JP4505917B2 - 新規微生物およびそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ生産能を有する新規組換え微生物および該微生物を用いるＬ-アミノ酸の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するパラコッカス属等の微生物を利用して、Ｌ−アミノ酸をオキソ酸化合物から酵素的に製造する方法が知られていた。具体的には例えば、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルピルビン酸から製造する方法（Applied Biochemistry and Biotechnology、第11巻、第367頁、1985年）や医薬として有用な２−オキソイミダゾリジン誘導体（塩酸イミダプリルなど）の製造中間体であるＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸を、２−オキソ−４−フェニル酪酸から製造する方法（特開昭６０−１５６３９４号）が知られていた。
【０００３】
また、パラコッカス・デニトリフィカンスからフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子が単離されており、これを含む組換えプラスミドを宿主大腸菌に導入した組換え微生物が報告されている（Oueら、J.Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997年；Takagiら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、第112-119頁、1991年；特開平１−１５３０８４号）。前記組換え微生物は、親株であるパラコッカス・デニトリフィカンスよりも高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ生産能を有していた。
【０００４】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸類の工業的製造に利用するためには、さらに高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ生産能を有する微生物の育種が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有する、新規組換え微生物を提供することにある。また該微生物を用いた工業的有利なＬ-アミノ酸の製法を提供することにある。さらに、これらを利用したＮ−アルキル化アミノ酸エステルおよび２−オキソイミダゾリジン誘導体の製法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、トランスアミナーゼ発現プラスミドから、パラコッカス・デニトリフィカンスに由来するフェニルアラニン・トランスアミナーゼ翻訳領域の上流域に存在したロダニース様蛋白質翻訳領域を除去するとともに特定塩基配列に置きかえることにより、組換え微生物のトランスアミナーゼ生産能が顕著に高まることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
宿主微生物中で機能するプロモータの下流に、パラコッカス属に属する微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換えプラスミドを、エシェリシア・コリである宿主微生物中に含有せしめた組換え微生物であって、該プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が配列番号５に示された配列である、組換え微生物である。
【０００８】
また、前記微生物又は該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化７】
【００１０】
（但し、式中、ｎは１または２を表す。）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることを特徴とする、一般式（Ｉ）
【００１１】
【化８】
【００１２】
（但し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるＬ-アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸等）の製法である。
【００１３】
さらに、前記製法により得たＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸から、Ｎ−置換アミノ酸誘導体、さらに２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を製造する方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼを発現するためのプラスミド（以下、トランスアミナーゼ発現プラスミドと称する）を、エシェリシア・コリの宿主微生物中に導入することにより得られる。
【００１５】
トランスアミナーゼ発現プラスミドは、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが、プロモータの下流に機能的に連結されており、フェニルアラニン・トランスアミナーゼが該プロモータの調節の下に発現する。
【００１６】
本発明の微生物の含有するトランスアミナーゼ発現プラスミドは、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡがプロモータの下流に組込まれた組換えプラスミドであって、該プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の領域は配列番号５に示された塩基配列を有する。
【００１７】
パラコッカス属に属する微生物は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼを産生する能力を有する微生物であれば限定されず、例えば、パラコッカス・デニトリフィカンス等が挙げられる。
【００１８】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとしては、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の中のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする翻訳領域を用いることができる。
【００１９】
パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、例えば、文献（タカギら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、第112−119頁、1991年）記載の方法と同様に、ショットガンクローニングによりパラコッカス属微生物から以下のようにして単離することができる。
【００２０】
まずパラコッカス属微生物から染色体ＤＮＡを調製する。これを適当な制限酵素で処理（Sau3AIによる部分切断等）した後、適当なベクタープラスミドのプロモータ下流（ｐＬＧ３３９のＢａｍＨＩ切断部位、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト等）に連結する。ついで、得られた組換えプラスミドを用いて、宿主大腸菌を形質転換する。宿主大腸菌として、例えばアスパラギントランスアミナーゼ酸及び芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの同時欠損変異を有し、該欠損変異に基いてフェニルアラニン要求性を示す菌株（例えばエシェリシア・コリＤＧ３０株（Journal of Bacteriology、第130巻、第441−444頁、1987年）を用いれば、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された菌株は、Ｌ−フェニルアラニンを含まない最小培地で、Ｌ−フェニルアラニン要求性が相補された菌株として容易に選択できる。
【００２１】
選択された形質転換株を培養し、得られた菌体を用いて、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を測定することにより、組換えプラスミド上に目的遺伝子が含まれていることを確認することができる。
【００２２】
パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、上記のような方法により単離できるほか、既知の塩基配列情報を利用して、取得することもできる。
【００２３】
例えば、オウエらの文献（J.Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997年）及び後記配列表の配列番号１には、パラコッカス・デニトリフィカンス（パラコッカス・デニトリフィカンス ＩＦＯ１２４４２）から単離したフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子を含む染色体断片の塩基配列が開示され、同文献及び後記配列表の配列番号２には、当該フェニルアラニン・トランスアミナーゼのアミノ酸配列が開示されている。
【００２４】
開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼーション法などを適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子を取得できる。
【００２５】
ＤＮＡライブラリーは、パラコッカス属微生物の染色体ＤＮＡを用い、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製できる。
【００２６】
かくして単離されたパラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の塩基配列を決定し、翻訳領域を同定できる。この翻訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出して、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとして用いることができる。
【００２７】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとしては、具体的には、例えば配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
このほか、配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基で示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション（すなわち６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこと）によりハイブリダイズし得るＤＮＡであって、フェニルアラニントランスアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡは、自然界に存在するフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を用いることもできるが、その一部の塩基配列を改変したものであってもよい。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、塩基配列を改変する際は、通常、コードするアミノ酸配列に変更が生じないように設計される。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、化学合成したＤＮＡの連結、ＤＮＡの断片化と結合、部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）（Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662〜5666頁、1984年）等を組み合わせることによって取得できる。
