CN1105726C - 人降钙素类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组新的人降钙素类似物肽和其医药上可接受的盐，含有这些肽类似物的药物组合物，以及该药物组合物在预防和治疗骨代谢紊乱相关的疾病中的应用。与人降钙素相比，本发明的降钙素类似物明显提高了降血钙活性和抑制骨吸收活性，并且明显降低了其在人体内可能产生的免疫原性。
Description
本发明涉及具有降低血清钙离子浓度活性的新的肽，含有所说的肽的药物组合物以及该组合物在治疗骨代谢和/或钙代谢紊乱等相关疾病中的应用。
降钙素(CT)是一种已知的具有降低血钙活性的的肽类激素，并且是从哺乳动物甲状腺，或鸟和鱼类等非哺乳类脊椎动物的后腮体分泌的。根据其不同来源，降钙素的氨基酸序列差异很大。天然来源的降钙素，例如鳗鱼、鲑鱼、高等哺乳动物和人来源的降钙素都是具有酰胺化羧基末端，并且在第1和7位的半胱氨酸残基之间具有一个分子内二硫键的，由32个氨基酸残基组成的单链多肽。
在某些脊椎动物体内，成骨细胞的活性是受全身性激素间的复杂相互作用，以及局部生长因子和细胞因子的生成调节的。降钙素通过与破骨细胞上的特异性降钙素受体结合来抑制骨吸收，以降低由骨释放到血清中的钙量，维持成年动物和人体内的骨吸收与骨形成间生理平衡[The Calcitonin-Physiology and Pharmacology，Azriaed.，Karger，Basel，1989]。鉴于降钙素的这种对骨吸收的抑制作用，人们试图开发并使用降钙素作为治疗骨质疏松及其他以骨骼内钙质降低为特征的疾病的药物。CT同时还表现其他一些生理学活性，例如在热板法疼痛实验中CT可延长疼痛的潜伏期，具有抗感受伤害的能力。临床应用也表明CT对骨痛等具有镇痛作用；此外，CT对内分泌细胞的作用类似于生长激素抑制因子，其能维持进食后甲状旁腺激素的分泌，并表现有抑制胃肠道激素的分泌和抗溃疡的作用[Copp，D.H.et al，是Clin.Invest.Med.17(3)：268-277(1994)]。
目前已知的临床应用效果表明，鲑鱼降钙素(sCT)用于抑制骨吸收治疗骨质疏松明显优于人降钙素(hCT)。这可能是由于鲑鱼降钙素具有较强的抗蛋白水解酶能力作用和较低的代谢清除率，并对骨细胞受体有更高的亲和力[Marx et al.Science 178：998-1001，1972]。然而当长期使用鲑鱼降钙素时，有可能使宿主产生抗这种异源蛋白质的抗体，从而限制了其临床应用价值。
本发明的一个目的是提供具有下列结构通式(1)的降钙素类似物或其医药上可接受的盐：
其中R1代表选自Val，Ile，n-Leu，D-Leu，D-Val，D-I1e，鸟氨酸，γ-氨基丁酸中的1或
2个疏水性氨基酸；
R2和R3代表选自Leu，Val，Ile，n-Leu，D-Leu，D-Val，D-Ile中的任何一种氨基酸；
hCT(13-32)代表人降钙素一级结构的第13至32位氨基酸；
R4代表--NH2或-OH。
本发明的一个目的是，提供一种提高了降血钙活性和/或延长了体内半衰期，并降低了免疫原性的新的人降钙素类似物。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的降钙素类似物与人降钙素具有90％以上的同源性。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的降钙素类似物是以肽的化学合成方法制备的。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的降钙素类似物是以重组DNA技术制备的。
本发明的另一个目的是提供包含上述降钙素类似物的药物组合物，其中所说的药物组合物含有作为基本活性成分的上述任何一种降钙素类似物和一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。
