JP2021516556A - リラグルチド、セマグルチド及びｇｌｐ−１の化学酵素合成 - Google Patents

Abstract

本発明は、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含む第２のペプチド断片を含むＮ末端非保護アミンを有するペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせることを含む、配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むペプチドを合成するための方法に関し、ここで、ＸはＡｌａ又はα−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）残基であり、ＹはＬｙｓであり、このＬｙｓは遊離側鎖ε−アミノ基を有するか、或いはＬｙｓの側鎖ε−アミノ基は保護基によって保護されているか、或いはＬｙｓの側鎖ε−アミノ基はアミノ酸又は別の官能基によって官能化されており、ＺはＡｒｇ又はＬｙｓである。

Description

本発明は、配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むペプチドを合成するために、リガーゼの存在下でペプチド断片のカップリングが酵素的に実行される方法に関する。

アミノ酸配列Ｈ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨを含むいくつかのペプチドは、インスリン分泌性ペプチドとして当該技術分野においてよく知られている。これらのペプチドは、ＧＬＰ−１、リラグルチド及びセマグルチドを含む。

ヒトＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）は、式Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨを有する。

リラグルチドは、上記の配列の２０位のリジンのε−アミノ基において、Ｇｌｕで離間されたパルミチン酸によって置換されたＡｒｇ^２０−ＧＬＰ−１類似体である。したがって、リラグルチドは、式Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨを有する（図１も参照、全てのキラルアミノ酸残基はＬ−アミノ酸残基である）。Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）において、Ｌｙｓ残基のε−アミノ基はγ−Ｇｌｕカルボキシル側鎖と連結されており、ＧｌｕはＮ−パルミトイル化されている。

セマグルチドは、式Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−１７−カルボキシヘプタデカノイル）−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨを有する。本明細書において、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−１７−カルボキシヘプタデカノイルは、Ｎ−（１７−カルボキシ−ｌ−オキソヘプタデシル）−Ｌ−γ−グルタミル−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチル−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルである（図２も参照、全てのキラルアミノ酸残基はＬ−アミノ酸残基である）。

これらのペプチドは、例えば、ＩＩ型糖尿病の処置において使用することができる。さらに、例えば、リラグルチドは、肥満症の処置において、成人患者における習慣的な体重管理のための低カロリーの食事及び身体活動の増加に対する注射可能な補助剤として使用することができる。

ＧＬＰ−１、リラグルチド及びセマグルチドのようなオリゴペプチドを含むペプチドを合成するためのプロセスは、当該技術分野において知られている。ＧＬＰ−１及びその類似体などのインスリン分泌性ペプチドの合成方法は、国際公開第２００７１４７８１６号パンフレット及び国際公開第２０１６／０４６７５３号パンフレットに記載されている。国際公開第２０１６／０４６７５３号パンフレットの「発明の背景」には、適切な調製方法、特に、組換え方法論、固相担体における逐次合成、アミノ酸残基（１〜１０）を含有するペプチド配列とアミノ酸残基（１１〜３１）を含有する配列とのカップリングを含むリラグルチドの固相合成、又はアミノ酸残基（１〜４）、（１５〜１６）及び（１７〜３１）を含有するペプチド配列の調製、アミノ酸残基（１５〜１６）を含有するペプチドと（１７〜３１）とのカップリング、及びアミノ酸配列（１〜４）を含有するペプチドとのカップリングの前のアミノ酸の逐次付加を含むリラグルチドの固相合成についての詳細な説明が示されている。

国際公開第２０１６／０４６７５３号パンフレットによると、ＧＬＰ−１ペプチドは、液相若しくは固相ペプチド合成又はその組み合わせを含むプロセスにおいて調製される。このプロセスは、少なくとも２つの断片が末端Ｇｌｙ残基においてカップリングされる最終カップリングステップを含み、断片の少なくとも１つは少なくとも２つのサブ断片のカップリングによって調製される。リラグルチドは、特に、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙと、Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯＸ）−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨとをカップリングさせることによって得られる。この配列中、ＸはＨ、又はＧｌｕ α−カルボン酸基のための保護基を表す。

国際公開第２０１６／０４６７５３号パンフレットの「発明の背景」から分かるように、より良好でより効率的及び／又はより安価なプロセスを提供するために、又は改善された収率及び純度を有する生成物を達成するようにより容易に精製され得る生成物を提供するために、リラグルチド又はセマグルチドなどのＧＬＰ−１タンパク質の合成のための新規の方法を発見することが依然として必要とされている。特に、良好な収率において、毒性又は他に望ましくない試薬の使用を必要としてはならず、且つ高純度を有する生成物を得るために容易に精製され得る、リラグルチド又はセマグルチドなどのＧＬＰ−１及び類似体を特に工業規模で調製するための方法を提供する必要性が示される。

リラグルチド又はセマグルチドのようなＧＬＰ−１又はその類似体の酵素合成は、国際公開第２００７１４７８１６号パンフレット及び国際公開第２０１６／０４６７５３号パンフレットでは示唆されておらず、これらはいずれも化学合成に焦点が当てられている。

しかしながら、上記の従来技術に同様に記載されるように、完全に化学的なペプチドの合成には欠点がある。さらに、１５個のアミノ酸よりも長いペプチドは、副反応のために固相で合成するのが非常に困難であることが多い。結果として、精製が厄介である。したがって、１０個のアミノ酸よりも長いペプチドは、側鎖が保護されたオリゴペプチド断片の固相合成と、その後の、例えば、２０個のアミノ酸のペプチドを作製するための１０＋１０縮合などにおける溶液中での化学的縮合との組み合わせによって合成されることが多い。化学的に側鎖が保護されたオリゴペプチド断片の縮合の主要な欠点は、アシル供与体のＣ末端アミノ酸残基の活性化の際にラセミ化が生じることである。対照的に、酵素触媒によるペプチドカップリングはラセミ化が完全になく、側鎖官能基における副反応がないなどの、化学的なペプチド合成を上回るいくつかの他の利点を有する。工業的用途のために、動力学的アプローチに基づいた、すなわちアシル供与体Ｃ末端エステルを用いる、酵素ペプチド合成の概念は、最も魅力的である（例えば、Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，ｉｎ：“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１ｓｔ ｒｅｐｒｉｎｔ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００２を参照）。

水溶液中の酵素カップリングの問題は、水の存在がカップリングよりも加水分解を促進する傾向があることである。水溶液中のオリゴペプチド断片の酵素的縮合に関していくつかの報告が公開されている（Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，９，７３４；Ｂｊｏｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，８９１；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８１，２１，３３８７；Ｋｏｍｏｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９８０，１６，４３３）。

Ｗｅｌｌｓら（米国特許第５，４０３，７３７号明細書）により、水溶液中のオリゴペプチドの酵素的縮合は、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のサブチリシンであるサブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）の活性部位を変更することによって著しく改善され得ることが見出された。２つの突然変異、すなわちＳ２２１Ｃ及びＰ２２５Ａを導入したときに、野生型サブチリシンＢＰＮ’と比較して５００倍増大した合成対加水分解比（Ｓ／Ｈ比）を有する、サブチリガーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ）と呼ばれるサブチリシンＢＰＮ’変異体が得られた。さらなる実験において、Ｗｅｌｌｓらは、サブチリガーゼに５つの付加的な突然変異を追加して、酵素をより安定化させた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１２５４４）。スタビリガーゼ（ｓｔａｂｉｌｉｇａｓｅ）と呼ばれる新しい突然変異体はドデカ硫酸ナトリウム及びグアニジウム塩酸塩に対して適度により耐性であると思われたが、依然として加水分解が主要な副反応であった。

国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットには、サブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体に特定の突然変異を提供することによって、サブチリガーゼ又はスタビリガーゼのような酵素が水性環境で（オリゴ）ペプチド合成のために使用されたときに遭遇する望ましくない高加水分解活性に対する解決策が提供される。これらの変異体又は相同体は、特に、第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片をカップリングさせることによるペプチドの合成を触媒するのに適しており、ここで、第１の断片はペプチドＣ末端エステル又はチオエステルであり、第２の断片は、Ｎ末端非保護アミンを有するペプチド求核剤である。

本発明者らは、国際公開第２００７１４７８１６号パンフレット又は国際公開第２０１６／０４６７５３号パンフレットに記載される、ペプチド断片から出発するＧＬＰ−１、リラグルチド及びセマグルチドの合成に対して酵素的な断片縮合を適用することを考えた。とりわけ、本発明者らは、酵素的な断片縮合によって、リラグルチド、セマグルチド又はＧＬＰ−１のアミノ酸残基１〜１０を有する１０−ｍｅｒペプチドと、アミノ酸残基１１〜３１を含有する２１−ｍｅｒペプチドとを、１０−ｍｅｒを（チオ）エステルとして、２１−ｍｅｒを求核剤として用いてカップリングさせることを考えた。アミノ酸残基１〜１０を有するペプチドＣ末端（チオ）エステルと、アミノ酸残基１１〜３１を含有するペプチド求核剤とをカップリングさせるために、Ｐ１’及びＰ２’の両方におけるセリンの存在は、ペプチド求核剤にとって不利であることが見出された。有効なカップリングが不十分であることのさらに可能性のある理由は、ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＰ４における非疎水性アミノ酸（スレオニン）の存在であり得る。さらに、本発明者らは、アミノ酸残基１〜４を有するペプチドＣ末端（チオ）エステルと、アミノ酸残基５〜３１を含有するペプチド求核剤とをカップリングさせることを試みたが、不成功であった。本発明者らは、特に、ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＰ４におけるヒスチジンの存在、及び／又はＰ１におけるグリシンの存在が有効なカップリングにとって有害であると結論付けた。本開示の実施例１及び２に示されるように、水性反応媒体中でもリガーゼの存在下での酵素カップリングによってこれらのペプチドを調製することが可能であるが、サブチリシン変異体又はその相同体のようなリガーゼが、ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルのＰ４位（Ｃ末端から４番目のアミノ酸）に疎水性アミノ酸残基を有するＣ末端ペプチド（チオ）エステルのカップリングを好むという考察などの科学的な考察に基づいて設計された、いくつかのプロセスについては収率が予想外に低いことが見出された。とりわけ、サブチリシンＢＰＮ’変異体の存在下で、１３−ｍｅｒＣ末端エステルＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨと、１８−ｍｅｒペプチド求核剤Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙとを酵素的にカップリングさせることによって、リラグルチドのアミノ酸配列を有するペプチド（「Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨ」）を調製する方法が実行された。Ｃ末端エステルのＰ４位における疎水性アミノ酸残基Ｖａｌの存在により、これらの断片はリラグルチドアミノ酸配列を高収率で作製するために特に良好な断片となり得ると予想されたが、このペプチドは、非常に低収率で得られた（実施例１を参照）。実施例に２示されるように、対応する９−ｍｅｒＣ末端エステル及び２２−ｍｅｒペプチド求核剤からのＨ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨの酵素的調製による収率は、Ｐ４位の疎水性Ｐｈｅ残基の存在によりこれらの断片が酵素的縮合反応のために特に良好な断片になり得ることが予想されたが、さらに低かった。