【００３０】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクタープラスミド中のプロモータ下流に連結することにより、トランスアミナーゼ発現プラスミドを得ることができる。この際、該プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が、特定の配列、すなわち後記配列表の配列番号５に示された配列となるようにすればよい。
【００３１】
プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡの制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化、断片化したＤＮＡの結合、化学合成したリンカーＤＮＡの連結、部位特異的変異導入法、ＰＣＲ法等を適宜組合わせることによって、後記配列表の配列番号５に示された塩基配列となるように構築することができる。
【００３２】
プロモータは、宿主微生物である大腸菌（エシェリシア・コリ）中で機能し得るプロモータであればよく、特に限定されない。このようなプロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター（大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター）が挙げられる。ｌａｃプロモーターの塩基配列を後記配列表の配列番号３に示した。
【００３３】
ベクタープラスミドは、宿主微生物である大腸菌（エシェリシア・コリ）中で複製可能なプラスミドであれば特に限定されない。このようなベクタープラスミドとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製)、ｐＬＧ３３９（Gene、第１８巻、第３３５頁、１９８２年、ATCC37131）、ｐＵＣ１８（Gene、第３３巻、第１０３頁、１９８５年、ATCC37253）等が挙げられる。このうち、ｐＵＣ１８がとりわけ好ましい。
【００３４】
トランスアミナーゼ発現プラスミドを、通常の形質転換法により宿主微生物となるエシェリシア・コリに導入することにより、本発明の組換え微生物を取得できる。このような宿主微生物は特に限定されないが、例えば、エシェリシア・コリＤＨ５株、エシェリシア・コリＪＭ１０９株、エシェリシア・コリＨＢ１０１株（Journal of molecular biology、第４１巻、第４５９頁、１９６９年、ATCC33694）、エシェリシア・コリＪＭ１０９株（蛋白質・核酸・酵素、第２９巻、第２９４頁、１９８１年）等が挙げられる。このうち、エシェリシア・コリＨＢ１０１株が好ましい。
【００３５】
本発明の組換え微生物において、フェニルアラニン・トランスアミナーゼの高発現が実現する。フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性は、フェニルピルビン酸、２−オキソ−４−フェニル酪酸などを基質とし、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などをアミノ供与体として含む反応溶液中、微生物菌体を酵素源として添加し、公知の方法により測定できる。
【００３６】
本発明の組換え微生物もしくは該微生物の処理物を利用した酵素反応により、オキソ酸化合物（フェニルピルビン酸または２−オキソ−４−フェニル酪酸）からＬ−アミノ酸（Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸）を製造することができる。
【００３７】
すなわち、本発明の組換え微生物もしくは該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に、一般式（ＩＩ）
【００３８】
【化９】
【００３９】
（但し、式中、ｎは１または２を表す。）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることにより、一般式（Ｉ）
【００４０】
【化１０】
【００４１】
（但し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるＬ-アミノ酸を製造できる。
【００４２】
酵素反応に用いる微生物（生菌体、培養物等）及びそれらの処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、培養上清、菌体破砕物、菌体自己消化物、菌体抽出物等）は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するものであればよく、その形態は特に限定されない。
【００４３】
微生物の培養は常法により行うことができる。例えば、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地のpHを5.0〜9.0に調整し、これに微生物を接種したのち10〜45℃、好ましくは28〜37℃で、好気的に培養すればよい。本発明の微生物の含有する発現プラスミドにおいて、トランスアミナーゼがｌａｃプロモータの制御下に発現するよう構築されている場合には、培地中にラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）などの酵素誘導物質を添加することが、トランスアミナーゼ発現を高めるために望ましい。
【００４４】
微生物の培養液から遠心分離またはろ過等により生菌体を得ることができる。また、生菌体を生理食塩水等で洗浄することにより洗浄菌体を得ることができ、生菌体や洗浄菌体等を凍結乾燥またはアセトン乾燥することにより乾燥菌体を得ることができる。また、生菌体、洗浄菌体等を種々の物理化学的方法（例えば、超音波、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、アルミナ破壊、溶菌酵素、界面活性剤または有機溶媒等で処理）で処理することにより、菌体の破砕物を得ることができ、これら菌体や細胞の破砕物からろ過または遠心分離などにより固形物を除去することによって菌体の抽出物を得ることができる。
【００４５】
基質とするオキソ酸化合物およびアミノ供与体は、遊離の形でも塩の形でも反応系に供することができる。
【００４６】
アミノ供与体としては、例えばＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸が挙げられ、Ｌ−グルタミン酸が好ましい。アミノ供与体は、オキソ酸化合物１モルに対して通常１〜３モル、とりわけ１．３〜１．５モル使用するのが好ましい。
【００４７】
酵素反応は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼの安定性を考慮して４０℃未満で行うのが好ましいが、とりわけ28〜37℃で実施するのが好ましく、また、そのpHは７〜９となるよう調整するのが好ましい。また、上記酵素反応に際しては、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム等の界面活性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度になるよう添加しておくことにより酵素反応を促進させることもできる。
【００４８】
本酵素反応は反応時間を適当に調整することにより反応進行率を１００％にまで高めることができる。反応液中に生成した目的Ｌ−アミノ酸の分離精製は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独で、或いは組合せて容易に行うことができる。
【００４９】
上記のようにして得たＬ−アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸）から、既知の方法（米国特許第４５４２２３４、同第４３４４９４９、特開昭５９−１８１２４７、特開昭６０−１３７１５、特開昭６３−１７４９５５および特開昭６３−１７４９５６記載の方法等）により、Ｎ−置換アミノ酸誘導体へ導くことができる。
【００５０】
すなわち、上記のようにして得たＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸をエステル化した後、α位に脱離基を有するα−置換カルボン酸又はα−置換カルボン酸エステル化合物と反応させて、
一般式（ＩＩＩ）
【００５１】
【化１１】
【００５２】
（但し、式中、Ｒ1は、低級アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ2は、低級アルキル基、アラルキル基またはアリール基を示す。Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表す。）
で示される化合物を得、ついでＲ3が水素原子でない場合には、所望により、該化合物を接触還元及び／又は酸処理（好ましくは接触還元）することにより置換基Ｒ3を除去することにより、Ｎ−置換アミノ酸誘導体を得ることができる。
【００５３】
一般式（III）で示される化合物において、Ｒ1、Ｒ2又はＲ3で示される低級アルキル基（炭素数１〜４のアルキル基）としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基などが挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基、α−フェネチル基、β−フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などが挙げられる。アリール基としては、無置換フェニル基、アルキル基置換フェニル基（トリル基等）、ハロゲン原子・ニトロ基置換フェニル基などが挙げられる。
【００５４】
一般式（III）で示される化合物において、Ｒ1がエチル基、Ｒ2がメチル基であることが好ましい。
【００５５】
α−置換カルボン酸又はα−置換カルボン酸エステル化合物がα位に有する脱離基としては、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、スルホニルオキシ基（脂肪族置換スルホニルオキシ基、芳香族置換スルホニルオキシ基、ハロスルホニルオキシ基等）が挙げられる。
【００５６】
かくして、各種アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の共通な合成中間体として有用なＮ−置換アミノ酸誘導体であるＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンなどを製造できる。
【００５７】
得られたＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンはさらに、特開昭６２−４８６９６記載の方法により、酸塩化物（例えば、塩化ギ酸の反応性誘導体（ホスゲンなど））と反応させることによって、下式
【００５８】
【化１２】
【００５９】
で示される化合物に変換することができる。
【００６０】
また、本発明の製法において得られる生成化合物（Ｌ−アミノ酸、Ｎ−置換アミノ酸誘導体）は、遊離の形であってもよく、或いは塩の形であってもよい。かかる塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）および有機酸塩（コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩等）が挙げられる。
