CN113773397B - 一种德谷胰岛素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种德谷胰岛素衍生物及其制备方法。具体地,本发明的方法利用包含绿色荧光蛋白折叠单元的德谷胰岛素融合蛋白进行德谷胰岛素的制备,并对Boc修饰的德谷胰岛素主链进行Fmoc修饰,利用正交保护进行德谷胰岛素的侧链加成。本发明还提供该制备方法过程中涉及的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链以及包含德谷胰岛素主链的融合蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,更具体地涉及一种德谷胰岛素的制备方法。
背景技术
糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国,随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快,糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急慢性并发症,尤其是慢性并发症累计多个器官,致残、致死率高,严重影响患者的身心健康,并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
由丹麦诺和诺德公司研制的重组德谷胰岛素注射液“Tresiba”是一种新型的长效胰岛素类似物。2013年1月得到欧盟批准,应用于I型和II型糖尿病患者的治疗。德谷胰岛素其结构特点为通过一个L-γ-Glu连接子将重组人胰岛素(去B链30位苏氨酸)的B链29位赖氨酸侧链εNH2基与修饰剂16碳脂肪二酸偶联而成。此设计提供一种独特的延长作用时间的机制。该种胰岛素类似物具有作用时间超长、变异性小、能够和速效胰岛素形成复方制剂等优点,皮下注射后会形成六聚体结构,此结构可作为一个存储库缓慢释放德谷胰岛素单体,这些单体能够缓慢并持续的被吸收利用。
国内外关于德谷胰岛素制备的报道很多,一般是通过一种基因重组技术得到德谷胰岛素主链(主链),再通过液相合成方法连接tBuO-Pal-Glu(OSu)-OtBu物质得到德谷胰岛素,由于德谷胰岛素主链处于未保护的状态,在连接过程中侧链容易接在N末端氨基上,从而产生杂质,导致纯化困难和收率较低的问题,工艺较复杂。
因此,本领域技术人员致力于开发新的、更长效的胰岛素衍生物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种德谷胰岛素的制备方法。
在本发明的第一方面,提供了一种德谷胰岛素前体融合蛋白,从N端到C端具有式III所示的结构:
A-FP-TEV-R-G (III)
式中,
“-”代表肽键;
A为无或前导肽,
FP为绿色荧光蛋白折叠单元,
TEV为第一酶切位点,较佳地为TEV酶酶切位点;
R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸;
G为德谷胰岛素或其活性片段;
其中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个选自下组的β-折叠单元:
β-折叠单元 | 氨基酸序列 |
u1 | VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO.:11) |
u2 | HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO.:12) |
u3 | KLTLKFICTT(SEQ ID NO.:13) |
u4 | YVQERTISFKD(SEQ ID NO.:14) |
u5 | TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:15) |
u6 | TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:16) |
u7 | HNVYITADKQ(SEQ ID NO.:17) |
u8 | GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:18) |
u9 | VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:19) |
u10 | HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:20) |
u11 | HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO.:21)。 |
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6。
在另一优选例中,所述的G为Boc修饰的德谷胰岛素前体,具有式IV所示的结构:
其具有式IV所示的结构:
GB-X-GA (IV)
式中,
“-”代表肽键;
GB为第29位Boc修饰的德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,
X为连接肽,较佳地,所述连接肽的氨基酸序列为R、RR、RRR,或如SEQ ID NO.:4-7所示(RRGSKR,RRAAKR,RRYPGDVKR或RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR);
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u3-u4-u5。
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元的氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中,所述的德谷胰岛素前体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中,所述GB的第29位赖氨酸为Nε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸。
