CN1219548C - C肽联合胰岛素治疗糖尿病并发症及c肽专一性抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗糖尿病并发症的药物组合物，包括(a)超生理剂量胰岛素原C肽和/或C肽相关肽，及其医药上可接受的盐，(b)可接受药物量的胰岛素及其医药上可接受的盐，(c)药学上可接受的载体。本发明还提供了对C肽特异性的抗体及其制备方法。本发明的优点是利用C肽联合胰岛素治疗糖尿病可有效地治疗糖尿病肾病，并且用聚丙酰化方法合成的C肽半抗原所制备的抗体具有专一性。

Description

C肽联合胰岛素治疗糖尿病并发症及C肽专一性抗体

本发明涉及胰岛素原C肽联合胰岛素疗法，该疗法具有改善糖尿病肾脏病变之形态与功能作用，可应用于糖尿病慢性并发症的治疗。本发明还涉及糖尿病诊断和胰岛β细胞评价所用的C肽专一性抗体及其制备方法。更具体地说，本发明涉及胰岛素原C肽及其制备方法，C肽专一性抗体及其制备方法，以及C肽联合胰岛素治疗在改善SD大鼠糖尿病肾病(DN)中的作用。

糖尿病的主要危害是各种并发症。其中I型糖尿病病人中糖尿病肾病约占1/3，是这些病人致死的主要原因之一。目前临床上治疗I型糖尿病使用的药物包括胰岛素治疗虽然可以控制血糖，但不能完全阻断糖尿病并发症的发生发展，因此，需要研制有效的针对并发症的药物。

C肽是胰岛素原中连接A、B两条链的连接肽(connecting peptide)。在胰岛β细胞分泌颗粒中，胰岛素原经蛋白酶裂解，形成等摩尔由AB链组成的胰岛素和C肽，然后分泌并进入血液。C肽分子的种族差异较大，人C肽含31个氨基酸。在胰岛素原分子中C肽对胰岛素原分子的折叠，二硫键的正确配对等分子结构形成起重要作用。

以前人们对血中游离的C肽生理功能不清楚，近来的研究发现，在I型糖尿病病人及动物的实验中，短期给予C肽可以改善肾功能障碍(Johansson.B.-L.etal.Diabetologia 35：121-128)，增强葡萄糖的利用，增加肌肉和皮肤的血流量(Forst，T.et al.J.Clin Invest.101：2036-2041)。另外，C肽还可以改善I型糖尿病病人红细胞的变形性(Kunt，T.et al.Diabetologia 42：465-471)，C肽能够促进来自IDDM病人的成纤维细胞的增殖(Hehenberger K.et al.EuropeanJ Endocrin 136(supple1)：15)。

体外研究证实，C肽能增强肾小管和坐骨神经Na+，K+-ATP酶活性(OhtomoY.et al.Diabetologia 39：199-205，Ido，Y.et al.Science 277：563-566)，可能C肽的作用与其刺激Na+，K+-ATP酶和内源NO合成酶的活性相关(OhtomoY.et al.Diabetologia 41：287-291，Forst T et al. Clin Sci 98(3)：283-290)。C肽可以增强神经肽Y对于I型糖尿病人血管收缩的影响，这可能也与C肽与神经肽Y能够协同刺激Na+，K+-ATP酶活性相关(Ohtomo Y.et al.Diabetologia39：199-205)。C肽刺激骨骼肌葡萄糖的转运，但这种作用是通过胰岛素受体外的途径进行的(Johansson BL et al.Diabetologia 39，687-695)。实验证明，C肽在纳摩尔浓度范围可特异性地结合于细胞表面-G蛋白偶连受体(RiglerR.et al.PNAS 96(23)：13318-13323)。给予I型糖尿病大鼠超生理剂量的C肽联合胰岛素治疗，能防止血管、神经机能障碍(Ido，Y.et al.Science 277：563-566)，长期(3个月)给予胰岛素联合C肽治疗，可以使糖尿病病人减少尿白蛋白排泄率，改善肾功能和自主神经功能障碍(Johansson BL et al.Diabet Med17(3)：181-9)。