本发明的再一个目的是提供上述药物组合物在降低包括人在内的哺乳动物的血清钙，以及在制备用于治疗骨代谢和钙代谢相关疾病的药物中的应用。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，所说的生物活性肽选自下列肽： 
本发明的合成肽是：天然人降钙素氨基酸序列的修饰产物，旨在改变天然人降钙素的二级结构，从而使其结构更加紧密；改变肽链中的个别氨基酸，从而增加整个肽分子的亲脂性和疏水性，并降低天然序列可能存在的免疫原性。
本文中使用的术语“氨基酸”，除了指人降钙素本身所固有氨基酸外，还包括D-型氨基酸和非天然的、合成的氨基酸以及被修饰的氨基酸，如鸟氨酸、正亮氨酸及γ-氨基丁酸。
本发明提供提高了降血钙活性和/或延长了体内半衰期并降低了免疫原性的，具有如上所示结构通式的降钙素类似物及其医药上可接受的盐。
本发明进一步提供了含有上述人降钙素类似物的药物组合物，及其在预防和治疗骨代谢和/或钙代谢障碍相关疾病中的应用。
我们利用大鼠骨质疏松模型所做的体内实验结果表明，与目前临床上普遍使用的并具有强的降血钙活性的鲑鱼降钙素相比，本发明的降钙素亦具有类似的、提高了的降血钙和促进钙离子在骨组织中沉积的活性。另外，本发明的降钙素与天然存在的人降钙素至少有90％以上的同源性，从而显著降低了长期使用后可能造成的免疫原性。再者，由于本发明的降钙素类似物不仅保留了天然脊椎动物来源的降钙素分子中的二硫键，而且由于在肽序列中加入了一个或多个侧链较大的天然的和/或非天然的疏水性氨基酸如Leu，Ile，D-Leu，从而提高了分子的结构稳定性和抗蛋白酶解能力，延长了其在体内半衰期。
尽管目前对降钙素的结构与功能的确切关系尚不完全清楚，但普遍认为各物种来源的，包括人来源的降钙素的生物活性主要取决于该肽分子的氨基酸序列、与其受体的亲和力、以及其结构稳定性和抗蛋白水解的能力[Marx et al.Science 178：998-1001，1972]。Guttmann等人的研究结果显示，几乎降钙素分子中的所有氨基酸残基都与其生物括性直接相关。N端第1位和第7位两个半胱氨酸间的分子内二硫键和C末端的脯胺酰胺及两末端间的相互联系也是维持分子的生物活性必不可少的。例如，除去C末端的脯胺酰胺或C端几个氨基酸残基、或C末端的羧基化均可导致降钙素活性的降低，甚至完全丧失。
研究结果表明，分子内二硫键的存在对整个分子的生物学活性显然具有完全不同的作用。切断人降钙素分子内的二硫环，或者以化学修饰法改变第1和7位上的半胱氨酸，以形成不带二硫键的降钙素类似物，结果发现所得产物几乎完全失去了降血钙活性。但经同样方法修饰的鲑鱼降钙素(sCT)则仍保留有较强的活性。因此有理由推测，就降钙素的生物活性来说，起决定作用的因素是分子中的固有氨基酸序列及其特定结构，而二硫环则可能只对CT构象起到限制作用。hCT的构象柔性较大，断开二硫环后构象柔性更大，因此活性降低明显；而sCT的构象刚性较大，断开二硫环后对肽的总体结构影响不大，相反还可能更有利于形成刚柔相济的，有利于CT分子与其受体的结合构象，因此其活性不仅没有丧失，反而还有所提高[Epand，D.M.et al.J.Med.Chem.31：1595-1598，1988]。
显然，与鲑鱼降钙素相比，人降钙素的分子构象具有更大的柔性。因此我们设想，如果用具有较大疏水性并且具有较小柔曲性的氨基酸取代hCT的个别固有氨基酸，或加入或插入具有相似结构特征的氨基酸，便有可能在基本保留人降钙素原有的氨基酸序列的前提下，适当提高分子N端的两亲性螺旋结构及其刚性和稳定性。从而将有可能获得结构上的刚柔结合的，并提高了与受体之结合能力的，且氨基酸序列基本上与人降钙素相同并具有更大降血钙活性的生物活性肽。事实上Epand等人[Epand，R.M.et al.Biochemistry 25：1964-1968(1986)]的早期研究结果也已显示，降钙素总体肽链构象的刚性柔性的适当结合对其生物学活性可能起到主要作用。