【００６１】
さらに、上記で得られたＮ−置換アミノ酸誘導体から、既知の方法（特開昭５８−２０３９７１記載の方法等）により、２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩へ導くことができる。
【００６２】
すなわち、上記で得られたＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンを、その活性エステル体に変換した後、一般式（ＩＶ）
【００６３】
【化１３】
【００６４】
（但し、Ｒ4は低級アルキル基又はフェニル基置換低級アルキル基を表す。）で示される２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸誘導体と縮合反応させ、得られた化合物をさらに、酸処理及び／又は接触還元（好ましくは酸処理）して置換基Ｒ4を除去して、下式
【００６５】
【化１４】
【００６６】
で示される化合物を得、所望により、該化合物をその薬理的に許容し得る塩とすることにより、２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を製造できる。かかる塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、有機酸塩（コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩など）、有機塩基との塩（リジン塩、オルニチン塩等）が挙げられる。
【００６７】
Ｎ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンの活性エステル体とは、そのカルボキシル基における反応性誘導体を意味する。このような活性エステル体は、例えば前記化合物を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は１−ヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド等）の存在下で反応させることにより得られる。
【００６８】
一般式（IV）においてＲ4で示される低級アルキル基としては、tert−ブチル基などが挙げられる。フェニル基置換低級アルキル基としては、ベンジル基などが挙げられる。このうちＲ4は、ベンジル基であることが好ましい。
【００６９】
かくして、塩酸イミダプリル（化学名：（４Ｓ）−１−メチル−３−｛（２Ｓ）−２−〔Ｎ−（（１Ｓ）−１−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル）アミノ〕プロピオニル｝−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸塩酸塩）など、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤として有用な２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を製造することができる。
【００７０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００７２】
【実施例】
実施例１ トランスアミナーゼ高発現プラスミドｐＰＡＰ２４３及びこれを含む大腸菌形質転換株の取得
(１)発現プラスミドｐＰＡＰ１４２の調製
タカギらの文献（Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、112-119頁、1991年；特開平１−１５３０８４)記載の方法に従って、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans IFO12442）の染色体ＤＮＡからトランスアミナーゼ遺伝子（フェニルアラニントランスアミナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を単離し、これを含む組換え発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を得た。
【００７３】
ｐＰＡＰ１４２は、トランスアミナーゼ遺伝子を含むパラコッカス・デニトリフィカンス染色体ＤＮＡ断片（約２．２ｋｂ）が、ベクタープラスミドｐＵＣ１８のｌａｃプロモータ下流に連結されている。この染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を後記配列表の配列番号１に示し、この染色体ＤＮＡ断片にコードされるトランスアミナーゼのアミノ酸配列を後記配列表の配列番号２に示した。この染色体ＤＮＡ断片中、トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有する）の上流には、パラコッカス・デニトリフィカンス由来の、プロモータ領域と、ロダニース様蛋白質をコードする領域（配列番号１の第１６６〜９２７番目の塩基に相当する塩基配列を有する）が存在する。
【００７４】
ｐＰＡＰ１４２中、ｌａｃプロモータ（配列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有する）との間の塩基配列は、後記配列表の配列番号４に示した通りである。配列番号４の第２３７〜９９８番目の塩基に相当する塩基配列は、ロダニース様蛋白質をコードする領域の塩基配列である。
【００７５】
ｐＰＡＰ１４２を導入した大腸菌中では、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のトランスアミナーゼ遺伝子はベクター中のｌａｃプロモータによって発現すると考えられる。
【００７６】
(２)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３の調製
前記(１)で得たプラスミドｐＰＡＰ１４２から、パラコッカス（パラコッカス・デニトリフィカンス）由来染色体ＤＮＡ断片中の、遺伝子源本来のプロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域を欠失させ、大腸菌でのトランスアミナーゼの発現に必要な領域のみを残したプラスミドを、以下のようにして構築した。（構築方法の概略図を図１に示した。）
まず、ｐＰＡＰ１４２を鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）により、ｐＰＡＰ１４２中のトランスアミナーゼ翻訳域Ｎ末端側（１７７ｂｐ）とその上流非翻訳域の一部（９５ｂｐ）を含む断片を増幅した。
【００７７】
ＰＣＲのためのプライマーとしては、後記配列表の配列番号９及び配列番号１０に示した塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを各々センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いた。
【００７８】
センスプライマーの配列は、上流非翻訳域部分配列（配列番号１の第９２９〜９５８番目の塩基に相当）のＮ末側を一部改変してＫｐｎＩ認識部位が生成されるように設計した。また、アンチセンスプライマーの配列は、トランスアミナーゼ翻訳域中の部分配列（配列番号１の第１１７１〜１２００番目の塩基に相当）に基づいて設計した。
【００７９】
ＰＣＲの反応は、5μｌ（0.09μｇ）のプラスミド pPAP142、各4μＭのプライマー、1.0単位のＤＮＡポリメラーゼ、5μｌの10倍緩衝液、各5μｌ（2mM）のデオキシＮＴＰおよび30.5μｌの水からなる混合液を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の工程を、３０回繰り返すことにより行った。反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＰＣＲ産物のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）をゲル中から回収した。
【００８０】
得られたＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製）のＥｃｏＲＶで切断部位に挿入し、プラスミドｐＢＳＫ１を得た。ｐＢＳＫ１中のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲで得たＤＮＡが目的とする正しい配列を有していることを確認した。
【００８１】
プラスミドｐＢＳＫ１をさらにＥｃｏＲＩで切断し、得られた約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＰＡＰ１４２のＥｃｏＲＩ切断断片（約３８００ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ遺伝子の３’末端側を含む）と連結して、組換え発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を得た。
【００８２】
ｐＰＡＰ２４３は、ｌａｃプロモータの下流にパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域及び３’非翻訳領域が正方向に連結されており、ｐＰＡＰ１４２におけるパラコッカス由来のプロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域が欠失している。
【００８３】
ｐＰＡＰ２４３において、ｌａｃプロモータ（配列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有する）との間の塩基配列は、配列番号５で示した通りである。
【００８４】
(３)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の取得
前項(２)で得た発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＨＢ１０１株に導入し、形質転換株 ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）を得た。
【００８５】
実施例２ トランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の培養物のトランスアミナーゼ活性
前記実施例１(３)で得たトランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を導入した形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）（実施例１(３)）のトランスアミナーゼ活性を測定した。
【００８６】
また、ロダニース様蛋白質をコードする領域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡＰ１４２（実施例１(１)）、ロダニース様蛋白質をコードする領域などは除かれているがプロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ２４３とは異なる対照発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６（後記参考例１(１)）、ｐＰＡＰ１４１７（後記参考例１(２)）及びｐＰＡＰＳＤ６１（後記参考例１(３)）について、これらを導入した形質転換株のトランスアミナーゼ活性を測定・比較した。
【００８７】