然而，对于超生理剂量C肽联合胰岛素改善链尿佐菌素(STZ)诱导SD大鼠形成的肾病病理学变化未见前人报道。

对于I型糖尿病病人体内胰岛素水平的测定，目前普遍采用直接测量胰岛素的方法。目前，在评价胰岛β细胞功能时需要C肽抗体，因I型糖尿病病人和晚期II型糖尿病病人血浆C肽水平明显降低。有人用BSA偶联C肽制备C肽抗体(Yang S.et.al，Chinese Science Bulletin，1982，2：110-114)，但因为抗血清中同时含有抗BSA的抗体，所以在测定人体内C肽含量时，抗血清中抗BSA的抗体可能与人血液中类似BSA的蛋白作用，从而导致假阳性。

因此，本领域迫切需要开发专一性强的C肽抗体。

本发明的目的是提供一种糖尿病肾病的治疗方法与药物组合物，包括胰岛素原C肽及其相关肽、胰岛素和医药上可以接受的盐。同时提供了该C肽的制备，纯化方法和其在治疗糖尿病并发症的药物中的应用。另外还提供一种能够准确测定人体血液中C肽含量的抗体的制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种治疗糖尿病并发症的药物组合物，包括

(a)超生理剂量胰岛素原C肽和/或C肽相关肽，及其医药上可接受的盐，

(b)可接受药物量的胰岛素及其医药上可接受的盐，

(c)药学上可接受的载体。

本发明还提供了一种胰岛素原C肽或其医药上可接受的盐的用途，它被用于制备药物，所述药物用于防止糖尿病所致肾脏基质肾小球截面积比值增加。

在另一优选例中，所述的药物还含有可接受药物量的胰岛素及其医药上可接受的盐。

在本发明的一个优选例中，所述的C肽是来源于胰岛素原的C链，具有下列氨基酸序列：

EAEDLQVGQV ELGGGPGAGS LQPLALEGSL Q。

在本发明的另一优选例中，所述的C肽相关肽是来源于胰岛素原C肽C末端，具有下列氨基酸序列或部分序列的肽：

X1-X2-E-G-S-L-Q-X3-X4

其中X1为氨基、乙酰基、乙酰化氨基酸或去氨基的氨基酸；

X2、X3可以不存在或是单个氨基酸，也可以是多个氨基酸或肽，

X4为氨基、羧基或羟基。

在本发明的另一优选例中，所述的C肽相关肽包括来源于胰岛素原C肽的C末端五肽的环状结构：

在本发明的第二方面，提供了一种胰岛素原C肽专一性抗体制备方法，包括步骤：

(a)将所述C肽或C肽相关肽与聚合单体在合适的条件下聚合，形成聚丙酰C肽或C肽相关肽；

(b)用步骤(a)得到的聚丙酰C肽或C肽相关肽免疫接种动物；

(c)从免疫接种的动物中分离出胰岛素原C肽专一性抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种胰岛素原C肽专一性抗体，它特异性地针对胰岛素原C肽，并且不结合于BSA。