基于上述考虑，本发明人探索性地合成了结构通式(1)的新的肽，结果令人惊奇地发现，本发明的具有结构通式(1)的肽表现有明显高于天然人降钙素的降血钙活性和促进骨组织中钙沉积的活性，其活性接近于鲑鱼降钙素。有关生物学活性的方法及相应实验结果详见下文实施例3和4。
另外，由于本发明的肽具有与天然存在的人降钙素序列基本相同的结构，所以可望大大降低在使用鲑鱼降钙素情况下可能存在的免疫原性，从而将显著提高本发明的降钙素类似物的临床应用价值。
可使用常规肽化学合成技术，以固相法或液相方法合成本发明的降钙素类似物，但较好是使用固相合成方法(例如参见Birr，C.，Aspect of the Merrifield PeptideSynthesis，Springer-Verlag，Heidelberg，1978；Stewart et al.，Solid PhasePeptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL，1984；Barany，G.and Merrifield R.B.in The Peptides，Vol.2；Gross，E.&Meienhoffer J.，eds.，Academic Press，New York，pp3-284，1979)。简单地说，首先按照已设计好的和给定的氨基酸序列，利用适当的活化剂和缩合剂将经适当保护基团保护的肽链C末端氨基酸残基连接到固相载体上。根据连接的氨基酸的不同，可选择使用各种不同的用于肽合成的固相载体，例如包括但不只限于二乙烯苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂、Kiseselguhr聚酰胺、控制孔径的玻璃纤维或小珠、纤维素、聚丙烯膜和丙烯酸包被的聚苯乙烯载体等。
可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，可在Fmoc系统中使用对酸敏感的树脂。为此，优选的固相载体包括二乙烯苯交联的聚丙烯树脂，不同功能形式的这类树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、对位乙酰氨甲基树脂、二苯甲胺(BHA)树脂、4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂、4-(2′，-4′-二甲氧基苯基氨甲基)-苯氧基甲基树脂、2，4-二甲氧基苯甲氨胺树脂及(2，4-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰-MBHA树脂(即Rink Amide MBHA树脂)。因为2-氯代三苯甲基不需要强烈的酸水解，并且其可对抗Aib-Pro键的裂解，所以该树脂被用作优选的酸敏感性树脂。本发明特别优选的α-氨基酸的保护基团是9-笏甲氧羰酰基(Fmoc)保护基团。
当使用Fmoc系统进行固相合成时，可适当选用下列被保护的氨基酸残基：Fmoc-Cys(Trit)，Fmoc-Asn，Fmoc-Ser(But)，Fmoc-Leu，Fmoc-Thr(But)，Fmoc-Val，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln，Fmoc-Glu(OBut)，Fmoc-His(Trit)，Fmoc-Tyr(But)，Fmoc-Arg(PMC)和Fmoc-Pro。当使用Boc系统进行固相合成时，可适当选用下列被保护的氨基酸残基：Boc-Cys(4-Mzl)，Boc-Lys(ClZ)，Boc-His(Bom)，Boc-Asp(OCHex)，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Pro，Boc-Trp(CHO)。