在另一优选例中,所述德谷胰岛素主链中包含的德谷胰岛素B链不包含侧链。
在另一优选例中,所述GB不包含侧链。
在本发明的第二方面,提供了一种德谷胰岛素主链融合蛋白,所述的德谷胰岛素融合蛋白从N端到C端具有式I所示的结构:
A-FP-TEV-R-D (I)
式中,
“-”代表肽键;
A为无或前导肽,
FP为绿色荧光蛋白折叠单元;
TEV为第一酶切位点,较佳地为TEV酶酶切位点(如序列ENLYFQG所示,SEQ ID NO.:10);
R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸;
D为Boc修饰的德谷胰岛素主链,具有式II所示的结构:
式中,
“║”代表二硫键;
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示,
X为连接肽;
GB为第29位Boc修饰的德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示;
其中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个选自下组的β-折叠单元:
β-折叠单元 | 氨基酸序列 |
u1 | VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO.:11) |
u2 | HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO.:12) |
u3 | KLTLKFICTT(SEQ ID NO.:13) |
u4 | YVQERTISFKD(SEQ ID NO.:14) |
u5 | TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:15) |
u6 | TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:16) |
u7 | HNVYITADKQ(SEQ ID NO.:17) |
u8 | GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:18) |
u9 | VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:19) |
u10 | HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:20) |
u11 | HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO.:21)。 |
在另一优选例中,所述的R用于胰蛋白酶酶切和羧肽酶酶切。
在另一优选例中,所述德谷胰岛素B链的C端通过连接肽与德谷胰岛素A链的N端相连。
在另一优选例中,所述连接肽的氨基酸序列为R、RR、RRR,或如SEQ ID NO.:4-7所示(RRGSKR,RRAAKR,RRYPGDVKR或RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)。
在另一优选例中,所述德谷胰岛素B链第7位与A链第7位(A7-B7)、B链第19位与A链第20位(A20-B19)之间形成链间二硫键。
在另一优选例中,所述德谷胰岛素A链第6位与A链第11位(A6-A11)之间形成链内二硫键。
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6。
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u3-u4-u5。
在另一优选例中,所述的Boc修饰的德谷胰岛素主链包含A链和B链,且A链和B链通过链间二硫键相连,较佳地通过两对。
在另一优选例中,所述的A链包含链内二硫键。
在另一优选例中,所述前导肽的序列如SEQ ID NO.:8所示。
在本发明的第三方面,提供了一种Boc修饰的德谷胰岛素前体,具有式IV所示的结构:
GB-X-GA (IV)
式中,
“-”代表肽键;
GB为第29位Boc修饰的德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,
X为连接肽,较佳地,所述连接肽的氨基酸序列为R、RR、RRR,或如SEQ ID NO.:4-7所示(RRGSKR,RRAAKR,RRYPGDVKR或RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR);
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
在本发明的第四方面,提供了一种Boc修饰的德谷胰岛素主链,具有式II所示的结构:
式中,
“║”代表二硫键;
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示,
GB为德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,且所述B链的第29位为Nε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸。
在本发明的第五方面,提供了一种Boc修饰和Fmoc修饰的德谷胰岛素主链,具有式II所示的结构:
式中,
“║”代表二硫键;
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示,
GB为德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,且所述B链的第29位为Nε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸;
并且所述A链和B链的N端均被Fmoc修饰。
在另一优选例中,所述的Fmoc为芴甲氧羰基。
在本发明的第六方面,提供了一种Fmoc修饰的德谷胰岛素主链,具有式II所示的结构:
式中,
“║”代表二硫键;
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示,
GB为德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示;