在本发明的第四方面，提供了一种聚丙酰C肽或C肽相关肽抗原的制备方法，它包括步骤：

(a)将C肽或C肽相关肽与丙烯酰氯以1∶10-1∶50的摩尔比进行混合，使C肽或C肽相关肽的N端丙烯酰化；

(b)加入过硫酸铵使N端丙烯酰化的C肽或C肽相关肽发生自身聚合，从而形成聚丙酰C肽或C肽相关肽；

(c)分离出聚丙酰C肽或C肽相关肽。

较佳地，在步骤(a)中，反应是在室温下反应约3-10小时；以及在步骤(b)中还加入TEMED以催化反应。

在附图中，

图1  胰岛素原C肽的TSK-f40柱层析分离纯化，其中阴影处为收集部分。

图2高压液相鉴定C肽纯度。

图3毛细管电泳鉴定C肽显示均一性。

图4电喷雾质谱测定合成C肽分子量。其中C肽理论分子量3020.29；实测分子量：3020.0。

图5显示了C肽半抗原分子量的测定。

图5(A)为标准分子量蛋白洗脱图谱。1为牛血清白蛋白(67KD)；2为卵清白蛋白(45KD)；3为慈菇蛋白酶抑制剂(20KD)。

图5(B)为聚丙酰C肽的洗脱图谱，由标准分子量蛋白洗脱图谱可知其分子量约为25KD。

图6显示了以八周为一疗程时，单独应用C肽或胰岛素治疗对糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率的影响。

图中Y轴表示各组大鼠24小时尿白蛋白排泄率(24hUAER)，数值以24hUAER的自然对数转换形式Ln(24hUAER)表示。

#：正常组与C肽治疗组、不治疗组相比，p＜0.05；

$：胰岛素治疗组与C肽治疗组、不治疗组相比，p＜0.05。

图7显示了以十二周为一疗程时，单独应用C肽或胰岛素治疗对糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率的影响。

图中Y轴表示各组大鼠24小时尿白蛋白排泄率(24hUAER)，数值以24hUAER的自然对数转换形式Ln(24hUAER)表示。

#：正常组与C肽治疗组、不治疗组相比，p＜0.05；

图8显示了以八周为一疗程时，C肽联合胰岛素治疗对糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率的影响。

图中Y轴表示各组大鼠24小时尿白蛋白排泄率(24hUAER)，数值以24hUAER的自然对数转换形式Ln(24hUAER)表示。

#：胰岛素治疗组与正常组相比，p＜0.05；

$：胰岛素治疗组与C肽和胰岛素治疗组，p＜0.05。

图9显示了以八周为一疗程时，单独应用C肽或胰岛素治疗对糖尿病大鼠肾脏基质肾小球截面积比值的影响。

图中Y轴表示各组大鼠肾脏基质肾小球截面积比值。

^*：不治疗组与其他三组相比，P＜0.001；

^▲：胰岛素治疗组与正常组相比，P＝0.026。

图10显示了以十二周为一疗程时，单独应用C肽或胰岛素治疗对糖尿病大鼠肾脏基质肾小球截面积比值的影响。

图中Y轴表示各组大鼠肾脏基质肾小球截面积比值。

^*：不治疗组与其他三组相比，P＜0.001。

图11显示了以八周为一疗程时C肽联合胰岛素治疗对糖尿病大鼠肾脏基质肾小球截面积比值的影响。

图中Y轴表示各组大鼠肾脏基质肾小球截面积比值。

#：胰岛素治疗组、C肽与胰岛素治疗组与正常组相比，p＜0.05；$：胰岛素治疗组与C肽和胰岛素治疗组，p＜0.05。

本发明人经过长期广泛而深入的研究，发现超生理剂量C肽联合胰岛素可明显改善链尿佐菌素(STZ)诱导SD大鼠形成的肾病病理学变化。此外，通过将C肽N端丙烯酰化，聚合后得到其半抗原，用它制备的抗血清只含有抗C肽的抗体，具有专一性，因而可用于糖尿病诊断和胰岛β细胞功能评价。丙烯酰化后聚合肽的寡肽抗原制备方法未见前人报道。

本发明中的胰岛素原C肽，不仅包括来源于胰岛素原中连接A、B两条链的连接肽及其类似物，还包括它们在医药上可接受的盐。

如本文所用，术语“超生理剂量”指血清C肽浓度超过生理剂量。在本发明的药物组合物，所述的C肽和/或C肽相关肽与胰岛素的摩尔比为1∶1-10∶1，较佳地为1.5∶1-8∶1，更佳地为2∶1-5∶1。

如本文所用，术语“治疗糖尿病并发症”是指C肽联合胰岛素对糖尿病肾脏病变之形态与功能的改善作用以及对全身微血管病变的作用，包括降低尿白蛋白排泄率，防止糖尿病所致肾脏基质肾小球截面积比值增加等作用，以及对其它部位的血管和神经机能障碍的治疗作用。