本発明の目的は、ＧＬＰ−１又はその類似体、特にリラグルチド又はセマグルチドを酵素的に合成する新規の方法を提供することである。一般にこれらのペプチドのために、特に、これらを作製するための手段の幅を広げるために、代替的な酵素的ペプチド合成プロセスが必要とされている。特に、前述の問題又は上記従来技術で議論される問題の１つ又は複数を克服するようなプロセス、より具体的には、全収率の改善又選択性の改善を提供することが目的である。

本発明の主題であり得る１つ又は複数の他の目的は、以下の説明から得られる。

驚くことに、今回、これらの目的の１つ又は複数は、断片の縮合によるペプチドの酵素合成を含み、前記ペプチドの２つの特定の断片がリガーゼ、特にサブチリシン変異体又は相同体の存在下でカップリングされる方法において、ＧＬＰ−１又はその類似体が調製される方法によって満たされることが見出された。

したがって、本発明は、配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むペプチドを合成するための方法に関し、ここで、
− Ｘは、Ａｌａ又はα−アミノ−イソ酪酸残基（Ａｉｂ）であり、
− ＹはＬｙｓであり、このＬｙｓは遊離側鎖ε−アミノ基（すなわち、非誘導体化リジン残基）を有するか、或いはその側鎖ε−アミノ基は保護基によって保護されているか、或いはそれはアミノ酸又は別の官能基によって官能化されており、
− ＺはＡｒｇ又はＬｙｓであり、
本方法は、
（ａ）配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含む第２のペプチド断片を含むＮ末端非保護アミンを有するペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせることを含み、酵素カップリングはリガーゼによって触媒される。

本発明に従う方法が、水性反応媒体中で実行したときにも、対象のペプチド（ライゲーション生成物）の合成を高収率で可能にすることは、特に驚くべきことである。結局、Ｃ末端（チオ）エステル断片のＰ４位のＳｅｒは極性であり、科学的観点から、これは酵素カップリング反応のために好ましくないことが予想された。

これは、ペプチド断片上に側鎖保護基を全く必要とすることなく、且つ断片の一方又は両方に、溶解度を高めるための官能基（例えば、ペプチド骨格アミド官能基上の２−ヒドロキシ−４−メトキシベンジルアミド基、又はカップリング反応に関与しない各断片の末端の極性アミノ酸のペプチド−タグ）を提供することを必要とせずに達成されたが、特定の実施形態では、保護基又は溶解度増強基が使用され得る。ペプチド求核剤の溶解度は低いので、溶解度増強基を必要としなくても高いＳ／Ｈ比は驚くべきことである。

本発明に従う方法では、ペプチド求核剤のＹは、遊離側鎖ε−アミノ基（すなわち、非誘導体化リジン残基）を有するＬｙｓであり得る。しかしながら、本発明は、ＹがＬｙｓであり、その側鎖ε−アミノ基が官能基を含むペプチド求核剤、特に、ＹがＬｙｓγ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）又はＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）であるペプチド求核剤のカップリングも可能にする。立体的に非常に要求の厳しいこのような基の存在にもかかわらず、このようなペプチド求核剤を使用した効率的な酵素カップリングが可能であることも、特に驚くべきことである。この態様では、さらに驚くべきことに、ペプチド求核剤は高い疎水性を有する（これは、Ｌｙｓの側鎖ε−アミノ基における疎水性基（例えば、脂肪酸テールなど）の存在によって増大される）が、水性反応媒体中でも高い合成対加水分解比（Ｓ／Ｈ比）が達成される。一般に、Ｓ／Ｈ比は求核剤の濃度と直接関連し、したがって水溶液中の求核剤の溶解度と直接関連することが本発明者らの知見である。疎水性官能基の存在は、得られる分子の溶解度を非常に低くするので、本発明で定義されるような、すなわち、１１−ｍｅｒペプチド（チオ）エステル及び２０−ｍｅｒペプチド求核剤を含む、（チオ）エステルとペプチド求核剤とのカップリングの場合でもＳ／Ｈ比が非常に高いことは、したがって非常に驚くべきことである。異なる（チオ）エステル及びペプチド求核剤（Ｙ位置に側鎖官能基が提供されてもされなくても）、例えば、対応する９−ｍｅｒ（チオ）エステル及び２２−ｍｅｒペプチド求核剤をカップリングさせることによって同じライゲーション生成物を得ることが試みられた参照方法は、成功しなかった。

ＹがＬｙｓであり、その側鎖ε−アミノ基がアミノ酸又は別の官能基によって官能化されているペプチド求核剤とのカップリングは、特に、本明細書中の他の箇所でさらに詳細に記載されるように、サブチリシンＢＰＮ’変異体を用いて可能であることが見出された。ＹがＬｙｓであり、その側鎖ε−アミノ基が官能化されたペプチド求核剤を用いてカップリングが実行される方法の好ましい実施形態も以下にさらに詳細に説明されるであろう。

本発明の目的のために、「合成対加水分解比」（Ｓ／Ｈ比）は、エステル又はチオエステル基が加水分解された（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルの量で除した、酵素的に合成された（オリゴ）ペプチド生成物の量を意味する。Ｓ／Ｈ比の決定に関するさらなる詳細については、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットが参照される。

本明細書で使用される「又は」という用語は、他に明記されない限り、又は文脈から「・・・又は・・・のいずれか」を意味することが分からない限り、「及び／又は」として定義される。

本明細書で使用される「ａ」又は「ａｎ」という用語は、他に明記されない限り、又は文脈から単数形のみを指すべきであることが分からない限り、「少なくとも１つ」として定義される。

単数形の名詞（例えば、化合物、添加剤など）に言及する場合、文脈から単数形のみを指すべきであることが分からない限り、複数形が含まれることを意味する。

「ｐＨ」という用語は、本明細書では、見かけのｐＨ、すなわち標準的な較正されたｐＨ電極を用いて測定されるｐＨに対して使用される。

本発明の目的のために、「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸から構成される任意の鎖を意味する。したがって、ペプチドは一般に、少なくとも概念的に、型通りの水の損失を伴った１つの分子のカルボニル炭素から別の分子の窒素原子への共有結合の形成により、２つ以上のアミノカルボン酸分子（すなわちアミノ酸）から構成されるアミドである。「ペプチド」という用語は、通常、α−アミノ酸から形成される構造に適用されるが、ペプチドは、１つ若しくは複数のベータ−アミノ酸及び／又は１つ若しくは複数のγ−アミノ酸などの他のアミノ酸を含んでいてもよい。

ペプチドのアミノ酸配列は一次構造と称される。実施形態において、ペプチドは、本質的に二次構造を含まず、且つ本質的に三次構造を含まない。

実施形態において、本発明に従う方法で合成された、又はカップリングすべきペプチドは、本質的にアミノ酸残基からなる。例えば、ＧＬＰ−１はアミノ酸残基からなる。さらなる実施形態において、ペプチドは本質的にアミノ酸単位及び保護基からなる。

さらなる実施形態では、本発明に従う方法で合成された、又はカップリングすべきペプチドは、ペプチド鎖と、脂肪酸などの別の残基とのコンジュゲートである。これらのペプチドは、リポペプチドと呼ばれる。脂肪酸は、例えば、溶解度を変化させるために使用することができる。適切な脂肪酸の例は、Ｃ８〜Ｃ２４飽和脂肪酸及びＣ８〜Ｃ２４不飽和脂肪酸である。所望により、例えば、水性環境における溶解度を増大させるために、ペプチドと脂肪酸との間に極性リンカーが提供される。リラグルチド及びセマグルチドは、ペプチド鎖と脂肪酸とのコンジュゲートであるペプチドである。セマグルチドは、ペプチドと脂肪酸残基との間に極性リンカーを含む。

通常、ペプチド（この用語は、オリゴペプチド、タンパク質及びキメラペプチドを含む）は、最大約３５０００個までのアミノ酸単位、特に３〜２００００個、より具体的には４〜１０００個又は５〜５００個のアミノ酸単位を含む。本発明に従うリガーゼは、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ以外のペプチドの合成ために使用されてもよい。このようなペプチドは、好ましくは、５００個以下のアミノ酸単位、特に２００個以下、より具体的には１００個以下のアミノ酸単位を含む。特に好ましい実施形態では、合成されるペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸単位、より具体的には、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸又は少なくとも４０個のアミノ酸を含む。このようなペプチドからの断片は広い範囲内で選択することができ、断片の長さは少なくとも２個、特に少なくとも５個、より具体的には少なくとも１０個でよく、上限は合成されるペプチドの長さによって決定される。

「オリゴペプチド」は、本発明との関連において、２〜２００個のアミノ酸単位から構成される、特に５〜１００個のアミノ酸単位から構成される、より具体的には１０〜５０個のアミノ酸単位から構成されるペプチドを意味する。

本発明の目的のために、「ペプチド結合」は、（ｉ）１つのα−アミノ酸のα−アミノ末端、又は１つのベータ−アミノ酸のベータ−アミノ末端のいずれかと、（ｉｉ）１つの他のα−アミノ酸のα−カルボキシル末端、又は１つの他のベータ−アミノ酸のベータ−カルボキシル末端のいずれかとの間のアミド結合を意味する。好ましくは、ペプチド結合は、１つのα−アミノ酸のα−アミノ末端と、別のα−アミノ酸のα−カルボキシルとの間にある。

本発明との関連では、「アミノ酸側鎖」は、任意のタンパク質原性（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）又は非タンパク質原性アミノ酸側鎖を意味する。

タンパク質原性アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸である。タンパク質原性アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を含む。セレノシステイン（Ｓｅｃ、Ｕ）は、構造がシステインに対応するが、ただし硫黄原子の代わりにセレンを含有するアミノ酸である。タンパク質原性アミノ酸は、前記アミノ酸のＬ−立体異性体である（立体異性体を有さないグリシンを除く）。

本発明に従う方法における特定の対象の非タンパク質原性アミノ酸は、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）であり、これは、セマグルチドのペプチド鎖の一部を形成する。

「（チオ）エステル」という用語は、本明細書では、「エステル又はチオエステル」という語句の省略形として使用される。

「Ｎ末端保護」という用語は、本明細書では、一般に、別のペプチド又は同じペプチド分子のＣ末端カルボン酸基へのカップリングからＮ末端アミン基を少なくとも実質的に保護する保護基が、ペプチドのＮ末端アミン基、通常はＮ末端α−アミン基に提供されることを示すために使用される。

「Ｃ末端保護」という用語は、本明細書では、一般に、別のペプチド又は同じペプチド分子のＮ末端アミン基へのカップリングからカルボン酸基を実質的に保護する保護基が、ペプチドのＣ末端カルボン酸基、通常はＣ末端α−カルボン酸基に提供されることを示すために使用される。

タンパク質又はポリペプチド（特に、リガーゼなどの酵素）に関して本明細書で使用される「突然変異された」又は「突然変異」という用語は、野生型又は天然に存在するタンパク質又はポリペプチド配列中の少なくとも１つのアミノ酸が、これらのアミノ酸をコードする核酸の突然変異誘発によって、異なるアミノ酸によって置換されている、配列中に挿入されている、配列に付加されている、又は配列から欠失されていることを意味する。突然変異誘発は当該技術分野において周知の方法であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３（１９８９）に記載されるように、ＰＣＲによる、又はオリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発による部位特異的突然変異誘発を含む。遺伝子に関して本明細書で使用される「突然変異された」又は「突然変異」という用語は、その遺伝子の核酸配列又はその制御配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、突然変異誘発によって、異なるヌクレオチドによって置換されている、配列中に挿入されている、配列に付加されている、又は配列から欠失されており、結果的に、定性的又は定量的に変更された機能を有するタンパク質配列の転写をもたらすか、或いはその遺伝子のノックアウトをもたらすことを意味する。