可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)进行直接偶联，或通过活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐。可以使用羟基苯骈三氮唑(HOBt)或7-氮杂羟基苯骈三唑(HOAt)或用2-(1H-苯骈三唑-1-基)，1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)活化氨基酸。
可以用手工方法合成仪完成上述人降钙素类似物多肽的合成，但为方便起见，最好使用可从市场上购得的多肽自动合成仪，例如由Applied Biosystems公司生产的ABI 430A型或ABI 431A型肽。在Fmoc合成系统中，首先将C端第一个氨基酸(C端Fmoc-Pro)装在含Rink Amide MBHA树脂的反应器中，用20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺(DMF )室温处理30分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。其中用Fmoc保护各种氨基酸的α-氨基。各氨基酸的侧链保护基分别为：Cys用三苯甲基(Trt)保护；Ser和Thr用叔丁基(But)保护；Asp用叔丁基(But)保护；Lys用Boc保护；His用Trt保护。使用HOBt和DCC活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子间的缩合。
合成完成后，用含有或不含还原剂(如巯基乙醇)的三氟乙酸水溶液将合成的降钙素类似物肽从树脂上切割下来并去除各保护基。可用过滤法或乙醚沉淀法分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤或反相高压液相层析法纯化所需的肽。
在Boc保护系统的固相合成中，典型的是使用MBHA树脂。不同的是用Boc保护各种氨基酸α-氨基。氨基酸侧链保护基团分别是：Cys用4-甲基苄基(4-Mzl)；Lys用氯苄氧羰(Cl-Z)保护ε-氨基；Asp用环己己烷(OCHex)保护γ-羧基；Thr和Ser均用苄基(Bzl)保护侧链羟基；His用甲氧基(Bom)保护咪唑基。在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团(Boc)并用二异丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1-2小时，将肽链从树脂上切下，同时除去所有保护基团。以50％-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，并进行多肽的氧化。冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相色谱C8柱纯化，得到HPLC纯的人降钙素类似物肽。
可用已知方法将按上述方法以重组DNA技术制得的人降钙素类似物肽制成其医药上可接受的盐，特别是碱加成盐。例如，可按本领域技术人员熟知的方法，用适当的碱处理这些肽，制得酸性氨基酸的碱加成盐。
如前所述，本发明的人降钙素类似物具有显著的降血钙活性，其降低血清钙含量的作用类似于目前临床上普遍使用的鲑鱼降钙素。而且，与人降钙素相比，本发明的人降钙素类似物具有进一步提高了的促进血清钙在骨组织中沉积，抑制破骨细胞的骨吸收，以及改善骨质疏松的活性。由于本发明的降钙素类似物与天然人降钙素至少有90％以上的同源性，从而显著地降低了长期使用后可能造成的免疫原性。再者，由于本发明的降钙素类似物不仅保留了脊椎动物来源的降钙素分子中的二硫键，而且由于在肽序列中加入了一个或多个侧链较大的疏水氨基酸如Leu，Ile，D-Leu等天然或非天然氨基酸，从而明显提高了分子的结构稳定性和在体内的半衰期。