在本文中，术语“氨基酸”除非特指，均指以下20种天然氨基酸(以三字母符表示)：Gly、Ala、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr、Leu、Ile、Lys、Arg、Phe、Tyr、Trp、Pro、Cys、Met、His、Val。该术语包括D型和L型氨基酸。此外，该术语还包括非天然氨基酸、甲基化氨基酸、allo氨基酸。

在本发明的药物组合物中，含有

(a)超生理剂量胰岛素原C肽和/或C肽相关肽，及其医药上可接受的盐，

(b)可接受药物量的胰岛素及其医药上可接受的盐，

(c)药学上可接受的载体。

除了含有所述组份之外，本发明的药物组合物还可包含常规的溶剂和防腐剂。对于溶液形式的药物组合物，其pH范围没有特别限制，通常为从4到8.5。此外，药物组合物还可制成冻干制剂。

可用于本发明的胰岛素原C肽的氨基酸序列如下(其中X_0X列出了人或鼠的氨基酸变化)：

X₀₀-Glu-Ala-Glu-Asp-X₀₁-Gln-Val-X₀₂-Gln-X₀₃-Glu-Leu-Gl y-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-X₀₄-Leu-Gln-X₀₅-Leu-Ala-Leu-Glu-X₀₆-X₀₇-X₀₈-Gln-Lys-Arg-

式中，X₀₀为乙酰基、乙酰化氨基酸或去氨基的氨基酸；

X₀₁为Leu或Pro；

X₀₂为Gly或Ala；

X₀₃为Val或Leu；

X₀₄为Ser或Asp；

X₀₅为Pro或Thr；

X₀₆为Gly或Val；

X₀₇为Ser或Ala；

X₀₈为Leu或Arg；

一种优选的C肽是人C肽，其氨基酸序列是EAEDLQVGQV ELGGGPGAGSLQPLALEGSL Q。

C肽相关肽也可用于本发明。所述的C肽相关肽是来源于胰岛素原C肽C末端，具有下列氨基酸序列或部分序列的肽：

X1-X2-E-G-S-L-Q-X3-X4

其中X1为氨基、乙酰基、乙酰化氨基酸或去氨基的氨基酸；

X2、X3可以不存在或是单个氨基酸，也可以是多个氨基酸或肽，

X4为氨基、羧基或羟基。

一种特殊的C肽相关肽是来源于胰岛素原C肽的C末端五肽的环状结构：

至于获得C肽及其相关肽的方法，没有任何特别限制。它们可以是以固相或液相肽化学合成技术、或是以基因工程方法、或用酶切加工方法制得的。

化学合成法

可使用常规肽化学合成技术，以固相法或液相法合成本发明的胰岛素原C肽及相关肽，但较好是使用固相合成方法(例如参见Birr，C.，Aspect of theMerrifield Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg，1978；Stewartet al.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.co.，Rockford，IL，1984；Barany，G.And Merrifield R.B.in The Peptides，Vol.2；Gross，E.& Meienhoffer J.，eds.，Academic Press，New York，pp3-284，1979)。简单地说，首先按照已设计好的和给定的氨基酸序列，利用适当的活化剂和缩合剂将经适当保护基团保护的肽链C末端氨基酸残基连接到固相载体上。根据连接的氨基酸的不同，可选择使用各种不同的用于肽合成的固相载体，例如包括(但并不限于)聚乙醇、二乙烯苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂。

树脂选择

可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，可在Fmoc系统中使用对酸敏感的树脂。为此，优先的固相载体包括PEG-PS-树脂、二乙烯苯交联的聚丙烯树脂，不同功能团形式的这类树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、对位乙酰氨甲基树脂、4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂、4-(2′，-4′-二甲氧基苯基氨甲基)-苯氧基甲基树脂、2，4-二甲氧基苯甲胺树脂及(2，4-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰-MBHA树脂(即Rink Amide MBHA树脂)。