形質転換株の培養及びトランスアミナーゼ活性の測定は、以下のように行った。ＬＢＧ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ、２％グルコース、２％寒天）で前培養した菌を一白金耳、生理食塩水４．５ｍｌに懸濁した後０．５ｍｌを生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０３％カラリン、アンピシリン２００μｇ／ｍｌを含む培地（ｐＨ７．０））５０ｍｌに植菌し、３７℃にて２６．５時間振とう培養した。培養後、培養液０．２ｍｌを採取し、洗浄用液（０．０１％臭化セチルトリメチルアンモニウム、０．９％塩化ナトリウム）４ｍｌに添加して３０℃、３０分間インキュベートした。これを遠心分離した後上清４ｍｌを除去し、残った菌体について、トランスアミナーゼ活性を測定した。
【００８８】
トランスアミナーゼ活性（フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性）は、２−オキソ−４−フェニル酪酸を基質とし、Ｌ−グルタミン酸をアミノ供与体として、以下のように測定した。
【００８９】
前記被験菌体（０．２ｍｌ）に基質溶液（0.25M ２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム、0.375M Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよび0.125M ピリドキサール−５’−リン酸）０．８ｍｌを添加し、３０℃で３０分反応させた後、１Ｎ塩酸４ｍｌを添加して反応停止させた。これを蒸留水で適宜希釈した後、ＨＰＬＣ（Nucleosil 10C18カラム（４×２５０ｍｍ、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）、移動相４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ２．５）／ＣＨ3ＣＮ［９／1］、流速１ｍｌ／分、検出波長２５４ｎｍ）にて、反応生成物Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸を測定・定量した。
【００９０】
測定結果を下記表１に示した。
【００９１】
【表１】
【００９２】
表１に示した通り、ｐＰＡＰ２４３をＨＢ１０１株に導入した形質転換株は、ロダニース様蛋白質をコードする領域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を導入した株の約２．１倍の高い活性を示した。
【００９３】
また、ｐＰＡＰ２４３と同様にロダニース様蛋白質をコードする領域などは除かれているがプロモータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ２４３とは異なる発現プラスミド、ｐＰＡＰ１４１６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を各々導入した形質転換株では、ｐＰＡＰ２４３を導入した株の約１／２以下の活性しか認められなかった。
【００９４】
実施例３ Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の製造
生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０３％カラリンを含む培地（ｐＨ７．０））１００ｍｌに、前記実施例１の（３）で得た大腸菌形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）を１白金耳植種し、３７℃で２６時間培養する。この培養液に２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム４．３３ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム５．０７ｇおよびピリドキサルリン酸２．６５ｍｇを添加後、アンモニア水でｐＨ８．８に調整し、更に３０℃で２６．５時間静置して酵素反応を行う。２時間および５時間反応後に、それぞれ２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム２．１６ｇとＬ−グルタミン酸ナトリウム２．５４ｇ（ｐＨ８．８）を添加して反応を行う。反応後、コットンフィルターでろ過を行い、ＨＣｌで溶解後、活性炭処理して、５Ｎ ＮａＣｌでｐＨ５．５に調整する。かくして収率約８８％で光学活性体Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の結晶を得ることができる。
【００９５】
参考例１ 対照トランスアミナーゼ発現プラスミドの調製
プロモータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ１４３とは異なる発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を以下のように調製した。
【００９６】
(１)ｐＰＡＰ１４１６の調製
実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られたＤＮＡ断片（３８９０ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカーＤＮＡ：配列番号６の第７０〜８４番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６を得た（調製方法の概略を図２に示した。）。リンカーＤＮＡは、３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム社製）を用いてホスホアミダイト法によって合成したものを用いた（以下、同）。
【００９７】
得られた発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列は、配列番号６で示した通りである。
【００９８】
(２)ｐＰＡＰ１４１７の調製
実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断した後、ＭＢヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）で処理して末端平滑化した。得られたＤＮＡ断片（約３８９０ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−平滑末端リンカーＤＮＡ：配列番号７の第７０〜８８番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰ１４１７を得た（調製方法の概略を図２に示した。）。
【００９９】
得られた発現プラスミドｐＰＡＰ１４１７は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列は、配列番号７に示した通りである。
【０１００】
(３)ｐＰＡＰＳＤ６１の調製
実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られたＤＮＡ断片（約３．９ｋｂ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカーＤＮＡ：配列番号８の第６９〜７８番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１を得た。
【０１０１】
得られた発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列は、配列番号８で示した通りである。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の微生物は、従来のトランスアミナーゼ発現組換え微生物と比較して顕著に高いトランスアミナーゼ発現能及び生産能を有する。また、本発明の微生物は、トランスアミナーゼ以外のパラコッカス・デニトリフィカンス由来蛋白質を発現しない点でも有利である。
【０１０３】
本新規微生物を用いることにより、Ｌ-アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸など）を工業的有利に製造できる。また、本新規微生物を用いることにより、Ｌ-アミノ酸を経由してＮ−置換アミノ酸誘導体アルキル及び２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を工業的有利に製造できる。
【０１０４】
「配列表フリーテキスト」
配列番号５のフリーテキスト
<223> ベクターの一部分とパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分が融合した配列（Sequence of the fusion of a portion of a vector and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region）
【０１０５】
配列番号６、７及び８のフリーテキスト
<223> ベクターの一部分とリンカーとパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分が融合した配列（Sequence of the fusion of a portion of a vector,a linker,and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region）
【０１０６】
配列番号９及び１０のフリーテキスト
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列（Artificially synthesized primer sequence）
【０１０７】
【配列表】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスアミナーゼ高発現プラスミドｐＰＡＰ２４３の作製方法概略を示す模式図。
【図２】対照トランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６及びｐＰＡＰ１４１７の作製方法概略を示す模式図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ生産能を有する新規組換え微生物および該微生物を用いるＬ-アミノ酸の製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するパラコッカス属等の微生物を利用して、Ｌ−アミノ酸をオキソ酸化合物から酵素的に製造する方法が知られていた。具体的には例えば、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルピルビン酸から製造する方法（Applied Biochemistry and Biotechnology、第11巻、第367頁、1985年）や医薬として有用な２−オキソイミダゾリジン誘導体（塩酸イミダプリルなど）の製造中間体であるＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸を、２−オキソ−４−フェニル酪酸から製造する方法（特開昭６０−１５６３９４号）が知られていた。
【０００３】
また、パラコッカス・デニトリフィカンスからフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする遺伝子が単離されており、これを含む組換えプラスミドを宿主大腸菌に導入した組換え微生物が報告されている（Oueら、J.Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997年；Takagiら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、第112-119頁、1991年；特開平１−１５３０８４号）。前記組換え微生物は、親株であるパラコッカス・デニトリフィカンスよりも高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ生産能を有していた。