并且所述A链和B链的N端均被Fmoc修饰。
在另一优选例中,所述的Fmoc为芴甲氧羰基。
在本发明的第七方面,提供了一种制备德谷胰岛素的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(A)利用重组菌进行发酵,制备德谷胰岛素前体融合蛋白,
(B)利用所述的德谷胰岛素前体融合蛋白,制备德谷胰岛素,
其中,所述的德谷胰岛素前体融合蛋白如本发明第一方面所述。
在另一优选例中,所述的步骤(B)还包括步骤:
(ia)从所述重组菌的发酵液中分离获得德谷胰岛素前体融合蛋白包涵体,对所述的包涵体进行变复性后,获得德谷胰岛素主链融合蛋白;
(ib)对所述的德谷胰岛素主链融合蛋白进行酶切处理,从而获得Boc修饰的德谷胰岛素主链;
(ii)对所述的Boc修饰的德谷胰岛素主链进行Fmoc修饰,从而制得Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链;
(iii)对所述的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链进行脱Boc处理,从而获得脱Boc的德谷胰岛素主链;
(iv)将所述脱Boc的德谷胰岛素主链与德谷胰岛素侧链进行反应,从而制得Fmoc修饰的德谷胰岛素;和
(v)对所述的Fmoc修饰的德谷胰岛素进行脱Fmoc与侧链脱tBu处理,从而制得德谷胰岛素。
在另一优选例中,在步骤(ib)中,利用胰蛋白酶和羧肽酶B进行酶切处理。
在另一优选例中,所述的Boc修饰的德谷胰岛素主链如本发明第四方面所述。
在另一优选例中,所述的Fmoc修饰是对德谷胰岛素B链和A链的N端进行修饰。
在另一优选例中,所述的德谷胰岛素侧链如下所示:
在另一优选例中,在步骤(ii)中,加入Fmoc-Osu、DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)和DMF(N,N-二甲基甲酰胺),从而进行Fmoc修饰。
在另一优选例中,加入的Fmoc-OSu、DIPEA与Boc修饰的德谷胰岛素主链的摩尔比为(3-6):(10-14):(0.8-1.2),较佳地为(3.5-5.5):(11-13):(0.8-1.2)。
在另一优选例中,在步骤(ii)和步骤(iii)之间,还包括对制得的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链进行纯化的步骤,较佳地,利用甲叔醚/石油醚混合液进行纯化。
在另一优选例中,在步骤(iii)中,还包括步骤:
(a)加入TFA(三氟乙酸)的混合液,低温搅拌,进行脱Boc处理,制得脱Boc产物;
(b)对脱Boc产物进行纯化处理,较佳地利用甲叔醚/石油醚混合液进行纯化,从而获得固体脱Boc产物,即脱Boc的德谷胰岛素主链。
在另一优选例中,在步骤(iv)中,在DIPEA存在下,在室温下进行所述反应。
在另一优选例中,在步骤(iv)中,在DMF中进行所述反应。
在另一优选例中,所述脱Boc的德谷胰岛素主链、德谷胰岛素侧链和DIPEA的摩尔比为(0.8-1.2):(2-5):(4-10),较佳地为1:2.5:12。
在另一优选例中,在步骤(v)中,加入含有哌啶的DMF溶液,进行脱Fmoc处理,从而制得所述的德谷胰岛素。
在另一优选例中,在步骤(v)中,包括对制得的德谷胰岛素进行纯化的步骤。
在另一优选例中,所述Boc修饰的德谷胰岛素主链利用基因重组技术制备。
在另一优选例中,在步骤(ib)之后,还包括两步纯化步骤。
在另一优选例中,在步骤(ib)中,所述德谷胰岛素融合蛋白与胰蛋白酶的质量比为1:3000-1:10000。
在另一优选例中,在步骤(ib)中,德谷胰岛素融合蛋白与羧肽酶的质量比为1:5000-1:15000。
在另一优选例中,所述的重组菌中包含或整合有表达德谷胰岛素前体融合蛋白的表达盒。
在另一优选例中,所述的方法如下:
在另一优选例中,所述方法包括步骤:
(i)提供本发明第二方面所述的德谷胰岛素主链融合蛋白,酶切获得化合物1;
(ii)对化合物1进行Fmoc修饰,从而制得化合物2;
(iii)对所述的化合物2进行脱Boc处理,从而制得化合物3;
(iv)将化合物3与德谷胰岛素侧链进行反应,从而制得化合物4;和
(v)对化合物4进行脱Fmoc与侧链脱tBu处理,从而制得化合物6所示的德谷胰岛素。
在本发明的第七方面,提供了一种德谷胰岛素制剂,所述的德谷胰岛素制剂使用本发明第六方面所述的方法制备。
在另一优选例中,制得的德谷胰岛素具有生物活性。
本发明的第八方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的德谷胰岛素前体融合蛋白、本发明第二方面所述的德谷胰岛素主链融合蛋白、本发明第三方面所述的德谷胰岛素前体、或本发明第四、五、六方面所述的德谷胰岛素主链。
本发明的第九方面,提供了一种载体,所述载体包括本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的载体选自下组:DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
本发明的第十方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第九方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第八方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其组合。
本发明的第十一方面,提供了一种制剂或药物组合物,所述制剂或药物组合物包含本发明第一方面所述的德谷胰岛素前体融合蛋白、本发明第二方面所述的德谷胰岛素主链融合蛋白、本发明第三方面所述的德谷胰岛素前体、或本发明第四、五、六方面所述的德谷胰岛素主链,以及药学上可接受的载体。
附图说明
图1显示了质粒pBAD-FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)图谱。
图2显示了质粒pEvol-pylRs-pylT图谱。
图3显示了包涵体变复性后Boc-德谷胰岛素主链融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图4显示了Boc-德谷胰岛素主链精纯的HPLC检测图谱。