保护基团和保护氨基酸选择

在本发明中，可选用肽化学合成技术中常用的保护基团。一种优选的α-氨基酸的保护基团是9-芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护基团。

当使用Fmoc系统进行固相合成时，可适当选用下列被保护的氨基酸残基：Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(But)，Fmoc-Leu，Fmoc-Thr(But)，Fmoc-Val，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Glu(Obut)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(But)，Fmoc-Arg(Pmc)或Fmoc-Arg(Pbf)和Fmoc-Pro。

当使用Boc系统进行固相合成时，可适当选用下列被保护的氨基酸残基：Boc-Cys(4-Mzl)，Boc-Lys(CLZ)，Boc-His(Bom)，Boc-Asp(OCHex)，Boc-Gln(Xan)，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Ser(Bzl)，Boc-Pro，Boc-Trp(CHO)。这里的Fmoc或Boc用来保护各种氨基酸的α-氨基，而括号里的基团用来保护氨基酸的侧链。

偶联与活化

在本发明中，可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基。例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)进行直接偶联，或通过活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐。可以使用羟基苯骈三氮唑(HOBt)或7-氮杂羟基苯骈三唑(HOAt)或用2-(1H-苯骈三唑-1-基)，1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)活化氨基酸。

合成与纯化

在本发明中，可以用手工方法完成上述胰岛素原C肽的合成，或利用多肽自动合成仪，例如由Applied Biosystems公司生产的ABI 433A型或PE Pioneer型多肽自动合成仪。

在Fmoc合成系统中，用20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺(DMF)室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含清洁剂的三氟乙酸将合成的胰岛素原C肽从树脂上切割下来并除去保护基。可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。

在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1-2小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。用0.05M NH₄HCO₃抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛TSK-40f一步分离纯化(图1)，既得到HPLC纯度为99％(图2)，毛细管电泳均一(图3)的胰岛素原C肽。

药学上可接受的盐

对于用上述技术或以重组DNA技术制得的胰岛素原C肽，还可用已知方法将其制成其医药上可接受的盐。例如，可按本领域技术人员熟知的方法，用适当的酸、碱处理这些肽得到合适的盐。

C肽或C肽相关肽的聚合(或聚丙酰化)

在本发明中，用于进行聚丙酰化的C肽或C肽相关肽可以是任何来源的。它们可以是纯净物或混合物。一种优选的原料是化学合成法合成的C肽或C肽相关肽。

在聚丙酰化反应时，将摩尔比为1∶50-1∶10，较佳地1∶40-1∶15的C肽或C肽相关肽与聚合单体混合在一起，在合适的温度下(例如0-50℃)反应足够的时间(如1-48小时)。此外，在反应中可加入催化剂如过硫酸铵和TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)以催化聚合反应，并可视情况加入缓冲液以维持反应体系的pH在合适范围(约6.0-8.5)内。

适用于聚合C肽或C肽相关肽的聚合单体包括：含3-6个碳原子的α，β-不饱和酰卤，或类似单体。一种特别优选的聚合单体是丙烯酰氯。

抗体制备

另一方面，本发明还包括对C肽或C肽相关肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于C肽或C肽相关肽。较佳地，指那些能与C肽或C肽相关肽结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，聚丙酰化的C肽或C肽相关肽，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol. 6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Jmmunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

在本发明的一个实例中，先用化学合成法合成C肽半抗原，进行聚丙酰化处理后，免疫大白兔得到专一性抗体。并通过下列实验观察化学合成的C肽半抗原免疫大白兔所得抗体的滴度和专一性：(1).ELISA测定兔抗人C肽抗血清效价；(2).用BSA包板，用上述方法测聚丙酰-C肽和BSA-C肽的抗血清滴度。

在本发明的一个实施例中，利用链尿佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，应用胰岛素原C肽联合胰岛素皮下注射观察对大鼠糖尿病肾病的治疗作用，结果表明不但改善其肾病病理学变化，而且改善糖尿病大鼠肾功能变化。具体而言，本发明通过下列实验观察超生理剂量C肽联合胰岛素对于糖尿病大鼠的作用：