【０００４】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸類の工業的製造に利用するためには、さらに高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ生産能を有する微生物の育種が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有する、新規組換え微生物を提供することにある。また該微生物を用いた工業的有利なＬ-アミノ酸の製法を提供することにある。さらに、これらを利用したＮ−アルキル化アミノ酸エステルおよび２−オキソイミダゾリジン誘導体の製法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、トランスアミナーゼ発現プラスミドから、パラコッカス・デニトリフィカンスに由来するフェニルアラニン・トランスアミナーゼ翻訳領域の上流域に存在したロダニース様蛋白質翻訳領域を除去するとともに特定塩基配列に置きかえることにより、組換え微生物のトランスアミナーゼ生産能が顕著に高まることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
宿主微生物中で機能するプロモータの下流に、パラコッカス属に属する微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが組込まれた組換えプラスミドを、エシェリシア・コリである宿主微生物中に含有せしめた組換え微生物であって、該プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が配列番号５に示された配列である、組換え微生物である。
【０００８】
また、前記微生物又は該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に一般式（ＩＩ）
【０００９】
【化７】
（但し、式中、ｎは１または２を表す。）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることを特徴とする、一般式（Ｉ）
【００１１】
【化８】
（但し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるＬ-アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸等）の製法である。
【００１３】
さらに、前記製法により得たＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸から、Ｎ−置換アミノ酸誘導体、さらに２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を製造する方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼを発現するためのプラスミド（以下、トランスアミナーゼ発現プラスミドと称する）を、エシェリシア・コリの宿主微生物中に導入することにより得られる。
【００１５】
トランスアミナーゼ発現プラスミドは、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡが、プロモータの下流に機能的に連結されており、フェニルアラニン・トランスアミナーゼが該プロモータの調節の下に発現する。
【００１６】
本発明の微生物の含有するトランスアミナーゼ発現プラスミドは、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡがプロモータの下流に組込まれた組換えプラスミドであって、該プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の領域は配列番号５に示された塩基配列を有する。
【００１７】
パラコッカス属に属する微生物は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼを産生する能力を有する微生物であれば限定されず、例えば、パラコッカス・デニトリフィカンス等が挙げられる。
【００１８】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとしては、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の中のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードする翻訳領域を用いることができる。
【００１９】
パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、例えば、文献（タカギら、Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、第112−119頁、1991年）記載の方法と同様に、ショットガンクローニングによりパラコッカス属微生物から以下のようにして単離することができる。
【００２０】
まずパラコッカス属微生物から染色体ＤＮＡを調製する。これを適当な制限酵素で処理（Sau3AIによる部分切断等）した後、適当なベクタープラスミドのプロモータ下流（ｐＬＧ３３９のＢａｍＨＩ切断部位、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト等）に連結する。ついで、得られた組換えプラスミドを用いて、宿主大腸菌を形質転換する。宿主大腸菌として、例えばアスパラギントランスアミナーゼ酸及び芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの同時欠損変異を有し、該欠損変異に基いてフェニルアラニン要求性を示す菌株（例えばエシェリシア・コリＤＧ３０株（Journal of Bacteriology、第130巻、第441−444頁、1987年）を用いれば、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された菌株は、Ｌ−フェニルアラニンを含まない最小培地で、Ｌ−フェニルアラニン要求性が相補された菌株として容易に選択できる。
【００２１】
選択された形質転換株を培養し、得られた菌体を用いて、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を測定することにより、組換えプラスミド上に目的遺伝子が含まれていることを確認することができる。
【００２２】
パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子は、上記のような方法により単離できるほか、既知の塩基配列情報を利用して、取得することもできる。
【００２３】
例えば、オウエらの文献（J.Biochem.、第121巻、第161−171頁、1997年）及び後記配列表の配列番号１には、パラコッカス・デニトリフィカンス（パラコッカス・デニトリフィカンス ＩＦＯ１２４４２）から単離したフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子を含む染色体断片の塩基配列が開示され、同文献及び後記配列表の配列番号２には、当該フェニルアラニン・トランスアミナーゼのアミノ酸配列が開示されている。
【００２４】
開示された塩基配列の情報をもとにプライマーやプローブを設計し、これらを用いるＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法、コロニーハイブリダイゼーション法などを適宜組み合わせて、ＤＮＡライブラリーから、パラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子を取得できる。
【００２５】
ＤＮＡライブラリーは、パラコッカス属微生物の染色体ＤＮＡを用い、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により調製できる。
【００２６】
かくして単離されたパラコッカス属微生物由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の塩基配列を決定し、翻訳領域を同定できる。この翻訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出して、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとして用いることができる。
【００２７】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡとしては、具体的には、例えば配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
このほか、配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基で示される塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション（すなわち６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０〜６０℃の温度条件下、約１６時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこと）によりハイブリダイズし得るＤＮＡであって、フェニルアラニントランスアミナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡは、自然界に存在するフェニルアラニン・トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を用いることもできるが、その一部の塩基配列を改変したものであってもよい。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、塩基配列を改変する際は、通常、コードするアミノ酸配列に変更が生じないように設計される。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、化学合成したＤＮＡの連結、ＤＮＡの断片化と結合、部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）（Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662〜5666頁、1984年）等を組み合わせることによって取得できる。
【００３０】
フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクタープラスミド中のプロモータ下流に連結することにより、トランスアミナーゼ発現プラスミドを得ることができる。この際、該プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が、特定の配列、すなわち後記配列表の配列番号５に示された配列となるようにすればよい。
【００３１】
プロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡの制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化、断片化したＤＮＡの結合、化学合成したリンカーＤＮＡの連結、部位特異的変異導入法、ＰＣＲ法等を適宜組合わせることによって、後記配列表の配列番号５に示された塩基配列となるように構築することができる。
【００３２】
プロモータは、宿主微生物である大腸菌（エシェリシア・コリ）中で機能し得るプロモータであればよく、特に限定されない。このようなプロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター（大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター）が挙げられる。ｌａｃプロモーターの塩基配列を後記配列表の配列番号３に示した。
【００３３】
ベクタープラスミドは、宿主微生物である大腸菌（エシェリシア・コリ）中で複製可能なプラスミドであれば特に限定されない。このようなベクタープラスミドとしては、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製)、ｐＬＧ３３９（Gene、第１８巻、第３３５頁、１９８２年、ATCC37131）、ｐＵＣ１８（Gene、第３３巻、第１０３頁、１９８５年、ATCC37253）等が挙げられる。このうち、ｐＵＣ１８がとりわけ好ましい。
【００３４】
トランスアミナーゼ発現プラスミドを、通常の形質転換法により宿主微生物となるエシェリシア・コリに導入することにより、本発明の組換え微生物を取得できる。このような宿主微生物は特に限定されないが、例えば、エシェリシア・コリＤＨ５株、エシェリシア・コリＪＭ１０９株、エシェリシア・コリＨＢ１０１株（Journal of molecular biology、第４１巻、第４５９頁、１９６９年、ATCC33694）、エシェリシア・コリＪＭ１０９株（蛋白質・核酸・酵素、第２９巻、第２９４頁、１９８１年）等が挙げられる。このうち、エシェリシア・コリＨＢ１０１株が好ましい。
【００３５】
本発明の組換え微生物において、フェニルアラニン・トランスアミナーゼの高発現が実現する。フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性は、フェニルピルビン酸、２−オキソ−４−フェニル酪酸などを基質とし、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などをアミノ供与体として含む反応溶液中、微生物菌体を酵素源として添加し、公知の方法により測定できる。
【００３６】
本発明の組換え微生物もしくは該微生物の処理物を利用した酵素反応により、オキソ酸化合物（フェニルピルビン酸または２−オキソ−４−フェニル酪酸）からＬ−アミノ酸（Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸）を製造することができる。
【００３７】
すなわち、本発明の組換え微生物もしくは該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に、一般式（ＩＩ）
【００３８】
【化９】
（但し、式中、ｎは１または２を表す。）
で示されるオキソ酸化合物に作用させることにより、一般式（Ｉ）
【００４０】
【化１０】
（但し、ｎは前記と同一意味を有する。）
で示されるＬ-アミノ酸を製造できる。
【００４２】
酵素反応に用いる微生物（生菌体、培養物等）及びそれらの処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、培養上清、菌体破砕物、菌体自己消化物、菌体抽出物等）は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するものであればよく、その形態は特に限定されない。
【００４３】
微生物の培養は常法により行うことができる。例えば、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地のpHを5.0〜9.0に調整し、これに微生物を接種したのち10〜45℃、好ましくは28〜37℃で、好気的に培養すればよい。本発明の微生物の含有する発現プラスミドにおいて、トランスアミナーゼがｌａｃプロモータの制御下に発現するよう構築されている場合には、培地中にラクトース、ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）などの酵素誘導物質を添加することが、トランスアミナーゼ発現を高めるために望ましい。
【００４４】
微生物の培養液から遠心分離またはろ過等により生菌体を得ることができる。また、生菌体を生理食塩水等で洗浄することにより洗浄菌体を得ることができ、生菌体や洗浄菌体等を凍結乾燥またはアセトン乾燥することにより乾燥菌体を得ることができる。また、生菌体、洗浄菌体等を種々の物理化学的方法（例えば、超音波、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、アルミナ破壊、溶菌酵素、界面活性剤または有機溶媒等で処理）で処理することにより、菌体の破砕物を得ることができ、これら菌体や細胞の破砕物からろ過または遠心分離などにより固形物を除去することによって菌体の抽出物を得ることができる。
【００４５】
基質とするオキソ酸化合物およびアミノ供与体は、遊離の形でも塩の形でも反応系に供することができる。
【００４６】
アミノ供与体としては、例えばＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸が挙げられ、Ｌ−グルタミン酸が好ましい。アミノ供与体は、オキソ酸化合物１モルに対して通常１〜３モル、とりわけ１．３〜１．５モル使用するのが好ましい。
【００４７】
酵素反応は、フェニルアラニン・トランスアミナーゼの安定性を考慮して４０℃未満で行うのが好ましいが、とりわけ28〜37℃で実施するのが好ましく、また、そのpHは７〜９となるよう調整するのが好ましい。また、上記酵素反応に際しては、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム等の界面活性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度になるよう添加しておくことにより酵素反応を促進させることもできる。
【００４８】
本酵素反応は反応時間を適当に調整することにより反応進行率を１００％にまで高めることができる。反応液中に生成した目的Ｌ−アミノ酸の分離精製は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独で、或いは組合せて容易に行うことができる。
【００４９】
上記のようにして得たＬ−アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸）から、既知の方法（米国特許第４５４２２３４、同第４３４４９４９、特開昭５９−１８１２４７、特開昭６０−１３７１５、特開昭６３−１７４９５５および特開昭６３−１７４９５６記載の方法等）により、Ｎ−置換アミノ酸誘導体へ導くことができる。
【００５０】
すなわち、上記のようにして得たＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸をエステル化した後、α位に脱離基を有するα−置換カルボン酸又はα−置換カルボン酸エステル化合物と反応させて、
一般式（ＩＩＩ）
【００５１】
【化１１】
（但し、式中、Ｒ1は、低級アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表す。Ｒ2は、低級アルキル基、アラルキル基またはアリール基を示す。Ｒ3は、水素原子、低級アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を表す。）
で示される化合物を得、ついでＲ3が水素原子でない場合には、所望により、該化合物を接触還元及び／又は酸処理（好ましくは接触還元）することにより置換基Ｒ3を除去することにより、Ｎ−置換アミノ酸誘導体を得ることができる。
【００５３】
一般式（III）で示される化合物において、Ｒ1、Ｒ2又はＲ3で示される低級アルキル基（炭素数１〜４のアルキル基）としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基などが挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル基、α−フェネチル基、β−フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などが挙げられる。アリール基としては、無置換フェニル基、アルキル基置換フェニル基（トリル基等）、ハロゲン原子・ニトロ基置換フェニル基などが挙げられる。
【００５４】
一般式（III）で示される化合物において、Ｒ1がエチル基、Ｒ2がメチル基であることが好ましい。
【００５５】
α−置換カルボン酸又はα−置換カルボン酸エステル化合物がα位に有する脱離基としては、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子など）、スルホニルオキシ基（脂肪族置換スルホニルオキシ基、芳香族置換スルホニルオキシ基、ハロスルホニルオキシ基等）が挙げられる。
【００５６】
かくして、各種アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の共通な合成中間体として有用なＮ−置換アミノ酸誘導体であるＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンなどを製造できる。
【００５７】
得られたＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンはさらに、特開昭６２−４８６９６記載の方法により、酸塩化物（例えば、塩化ギ酸の反応性誘導体（ホスゲンなど））と反応させることによって、下式
【００５８】
【化１２】
で示される化合物に変換することができる。
【００６０】
また、本発明の製法において得られる生成化合物（Ｌ−アミノ酸、Ｎ−置換アミノ酸誘導体）は、遊離の形であってもよく、或いは塩の形であってもよい。かかる塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）および有機酸塩（コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩等）が挙げられる。
【００６１】
さらに、上記で得られたＮ−置換アミノ酸誘導体から、既知の方法（特開昭５８−２０３９７１記載の方法等）により、２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩へ導くことができる。
【００６２】
すなわち、上記で得られたＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンを、その活性エステル体に変換した後、一般式（ＩＶ）
【００６３】
【化１３】
（但し、Ｒ4は低級アルキル基又はフェニル基置換低級アルキル基を表す。）で示される２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸誘導体と縮合反応させ、得られた化合物をさらに、酸処理及び／又は接触還元（好ましくは酸処理）して置換基Ｒ4を除去して、下式
【００６５】
【化１４】
で示される化合物を得、所望により、該化合物をその薬理的に許容し得る塩とすることにより、２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を製造できる。かかる塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、有機酸塩（コハク酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、メタンスルホン酸塩など）、有機塩基との塩（リジン塩、オルニチン塩等）が挙げられる。