基于这些优点，可望将本发明的降钙素类似物制成以该肽为基本活性成分的药物组合物，用于治疗和预防诸如骨质疏松、甲状旁腺机能亢进、骨软化、变形性骨炎(Paget氏病)、特发性低钙血症及其他血清钙吸收和利用障碍等相关性疾病或病理状态。此外，本发明的降钙素类似物亦可用于治疗某些急性胰腺炎和胃肠道溃疡，以及用作镇痛剂，例如用于治疗骨痛。
可按制药领域已知的常规方法，将本发明的人降钙素类似物制成适合临床上特定给药方式的药物组合物。例如可在本发明的降钙素类似物中加入适当的载体或稀释剂，如水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液以制成可经胃肠道以外途径给药的溶液剂、注射剂、乳剂、滴鼻剂、滴眼剂。也可加入淀粉、乳糖、滑石粉、蔗糖、葡萄糖或甘油、液体石蜡、脂质体或明胶等赋形剂或载体，将本发明的降钙素类似物制成可经胃肠道途经给药的栓剂、、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或脂质体包裹剂。这些制剂中除含有活性成分和适当的载体或赋形剂外，还可根据需要添加其他一些辅助成分，例如一种或多种稀释剂、填充剂、乳化剂、防腐剂、表面活性剂、吸收促进剂、缓冲剂、香味剂及着色剂。
基于上述这些优点和下文实施例3和4中详细举例描述的动物实验结果，预期可将本发明的人降钙素类似物肽或其盐或含有这些肽或其盐的药物组合物用于治疗骨质疏松、甲状旁腺机能亢进、骨软化、变形性骨炎、特发性低钙血症及其他骨吸收增强或新骨形成障碍等相关的疾病或病理状态。此外，本发明的降钙素类似物亦可用于抑制胃液分泌，治疗急性胰腺炎和胃肠道功能紊乱，并可用作镇痛剂，特别是用作骨痛治疗剂。
本发明的药物组合物的用量将取决于待治疗的疾病的性质和严重程度、病人的体重、一般健康状况、给药途径等多种因素。一般说来，本发明药物组合物的用量每天每公斤体重大约0.1至10国际单位(IU)，较好为0.5-5IU。
可通过各种常规给药途径使用本发明的药物组合物，例如可经胃肠道内、皮下、皮内、鼻内、静脉内、肌肉内、直肠内、眼内等途径给药，但其中优选的给药途径是肌肉内注射、鼻喷雾或口服给药。
图1显示骨质疏松模型大鼠在投用给hCT类似物，sCT及生理盐水3个月后，以骨密度扫描法测得的动物腰椎和股骨胫的骨密度值。
图2是用透射电镜观察到的投用生理盐水3个月后大鼠骨质疏松动物模型的处于退变相的骨细胞照片。
图3是用透射电镜观察到的投用hCT类似物3个月后大鼠骨质疏松动物模型的处于成骨相的骨细胞照片。
下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明
实施例1：使用Boc系统的制备实例
(1)用Boc系统合成下列结构(2)hCT肽类似物：
将起始MBHA树脂(1g，0.5mmol)装于ABI 430自动多肽合成仪反应器中，按下表所示步骤由C端向N端缩合各个被保护的氨基酸。每一步反应完成后，经氮气正压作用过滤从树脂上除去各试剂。其中C端第一个被保护氨基酸Boc-Pro与树脂的缩合反应按下表中第5～14步骤进行，其余氨基酸的缩合均按第1～14步骤进行。
| 步骤 | 试剂 | 试剂用量(ml) | 重复次数 | 混合时间(分) |
| 1 | DCM | 30 | 3 | 2 |
| 2 | TFA/DCM | 30 | 1 | |
| 3 | TFA/DCM | 30 | 15 | |
| 4 | DCM | 30 | 3 | 2 |
| 5 | DIEA/DMF | 30 | 1 | |
| 6 | DIEA/DMF | 30 | 10 | |
| 7 | DMF | 30 | 3 | 2 |
| 8 | DCM | 30 | 3 | 2 |
| 9 | Boc-氨基酸，2mmolHOBT/DCC溶于DMF | 20 | 120 | |
| 10 | DCM | 30 | 3 | 2 |
| 11 | DMF | 30 | 3 | 2 |
| 12 | DCM | 30 | 3 | 2 |