图5显示了本发明的德谷胰岛素精纯最终产物的HPLC检测图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,发现了一种德谷胰岛素衍生物及其制备方法。具体地,本发明的方法利用包含绿色荧光蛋白折叠单元的德谷胰岛素融合蛋白进行德谷胰岛素的制备,并对Boc修饰的德谷胰岛素主链进行Fmoc修饰,利用正交保护进行德谷胰岛素的侧链加成。本发明还提供该制备方法过程中涉及的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链以及包含德谷胰岛素主链的融合蛋白。
德谷胰岛素
德谷胰岛素是一种新型的长效胰岛素类似物。2013年1月得到欧盟批准,应用于I型和II型糖尿病患者的治疗。德谷胰岛素其结构特点为通过一个L-γ-Glu连接子将重组人胰岛素(去B链30位苏氨酸)的B链29位赖氨酸侧链ε-NH2基与修饰剂16碳脂肪二酸偶联而成。此设计提供一种独特的延长作用时间的机制。该种胰岛素类似物具有作用时间超长、变异性小、能够和速效胰岛素形成复方制剂等优点,皮下注射后会形成六聚体结构,此结构可作为一个存储库缓慢释放德谷胰岛素单体,这些单体能够缓慢并持续的被吸收利用。
德谷胰岛素表达质粒的构建
合成带有目的基因的FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)片段,片段两端具有限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点。该序列进行了密码子优化,可以实现功能蛋白在大肠杆菌中的高水平表达。表达后使用限制性内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切表达载体“pBAD/His A(KanaR)”和含有“FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)”目的基因的质粒,酶切产物通过琼脂糖电泳进行分离,再使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行提取,最后使用T4 DNA连接酶将两个DNA片段连接起来。将所述连接产物以化学法转化至大肠杆菌Top10细胞,将所述转化的细胞培养在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基(10g/L酵母蛋白胨,5g/L酵母浸粉,10g/L NaCl,1.5%琼脂)上过夜。挑取3个活菌落,在5mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基(10g/L酵母蛋白胨,5g/L酵母浸粉,10g/L NaCl)中过夜培养,使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取。然后,将所述提取的质粒使用测序寡核苷酸引物5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3’进行测序,以确认正确插入。最终得到的质粒被命名为“pBAD-FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)”。
融合蛋白
利用绿色荧光蛋白折叠单元,本发明构建了两种融合蛋白,即本发明第一方面所述的包含单链德谷胰岛素的德谷胰岛素前体融合蛋白和本发明第二方面所述的包含双链德谷胰岛素的德谷胰岛素主链融合蛋白。事实上,本发明的两种融合蛋白的保护范围可能部分重叠,例如融合蛋白中包含的双链形式的德谷胰岛素,其B链的C端也可以连接肽与A链的N端相连,也可以被认定为包含链内二硫键的单链。
本发明的融合蛋白中包含的绿色荧光蛋白折叠单元FP包含2-6个,较佳地2-3个选自下组的β-折叠单元:
氨基酸序列 | |
u1 | VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO.:11) |
u2 | HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO.:12) |
u3 | KLTLKFICTT(SEQ ID NO.:13) |
u4 | YVQERTISFKD(SEQ ID NO.:14) |
u5 | TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:15) |
u6 | TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:16) |
u7 | HNVYITADKQ(SEQ ID NO.:17) |
u8 | GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:18) |
u9 | VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:19) |
u10 | HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:20) |
u11 | HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO.:21)。 |
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元FP可以选自:u8、u9、u2-u3、u4-u5、u8-u9、u1-u2-u3、u2-u3-u4、u3-u4-u5、u5-u6-u7、u8-u9-u10、u9-u10-u11、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u4-u7-u10、u6-u8-u10、u1-u2-u3-u4、u2-u3-u4-u5、u3-u4-u3-u4、u3-u5-u7-u9、u5-u6-u7-u8、u1-u3-u7-u9、u2-u2-u7-u8、u7-u2-u5-u11、u3-u4-u7-u10、u1-I-u2、u1-I-u5、u2-I-u4、u3-I-u8、u5-I-u6、或u10-I-u11。