【００６７】
Ｎ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンの活性エステル体とは、そのカルボキシル基における反応性誘導体を意味する。このような活性エステル体は、例えば前記化合物を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール又は１−ヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド等）の存在下で反応させることにより得られる。
【００６８】
一般式（IV）においてＲ4で示される低級アルキル基としては、tert−ブチル基などが挙げられる。フェニル基置換低級アルキル基としては、ベンジル基などが挙げられる。このうちＲ4は、ベンジル基であることが好ましい。
【００６９】
かくして、塩酸イミダプリル（化学名：（４Ｓ）−１−メチル−３−｛（２Ｓ）−２−〔Ｎ−（（１Ｓ）−１−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル）アミノ〕プロピオニル｝−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸塩酸塩）など、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤として有用な２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を製造することができる。
【００７０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」(Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００７２】
【実施例】
実施例１ トランスアミナーゼ高発現プラスミドｐＰＡＰ２４３及びこれを含む大腸菌形質転換株の取得
(１)発現プラスミドｐＰＡＰ１４２の調製
タカギらの文献（Biotechnology and Applied Biochemistry、第13巻、112-119頁、1991年；特開平１−１５３０８４)記載の方法に従って、パラコッカス・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans IFO12442）の染色体ＤＮＡからトランスアミナーゼ遺伝子（フェニルアラニントランスアミナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を単離し、これを含む組換え発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を得た。
【００７３】
ｐＰＡＰ１４２は、トランスアミナーゼ遺伝子を含むパラコッカス・デニトリフィカンス染色体ＤＮＡ断片（約２．２ｋｂ）が、ベクタープラスミドｐＵＣ１８のｌａｃプロモータ下流に連結されている。この染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を後記配列表の配列番号１に示し、この染色体ＤＮＡ断片にコードされるトランスアミナーゼのアミノ酸配列を後記配列表の配列番号２に示した。この染色体ＤＮＡ断片中、トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有する）の上流には、パラコッカス・デニトリフィカンス由来の、プロモータ領域と、ロダニース様蛋白質をコードする領域（配列番号１の第１６６〜９２７番目の塩基に相当する塩基配列を有する）が存在する。
【００７４】
ｐＰＡＰ１４２中、ｌａｃプロモータ（配列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有する）との間の塩基配列は、後記配列表の配列番号４に示した通りである。配列番号４の第２３７〜９９８番目の塩基に相当する塩基配列は、ロダニース様蛋白質をコードする領域の塩基配列である。
【００７５】
ｐＰＡＰ１４２を導入した大腸菌中では、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のトランスアミナーゼ遺伝子はベクター中のｌａｃプロモータによって発現すると考えられる。
【００７６】
(２)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３の調製
前記(１)で得たプラスミドｐＰＡＰ１４２から、パラコッカス（パラコッカス・デニトリフィカンス）由来染色体ＤＮＡ断片中の、遺伝子源本来のプロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域を欠失させ、大腸菌でのトランスアミナーゼの発現に必要な領域のみを残したプラスミドを、以下のようにして構築した。（構築方法の概略図を図１に示した。）
まず、ｐＰＡＰ１４２を鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）により、ｐＰＡＰ１４２中のトランスアミナーゼ翻訳域Ｎ末端側（１７７ｂｐ）とその上流非翻訳域の一部（９５ｂｐ）を含む断片を増幅した。
【００７７】
ＰＣＲのためのプライマーとしては、後記配列表の配列番号９及び配列番号１０に示した塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを各々センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いた。
【００７８】
センスプライマーの配列は、上流非翻訳域部分配列（配列番号１の第９２９〜９５８番目の塩基に相当）のＮ末側を一部改変してＫｐｎＩ認識部位が生成されるように設計した。また、アンチセンスプライマーの配列は、トランスアミナーゼ翻訳域中の部分配列（配列番号１の第１１７１〜１２００番目の塩基に相当）に基づいて設計した。
【００７９】
ＰＣＲの反応は、5μｌ（0.09μｇ）のプラスミド pPAP142、各4μＭのプライマー、1.0単位のＤＮＡポリメラーゼ、5μｌの10倍緩衝液、各5μｌ（2mM）のデオキシＮＴＰおよび30.5μｌの水からなる混合液を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の工程を、３０回繰り返すことにより行った。反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とするＰＣＲ産物のＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）をゲル中から回収した。
【００８０】
得られたＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Stratagene社製）のＥｃｏＲＶで切断部位に挿入し、プラスミドｐＢＳＫ１を得た。ｐＢＳＫ１中のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲで得たＤＮＡが目的とする正しい配列を有していることを確認した。
【００８１】
プラスミドｐＢＳＫ１をさらにＥｃｏＲＩで切断し、得られた約１５０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＰＡＰ１４２のＥｃｏＲＩ切断断片（約３８００ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ遺伝子の３’末端側を含む）と連結して、組換え発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を得た。
【００８２】
ｐＰＡＰ２４３は、ｌａｃプロモータの下流にパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域及び３’非翻訳領域が正方向に連結されており、ｐＰＡＰ１４２におけるパラコッカス由来のプロモータ領域とロダニース様蛋白質をコードする領域が欠失している。
【００８３】
ｐＰＡＰ２４３において、ｌａｃプロモータ（配列番号３で示した塩基配列を有する）とパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域（配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基に相当する塩基配列を有する）との間の塩基配列は、配列番号５で示した通りである。
【００８４】
(３)発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の取得
前項(２)で得た発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＨＢ１０１株に導入し、形質転換株 ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）を得た。
【００８５】
実施例２ トランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を含む大腸菌形質転換株の培養物のトランスアミナーゼ活性
前記実施例１(３)で得たトランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ２４３を導入した形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）（実施例１(３)）のトランスアミナーゼ活性を測定した。
【００８６】
また、ロダニース様蛋白質をコードする領域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡＰ１４２（実施例１(１)）、ロダニース様蛋白質をコードする領域などは除かれているがプロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ２４３とは異なる対照発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６（後記参考例１(１)）、ｐＰＡＰ１４１７（後記参考例１(２)）及びｐＰＡＰＳＤ６１（後記参考例１(３)）について、これらを導入した形質転換株のトランスアミナーゼ活性を測定・比較した。
【００８７】
形質転換株の培養及びトランスアミナーゼ活性の測定は、以下のように行った。ＬＢＧ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％ＮａＣｌ、２％グルコース、２％寒天）で前培養した菌を一白金耳、生理食塩水４．５ｍｌに懸濁した後０．５ｍｌを生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０３％カラリン、アンピシリン２００μｇ／ｍｌを含む培地（ｐＨ７．０））５０ｍｌに植菌し、３７℃にて２６．５時間振とう培養した。培養後、培養液０．２ｍｌを採取し、洗浄用液（０．０１％臭化セチルトリメチルアンモニウム、０．９％塩化ナトリウム）４ｍｌに添加して３０℃、３０分間インキュベートした。これを遠心分離した後上清４ｍｌを除去し、残った菌体について、トランスアミナーゼ活性を測定した。
【００８８】
トランスアミナーゼ活性（フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性）は、２−オキソ−４−フェニル酪酸を基質とし、Ｌ−グルタミン酸をアミノ供与体として、以下のように測定した。
【００８９】