| 13 | Boc-氨基酸，1mmolHOBT/DCC溶于DMF | 20 | 120 | |
| 14 | 重复10～12步骤 | |||
| 15 | 重复1～14步进行C端氨基酸逐个向N端的延伸反应 |
每个氨基酸缩合反应平均进行2小时。每进入下一个氨基酸缩合循环前用茚三酮法测定游离氨基以确定缩合是否完全[Kaiser ET，et al.Anal.Biochem.34：595-598，1969]。按上述反应步骤由C端氨基酸逐个向N端延伸肽链后得到目的肽链树脂，将树脂从反应器中移出后进行真空干燥。
(2)肽链树脂的氟化氢(HF)切割反应
将干燥的肽链树脂(1g)和对甲酚(1ml)置于反应器中。于容器外置干冰/乙醇冷浴冷却，并收约集20ml液态HF，然后在冰浴下搅拌反应1小时。反应完成后，移去冰浴，于真空下蒸发除去HF。向反应器内加入无水乙酸乙酯(含少量巯基乙醇)将树脂洗三次(每次30ml)，然后滤去试剂。用50％乙酸抽提粗肽2次(每次5ml)。合并所得滤液，用100ml去离子水稀释后进行冷冻干燥以去除溶剂。
(3)去保护的hCT类似物粗肽的氧化反应
称取冻干的hCT类似物粗肽50mg，溶解于蒸馏水(pH6.0-7.5)中，至肽的终浓度为约为0.2～0.4mg/ml。缓慢搅拌并自然氧化24小时后，冷冻干燥所得样品。
(4)hCT类似物粗肽的纯化
称取上述氧化产物40mg，溶于1ml 1N乙酸中，将所得溶液过Sephadex G10柱(2.0×25cm)，1N乙酸洗脱以脱盐。收集全排峰后进行冷冻干燥，得脱盐粗品33mg。进一步将所得脱盐品过高压液相反向层析柱Beckman Octyl C8，10mm×25cm。收集主峰，合并后真空除去乙腈，并冷冻干燥。纯化后的样品纯度达95％以上，氨基酸组成分析及质谱分析结果均符合理论值。
实施例2：使用Fmoc系统的制备实例
(1)用Fmoc系统合成有下示结构(3)的人降钙素类似物：
将起始Rink Amide MBHA树脂(1g，0.45mmol)装于30ml小瓶内，并用DCM处理30分钟。按下表所示步骤由C端向N端逐个缩合各被保护的氨基酸，每步反应完成后，经负压作用过滤去除各试剂，并使之与肽树脂分离。其中C端第一个被保护的氨基酸Fmoc-Pro与树脂的缩合反应按下表中步骤1～15进行。其余氨基酸缩合均按步骤1～15进行。
| 步骤 | 试剂 | 试剂用量(ml) | 重复次数 | 混合时间(分) |
| 1 | DMF | 20 | 3 | 2 |
| 2 | 六氢吡啶/DMF | 20 | 5 | |
| 3 | 六氢吡啶/DMF | 20 | 15 | |
| 4 | DCM | 20 | 3 | 2 |
| 5 | DMF | 20 | 3 | 2 |
| 6 | 二氧六环/H2O | 20 | 3 | 2 |
| 7 | DMF | 20 | 3 | 2 |
| 8 | DCM | 20 | 3 | 2 |
| 9 | Fmoc-AA，1.5mmolHOBT/DCC溶于DMF | 15 | 120 | |
| 10 | DCM | 20 | 3 | 2 |
| 11 | 乙醇 | 20 | 3 | 2 |
| 12 | DMF | 20 | 3 | 2 |
| 13 | DCM | 20 | 3 | 2 |
| 14 | Fmoc-AA，0.5mmolHOBT/DCC溶于DMF | 15 | 120 | |
| 15 | 重复10～13步骤 |
| 16 | 重复步骤1～15完成C端氨基酸逐个向N端的延伸 |
每个氨基酸缩合反应平均进行约2小时。每进入下一个氨基酸缩合循环前用茚三酮法测定游离氨基以确定缩合是否完全。按上述反应步骤由C端氨基酸逐个向N端延伸肽链结束后得到目的肽链树脂，将树脂从反应器中移出后进行真空干燥。
(2)肽链树脂的TFA切割反应