本明細書において、アミノ酸置換を示すための省略形は、置換されるアミノ酸の一文字アミノ酸コードと、それに続く、タンパク質アミノ酸配列中で置換が行われる場所を指定する数字とを使用する。この数字は、野生型アミノ酸配列のアミノ酸位置である。したがって、突然変異されたアミノ酸配列については、野生型酵素においてその数字を有する位置に対応するアミノ酸位置である。より小さい数の位置における１つ又は複数の他の突然変異（付加、挿入、欠失など）のために、実際の位置は同じである必要はない。当業者は、ＮＥＥＤＬＥなどの一般に知られているアライメント技術を用いて、対応する位置を決定することができるであろう。この数字の後に、その中の野生型アミノ酸を置換するアミノ酸の一文字コードが続く。例えば、Ｓ２２１Ｃは、２２１位に対応する位置におけるセリンのシステインへの置換を示す。Ｘは、置換されるアミノ酸以外の任意のタンパク質原性アミノ酸を示すために使用される。例えば、Ｓ２２１Ｘは、２２１位に対応する位置におけるセリンの、任意の他のタンパク質原性アミノ酸への置換を示す。

「リガーゼ」という用語は、本明細書では、第１のペプチドのＣ末端及び別のペプチドのＮ末端をカップリングさせることによるペプチド結合の形成を触媒することによって、２つのペプチドのカップリングにおける触媒活性を有する酵素に対して使用される。一般に、本発明に従う（方法で使用される）リガーゼは、１１−ｍｅｒのＨｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルと、２０−ｍｅｒペプチド求核剤のＨ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙとのカップリングに関するリガーゼ活性を有する。

Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒにより定義されるように、リガーゼを含むプロテアーゼ中の活性部位残基は、サブサイトと呼ばれる隣接ポケットから構成される。各サブサイトポケットは、本明細書では配列位置と呼ばれるペプチド基質配列中の対応する残基に結合する。この定義によると、基質配列中のアミノ酸残基は、−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−．（切断できる結合は、Ｐ１位とＰ１’位の間に位置する）のように切断部位から外側に向かって連続して番号付けされるが、活性部位のサブサイト（ポケット）は、−Ｓ４−Ｓ３−Ｓ２−Ｓ１−Ｓ１’−Ｓ２’−Ｓ３’−Ｓ４’−．のように、それに対応して標識化される（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７ Ａｐｒ ２０；２７（２）：１５７−６２）。全てのプロテアーゼが前記サブサイトの全てを有するわけではないことに注意すべきである。例えば、Ｓ３’及び／又はＳ４’ポケットは、本発明に従うサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体中には存在しないことがある。

本発明の目的のために、「Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４ポケット」は、ペプチドアシル供与体のアミノ酸と相互作用をするプロテアーゼ（特に、リガーゼ）のアミノ酸を意味する。アシル供与体ペプチドのＣ末端アミノ酸（１番目のアミノ酸；Ｐ１）は、プロテアーゼのＳ１ポケット中のアミノ酸と相互作用をする。アシル供与体ペプチドの最後から２番目のアミノ酸（Ｃ末端から２番目のアミノ酸；Ｐ２）は、プロテアーゼのＳ２ポケット中のアミノ酸と相互作用をし、３番目のアミノ酸（Ｐ３）はＳ３と、４番目のアミノ酸（Ｐ４）はＳ４ポケットと相互作用をする。プロテアーゼのＳ１〜Ｓ４結合ポケットは、プロテアーゼの一次構造中では遠くにあり得るが、三次元空間では近接するいくつかのアミノ酸によって画定される。本発明の目的のために、Ｓ１’及びＳ２’ポケットは、ペプチド求核剤のＮ末端アミノ酸と相互作用をするプロテアーゼのアミノ酸を意味する。ペプチド求核剤のＮ末端アミノ酸は、プロテアーゼのＳ１’ポケット中のアミノ酸と相互作用をする。ペプチド求核剤のＮ末端の最後から２番目のアミノ酸は、プロテアーゼのＳ２’ポケット中のアミノ酸と相互作用をする。プロテアーゼのＳ１’及びＳ２’結合ポケットは、プロテアーゼの一次構造中では遠くにあり得るが、三次元空間では近接するいくつかのアミノ酸によって画定される。

酵素が括弧内の酵素クラス（ＥＣ）に関して言及される場合、酵素クラスは、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によって提供される酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）に基づいて酵素が分類される又は分類され得るクラスであり、この命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／において見出すことができる。特定のクラスに（まだ）分類されていないが、そのように分類され得る他の適切な酵素も含むことを意味する。

相同体は、通常、それが相同であるペプチド又は酵素と共通する意図された機能を有し、例えば、同じ反応、特に本発明に従う方法の酵素カップリングを触媒することができる。

アミノ酸又はヌクレオチド配列は、特定のレベルの類似性を示す場合に相同であると言われる。２つの相同配列が近接して関連するか又はより離れて関連するかは、それぞれ、高い又は低い「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」によって示される。

「相同性」、「相同性パーセント」、「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本発明の目的のために、本明細書では、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を目的として完全な配列がアラインされることが定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアライメントは、比較される配列の全長にわたって実行される。或いは、アライメントは、より短い長さにわたって、例えば、約２０個、約５０個、約１００個又はそれ以上の核酸又はアミノ酸にわたって実行されてもよい。同一性の割合は、報告されるアライン領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。

２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。当業者は、２つの配列をアラインさせて、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｉｎ Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを用いて決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，ｐｐ４４３−４５３）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。他のマトリックスを指定することもできる。アミノ酸配列のアライメントのために使用される任意選択的なパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらの全ての異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用する場合、２つの配列の同一性の全体の割合は有意に変更されないことを認識するであろう。

２つのアラインされた配列間の相同性又は同一性は次のように計算される：両方の配列中で同一のアミノ酸を示す、アライメント中の対応する位置の数を、アライメント中のギャップの総数を減算した後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを用いることによりＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プロブラムの出力で「最長同一性」として標識される。本発明の目的のために、２つの配列間の同一性（相同性）のレベルは、プログラムＮＥＥＤＬＥを用いることにより実行され得る「最長同一性」の定義に従って計算される。

ポリペプチド配列、特に酵素配列は、配列データベースに対する検索を実施するため、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列に対して使用される。ＢＬＡＳＴプログラムは、フォルトとして以下を使用する：
− オープンギャップに対するコスト：デフォルト＝タンパク質について１１
− 伸長ギャップに対するコスト：デフォルト＝タンパク質について１
− 期待値：デフォルト＝１０
− ワードサイズ：デフォルト＝ｍｅｇａｂｌａｓｔについて２８／タンパク質について３。

さらに、アミノ酸配列クエリーと、検索される相同配列との間の局所同一性（相同性）の程度は、ＢＬＡＳＴプログラムによって決定される。しかしながら、特定の閾値を超えるマッチを与える配列セグメントのみが比較される。したがって、これらのマッチングセグメントに対してのみプログラムにより同一性が計算される。したがって、このようにして計算された同一性は、局所同一性と称される。

「相同体」という用語は、本明細書では、特に、相同体ペプチド又は酵素が比較されるペプチド、特に酵素と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチド、より具体的には酵素に対して使用される。明らかに、配列同一性は１００％未満になる。配列同一性の割合は、突然変異の数と、相同体が比較されるペプチド（酵素）の長さとに依存する。「最長同一性」アライメントにおいて、欠失は考慮されない。

本発明の目的のために、「縮合」は、ペプチドのＣ末端カルボキシル官能基と、特定の別のペプチドの求核剤のＮ末端アミン官能基との間の新たなアミド結合の形成を意味する。

ペプチドの「類似体」という用語は、特に、前記ペプチドの構造的類似体及び／又は機能的類似体であるペプチドに対して使用される。機能的類似体は、インビボで同じ標的（例えば、細胞膜上の同じ標的受容体）を有し、構造的類似体はアミノ酸配列における高い類似性を有する。ペプチドの機能的類似体は、全アミノ酸配列にわたって比較的低いアミノ酸配列同一性、例えば約５０％以下のアミノ酸配列同一性を有し得るが、Ｎ−末端部分付近又はＣ末端部分付近などのアミノ酸配列のセグメントにおいて、それが類似体であるペプチドとは高い配列同一性（したがって、高い構造的類似性）を有し得る。構造的類似体は、特に、ペプチドが類似体であるそのペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％、より具体的には少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。明確さ及び簡潔な説明を目的として、本明細書では特徴は同じ又は別の実施形態の一部として記載されるが、本発明の範囲が、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることは認識されるであろう。本明細書において明確に定義されない本明細書で使用される用語は、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットにおいて定義される通りであるか、或いはそこに定義されていなければ、共通の一般的知識にしたがって使用される。

ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルは、アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含み、ここで、Ｘは、Ａｌａ又はα−アミノ−イソ酪酸単位（Ａｉｂ）である。これが第１のペプチド断片のアミノ酸配列である第１のペプチド断片を用いて、特に良好な結果が達成された。特定の実施形態では、Ｎ末端は、少なくとも１つのアミノ酸（Ｗ_ｖ、以下を参照）、例えば、Ｇｌｙ又はＰｈｅにより延長され、延長されたペプチドのＮ末端には、保護基、通常はエドマン型保護基が提供される（以下を参照）。所望により、例えば、反応媒体中の溶解度を変更するために、Ｎ末端にペプチドタグを提供することができる。しかしながら、特に水性反応媒体中でない場合には、これは一般に必要ではない。

ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルは、通常、活性化（チオ）エステルであり、すなわち、酵素カップリング反応に関与することができるカルボキシエステル又はカルボキシチオエステル基を含有する。原則として、任意の（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール（チオ）エステルを使用することができる。酵素カップリング反応に関与することができる（チオ）エステルの典型的な例は、メチル−、エチル、プロピル−、イソプロピル−、フェニル−、ベンジル−（例えば、ｐ−カルボキシ−ベンジル−）、２，２，２−トリクロロエチル−、２，２，２−トリフルオロエチル−、シアノメチル−及びカルボキシアミドメチル−（チオ）エステルである。

式ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＸ_１Ｘ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−Ｒ_１Ｒ_２によって表されるカルボキシアミドメチル型エステル（Ｃａｍ−エステル）を用いて、特に良好な結果が得られた。本明細書において、各Ｘ_１及びＸ_２は独立して、水素原子又はアルキル基を表す。Ｘ_１及びＸ_２の両方が水素原子である（ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ−Ｒ_１Ｒ_２）場合に、良好な結果が達成された。本明細書において、Ｒ_１は水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ_２は、水素原子若しくはアルキル基、又はアミノ酸の側鎖官能基上で若しくはアミノ酸の側鎖官能基の１つ若しくは複数上で任意選択的に保護されたＣ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す。本明細書において、各アルキル基は独立して、（置換又は非置換）Ｃ１〜Ｃ７アルキル基、好ましくは（置換又は非置換）線状Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、より好ましくは（置換又は非置換）線状Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、最も好ましくはメチル基を表すことができる。Ｒ_１及びＲ_２の両方が水素原子を表すか、或いはＲ_１が水素原子を表し、且つＲ_２が、アミノ酸の側鎖官能基上で又はアミノ酸の側鎖官能基の１つ又は複数上で任意選択的に保護されたＣ末端カルボキシアミド又はカルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す本発明の方法において特に良好な結果が達成された。

Ｃａｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−エステルを使用することが特に有利であり、ここで、ＡＡ１は第１のアミノ酸残基であり、ＡＡ２は第２のアミノ酸残基である。本明細書において、ＡＡ１は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファン単位などの疎水性アミノ酸残基である。ＡＡ２は、アルギニン又はリジン単位などの塩基性アミノ酸残基である。特に好ましいのは、Ｃａｍ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ及びＣａｍ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓである。ＡＡ１及びＡＡ２は、通常、遊離側鎖官能基、すなわち保護基又は別の残基を持たない側鎖官能基を有する。

また特に良好な結果は、カルボキシル置換されたベンジルエステル、特に、式ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＯ_２Ｅ（式中、Ｅは水素原子、アンモニウムイオンなどの正帯電塩イオン、又はアミノ酸の側鎖官能基上で若しくはアミノ酸の側鎖官能基の１つ若しくは複数上で任意選択的に保護されたＣ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す）によって表されるｐ−カルボキシル置換ベンジルエステルを用いても得られた。また良好な結果は、式ペプチド−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＯ_２Ｅ（式中、Ｅは上記のように定義され、ここで、フェニル環（上記式中のＣ_６Ｈ_４）中の１つ又は複数の水素原子は、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ又はハロゲンなどの置換基によって置き換えられる）によって表されるｐ−カルボキシル置換ベンジルエステルを用いても得られた。

ペプチドＣ末端（チオ）エステルはＮ末端非保護であっても、Ｎ末端保護されていてもよい。

適切なＮ末端保護基は、ペプチドの合成のために使用可能なＮ−保護基である。このような基は当業者に知られている。適切なＮ−保護基の例としては、カルバマート又はアシル型の保護基、例えば、「Ｃｂｚ」（ベンジルオキシカルボニル）、「Ｂｏｃ」（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、「Ｆｏｒ」（ホルミル）、「Ｆｍｏｃ」（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、「ＰｈＡｃ」（フェナセチル）及び「Ａｃ」（アセチル）が挙げられる。基Ｆｏｒ、ＰｈＡｃ及びＡｃは、それぞれ、酵素ペプチドデホルミラーゼ、ＰｅｎＧアシラーゼ又はアシラーゼを用いて酵素的に導入及び切断され得る。

本発明者らはさらに、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）基などの置換チオカルバモイル基が、断片縮合によるペプチドの酵素合成方法においてＣ末端（チオ）エステルのＮ末端α−アミン官能基のための有用な保護基であることに気付いた。このような基の使用はそれ自体、例えば、エドマン分解プロセスから周知である。エドマン型のアミノ酸配列決定のために使用可能な保護剤は本明細書中でエドマン型保護剤とも呼ばれ、ペプチドのアミン基（特に、Ｎ末端アミン）にカップリングされた同様の薬剤は本明細書中でエドマン型保護基と呼ばれる。本発明者らは、リラグルチド又はセマグルチドを得るために酵素カップリング反応の後に得られたペプチドがＹ位置に官能基が提供されることを必要とする場合、例えば、ＰａｌをＬｙｓ−γ−Ｇｌｕ（Ｙ）にカップリングさせる場合、又は１７−カルボキシヘプタデカン酸をＬｙｓ−ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ（Ｙ）にカップリングさせる場合に、エドマン型保護剤（付加的な連結アミノ酸、例えばグリシンを介してＮ末端α−アミノ官能基に結合される）が有効な保護基を形成することを見出した。置換チオカルバモイル基は、前記アミン官能基と、対応するイソチオシアネートとを（わずかに）アルカリ性条件下で反応させることによって、Ｎ末端α−アミノ官能基に提供することができる。したがって、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）基はフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を用いて導入することができ、メチルチオカルバモイル（ＭＴＣ）基は、メチルイソチオシアネート（ＭＩＴＣ）を用いて導入することができる。酸性条件下では、このような置換チオカルバモイル基は、チアゾリノン誘導体の形態で結合されたα−アミノ酸と一緒にペプチドから切断される。

Ｎ末端保護を提供するこの新しい方法は、例えばＦｍｏｃと比べて、水性反応系中の溶解度に関して有利であることが見出された。これは、固相合成を用いる場合の適合性に関して、例えばＢｏｃと比べて有利であることが見出された。置換チオカルバモイル部分などのエドマン型保護基は中性又はアルカリ性ｐＨでは保護基として特にうまく機能し、酸性ｐＨでは容易に除去することが可能である。したがって、このような基は通常、本明細書中の他の箇所でさらに詳細に記載されるように、中性又はアルカリ性ｐＨで良好なＳ／Ｈ比を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体のようなリガーゼを用いて、このようなｐＨでのカップリング反応において使用される。

エドマン型保護部分を使用する場合の適切な保護／脱保護条件は、エドマン型分解法においてこのような部分を使用する場合に当該技術分野で通常知られている条件を含む。置換チオカルバモイル基は、水性反応媒体中でも良好な溶解度に寄与することと組み合わされて、特に有効であることが見出された。置換チオカルバモイル基は芳香族又は脂肪族であり得る。好ましくは、置換チオカルバモイル基は、アリール置換チオカルバモイル基、又はアルキル置換チオカルバモイル基である。特に好ましいアリール置換チオカルバモイル基はＣ６〜Ｃ１２−アリール置換チオカルバモイル基であり、より具体的には、フェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）である。特に好ましいアルキル置換チオカルバモイル基はＣ１〜Ｃ６−アルキル置換チオカルバモイル基であり、より具体的には、メチルチオカルバモイル（ＭＴＣ）である。置換チオカルバモイル基の導入のために使用される好ましいイソチオシアネートのさらなる例は、ＦＩＴＣ、ＢＡＭＰＩＴＣ、ＤＮＴＣ、ＤＮＳＡＰＩＴＣ、ダンシルアミノ−ＰＩＴＣ、３−ＰＯＰＩＣ、４−ＰＯＰＩＣ、ＣＩＰＩＣ及び７−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）スルホニル］−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イルイソチオシアネート（ＤＢＤ−ＮＣＳ）などの、Ｈ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．Ｓａｎｔａ，Ｋ．Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｈ．Ｈｏｍｍａ，Ｋ．Ｉｍａｉ，Ｓ．Ｕｚｕ，Ｋ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．Ａｋｉｙａｍａ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６７，４２７６において言及されるものである。参照によって援用される４２７６頁の左側及び右側欄にわたる段落を参照されたい。さらに別の好ましい例は、７−アミノスルホニル−４−（２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル）−イソチオシアネート（ＡＢＤ−ＮＣＳ）である。

置換チオカルバモイル部分の代替として、エドマン型分解法によるペプチド中のアミノ酸の配列決定に適した別の部分を、同様にして、すなわち連結アミノ酸を介してペプチドＣ末端エステルのＮ末端を前記部分で標識化し、ペプチド求核剤との酵素カップリングの後にその部分を連結アミノ酸残基と一緒にカップリング生成物の残りの部分から切断することによって、保護基として使用することができる。したがって、連結アミノ酸残基を介してペプチドのＮ末端に標識化され、連結アミノ酸残基と一緒に切断除去され得る適切な保護部分も、本明細書では「エドマン型保護基」と呼ばれる。

さらに、２つ以上のアミノ酸を介して（すなわち、ペプチド鎖を介して）エドマン型保護基をペプチドＣ末端（チオ）エステルに連結させることが可能である。次に、ペプチド配列決定法において行われるものと同様の方法で、その部分により標識化し、そしてその部分とアミノ酸を切断除去するいくつかのサイクルによって、連結アミノ酸を除去することができる。付加的な連結アミノ酸の使用は必要ではないが、所望により、例えば、選択の反応媒体中のペプチドＣ末端（チオ）エステルの溶解度を変更するために使用することができる。

したがって、特定の好ましい実施形態では、本発明に従う方法は、（ａ）式Ｐ−Ｗ_ｖ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルによって表されるペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）ペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせることを含む。本明細書において、Ｐはエドマン型保護基、好ましくはフェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）又はメチルチオカルバモイル（ＭＴＣ）部分を表す。本明細書において、ｖは、少なくとも１、通常は１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２又は３、最も好ましくは１の整数であり、ｖは、アミノ酸残基Ｗの数を表す。各Ｗは、同じであっても異なっていてもよい。通常、各Ｗは、タンパク質原性アミノ酸の群から選択されるが、原則として、エドマン型の切断条件下でＰ−Ｗとして切断除去が可能であれば、別のアミノ酸も使用され得る。

このＮ末端保護されたペプチドＣ末端（チオ）エステルは求核剤（ｂ）とカップリングされ、それによりＮ末端保護されたペプチドＰ−Ｗ_ｖ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙが形成される。その後このペプチドは切断反応を受け、ここで、ペプチドＷ_ｖ−１−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（このペプチドは、Ｃ末端で伸長され得る）が形成される。

ｖ−１＞０の場合、基Ｐは、ペプチドのＷのＮ末端α−アミノ官能基にカップリングされ、その後、Ｐ−Ｗは切断により除去される。次に、カップリング及び切断サイクルは、ペプチド^１Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙが得られるまで繰り返される。

ペプチドのＮ末端へのＰの標識化は、通常は弱アルカリ性条件、例えば約ｐＨ８で、前記Ｐに対して知られているエドマン型の方法論に基づいて、それ自体が知られている方法で達成される。ペプチドのＮ末端からのＰ−Ｗの切断は、通常は酸性条件、普通は約４以下、特に約３以下、例えば０〜２の範囲のｐＨで、前記Ｐに対して知られているエドマン型の方法論に基づいて、それ自体が知られている方法で達成される。例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が使用され得る。

ペプチド（チオ）エステルのＮ末端保護は、Ｙが、パルミチン酸とカップリングされる必要のある遊離α−アミノ官能基を持つＬｙｓ（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）部分を含む方法において、或いはＹが、１７−カルボキシ−ヘプタデカン酸とカップリングされる必要のある遊離α−アミノ官能基を持つＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）部分を含む場合に特に有用である。

特に、保護される側鎖官能基を持たないペプチドＣ末端（チオ）エステルを用いて、良好な結果が達成された。しかしながら、実施形態では、１つ又は複数の側鎖官能基、例えば全ての側鎖官能基に保護基が提供される。適切な保護基は当業者に知られている。カルボン酸基は、例えば、シクロヘキシル、ベンジル又はアリル基によって保護することができる。