前記被験菌体（０．２ｍｌ）に基質溶液（0.25M ２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム、0.375M Ｌ−グルタミン酸ナトリウムおよび0.125M ピリドキサール−５’−リン酸）０．８ｍｌを添加し、３０℃で３０分反応させた後、１Ｎ塩酸４ｍｌを添加して反応停止させた。これを蒸留水で適宜希釈した後、ＨＰＬＣ（Nucleosil 10C18カラム（４×２５０ｍｍ、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）、移動相４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ２．５）／ＣＨ3ＣＮ［９／1］、流速１ｍｌ／分、検出波長２５４ｎｍ）にて、反応生成物Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸を測定・定量した。
【００９０】
測定結果を下記表１に示した。
【００９１】
【表１】
表１に示した通り、ｐＰＡＰ２４３をＨＢ１０１株に導入した形質転換株は、ロダニース様蛋白質をコードする領域などを除く前の発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を導入した株の約２．１倍の高い活性を示した。
【００９３】
また、ｐＰＡＰ２４３と同様にロダニース様蛋白質をコードする領域などは除かれているがプロモータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ２４３とは異なる発現プラスミド、ｐＰＡＰ１４１６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を各々導入した形質転換株では、ｐＰＡＰ２４３を導入した株の約１／２以下の活性しか認められなかった。
【００９４】
実施例３ Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の製造
生産用培地（１％乳糖、０．２％ブドウ糖、０．５％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、２％コーンスチープリカー、２％ミーストＮ、０．３％リン酸第１カリウム、０．７％リン酸第２カリウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．０３％カラリンを含む培地（ｐＨ７．０））１００ｍｌに、前記実施例１の（３）で得た大腸菌形質転換株ＨＢ１０１（ｐＰＡＰ２４３）を１白金耳植種し、３７℃で２６時間培養する。この培養液に２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム４．３３ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム５．０７ｇおよびピリドキサルリン酸２．６５ｍｇを添加後、アンモニア水でｐＨ８．８に調整し、更に３０℃で２６．５時間静置して酵素反応を行う。２時間および５時間反応後に、それぞれ２−オキソ−４−フェニル酪酸カリウム２．１６ｇとＬ−グルタミン酸ナトリウム２．５４ｇ（ｐＨ８．８）を添加して反応を行う。反応後、コットンフィルターでろ過を行い、ＨＣｌで溶解後、活性炭処理して、５Ｎ ＮａＣｌでｐＨ５．５に調整する。かくして収率約８８％で光学活性体Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の結晶を得ることができる。
【００９５】
参考例１ 対照トランスアミナーゼ発現プラスミドの調製
プロモータとトランスアミナーゼ翻訳領域との間の配列がｐＰＡＰ１４３とは異なる発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６、ｐＰＡＰ１４１７及びｐＰＡＰＳＤ６１を以下のように調製した。
【００９６】
(１)ｐＰＡＰ１４１６の調製
実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られたＤＮＡ断片（３８９０ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカーＤＮＡ：配列番号６の第７０〜８４番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６を得た（調製方法の概略を図２に示した。）。リンカーＤＮＡは、３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム社製）を用いてホスホアミダイト法によって合成したものを用いた（以下、同）。
【００９７】
得られた発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列は、配列番号６で示した通りである。
【００９８】
(２)ｐＰＡＰ１４１７の調製
実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断した後、ＭＢヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）で処理して末端平滑化した。得られたＤＮＡ断片（約３８９０ｂｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−平滑末端リンカーＤＮＡ：配列番号７の第７０〜８８番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰ１４１７を得た（調製方法の概略を図２に示した。）。
【００９９】
得られた発現プラスミドｐＰＡＰ１４１７は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列は、配列番号７に示した通りである。
【０１００】
(３)ｐＰＡＰＳＤ６１の調製
実施例１(１)で取得した発現プラスミドｐＰＡＰ１４２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩで切断し、得られたＤＮＡ断片（約３．９ｋｂ：アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモータ及びトランスアミナーゼ翻訳領域を含む）にリンカーＤＮＡ（ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩリンカーＤＮＡ：配列番号８の第６９〜７８番目の塩基に相当）を連結して閉環し発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１を得た。
【０１０１】
得られた発現プラスミドｐＰＡＰＳＤ６１は、プロモータ（ｌａｃ）及びパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子の翻訳領域を含み、プロモータ（ｌａｃ）とトランスアミナーゼ翻訳領域との間の塩基配列は、配列番号８で示した通りである。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明の微生物は、従来のトランスアミナーゼ発現組換え微生物と比較して顕著に高いトランスアミナーゼ発現能及び生産能を有する。また、本発明の微生物は、トランスアミナーゼ以外のパラコッカス・デニトリフィカンス由来蛋白質を発現しない点でも有利である。
【０１０３】
本新規微生物を用いることにより、Ｌ-アミノ酸（Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸など）を工業的有利に製造できる。また、本新規微生物を用いることにより、Ｌ-アミノ酸を経由してＮ−置換アミノ酸誘導体アルキル及び２−オキソイミダゾリジン誘導体またはその薬理学的に許容しうる塩を工業的有利に製造できる。
【０１０４】
「配列表フリーテキスト」
配列番号５のフリーテキスト
<223> ベクターの一部分とパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分が融合した配列（Sequence of the fusion of a portion of a vector and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region）
【０１０５】
配列番号６、７及び８のフリーテキスト
<223> ベクターの一部分とリンカーとパラコッカス由来トランスアミナーゼ遺伝子翻訳領域の５’上流の一部分が融合した配列（Sequence of the fusion of a portion of a vector,a linker,and 5' upstream part of the Paracoccus transaminase gene coding region）
【０１０６】
配列番号９及び１０のフリーテキスト
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列（Artificially synthesized primer sequence）
【０１０７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスアミナーゼ高発現プラスミドｐＰＡＰ２４３の作製方法概略を示す模式図。
【図２】対照トランスアミナーゼ発現プラスミドｐＰＡＰ１４１６及びｐＰＡＰ１４１７の作製方法概略を示す模式図。
Claims (10)
- ｌａｃプロモータの下流に、パラコッカス・デニトリフィカンス由来のフェニルアラニン・トランスアミナーゼをコードするＤＮＡであって、配列番号１の第１０２４〜２２０５番目の塩基からなる塩基配列を含むＤＮＡが組込まれた組換えプラスミドを、エシェリシア・コリ（宿主微生物）に含有せしめた組換え微生物であって、ｌａｃプロモータとフェニルアラニン・トランスアミナーゼの翻訳開始コドンとの間の塩基配列が配列番号５に示された配列である、組換え微生物。
- 請求項１記載の微生物を用いて、フェニルアラニン・トランスアミナーゼを生産する方法。
- 請求項１項記載の微生物又は該微生物の処理物を、アミノ供与体の存在下に、一般式（ＩＩ）
- アミノ供与体がＬ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸である請求項３記載の製法。
- オキソ酸化合物が２−オキソ−４−フェニル酪酸であり、Ｌ−アミノ酸がＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸である、請求項３記載の製法。
- 請求項５記載の製法によりＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸を得、該化合物をエステル化した後、α位に脱離基を有するα−置換カルボン酸又はα−置換カルボン酸エステル化合物と反応させて、一般式（ＩＩＩ）
- Ｒ１がエチル基、Ｒ２がメチル基である請求項６記載の製法。
- Ｎ−置換アミノ酸誘導体が、Ｎ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンである請求項７記載の製法。
- 請求項８記載の製法によりＮ−〔（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル〕−Ｌ−アラニンを得、該化合物をさらに酸塩化物と反応させて、下式
- 請求項８記載の製法により得たＮ−［（１Ｓ）−エトキシカルボニル−３−フェニルプロピル］−Ｌ−アラニンを、その活性エステル体（カルボキシル基における反応性誘導体）に変換した後、一般式（ＩＶ）
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