在另一优选例中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元为u3-u4-u5。
在另一优选例中,本发明的融合蛋白具有下式所示的结构:
A-FP-TEV-R-G
式中,
“-”代表肽键;
A为无或前导肽,
FP为绿色荧光蛋白折叠单元,
TEV为酶切位点,较佳地为TEV酶酶切位点(序列为ENLYFQG,SEQ ID NO.:4);
R为酶切位点;
G为Boc修饰的德谷胰岛素前体,G具有下式所示的结构:
(B1F~B29Boc-K)-X-(A1G~A21N)
式中,
X为连接肽,较佳地,所述连接肽的氨基酸序列为R、RR、RRR,或如SEQ ID NO.:4-7所示(RRGSKR,RRAAKR,RRYPGDVKR或RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)。
如本文所用,术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):1-3个(通常为1-2个,更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内,较佳地为2个以内,更佳地为1个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外,所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比,有至多3个,较佳地至多2个,更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外,还可以对本发明融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“编码本发明融合蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。
本发明的融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地,被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
Fmoc修饰
在生物医药领域中,多肽的用途越来越大,氨基酸是合成多肽技术的基本原料,氨基酸都含有α-氨基和羧基,有些还含有侧链活泼基团,如:羟基、氨基、胍基和杂环等,因此,氨基和侧链活泼基团在接肽反应中都需要保护起来,合成多肽后再脱去保护基团,否者会发生氨基酸的错接和许多副反应。
芴甲氧羰基(Fmoc)为碱敏感保护基,能在浓氨水或二氧六环-甲醇-4N Na OH(30:9:1)以及哌啶、乙醇胺、环己胺、1,4-二氧六环、吡咯烷酮等氨类的50%二氯甲烷溶液中脱去。
在碳酸钠或碳酸氢钠等弱碱性条件下,一般用Fmoc-Cl或Fmoc-OSu引入Fmoc保护基。相对Fmoc-Cl来说,Fmoc-OSu更容易控制反应条件,且副反应较少。Fmoc具有很强的紫外吸收,最大吸收波长为267nm(ε18950),290nm(ε5280),301nm(ε6200),因此可用紫外吸收来检测,给仪器自动多肽合成带来许多方便。再者可与大范围的溶剂、试剂相兼容,机械稳定性高,可用多种载体和多种活化方式等。因此当今多肽合成中最常用的就是Fmoc保护基团。
Fmoc-OSu(芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺)
德谷胰岛素侧链
tBuO-Pal-Glu(OSu)-OtBu为德谷胰岛素侧链。
德谷胰岛素的制备,是先利用基因重组技术得到29位Boc保护赖氨酸的德谷胰岛素主链,再连接德谷胰岛素侧链tBuO-Pal-Glu(OSu)-OtBu,从而得到德谷胰岛素。
德谷胰岛素的的制备
本发明的提供了德谷胰岛素合成路线如下所示,从Boc-德谷胰岛素主链(化合物1)制备Fmoc修饰的化合物2,化合物2脱Boc保护后得化合物3,化合物3与活化德谷胰岛素侧链tBuO-Pal-Glu(OSu)-OtBu反应,得到化合物4,再经脱去Fmoc反应得到化合物5,侧链脱除tBu保护基,最后得到化合物6德谷胰岛素。
具体地,本发明提供一种制备德谷胰岛素的方法,所述方法包括步骤:
(i)提供一Boc修饰的德谷胰岛素主链;
(ii)对所述的Boc修饰的德谷胰岛素主链进行Fmoc修饰,从而制得Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链;
(iii)对所述的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链进行脱Boc处理,并将其与德谷胰岛素侧链进行反应,从而制得Fmoc修饰的德谷胰岛素;和
(iv)对所述的Fmoc修饰的德谷胰岛素进行脱Fmoc与侧链脱tBu处理,从而制得德谷胰岛素。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明直接利用生物合成的方式生产Boc修饰的德谷胰岛素主链,不需要采用稀释、超滤换液等方法去除发酵液上清中过量的无机盐。其次,在制备目的肽过程中无需溴化氰裂解、氧化亚硫酸盐解以及相关纯化步骤。
(2)在本发明的方法中,融合蛋白中包含德谷胰岛素主链的比重高(融合比增加),融合蛋白中FP或A-FP包含精氨酸、赖氨酸,可以被蛋白酶消化成小片段,和目的蛋白相比分子量差别大,容易分离,使用层析柱分离Boc-德谷胰岛素主链或类似物前体,一步收率在70%以上,比常规方法高3倍,并且能除去绝大部分色素,Boc-德谷胰岛素主链的产量约1.5-1.8g/L。本发明的合成工艺步骤简化了三分之二以上,降低了工艺时间和设备投资成本。
(3)由于29位Boc-赖氨酸的保护,本发明可以直接利用与Fmoc保护的正交反应,合成德谷胰岛素。
(4)本发明的方法合成的德谷胰岛素无N端脂肪酸酰化的杂质,利于下游纯化,降低成本。
(5)与固相合成相比,本发明的方法不会产生消旋的杂质多肽,并且不需使用大量的修饰氨基酸,不使用大量的有机试剂,对环境污染小,成本更低。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1德谷胰岛素表达菌株的构建及表达