(1)C肽联合胰岛素作用于链尿佐菌素(STZ)诱导的SD大鼠糖尿病模型，可以降低其尿白蛋白排泄率。

(2)C肽联合胰岛素作用于链尿佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，降低糖尿病引起的基质肾小球面积比值增大。

本发明的优点在于：

(1)利用C肽联合胰岛素治疗糖尿病比传统的单用胰岛素治疗可以有效地降低肾脏尿白蛋白排泄，对糖尿病肾病具有治疗作用。C肽联合胰岛素治疗可以减少糖尿病大鼠肾小球细胞外基质是其作用机制之一。

(2)用聚丙酰化方法合成C肽半抗原，该半抗原免疫动物所得抗血清含有抗C肽的抗体，但避免了通常用BSA、KLH等作为载体偶联寡肽制备抗体时，同时产生抗载体的抗体的问题，具有专一性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

用Boc系统合成胰岛素C肽及其相关肽

以C肽为例：起始0.32mmol BocQ-Pam-树脂，按多肽顺序由C端逐个向N端延伸。各种Boc氨基酸所用的保护基分别为Ser(OBzl)、Asp(OCHex)、Glu(OCHex)。缩合剂为DCCI，加HOBT以活化各氨基酸的羧基。每轮循环开始，以50％TFA去除Boc，然后以10％DIEA中和。肽链合成后，用含5％对甲苯酚的干燥氟化氢在0℃处理60分钟，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除各种保护基，用0.05M的碳酸氢氨抽提，冷冻干燥，获得粗肽，然后用TSK HW-40F凝胶柱层析分离纯化(图1)。

以高压液相反相柱层析鉴定纯度达99％(图2)；毛细管电泳显示均一(图3)；经电喷雾质谱测定分子量为3020Da，与理论分子量3020.29Da符合(图4)。

此外，用PE-ABI 491A仪器对N端蛋白全序列进行测定，测得的N端序列为：E-A-E-D-L-Q-V-G-Q-V-E-L-G-G-G-P-G-A-G-S-L-Q-P-L-A-L-E-G-S-L-。

用PE-ABI 491A仪器对C端蛋白部分序列进行测定，测得的C端序列为...G-S-L-Q。综合测序结果，表明合成的C肽的氨基酸序列是正确的。

实施例2

I型糖尿病大鼠模型的建立

对雄性S-D大鼠(3月龄，体重200-250g)经尾静脉注射链尿佐菌素STZ(50mg/kg体重)，从而制备糖尿病模型。同样大鼠经尾静脉注射缓冲液作为正常对照。

实施例3

C肽联合胰岛素作用于I型糖尿病大鼠模型，降低尿白蛋白排泄率

在单独应用C肽或胰岛素治疗试验中，糖尿病大鼠分为3组：胰岛素治疗组、C肽治疗组和非治疗组。胰岛素治疗组给予长效胰岛素注射液(PZI)每天一次皮下注射，使血糖维持在接近正常水平(7-8mmol/l)；C肽治疗组给予人C肽(130nmol/kg体重)每天两次皮下注射，并加以小剂量PZI每天一次皮下注射维持大鼠存活；非治疗组小剂量PZI每天一次皮下注射维持大鼠存活；正常对照组，不给予任何治疗。疗程为8周或12周。

在C肽联合胰岛素治疗试验中，糖尿病大鼠分为2组：胰岛素治疗组和C肽联合胰岛素治疗组。胰岛素治疗组给予长效胰岛素注射液(PZI)每天一次皮下注射，使血糖维持在中等控制水平(10mmol/l左右)；C肽联合胰岛素治疗组给予人C肽(130nmol/kg体重)每天两次皮下注射，并加以长效胰岛素注射液(PZI)每天一次皮下注射，使血糖维持在中等控制水平。正常对照组，不给予任何治疗。疗程为8周。