ペプチドＣ末端（チオ）エステルの活性化Ｃ末端（チオ）エステル基は、ラセミ化を伴わずに固相合成を用いて高い収率及び純度で合成することができる。カルボキシアミドメチル型の（チオ）エステル（Ｒ_１は水素原子を表し、Ｒ_２は、アミノ酸の側鎖官能基上で又はアミノ酸の側鎖官能基の１つ又は複数上で任意選択的に保護されたＣ末端カルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す）を使用する付加的な利点は、安価で工業的に入手可能な２−クロロトリチルクロリドを用いてその活性化Ｃ末端エステル又はチオエステル基を合成できることである。

ペプチドＣ末端（チオ）エステルの活性化Ｃ末端（チオ）エステル基は、溶液相合成によって、又は発酵によって、すなわち微生物を用いて合成することもできる。当該技術分野で一般に知られているように、発酵プロセスは、化合物、すなわちペプチドの好気性又は嫌気性条件下での産生を含む。発酵を用いてペプチド（チオ）エステルを得るための確実な方法は、いわゆるインテイン発現による（例えば、Ｅ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，９，１１−１８を参照）。種々のインテイン発現系キットが市販されている（例えば、ＩＭＰＡＣＴ^ＴＭキット）。ペプチド（チオ）エステルの発酵生産のための他の方法は、当該技術分野において知られている。

Ｎ末端非保護アミンを有するペプチド求核剤は、アミノ酸配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（「第２のペプチド断片」）を含む。これがペプチド求核剤のアミノ酸配列であるペプチド求核剤を用いて、特に良好な結果が達成された。水溶液系中でも、ペプチド求核剤の溶解度又は反応性を高めるためにＣ末端をペプチドタグ又は別の誘導体によって延長することを必要とせずに酵素カップリングがうまく機能することは、特に本発明の重要な利点である。

実施形態では、ペプチド求核剤はＣ末端保護される。別の実施形態では、Ｃ末端保護を含まない。

特に、保護される側鎖官能基を持たないペプチド求核剤を用いて、良好な結果が達成された。

実施形態において、ペプチド求核剤の１つ又は複数の側鎖官能基（特に、１つ又は複数のヒドロキシル、カルボキシル又はアミン基）には、保護基が提供される。適切な保護基は、当業者に知られている。カルボン酸基は、例えば、シクロヘキシル、ベンジル又はアリル基によって保護することができ、アミン官能基は、例えば、アリルオキシカルボニル基又はトリフルオロアセチル基によって保護することができる。

ペプチド求核剤は、固相合成、溶液相合成又は発酵などの当該技術分野において知られている方法を用いて合成され得る。

上述のように、ＹはＬｙｓであり、このＬｙｓの側鎖ε−アミノ基は、保護基によって保護され得る。しかしながら、側鎖ε−アミノ基を保護することは、一般に、満足できるカップリング収率及び速度のために必要ではなく、特に、サブチリシン又はその相同体がリガーゼとして使用される場合には必要でない。特に、本明細書に記載されるサブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体は、位置ＹにおけるＬｙｓのε−アミノ基が保護基を含まない場合でも、両方の断片をカップリングさせるのに適している。

したがって、通常、ペプチド求核剤のＹは、遊離ε−アミノ側鎖を有するか、又は官能化ε−アミノ側鎖を有するリジン残基である。例えば、ＧＬＰ−１が合成される対象のペプチドである場合、又はペプチド求核剤のＹが既にリラグルチド若しくはセマグルチドを得るために必要とされる官能化を含む場合、酵素カップリングによって得られる生成物は対象のペプチドであり得る（任意選択的に、もしあれば保護基を除去した後）。或いは、酵素カップリングによって得られる生成物は続いて、特にアミノ酸又は別の官能基、より具体的には、Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ、及びＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ（式中、Ｐａｌはパルミトイルであり、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡは２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチル−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルである）からなる群から選択される官能基によって官能化されるようにさらなる反応を受けることができる。リラグルチド若しくはセマグルチドを得るため、又はリラグルチド若しくはセマグルチドの合成に適したペプチド求核剤を提供するために、Ｙの遊離アミノ酸側鎖を官能化する方法は、当該技術分野で一般に知られている方法論に基づくこともでき、或いは、本発明の実施例に、又は本明細書中で引用される参考文献で言及される文献で記載される技術に基づいていてもよい。特に、官能化プロトコルは、米国特許第６，４５１，９７４Ｂ１号明細書に基づいて使用され得る。

特に好ましい実施形態では、本発明に従う方法で合成されるペプチドは、リラグルチドである。

本発明は、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＬｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）を含む第２のペプチド断片を含むペプチド求核剤との酵素的なカップリングを可能にするという点で有利である。したがって、対応する１１−ｍｅｒペプチドＣ末端（チオ）エステル及び２０−ｍｅｒＮ末端求核剤をカップリングさせ、それによりリラグルチドを得る酵素カップリングが実行され得る。ペプチド（チオ）エステルのＮ末端α−アミノ官能基には、エドマン型保護基を説明する際に本明細書中の他の箇所で定義されるように、Ｐ−Ｗ_ｖで表される基などの保護基が提供され得るが、とりわけ、ペプチド（チオ）エステルのＮ末端の保護を用いず、任意のさらなる保護基を必要とせずに、Ｙ＝Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）を有するペプチド求核剤が、式Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルによって表されるペプチドＣ末端エステル又はチオエステルにカップリングされる方法を用いて、特に良好な結果が達成された。

さらに好ましい実施形態では、リラグルチドは、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含む第２のペプチド断片を含むペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせ、その後、前記Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）残基にパルミトイル基（Ｐａｌ）を提供し、それにより、リラグルチドを得ることを含む方法において調製される。この実施形態では、ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルのＮ末端α−アミノ官能基は通常、酵素カップリングの間、好ましくはエドマン型保護基によって保護される。

さらに特に好ましい実施形態では、リラグルチドは、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、Ｙは、遊離ε−アミノ側鎖を有するリジン残基である）を含む第２のペプチド断片を含むペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせ、その後、前記ε−アミノ側鎖にＰａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨを提供し、それにより、リラグルチドを得ることを含む方法によって調製される。この実施形態では、ペプチド（チオ）エステルのＮ末端α−アミノ官能基において任意の保護基を使用することなく、特に良好な結果が達成された。

代替の実施形態では、本発明に従う方法は、セマグルチドの合成を含む。

有利な実施形態では、セマグルチドの合成は、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）である）を含む第２のペプチド断片を含むペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせることを含む。それにより、セマグルチドを直接得ることができる。ペプチド（チオ）エステルのＮ末端α−アミノ官能基には、エドマン型保護基を説明する際に本明細書中の他の箇所で定義されるように、Ｐ−Ｗ_ｖで表される基などの保護基が提供され得るが、とりわけ、ペプチド（チオ）エステルのＮ末端α−アミノ官能基の保護を用いず、任意のさらなる保護基を必要とせずに、Ｙ＝Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）を有するペプチド求核剤が、式Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルによって表されるペプチドＣ末端エステル又はチオエステルにカップリングされる方法を用いて、特に良好な結果が達成された。

さらなる実施形態では、セマグルチドの合成方法は、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）を含む第２のペプチド断片を含むペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせ、その後、Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）部分に１７−カルボキシヘプタデカノイル基を提供することを含む。したがって、酵素カップリングの後のさらなる官能化によってセマグルチドを得ることができる。この実施形態では、ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルのＮ末端α−アミノ官能基は通常、酵素カップリングの間、好ましくはエドマン型保護基によって保護される。

さらなる実施形態では、セマグルチドは、（ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、Ｙは、遊離ε−アミノ側鎖を有するリジン残基である）を含む第２のペプチド断片を含むペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせ、その後、前記εアミノ側鎖にＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ基を提供し、それによりセマグルチドを得ることを含む方法によって得られる。したがって、酵素カップリングの後の官能化によってセマグルチドを得ることができる。この実施形態では、ペプチド（チオ）エステルのＮ末端α−アミノ官能基において任意の保護基（又は任意の側鎖官能基）を使用することなく、特に良好な結果が達成された。

さらに別の代替の実施形態では、合成されるペプチドはＧＬＰ−１である。

ペプチドＣ末端（チオ）エステル及びペプチド求核剤のカップリングを触媒するために使用されるリガーゼは、ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端と、ペプチド求核剤のＮ末端との間のペプチド結合の形成を触媒することにより、両方のペプチドのカップリングにおける触媒活性を有する任意のリガーゼでよく、ここで、使用される反応媒体中のカップリング生成物のカップリング対加水分解についてのＳ／Ｈ比は１よりも大きい。通常、リガーゼはセリンプロテアーゼとして分類することができ、これは一般に、ＥＣ３．４．２１に分類され得る。一般に、これは、Ａｓｐ、Ｈｉｓ及びＳｅｒの順の触媒三残基を有する。

特に、本発明に従う方法で使用されるリガーゼは、単離された酵素である。したがって、このリガーゼは、生物において産生された場合にはそれが発現された生物、通常は組換え生物から単離され、或いはそれが合成された反応媒体から単離される。特に、本発明の酵素は、粗製形態、又は例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に開示される単一段階精製法などの任意の適切技術によって実質的に精製された形態のいずれかで、本発明の目的のために単離されたと考えられる。

特に、リガーゼはセリンエンドプロテアーゼであり得る。リガーゼは、使用される反応媒体中、特に水を含む反応媒体中、より具体的には水性媒体中で、通常、１よりも大きい、好ましくは２以上、特に５以上のＳ／Ｈ比を有する。この割合の上限値は重要ではなく、実際にはそれは、例えば、１００以下、特に２０以下であり得る。本発明に従う方法において使用されるリガーゼは一般に、少なくともサブチリシンＢＰＮ’と比較して改善された「合成対加水分解比」（Ｓ／Ｈ比）を有する。

サブチリシンＢＰＮ’のＳ／Ｈ比で除した、本発明に従う（方法において使用される）リガーゼのＳ／Ｈ比は、少なくとも実施例に記載される条件下で、通常、１００よりも大きい、好ましくは２５０以上、より好ましくは５００以上、特に１０００以上である。この割合の上限値は重要ではなく、それはほぼ無限であり得る。

特に、サブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体を用いて非常に良好な結果が達成された。

特に、主要な溶媒として水を含む（例えば、全液体を基準として５０〜１００ｗｔ．％）反応媒体中で酵素カップリングを実行する場合、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットに従うサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体は、特に適切であることが見出された。この公開物の内容は、特に、その特許請求の範囲に示されるようなサブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体についての詳細に関して、参照によって援用される。

したがって、通常、カップリング反応のために使用されるリガーゼは、配列番号２で表されるサブチリシンＢＰＮ’又はその相同体配列と比べて、以下の突然変異：
− ７５〜８３位に対応するアミノ酸の欠失；
− Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異（この突然変異は、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである）；
− 好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置における突然変異；
を含むサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体であり、
− アミノ酸位置は、配列番号２で表されるサブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される。

本発明に従う方法において使用するためのさらに好ましいリガーゼは、１つ又は複数の付加的な突然変異、特に、本明細書中の他の箇所、又は参照によって本明細書中に援用される国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットにおいて特定されるような１つ又は複数のさらなる突然変異を含み得る。

リガーゼ、特にサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体のＳ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異は、好ましくはＳ２２１Ｃである。

Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置における突然変異は、通常、酵素カップリングのＳ／Ｈ比のために有利である。突然変異は、通常、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ、Ｐ２２５Ｑの群から、好ましくはＰ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ及びＰ２２５Ｇの群から選択され、より好ましくはＰ２２５Ｎ又はＰ２２５Ｄであり、最も好ましくＰ２２５Ｎである。

良好な酵素安定性のために、リガーゼ、特にサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体は、好ましくは、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置における突然変異の群から選択される１つ又は複数の突然変異を含む。

Ｑ２に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｑ２Ｋに対応する。

Ｓ３に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｓ３Ｃに対応する。

Ｐ５に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｐ５Ｓに対応する。

Ｓ９に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｓ９Ａに対応する。

Ｉ３１に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｉ３１Ｌに対応する。

Ｋ４３に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｋ４３Ｎに対応する。

Ｍ５０に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｍ５０Ｆに対応する。

Ａ７３に対応する位置における好ましい突然変異は、Ａ７３Ｌに対応する。

Ｓ１８８に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｓ１８８Ｐに対応する。

Ｑ２０６に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｑ２０６Ｃに対応する。

Ｎ２１２に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｎ２１２Ｇに対応する。

Ｔ２５４に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｔ２５４Ａに対応する。

Ｑ２７１に対応する位置における好ましい突然変異は、Ｑ２７１Ｅに対応する。

特に好ましい実施形態では、リガーゼ、特にサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体は、Ｑ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応する位置における突然変異の群から選択される前記突然変異のうちの少なくとも６個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個、特に１２個、１３個又は１４個を含む。これは、水を主要な又は唯一の溶媒として含む反応媒体中での酵素の安定性のために特に好ましい。リガーゼは、本発明に従うペプチドの調製において酵素断片縮合活性（カップリング活性）を有することを条件として、サブチリシンＢＰＮ’と比較してさらなる突然変異、特に、本明細書中で引用される参考文献に記載されるような１つ又は複数のさらなる突然変異を有し得る。

本発明に従う酵素、特に、本発明のサブチリシンＢＰＮ’変異体の相同体を突然変異誘発によって誘導させ得る鋳型酵素としてのサブチリシンＢＰＮ’の代替物は、他のサブチリシン、特にサブチリシンＢＰＮ’と少なくとも５０％の相同性を有するサブチリシンである。

適切なサブチリシンの配列は、クエリーとしてサブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）を用いてデータベースをＢＬＡＳＴ処理することによって、２０１４年８月１１日に利用可能なＵＮＩＰＲＯＴ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）から検索することができる。しかしながら、配列検索は、ＵＮＩＰＲＯＴにも日付にも限定されない。当業者には、代替配列の保管場所（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を検索する方法、又は配列決定により付加的な相同体配列を収集する方法が分かる（例えば、Ｚｏｏｍｉｎｇ ｉｎ ｏｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ ｉｎ ｓｏｉｌ．Ｇａｂｏｒ Ｅ，Ｎｉｅｈａｕｓ Ｆ，Ａｅｈｌｅ Ｗ，Ｅｃｋ Ｊ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｐｒ ２０；４１８（１−２）：１６−２０を参照）。

特に、本発明はさらに、少なくとも、サブチリシンＢＰＮ’のＬ７５からＧ８３（Ｇ８３を含む）までに対応するアミノ酸の前記欠失と、サブチリシンＢＰＮ’の２２１位に対応する位置におけるシステイン又セレノシステインと、本請求項１における前記さらなる突然変異の少なくとも１つとを有する変異体に関する。

サブチリシンＢＰＮ’の配列は、配列番号２（成熟型）で示される。サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸−１０７〜２７５をコードする遺伝子は配列番号１に示される。サブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体は、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットに従う酵素に基づくことができるが、ただし、上述の突然変異を有することを条件とする。

有利な実施形態では、リガーゼは、７５〜８３位に対応するアミノ酸の欠失と、突然変異Ｓ２２１Ｃと、野生型サブチリシンＢＰＮ’（成熟）のＭ２２２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ｆ１８９、Ｎ２１８、Ｅ１５６、Ｇ１６６及びＮ６２に対応するアミノ酸位置における１つ又は複数のさらなる突然変異、好ましくは少なくとも３つのさらなる突然変異、特に５〜８個のさらなる突然変異とを有するサブチリシンＢＰＮ’変異体である。

これらの突然変異のうち、特に、Ｍ２２２Ｐ、Ｙ２１７Ｈ、Ｐ２２５Ｎ、Ｆ１８９Ｗ、Ｎ２１８Ｄ、Ｅ１５６Ｎ、Ｇ１６６Ｅ、Ｎ６２Ａに対応する突然変異により、良好な結果が達成された。配列番号３は、Ｃａ^２＋結合ループの欠失、Ｓ２２１Ｃを有すると共に、前記のさらなる突然変異を有する、本発明に従う（使用のための）サブチリシンＢＰＮ’変異体を示す。Ｈｉｓタグは精製を容易にするために包含されたものであり、リガーゼ活性のために必要なものではない。さらに好ましい酵素は、１つ又は複数の付加的な突然変異、特に、本明細書中の他の箇所、又は参照によって本明細書中に援用される国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットにおいて特定されるような１つ又は複数のさらなる突然変異を含み得る。

本発明の方法において、酵素反応は、通常、水を含む流体中で実施される。好ましくは、反応は、緩衝流体中で実施される。含水率は、通常、全液体を基準として１０〜１００ｖｏｌ％、好ましくは２０ｖｏｌ．％以上、好ましくは４０ｖｏｌ．％以上、特に５０ｖｏｌ．％以上、より具体的には６０ｖｏｌ．％以上である。特に、７０〜１００ｖｏｌ％の水、より具体的には９０〜１００ｖｏｌ．％、９５〜１００ｖｏｌ．％又は９８〜１００ｖｏｌ．％の水を含む反応媒体中で、良好な結果が達成された。「水性」という用語は、少なくとも実質的に水からなる媒体に対して使用される。

原則として、任意の緩衝液が適している。良好な緩衝液は、当業者に知られている。例えば、Ｄａｖｉｄ Ｓｈｅｅｈａｎ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２^ｎｄ Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｏｒｅ−ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｂｕｆｆｅｒｓ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｂｕｆｆｅｒ−ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｈｔｍｌを参照されたい。特に良好な結果は、例えば、トリシンなどのグッド緩衝液を用いて達成された。緩衝液の濃度は、広い範囲、例えば、１０〜１０００ｍＭの範囲、特に２５〜５００ｍＭの範囲、より具体的には５０〜２５０ｍＭの範囲内で選択され得る。ペプチド求核剤（ＹがＬｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）などである）をカップリングさせるために、比較的低いモル濃度の緩衝液が有利であることが見出された。

本発明に従う方法におけるカップリング反応のための緩衝液のｐＨは、少なくとも５、特に少なくとも６、好ましくは少なくとも７であり得る。所望のｐＨは、通常１１未満、特に１０未満、さらにより好ましくは９未満である。通常、酵素カップリングに最適なｐＨは７〜９の間である。

Ｓ／Ｈ比が高いために、大幅に過剰なペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステル又はペプチド求核剤は、一般に、縮合反応における高収率を達成するために必要とされない。一般に、これらは、ほぼ化学量論的な比率で、又はペプチドＣ末端エステルが過剰で、特に（ａ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステル対（ｂ）ペプチド求核剤のモル比が１：１〜５：１の範囲で接触される。化学量論的な比率について満足できる結果が達成されるが、過剰のペプチドＣ末端（チオ）エステルは、反応速度のために有利であることが見出された。したがって、好ましくは、（ａ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステル対（ｂ）ペプチド求核剤のモル比は、１．０５：１．０〜４：１の範囲、より好ましくは１．１：１．０〜３：１の範囲、さらにより好ましくは１．２：１．０〜２．５：１．０の範囲、特に１．２：１．０〜２．０：１．０の範囲である。

本発明の方法では、ペプチド断片の溶解度を改善するため、又は反応収率を改善するために、反応が実行される流体に添加剤を添加することが有利であり得る。このような添加剤は、塩又は有機分子、例えば、グアニジウム塩酸塩、尿素、ドデカ硫酸ナトリウム又はＴｗｅｅｎであり得る。しかしながら、例えば、ＹがＬｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）などである実施形態において、完全に水性の反応媒体中でもこのような添加剤を用いずに良好な結果が達成された。

反応は、完全に水性の液体中、又は水と、水混和性の共溶媒、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル−ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、エーテル、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２−メチル−テトラヒドロフラン（Ｍｅ−ＴＨＦ）若しくは１，２−ジメトキシエタン、又は（ハロゲン化）アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、又はこれらの有機溶媒の混合物との混合物中で実行され得る。サブチリシンＢＰＮ’変異体の安定性と、ペプチド基質の溶解度とに依存して、共溶媒の量は、好ましくは７０ｖｏｌ％未満、より好ましくは６０ｖｏｌ％未満、さらにより好ましくは５０ｖｏｌ％未満、最も好ましくは４０％未満である。

原則として、使用されるリガーゼが十分な活性及び安定性を示す温度が選択される限り、酵素断片縮合の間の温度は重要ではない。このような温度は、ルーチン的に決定することができる。一般に、温度は、少なくとも−１０℃、特に少なくとも０℃、又は少なくとも１０℃であり得る。一般に、温度は、７０℃以下、特に６０℃以下、又は５０℃以下であり得る。最適な温度条件は、特定の酵素断片縮合のための特定のリガーゼに対して、共通の一般知識及び本明細書で開示される情報に基づくルーチン的な実験を通して当業者により容易に特定することができる。一般に、温度は、２０〜５０℃の範囲であるのが有利である。

本発明はさらに、断片縮合によるペプチドの酵素カップリングを含む方法においてペプチドの合成の際に保護基を提供するためのエドマン型の薬剤の使用に関する。したがって、本発明はさらに、（ａ）式Ｐ−Ｗ_ｖ−ＡＡ_ｎ−（チオ）エステルで表されるペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、式ＡＡ_ｍで表されるペプチド求核剤とを酵素的にカップリングさせることを含むペプチドの合成方法に関し、このカップリングは、リガーゼ、好ましくは、本明細書中の他の箇所に記載されるようなサブチリシンＢＰＮ’変異体又は相同体によって触媒される。

本明細書中、Ｐは、上記で定義したようにエドマン型保護基、好ましくはチオカルバモイル基を表す。ペプチドのＮ末端へのＰのカップリングは、通常は弱アルカリ性条件、例えば約ｐＨ８で、前記Ｐに対して知られているエドマン型の方法論に基づいて、それ自体知られている方法で達成される。本明細書中、ｖは、少なくとも１、通常好ましくは１〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは１、２又は３、最も好ましくは１の整数であり、ｖはアミノ酸残基Ｗの数を表し、ここで、各Ｗは同じであっても異なっていてもよく、好ましくは、上記のように定義される通りである。各ＡＡはアミノ酸残基を表し、ｎは、ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルのアミノ酸残基の数を表す整数であり、ｍは、ペプチド求核剤のアミノ酸残基の数を表す整数である。通常、ｎ及びｖの合計は、リガーゼによる認識を可能にするために少なくとも４である。好ましくは、ｎは、３〜２００の範囲、特に３〜５０の範囲、より具体的には３〜２５の範囲である。特定の実施形態では、ｎは少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５又は少なくとも２０である。好ましくは、ｍは、３〜２００の範囲、特に５〜５０の範囲、より具体的には８〜３０の範囲である。特定の実施形態では、ｍは少なくとも４、少なくとも１０、少なくとも１５又は少なくとも２０である。