德谷胰岛素表达载体的构建参照专利申请号201910210102.9中实施例的记载。将融合蛋白FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)的DNA片段,克隆至表达载体质粒pBAD/HisA(购自NTCC公司,卡那霉素抗性)的araBAD启动子下游NcoI-XhoI位点,得到质粒pBAD-FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)。质粒图谱如图1所示。
再将pylRs的DNA序列,克隆至表达载体质粒pEvol-pBpF(购自NTCC公司,氯霉素抗性)的araBAD启动子下游SpeI-SalI位点,同时在proK启动子下游,以PCR方法插入赖氨酰-tRNA合成酶的tRNA(pylTcua)的DNA序列。该质粒命名为pEvol-pylRs-pylT。质粒图谱如图2所示。
将构建的质粒pBAD-FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)和pEvol-pylRs-pylT共同转化至大肠杆菌TOP10菌株,筛选获得表达德谷胰岛素主链融合蛋白FP-TEV-R-Insulin(DesB30,Lys29Boc)的重组大肠杆菌菌株。
MVSKGEELFTGVKLTLKFICTTYVQERTISFKDTYKTRAEVKFEGDENLYFQGRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Boc)RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.:1)
配制种子液培养基,接种,经过两级培养制得二级种子液,培养20h,OD600达到180左右,发酵结束,得到约3L发酵液,离心得到约150g/L的湿菌体。发酵液离心后,加入破碎缓冲液,利用高压均质机破菌两次,离心后加入一定浓度吐温80和EDTA-2Na等洗涤,接着水洗一次,离心收集沉淀得到包涵体。每升发酵液最终可获得约40g湿重包涵体,包涵体中包含的为德谷胰岛素前体融合蛋白。
实施例2Boc-德谷胰岛素前体包涵体的变复性及酶切
向实施例1所得包涵体中以重量体积比1:10(m/v)的比例加入7.5-9.0mol/L尿素溶解液,室温搅拌溶解,控制包涵体溶解液总蛋白浓度为10-25mg/mL,NaOH调节pH至11.0-11.8,加入β-巯基乙醇搅拌均匀。将包涵体溶解液滴加至含有0.2-1.0mmol/L L-胱氨酸的复性缓冲液中,使包涵体溶解液稀释5-10倍复性,维持融合蛋白复性液pH值在10.5-11.8,温度控制在4-8℃,复性时间为10-20h,复性率60%以上(电泳检测见图3),得到德谷胰岛素A链和德谷胰岛素B链间包含二硫键的德谷胰岛素主链融合蛋白。
取Boc-德谷胰岛素主链融合蛋白复性液,调节pH至8.0-9.5,按1:3000-1:10000加入重组胰蛋白酶,1:5000-1:15000加入重组羧肽酶B,15-25℃下酶切20-40h,最终获得Boc-德谷胰岛素主链,酶切率高于70%。
实施例3Boc-德谷胰岛素主链的初步纯化
超滤去除酶切液中的不溶混合物,根据蛋白质等电点差异,采用阴离子交换层析技术对实施例2获得的Boc-德谷胰岛素主链进行初步纯化,以去除大部分杂质,控制Boc-德谷胰岛素主链与填料结合载量低于50mg/mL,梯度洗脱收集Boc-德谷胰岛素主链,粗纯后Boc-德谷胰岛素主链纯度达70%以上,收率大于85%。
实施例4Boc-德谷胰岛素主链的反相层析
实施例3获得的Boc-德谷胰岛素主链溶液,进行反相层析分离纯化。以含有三氟乙酸的水溶液作为流动相A;以含有三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相B。Boc-德谷胰岛素主链与填料结合,控制Boc-德谷胰岛素主链上样量<10mg/mL,梯度洗脱,收集Boc-德谷胰岛素主链。实验结果显示,反相层析收集的Boc-德谷胰岛素主链纯度≥90%(HPLC检测图见图4),收率大于60%。
实施例5利用Boc-德谷胰岛素主链制备德谷胰岛素
取实施例4得到的Boc-德谷胰岛素主链化合物1干燥品(本例中投料摩尔比以30mg为例),按照表1的比例加入Fmoc-Osu、DIPEA及DMF,pH7.5-8.5条件下反应8-12小时,制得Fmoc和Boc保护的德谷胰岛素主链。然后向反应体系中加入冷的甲叔醚/石油醚混合溶剂,将固体沉淀离心分离,用甲叔醚和石油醚混合溶剂洗涤沉淀2-3次,获得Fmoc保护的化合物2:DiFmoc-Insulin(DesB30,Lys29Boc)。
表1投料的摩尔比
Boc-德谷胰岛素主链 | Fmoc-OSu | DIPEA | DMF | |
当量或体积 | 1.0eq | 5eq | 12eq | 1V |
取化合物2,加入TFA溶液,低温搅拌0.5-2.0h,向反应混合物中加入冷的甲叔醚和石油醚的混合溶液,沉降离心。固体用甲叔醚洗涤2-3次,干燥,获得脱除Boc的固体化合物3:DiFmoc-Insulin(DesB30,Lys29 NH2)。
取Boc脱除后的化合物3,溶于DMF溶液,加入12eq的DIPEA,在pH8.0-9.0条件下加入2.5eq的侧链化合物tBuO-Pal-Glu(OSu)-OtBu,将反应混合物在室温下温和搅拌2-3小时。反应结束后加入冷的甲叔醚/石油醚混合溶剂沉淀出固体产物,洗涤2-3次,干燥,获得白色的化合物4:DiFmoc-Insulin(tBuO-Pal-Glu-(Lys29NH)-OtBu,DesB30)。
取化合物4,加入含有20%哌啶的DMF溶液,室温反应0.5-2.0h。接着在反应体系中内加入甲叔醚和石油醚的混合溶液沉淀产物,固体离心用甲叔醚和石油醚洗涤3-5次,干燥,得到脱除Fmoc后的化合物5:Insulin(tBuO-Pal-Glu-(Lys29NH)-OtBu,DesB30)。
取脱除Fmoc后的化合物5,加入TFA(三氟乙酸)、TIS(三异丙基硅烷)及DCM(二氯甲烷)的混合溶液,室温震荡反应2-4h,脱除侧链tBu保护基,在反应体系内加入10-20倍体积的冷的甲叔醚和石油醚混合溶剂,沉淀离心,固体用甲叔醚和石油醚混合溶剂洗涤3次以上,抽干,最终获得德谷胰岛素。