C肽和/或胰岛素治疗结束时留取大鼠24小时尿量，用大鼠白蛋白EIA试剂盒(Cayman Chemical Company，Australia)测定尿白蛋白浓度，计算24小时尿白蛋白排泄率(μg/24h)。

结果表明，在单独应用C肽或胰岛素治疗试验中，8周疗程大鼠的24小时尿白蛋白排泄率由小到大均依次为正常组、胰岛素治疗组、C肽治疗组和非治疗组。方差分析显示各组间差异有统计意义(p＜0.001)。Least-significant difference法分析显示正常组大鼠的尿白蛋白排泄率与胰岛素治疗组相近(p＝0.124)，但小于C肽治疗组和非治疗组(分别为p＝0.001和p＜0.001)。胰岛素治疗组大鼠的尿白蛋白排泄率也小于C肽治疗组和非治疗组(分别为p＝0.019和p＝0.001)。C肽治疗组大鼠的尿白蛋白排泄率小于非治疗组，但差异显著性处于临界范围(p＝0.059)。12周疗程大鼠的24小时尿白蛋白排泄率由小到大均依次为正常组、胰岛素治疗组、非治疗组和C肽治疗组。方差分析显示各组间差异有统计意义(p＝0.021)。最小显著差法(Least-significant difference)分析显示，正常组大鼠的尿白蛋白排泄率与胰岛素治疗组相近(p＝0.385)，C肽治疗组大鼠的尿白蛋白排泄率与非治疗组相近(p＝0.895)。正常组大鼠的尿白蛋白排泄率小于C肽治疗组和非治疗组(均为p＝0.011)。胰岛素治疗组大鼠的尿白蛋白排泄率小于C肽治疗组和非治疗组，但差异显著性处于临界范围(分别为p＝0.050和p＝0.054)。这一结果提示在不控制血糖情况下，单独应用C肽短期内(8周)治疗糖尿病大鼠，具有防止糖尿病所致尿白蛋白排泄率增加的趋势；但随着疗程的延长(12周)，单独应用C肽治疗不再显示出治疗效果，可能由于长期高血糖的毒性作用掩盖了C肽对肾脏的保护作用(参见图6、图7)。

在C肽联合胰岛素治疗试验中，24小时尿白蛋白排泄率由小到大均依次为正常组、C肽联合胰岛素治疗组和胰岛素治疗组。方差分析显示各组间差异有统计意义(p＜0.05)。最小显著差法(Least-significant difference)分析显示C肽联合胰岛素治疗组大鼠的尿白蛋白排泄率与正常组相近；胰岛素治疗组大鼠的尿白蛋白排泄率大于正常组和C肽联合胰岛素治疗组(均为p＜0.05)。这提示C肽联合胰岛素治疗较单独应用C肽或胰岛素治疗对防止糖尿病所致尿白蛋白排泄率增加有更好的效果(参见图8)。

实施例4

C肽联合胰岛素作用于I型糖尿病大鼠模型，对糖尿病引起的基质肾小球面积比值变化的影响

在本实施例中，实验方法与实施例3中所述基本相同。不同点在于，C肽和/或胰岛素治疗结束时取大鼠肾脏，用中性甲醛固定，石蜡包埋切片，行PAS染色，在光镜下用IMS彩色图像分析综合系统(上海申滕信息技术有限公司)测定基质肾小球截面积比值(即肾小球截面积中PAS阳性物质的面积与肾小球截面积的比值)。

结果表明，在单独应用C肽或胰岛素治疗试验中，8周疗程大鼠肾脏基质肾小球截面积比值在不治疗组最大，其次为胰岛素治疗组，C肽治疗组和正常组的值最小。方差分析显示各组间差异有统计意义(P＜0.001)。最小显著差法(Least-significant difference)分析显示不治疗组的基质肾小球截面积比值大于其他三组(P＜0.001)；C肽治疗组与胰岛素治疗组及正常组间的差异没有统计意义(P＞0.05)。

