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。）
  4. インスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１で示されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端へ、式Ｉで表される構造を有することを特徴とする、前記融合タンパク質。
    Ａ－ＦＰ－ＴＥＶ－Ｒ－Ｄ （Ｉ）
    （式中において、
    「－」はペプチド結合を表す。
    Ａは無しか、リードペプチドである。
    ＦＰは緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位である。
    ＴＥＶは第一の酵素切断部位で、好ましくはＴＥＶ酵素の酵素切断部位である。
    Ｒは酵素切断のためのアルギニンまたはリシンである。
    ＤはＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖で、式ＩＩで表される構造を有する。
    （式中において、

    はジスルフィド結合を表す。
    ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
    Ｘは連結ペプチドである。
    ＧＢは２９番目がＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
    ここで、緑色蛍光タンパク質のフォールディング単位は２－６個の以下の群から選ばれるβシート単位を含む。）
  6. Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデク前駆体であって、式ＩＶで表される構造を有することを特徴とする、前記インスリンデグルデク前駆体。
    ＧＢ－Ｘ－ＧＡ （ＩＶ）
    （式中において、
    「－」はペプチド結合を表す。
    ＧＢは２９番目がＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
    Ｘは連結ペプチドで、好ましくは、連結ペプチドのアミノ酸配列がＲ、ＲＲ、ＲＲＲ、あるいは配列番号４－７で示される。
    ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。）
  7. Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩで表される構造を有することを特徴とする、前記インスリンデグルデクの主鎖。

    （式中において、

    はジスルフィド結合を表す。
    ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
    ＧＢはインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示され、かつＢ鎖の２９番目のリシンがＮ－ε－（ｔ－ブトキシカルボニル）－リシンである。）
  8. Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端がいずれもＦｍｏｃ修飾されていることを特徴とする、請求項７に記載の主鎖。
  9. Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩで表される構造を有することを特徴とする、前記インスリンデグルデクの主鎖。

    （式中において、

    はジスルフィド結合を表す。
    ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
    ＧＢはインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示される。
    そして、Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端がいずれもＦｍｏｃ修飾されている。）
  10. 単離されたポリヌクレオチドであって、請求項１に記載のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質、請求項５に記載のインスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質、請求項６に記載のインスリンデグルデク前駆体、あるいは請求項７または８に記載のインスリンデグルデクの主鎖をコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
  11. インスリンデグルデクを製造する方法であって、
    （Ａ） 組み換え菌を利用して発酵を行い、請求項１に記載のインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質を製造する工程、
    （Ｂ） インスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質を利用し、インスリンデグルデクを製造する工程
    を含むことを特徴とする、前記方法。
  12. 工程（Ｂ）が、さらに、
    （ｉａ） 組み換え菌の発酵液から分離してインスリンデグルデク前駆体の融合タンパク質の封入体を得、封入体を変性・再生した後、インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質を得る工程、
    （ｉｂ） インスリンデグルデクの主鎖の融合タンパク質に対して酵素切断処理を行うことにより、Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
    （ｉｉ） Ｂｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖に対してＦｍｏｃ修飾を行うことにより、ＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
    （ｉｉｉ） ＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖に対して脱Ｂｏｃ処理を行うことにより、脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程、
    （ｉｖ） 脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖をインスリンデグルデクの側鎖と反応させることにより、Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクを得る工程、ならびに
    （ｖ） Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクに対して脱Ｆｍｏｃ処理および側鎖の脱ＯｔＢｕ処理を行うことにより、インスリンデグルデクを得る工程
    を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 工程（ｉｉ）では、Ｆｍｏｃ－Ｏｓｕ、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）およびＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）を入れることにより、Ｆｍｏｃ修飾を行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  14. 工程（ｉｉｉ）が、
    （ａ） ＦｍｏｃおよびＢｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖を、冷却しておいたＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に入れ、低温で撹拌し、脱Ｂｏｃ処理を行い、脱Ｂｏｃ産物を製造する工程、
    （ｂ） 脱Ｂｏｃ産物に対して精製処理を行い、好ましくはメチル－ｔ－ブチルエーテル／石油エーテルの混合液を利用して精製することにより、脱Ｂｏｃされたインスリンデグルデクの主鎖を得る工程
    をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  15. Ｆｍｏｃ修飾されたインスリンデグルデクの主鎖であって、式ＩＩで表される構造を有することを特徴とする、前記インスリンデグルデクの主鎖。

    （式中において、

    はジスルフィド結合を表す。
    ＧＡはインスリンデグルデクのＡ鎖で、アミノ酸配列が配列番号３で示される。
    ＧＢ’はインスリンデグルデクのＢ鎖で、アミノ酸配列が配列番号２で示され、かつＢ鎖の２９番目のリシンにインスリンデグルデクの側鎖が連結している。
    そして、Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端がいずれもＦｍｏｃ修飾されている。）
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