合成后的德谷胰岛素经过两步高压反相层析,最终获得纯度大于99%的德谷胰岛素(见图5)。
对比例
采用实施例1类似的方法进行融合蛋白表达菌株的构建及表达,其区别仅在于用于表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:22所示。
MKKLLFAIPLVVPFYSHSTMELEICSWYHMGIRSFLEQKLISEEDLNSAVDRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Boc)RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.:22)
上述融合蛋白中,包含德谷胰岛素B链和A链,同时还包含gⅢ信号肽。
结果显示,培养20h,OD600达到140左右,发酵结束,得到约3L发酵液,离心得到约105g/L的湿菌体。发酵液离心后,加入破碎缓冲液,利用高压均质机破菌两次,并离心收集沉淀得到包涵体。每升发酵液最终可获得约30g湿重包涵体,包涵体中包含的为德谷胰岛素融合蛋白。
上述结果表明,与常规结构融合蛋白的表达相比,本发明的融合蛋白表达量显著提高,并且融合蛋白中的德谷胰岛素蛋白折叠正确,具有生物活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 宁波鲲鹏生物科技有限公司
<120> 一种德谷胰岛素的制备方法
<130> P2020-0742
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Lys Leu Thr Leu
1 5 10 15
Lys Phe Ile Cys Thr Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys
20 25 30
Asp Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Glu Asn
35 40 45
Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
50 55 60
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
65 70 75 80
Thr Pro Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
85 90 95
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Arg Gly Ser Lys Arg
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Arg Ala Ala Lys Arg
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Arg Tyr Pro Gly Asp Val Lys Arg
1 5
<210> 7
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
20 25 30
Gln Lys Arg
35
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val
1 5 10
<210> 9
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr
1 5 10 15
Ile Ser Phe Lys Asp Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
20 25 30
Gly Asp
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp
1 5 10
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile
1 5 10
<210> 22
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser
1 5 10 15
His Ser Thr Met Glu Leu Glu Ile Cys Ser Trp Tyr His Met Gly Ile
20 25 30
Arg Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser
35 40 45
Ala Val Asp Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val
50 55 60
Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
65 70 75 80
Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
85 90 95
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100
Claims (11)
1.一种制备德谷胰岛素的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(A)利用重组菌进行发酵,制备德谷胰岛素前体融合蛋白,
(B)利用所述的德谷胰岛素前体融合蛋白,制备德谷胰岛素,
其中,所述的德谷胰岛素前体融合蛋白从N端到C端结构如式III所示:
A-FP-TEV-R-G(III)
式中,
“-”代表肽键;
A为无或前导肽,
FP为绿色荧光蛋白折叠单元,
TEV为第一酶切位点;
R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸;
G为德谷胰岛素主链或其活性片段;
其中,所述的绿色荧光蛋白折叠单元为2-3个选自下组的β-折叠单元:
并且所述的绿色荧光蛋白折叠单元选自下组:u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u3-u4-u5或u4-u5-u6,其中,所述的步骤(B)包括步骤:
(ia)从所述重组菌的发酵液中分离获得德谷胰岛素前体融合蛋白包涵体,对所述的包涵体进行变复性后,获得德谷胰岛素主链融合蛋白;
(ib)对所述的德谷胰岛素主链融合蛋白进行酶切处理,从而获得Boc修饰的德谷胰岛素主链;
(ii)对所述的Boc修饰的德谷胰岛素主链进行Fmoc修饰,从而制得Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链;
(iii)对所述的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链进行脱Boc处理,从而获得脱Boc的德谷胰岛素主链;
(iv)将所述脱Boc的德谷胰岛素主链与德谷胰岛素侧链进行反应,从而制得Fmoc修饰的德谷胰岛素,
并且,所述的G为Boc修饰的德谷胰岛素前体,具有式IV所示的结构:
GB-X-GA(IV)
式中,
“-”代表肽键;
GB为第29位Boc修饰的德谷胰岛素B链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,
X为连接肽;
GA为德谷胰岛素A链,氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(B)还包括步骤:
(v)对所述的Fmoc修饰的德谷胰岛素进行脱Fmoc与侧链脱tBu处理,从而制得德谷胰岛素。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(ib)中,利用胰蛋白酶和羧肽酶B进行酶切处理。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(ii)中,加入Fmoc-Osu、DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)和DMF(N,N-二甲基甲酰胺),从而进行Fmoc修饰。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(iii)中,还包括步骤:
(a)加入TFA(三氟乙酸)的混合液,低温搅拌,进行脱Boc处理,制得脱Boc产物;
(b)对脱Boc产物进行纯化处理,从而获得固体脱Boc产物,即脱Boc的德谷胰岛素主链。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤(b)中,利用甲叔醚/石油醚混合液进行纯化处理。
7.如权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(v)中,加入含有哌啶的DMF溶液,进行脱Fmoc处理,从而制得所述的德谷胰岛素。
8.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的步骤(ii)-(v)如下:
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的德谷胰岛素侧链如下所示:
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的TEV为TEV酶酶切位点。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的德谷胰岛素前体融合蛋白的序列如SEQ ID NO:1所示。
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---|---|---|---|---|
CN104619726A (zh) * | 2012-03-23 | 2015-05-13 | 苏州鲲鹏生物技术有限公司 | 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途 |
CN105154498A (zh) * | 2007-12-28 | 2015-12-16 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | Glp-1类似物的半重组制备法 |
CN105820233A (zh) * | 2015-01-04 | 2016-08-03 | 甘李药业股份有限公司 | 一种胰岛素衍生物的制备方法 |
CN109851667A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-06-07 | 江苏万邦医药科技有限公司 | 一种德谷胰岛素前体的纯化方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9839579B2 (en) * | 2013-04-24 | 2017-12-12 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
WO2018096162A1 (en) * | 2016-11-28 | 2018-05-31 | Novo Nordisk A/S | Insulin degludec in cardiovascular conditions |
-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105154498A (zh) * | 2007-12-28 | 2015-12-16 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | Glp-1类似物的半重组制备法 |
CN104619726A (zh) * | 2012-03-23 | 2015-05-13 | 苏州鲲鹏生物技术有限公司 | 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途 |
CN105820233A (zh) * | 2015-01-04 | 2016-08-03 | 甘李药业股份有限公司 | 一种胰岛素衍生物的制备方法 |
CN109851667A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-06-07 | 江苏万邦医药科技有限公司 | 一种德谷胰岛素前体的纯化方法 |
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