12周疗程大鼠肾脏基质肾小球截面积比值也是不治疗组最大，以下依次为C肽治疗组、正常组和胰岛素治疗组。方差分析显示各组间的差异有统计意义(P＜0.001)。最小显著差法(Least-significant difference)分析显示不治疗组的基质肾小球截面积比值大于其他三组(P＜0.001)；C肽治疗组、胰岛素治疗组和正常组间的差异没有统计意义(P＞0.05)。这提示糖尿病大鼠单独应用C肽或胰岛素治疗都有防止糖尿病所致肾脏基质肾小球截面积比值增加的作用(参见图9、图10)。

在C肽联合胰岛素治疗试验中，大鼠肾脏基质肾小球截面积比值从大到小依次为胰岛素治疗组、C肽联合胰岛素治疗组和正常组。方差分析显示各组间的差异有统计意义(P＜0.05)。最小显著差法(Least-significant difference)分析显示胰岛素治疗组和C肽联合胰岛素治疗组的基质肾小球截面积比值都大于正常组(P＜0.05)；而胰岛素治疗组的基质肾小球截面积比值又大于C肽联合胰岛素治疗组(P＜0.05)。这提示糖尿病大鼠C肽联合胰岛素治疗对防止糖尿病所致肾脏基质肾小球截面积比值增加较单独应用C肽或胰岛素治疗有更好的效果(参见图11)。

实施例5

化学合成聚丙酰C肽

将4.0mg实施例1中制备的C肽悬浮于100μl PH7.5的超纯水，加入2μl丙烯酰氯(C肽与丙烯酰氯的摩尔比为1∶20)，室温反应5.5小时(用KHCO₃维持溶液PH在7.5左右)，然后加入20μl 10％过硫酸铵和3μl TEMED催化聚合，室温过夜后，加入5μl 10％氨水中和，对超纯水透析后冻干，获得聚丙酰C肽。

实施例6

聚丙酰C肽分子量测定

以BSA(牛血清白蛋白，67KD)，卵清白蛋白(Ovalbumin，45KD)，慈菇蛋白酶抑制剂(Arrowhead protease inhibitor，20KD)为标准分子量蛋白，在TSK SW G-300柱上凝胶过滤(Φ0.75×60cm)，测定聚丙酰C肽分子量。

结果表明，聚丙酰C肽分子量的分子量约为25KD。

实施例7

兔抗人C肽抗血清的制备

将0.8mg实施例5中制备的聚丙酰C肽溶于0.5ml生理盐水中(每次注射1只新西兰大白兔C肽用量)，与福氏佐剂在注射器中推成乳剂(1∶1)，免疫新西兰大白兔，第一天、第八天腹股沟注射；与非完全佐剂在注射器中推成乳剂(1∶1)，第十五天、第二十二天足掌多点注射；第三十天放血，然后进行抗血清滴度测定。

结果表明，得到的C肽抗血清滴度达2.5×10⁴。以BSA包板时，用正常兔血清为阴性对照，测得BSA-C肽抗原(本实验室制备)制备的抗体显阳性，而聚丙酰C肽不产生抗BSA抗体。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种胰岛素原C肽或其医药上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于防止糖尿病所致肾脏基质肾小球截面积比值增加。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还含有可接受药物量的胰岛素及其医药上可接受的盐。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的C肽是来源于胰岛素原的C链，具有下列氨基酸序列：

EAEDLQVGQV ELGGGPGAGS LQPLALEGSL Q。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还含有C肽相关肽，并且所述的C肽相关肽是来源于胰岛素原C肽C末端，具有下列氨基酸序列或部分序列的肽：

X1-X2-E-G-S-L-Q-X3-X4

其中X1为氨基、乙酰基、乙酰化氨基酸或去氨基的氨基酸；

X2、X3可以不存在或是单个氨基酸，也可以是多个氨基酸或肽，

X4为氨基、羧基或羟基。

5.根据权利要求4所述的的用途，其特征在于，所述的C肽相关肽包括来源于胰岛素原C肽的C末端五肽的环状结构：

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的C肽与胰岛素的摩尔比为1∶1-10∶1。

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