将干燥的肽树脂(0.5g)和间甲苯酚(0.5ml)置反应器中并在冰浴中预冷30分钟。加入0.5ml水，9mlTFA在冰浴条件下搅拌反应1小时。滤去反应液，由少量TFA将残余树脂洗三次，再用DCM洗三次，然后合并滤液。真空抽气蒸发除去DCM和TFA。待液体基本抽干成粘稠状时，加入预冷的乙酸乙酯，迅速振摇后逐渐析出固体形式粗肽并离心沉淀之。
粗品进一步的氧化和纯化方法同实施例1中(3)和(4)。
实施例3：人降钙素类似物的生物学鉴定
按照已建立的方法[Xue JZ，et al.Chinese Journal of Medical LaboratoryTechnology，1984，7(3)：147]检测本发明的人降钙素类似物的降血钙活性。所用实验动物为体重约100g的Wistar大鼠。并将动物随机分成实验组和对照组(各10只)，并在实验开始前隔夜饥饿18小时。将用实验组的人降钙素类似物结构(3)和用于对照组的鲑鱼降钙素(sCT)分别溶解于pH4.0的醋酸中，配成浓度范围从0.01ug/ml至100ug/ml的溶液。按给药剂量0.05ug/kg至1ug/kg经腹腔注射给药1小时后，眼眶取血并测定动物的血钙值。通过计算使大鼠血清钙离子水平降低10％所用的降钙素量(ug/kg)来估计本发明hCT类似物的降血钙能力。下表显示对照组和实验组动物用药后血清Ca2+浓度的变化。
| 化合物 | 剂量(ug/kg) | 时间(hour) | Ca++降低(mg/dl) |
| hCT类似物结构(2) | 0.16 | 1 | 1.18 |
| 0.50 | 1 | 2.52 | |
| hCT类似物结构(3) | 0.10 | 1 | 1.10 |
| 0.30 | 1 | 2.75 | |
| 0.60 | 1 | 3.43 | |
| sCT | 0.05 | 1 | 1.26 |
| 0.15 | 1 | 2.87 |
实施例4：本发明的人降钙素类似物对骨质疏松模型动物的治疗作用
(1)给平均体重250g的雄性大鼠(SD)，喂食半年低钙食物(Ca：0.1％，P：0.6％)，并比较喂食低钙食物前和喂食低钙食物后的大鼠股骨胫处骨密度值和腰椎处骨密度值BMD(gms/cm2)。结果显示低钙饮食前和后的动物骨密度值有显著差异(P＜0.01)，故成功地建立了用于本实验的大鼠骨质疏松模型。
(2)上述平均体重400g的骨质疏松大鼠均喂食正常食物(Ca：1.1％，P：1.1％)，随机分成三组(10只)，分别为注射生理盐水组、注射hCT-1组和注射sCT组。其中hCT-1用量为每只大鼠0.1ug/kg，sCT用量为每只大鼠0.04ug/kg。进行皮下隔天注射。90天后，比较各组大鼠股骨胫处骨密度值和腰椎处骨密度值BMD(gms/cm2)，分别记作R1和R2值(图1)。结果发现给药组骨密度均比对照组有显著改善，且hCT-1组的骨密度值与sCT相近。透射电镜观察可见，生理盐水对照组动物的骨细胞多处于退变相，胞核固缩，核/浆比例大，出现较多空泡，胞质减少，陷窝间絮状物增多，陷窝壁有嗜锇板层(图2)。而hCT-1给药组动物的骨细胞则多处于成骨相细胞，胞质丰富，核/浆比例小且陷窝间隙小(图3)。
Claims (4)
1.本发明的人降钙素类似物，其具有下列结构通式的肽或医药上可接受的盐：其中R1选自缬氨酸或异亮氨酸。
2.权利要求1或2的人降钙素类似物，其特征在于所说的肽类似物是以固相或液相肽化学合成技术制得。
3.由作为基本成分的权利要求1的人降钙素类似物和一种或多种载体和/或赋形剂组成的药物组合物。
4.根据权利要求3的药物组合物在制备用于治疗骨代谢和/或钙代谢剂障碍、骨痛及相关疾病的药物中的应用。
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| JPH09221500A (ja) * | 1996-02-14 | 1997-08-26 | A G Technol Kk | カルシトニン類似体 |
Cited By (2)
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