カップリング生成物Ｐ−Ｗ_ｖ−ＡＡ_ｎ−ＡＡ_ｍは切断反応を受け、ペプチドＷ_ｖ−１−ＡＡ_ｎ−ＡＡ_ｍが形成される。通常、切断は、酸性条件下で達成される。ｖ−１＞０の場合、その後にペプチドＷ_ｖ−１−ＡＡ_ｎ−ＡＡ_ｍのＮ末端位置において基ＰがＷにカップリングされ、Ｐ−Ｗ_ｖ−１−ＡＡ_ｎ−ＡＡ_ｍを形成し、その後にＰ−Ｗが切断される。これは次に、式ＡＡ_ｎ−ＡＡ_ｍで表されるペプチドが得られるまで繰り返される。

したがって、本発明は、配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むペプチドを合成するための方法に関し、式中、
− Ｘは、Ａｌａ又はα−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）残基であり、
− ＹはＬｙｓであり、このＬｙｓは、遊離側鎖ε−アミノ基（すなわち、非誘導体化リジン残基）を有するか、或いはそのＬｙｓ側鎖ε−アミノ基は保護基によって保護されているか、或いはそのＬｙｓ側鎖ε−アミノ基はアミノ酸又は別の官能基によって官能化されており、
− Ｚは、Ａｒｇ又はＬｙｓであり、
本方法は、
（ｃ）配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む、第１のペプチドＣ末端エステル又はチオエステル断片と、
（ｄ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むＮ末端非保護アミンを有する第２のペプチド求核剤断片と
を酵素的にカップリングさせることを含み、この酵素カップリングはリガーゼによって触媒され、前記リガーゼは、サブチリシンＢＰＮ’変異体、又は少なくとも８０％、若しくは８５％、若しくは９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するその相同体である。好ましくは、リガーゼは、７５〜８３位に対応するアミノ酸の欠失と、突然変異Ｓ２２１Ｃと、野生型サブチリシンＢＰＮ’（成熟）のＭ２２２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ｆ１８９、Ｎ２１８、Ｅ１５６、Ｇ１６６及びＮ６２に対応するアミノ酸位置における１つ又は複数のさらなる突然変異、好ましくは少なくとも３つのさらなる突然変異、特に５〜８個のさらなる突然変異（これらのうち、最も好ましくは、１つの突然変異はＰ２２５におけるものである）とを有するサブチリシンＢＰＮ’変異体である。

特に有利な実施形態では、本発明に従う方法で使用されるリガーゼは、サブチリシンＢＰＮ’変異体、又は配列番号１４と少なくとも８０％、若しくは８５％、若しくは９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するその相同体であり、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、及びＱ２７１Ｅが含まれ、任意選択的にＨｉｓタグが含まれる。

別の好ましい実施形態では、本発明に従う方法で使用されるリガーゼは、配列番号３を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体、又は少なくとも８０％、若しくは８５％、若しくは９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するその相同体であり、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ｎ６２Ａ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｎ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｆ１８９Ｗ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｎ２１８Ｄ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅが含まれ、任意選択的にＨｉｓタグが含まれる。

配列番号１４は、Ｃａ^２＋結合ループの欠失、Ｓ２２１Ｃ及びさらなる突然変異を有する、本発明に従う（使用のための）サブチリシンＢＰＮ’変異体を示す。Ｈｉｓタグは精製を容易にするために包含されたものであり、リガーゼ活性のために必要なものではない。

また記載されるリガーゼの全て、好ましくは、配列番号１４及び配列番号３によって指定されるもの、並びに少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するこれらの相同体も本発明の実施形態である。

好ましい実施形態では、本方法はさらに、ＹがＬｙｓであり、その側鎖ε−アミノ基が、γ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ及びＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ（式中、Ｐａｌはパルミトイルであり、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡは−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチル−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルである）からなる群から選択される官能基によって官能化されることを特徴とする。

さらにより好ましい実施形態では、前記Ｙは、Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）、Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）、Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）又はＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）である。

「ペプチド断片」又は「断片」という用語は、定義された配列を有するより長いペプチドに関して、部分的なアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。

本発明は、以下の実施例によってこれから説明されるが、それらに限定されるものではない。

リガーゼの産生
突然変異誘発、クローニング及び発現
配列番号１は、サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸−１０７〜２７５をコードする野生型遺伝子を示す。ここで、アミノ酸−１０７〜−１をコードするコドンが存在する。これらのアミノ酸は、完全成熟の際に切断除去されるシグナル配列、プレ配列及びプロ配列を含む。配列番号２は、成熟野生型サブチリシンＢＰＮ’（すなわち、アミノ酸−１０７〜−１を有さない）を示す。実施例のために使用されるリガーゼは、配列番号３に示される通りであった。成熟野生型サブチリシンＢＰＮ’と比べて、このリガーゼは、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ｎ６２Ａ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｎ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｆ１８９Ｗ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｎ２１８Ｄ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、及びＱ２７１Ｅを有した。さらに、高速且つ効率的な精製を促進するために、配列番号３で示されるようにアミノ酸２７５の後にＣ末端Ｈｉｓタグが取り付けられる。対応するアミノ酸配列は、サブチリシンＢＰＮ’の番号付けスキームに従って番号付けされる。したがって、使用されるリガーゼに対してサブチリシンＢＰＮ’の番号付けを維持するために、番号付けは、７４から８３まで飛ばされる。

以下の合成実施例のために使用されるリガーゼをコードする遺伝子は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た。ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩ部位ベースのベクターを用いて、遺伝子をｐＵＢ−１１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＢＥＳ）中にクローニングした（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによる）。シャトルベクター中で、遺伝子の発現はａｐｒＥプロモーターの制御下にある。ベクターは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の複製のｐＵＢ ｏｒｉ及びカナマイシン耐性マーカーを含有していた。またベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持のために複製のＣｏｌＥ１ ｏｒｉ及びアンピシリン耐性マーカーも含有していた。得られたプラスミドｐＢＥＳ−リガーゼＨＩＳを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０において増殖させ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＸ４９３５中に形質転換した（ｔｒｐＣ２ ｍｅｔＢ１０ ｌｙｓ−３ ΔｎｐｒＥ ΔａｐｒＥ）。

リガーゼの産生及び精製
対象のサブチリシン変異体遺伝子を有するプラスミドを含有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の単一微生物コロニーを、振とうインキュベーター中３７℃において、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含む５ｍＬのＬＢ中に播種した。抗生物質（カナマイシン１０μｇ／ｍＬ）及びアミノ酸（１００ｍｇ／ＬのＴｒｐ、１００ｍｇ／ＬのＭｅｔ及び１００ｍｇ／ＬのＬｙｓ）を補充した３０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈに、０．６ｍＬの一晩培養物を添加した。振とうインキュベーター（２００ｒｐｍ）中で細胞を３７℃で４８時間成長させた。遠心分離（１５分、４，０００ｒｐｍ、４℃）により細胞を回収した。培地（３０ｍＬ）をデカントし、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒユニット（１５ｍＬ、１０ｋＤａのＭＷカットオフ）において２回の遠心分離ステップ（１５分、４０００ｒｐｍ、４℃）で濃縮した。次に、３回の洗浄／濃縮ステップ（１４ｍＬの緩衝液Ａ、１０分、４，０００ｒｐｍ、４℃）において、濃縮した培地（０．５ｍＬ）を緩衝液Ａ（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ）と交換した。Ｈｉｓタグ精製のために、Ｔａｌｏｎ樹脂（２．５ｍＬ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をプラスチックカラムカートリッジに添加した。樹脂を２０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、２０ｍＬの緩衝液Ａにより平衡化した。粗酵素をカラムに負荷し、５ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。１５ｍＬの緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）を用いて酵素を溶出させた。溶出物を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ（１５ｍＬ、１０ｋＤａのＭＷカットオフ）において遠心分離（１５分、４０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮し、緩衝液を３回の洗浄／濃縮ステップ（１５ｍＬの緩衝液、１０分、４，０００ｒｐｍ、４℃）で２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５に交換した。

タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、酵素濃度は、国際公開第２０１６０５６９１３（Ａ１）号パンフレットに記載されるように決定した。純度は９０％超であった。約２ｍｇ／ｍＬの得られた酵素を含有する得られた水溶液（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５）をオリゴペプチド断片縮合のためにそのまま使用した。

酵素断片縮合の実施例
材料及び方法
他に記載されない限り、化学物質は商業的供給源から入手し、さらに精製することなく使用した。全ての酵素断片縮合において、配列番号３のリガーゼを使用した。分析ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈにおいて、逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、粒径５μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）を用いて４０℃で実施した。ＵＶ検出は、ＵＶ−ＶＩＳ２０４リニアスペクトロメータを用いて２２０ｎｍで実施した。勾配プログラムは、０〜２５分の５％から９８％の溶離液Ｂの直線的勾配傾斜と、２５．１〜３０分の５％の溶離液Ｂとであった（溶離液Ａ：Ｈ_２Ｏ中０．５ｍＬ／Ｌのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）、溶離液Ｂ：アセトニトリル中０．５ｍＬ／ＬのＭＳＡ）。流量は、０〜２５．１分まで１ｍＬ／分、２５．２〜２９．８分まで２ｍＬ／分であり、次に３０分で停止させるまで１ｍＬ／分に戻した。注入容積は１０μＬであった。分取ＨＰＬＣは、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｅｐＳｔａｒシステムにおいて、固定相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、粒径１０μｍ、２５０ｘ５０ｍｍ）を用いて実施した。ＬＣ−ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ液体クロマトグラフにおいて、逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、粒径５μｍ、１５０ｘ４．６ｍｍ）を用いて４０℃で実施した。ＵＶ検出及び勾配プログラムは、分析ＨＰＬＣについて記載した通りであった。分子量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６１３０四重極ＬＣ／ＭＳシステムを用いて決定した。

プロトコル１：Ｆｍｏｃ−グリコール酸の合成
ｔｅｒｔ−ブチル２−ヒドロキシ−アセテート（２．５ｇ）を、ピリジン（１５ｍｌ）及びジクロロメタン（ＤＣＭ、３０ｍｌ）の混合物中に溶解させた。次に、乾燥ＤＣＭ（１５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−クロリド（５ｇ）を０℃で滴下した。反応混合物を室温で２４時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をＤＣＭ（４０ｍｌ）中に再溶解させ、１Ｍの重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で２回洗浄し、塩水溶液（２０ｍｌ）で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。得られたＦｍｏｃ−グリコール酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び水（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）中に溶解させ、１２０分間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、粘性の残渣を５％の重炭酸ナトリウム溶液（１５０ｍｌ）中に再溶解させ、ジエチルエーテル（７５ｍｌ）で３回洗浄した。次に、水溶液を酢酸エチル（４５ｍＬ）と混合し、４０％のリン酸により０℃でｐＨ＝２まで酸性化した。有機層を集め、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、最終生成物Ｆｍｏｃ−グリコール酸（Ｆｍｏｃ−ＧＡ）を得た。

プロトコル２：オリゴペプチド−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨエステルの合成
１グラムの予め負荷したＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（０．８１ｍｍｏｌ／グラムの負荷）をＤＣＭ（２ｘ２分、１０ｍＬ）及びＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２ｘ２分、１０ｍＬ）で洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１／５、ｖ／ｖ、２ｘ８分、１０ｍＬ）を用いてＦｍｏｃ脱保護した。ＤＭＦ（６ｘ２分、１０ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（４５分、１０ｍＬ）中の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ、４当量）、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（４当量）及びジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、８当量）を用いてＦｍｏｃ−ＧＡ（４当量）を樹脂にカップリングさせた。ＤＭＦ（２ｘ２分、１０ｍＬ）で洗浄した後、ピペリジン／ＤＭＦ（１／５、ｖ／ｖ、２ｘ８分、１０ｍＬ）を用いて樹脂をＦｍｏｃ脱保護した。ＤＭＦ（２ｘ６０分、１０ｍＬ）中の４当量のＦｍｏｃ−Ｘｘｘ−ＯＨ、４当量のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及び０．１当量の４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を用いて第１のＦｍｏｃ保護アミノ酸をカップリングさせることにより、Ｃａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨエステルを形成した。ここで、及び本開示の他の部分において、「Ｘｘｘ」は１つのアミノ酸（以下の実施例中の配列中に示されるような変数）を表す。セマグルチド出発材料のために、市販のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ構成要素を使用した。

ＤＭＦ（６ｘ２分、１０ｍＬ）で洗浄した後、標準ＳＰＰＳプロトコルに従って、ペプチドを伸長させた（Ｗｅｎｇ Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ，ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）の混合物を用いて、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて、粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）で２回洗浄した後、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。分取ＨＰＬＣにより粗生成物を精製した後、純粋な画分を凍結乾燥させた。

上記のように、しかし予め負荷したＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｒｉｎｋ樹脂（０．６２ｍｍｏｌ／グラムの負荷）において、いくつかの代替ペプチドＣａｍ−エステル、すなわち、Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ_２、Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ_２、及びＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＮＨ_２を調製した。

プロトコル３：オリゴペプチドＣ末端酸求核剤の合成
１グラムの予め負荷したＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（０．３０ｍｍｏｌ／グラムの負荷）をＤＣＭ（２ｘ２分、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｘ２分、１０ｍＬ）で洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１／５、ｖ／ｖ、２ｘ８分、１０ｍＬ）を用いてＦｍｏｃ脱保護した。標準ＳＰＰＳプロトコルに従って、ペプチドを伸長させた（Ｗｅｎｇ Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ，ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）の混合物を用いて、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて、粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）で２回洗浄した後、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。分取ＨＰＬＣにより粗生成物を精製した後、純粋な画分を凍結乾燥させた。

プロトコル４：Ｈ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨのＰＴＣ保護
１００ｍｇのＨ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨを１０ｍＬのピリジン／水（１／１、ｖ／ｖ）中に溶解させた。この混合物に、２５ｍｇのフェニルイソチオシアネートを添加し、溶液を周囲温度で１４時間攪拌した。粗反応混合物を５０ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄した。分取ＨＰＬＣにより水層を精製した後、純粋な画分を凍結乾燥させ、ＰＴＣ−Ｇｌｙ保護ペプチドを得た。

プロトコル５：γ−Ｇｌｕ又はＰａｌ−γ−Ｇｌｕ含有ペプチドの合成
市販のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−γ−Ｇｌｕ−Ｏ^ｔＢｕ）−ＯＨ又はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−Ｏ^ｔＢｕ）−ＯＨ構成要素を用いて、一般的なプロトコル３に従った。

プロトコル６：セマグルチド断片Ｈ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨの合成
市販のＦｍｏｃ−^２０Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ及びＢｏｃ−^１２Ｓｅｒ（^ｔＢｕ）−ＯＨ構成要素を用いて、一般的なプロトコル３に従った。Ｂｏｃ−１２−３１−Ｗａｎｇ断片のＳＰＰＳの後、１０ｍＬのＴＩＳ／ＴＦＡ／ＤＣＭ（１／１／４８、ｖ／ｖ／ｖ、３ｘ１５分）を用いてＭｔｔ保護基を除去した。Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨ（２回）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−Ｏ^ｔＢｕ、及び１７−カルボキシヘプタデカノイル−Ｏ^ｔＢｕのカップリングのために標準ＳＰＰＳ手順を使用した。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）の混合物を用いて、樹脂からの切断及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を用いて、粗ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離によって回収し、ＭＴＢＥ／ｎ−ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）で２回洗浄した後、アセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。分取ＨＰＬＣにより粗生成物を精製した後、純粋な画分を凍結乾燥させた。

実施例１（参照）：
１３−ｍｅｒ＋１８−ｍｅｒアプローチを用いる、リラグルチド前駆体Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨの酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、６ｍｇのＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び９ｍｇのＨ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを８００μＬの２Ｍの塩化グアニジウム水中に溶解させた。この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、４ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．３に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

９０分後に、全てのＣａｍエステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは１４面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−ＯＨは８６面積％であった。

生成物Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨは、分取ＨＰＬＣと、その後の純粋な画分の凍結乾燥とによって得ることができた。

実施例２（参照）：
９−ｍｅｒ＋２２−ｍｅｒアプローチを用いる、リラグルチド前駆体Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨの酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、６ｍｇのＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び１０ｍｇのＨ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを８００μＬの２Ｍの塩化グアニジウム水中に溶解させた。この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、４ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．３に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物をアセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

３００分後に、全てのＣａｍ−エステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは８面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−ＯＨは９２面積％であった。

生成物Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨは、分取ＨＰＬＣと、その後の純粋な画分の凍結乾燥とによって得ることができた。

実施例３：１１−ｍｅｒ＋２０−ｍｅｒアプローチを用いる、Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨの酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、６ｍｇのＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び１０ｍｇのＨ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを８００μＬの２Ｍの塩化グアニジウム水中に溶解させた。この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、４ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．３に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

１８０分後に、全てのＣａｍ−エステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは９６面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−ＯＨは４面積％であった。

生成物Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨは、分取ＨＰＬＣと、その後の純粋な画分の凍結乾燥とによって得ることができた。

したがって、本発明に従う方法は予想外に、Ｃ末端（チオ）エステル及びペプチド求核剤のためのカップリング部位がＨ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨのＣ末端又はＮ末端への２つのアミド結合である比較方法における収率よりもはるかに高い収率で、所望のカップリング生成物（すなわち、Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨ、^２０Ｌｙｓにおける誘導体化を伴わないリラグルチドのアミノ酸配列を有するペプチド）を提供することが示される。

実施例４：１１−ｍｅｒ＋２０−ｍｅｒアプローチを用いる、ＰＴＣ−Ｇｌｙ−リラグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ）］−ＯＨの酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、６ｍｇのＰＴＣ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び１０ｍｇのＨ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを８００μＬの２Ｍの塩化グアニジウム水中に溶解させた。

この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、４ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．３に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

１８０分後に、全てのＣａｍ−エステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物ＰＴＣ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは９３面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＰＴＣ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＨは７面積％であった。

生成物ＰＴＣ−Ｇｌｙ−リラグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ）］−ＯＨは、分取ＨＰＬＣと、その後の純粋な画分の凍結乾燥とによって得ることができた。

実施例５：実施例４からのＰＴＣ−Ｇｌｙ−リラグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ）］−ＯＨ前駆体を用いる、Ｈ−リラグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）］−ＯＨの合成
２ｍｇのＰＴＣ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ −^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ −^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを５００μＬの水及び５００μＬのピリジン中に溶解させた。この溶液に、２ｍｇのパルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｐａｌ−ＯＳｕ）を添加し、混合物を周囲温度で５時間反応させた後、溶媒を真空で蒸発させた。ＰＴＣ−Ｇｌｙ基を切断（脱保護）するために、粗生成物ＰＴＣ−Ｇｌｙ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを水中５ｖｏｌ％のトリフルオロ酢酸中に溶解させた。

完了（１５分）後に、生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ −^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨが得られ、これを分取ＨＰＬＣにより精製した後、純粋な画分を凍結乾燥させた。

実施例６：１１−ｍｅｒ＋２０−ｍｅｒアプローチを用いる、Ｈ−リラグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）］−ＯＨ（Ｐａｌ＝パルミトイル）の酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、６ｍｇのＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び１０ｍｇのＨ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを９５０μＬの水中に溶解させた。この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、３ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．１に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

１８０分後に、全てのＣａｍ−エステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは９５面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＨは５面積％であった。

この実施例は、本発明が、単一の酵素カップリングステップにおいて高収率のリラグルチドの直接合成を可能にすることを示す。

いくつかの代替のペプチドＣａｍ−エステル、すなわち（１）Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨ_２、（２）Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ_２、及び（３）Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＮＨ_２を使用することを除いて、上記と同一のライゲーション反応を実施した。一般に、反応は、Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１８０分）エステルの場合よりも速く進行し、（１）の場合は８０分後、（２）の場合は１００分後、及び（３）の場合は８５分後に完全な転化が得られた。

実施例７：酵素的に合成された実施例３の前駆体Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨからのＨ−リラグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）］−ＯＨの合成
米国特許第６４５１９７４Ｂ１号明細書に記載されるプロトコルを用いて、前駆体Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨに、Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ部分をカップリングさせて、生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを得た。

実施例８：１１−ｍｅｒ＋２０−ｍｅｒアプローチを用いる、Ｈ−セマグルチド−１〜３１−［^２０Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）］−ＯＨの合成
ＨＰＬＣバイアル中で、６ｍｇのＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｉｂ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び１０ｍｇのＨ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを９５０μＬの水中に溶解させた。この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、３ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．１に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

１８０分後に、全てのＣａｍ−エステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｉｂ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは９６面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＨは４面積％であった。

この実施例は、本発明が、単一の酵素カップリングステップにおいて高収率のセマグルチドの直接合成を可能にすることを示す。

実施例９：配列番号１４の酵素変異体と共に１１−ｍｅｒ＋２０−ｍｅｒアプローチを用いる、Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨの酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、１０ｍｇのＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ及び１０ｍｇのＨ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨを５００μＬの５０ｍＭのトリシン緩衝液ｐＨ９．０中に溶解させた。３ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．３に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

２４０分後に、全てのＣａｍ−エステル出発材料が消費され、生成物及び加水分解ピークを積分した。ライゲーション生成物Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨは９２面積％であり、加水分解されたＣａｍ−エステルＨ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＨは８面積％であった。

生成物Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨは、分取ＨＰＬＣと、その後の純粋な画分の凍結乾燥とによって得ることができた。

実施例１０：配列番号３を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体（Ｃ２２１Ｓ突然変異）から誘導されるセリンエンドプロテアーゼを用いるリラグルチドの酵素合成に適した断片の同定
１ｍｇのリラグルチド１〜３１（２０位のリジンにＰａｌ−γ−Ｇｌｕを有するもの及び有さないもの）を１ｍＬのトリシン緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．０）中に溶解させた。この混合物に、１μＬのエンドプロテアーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温で攪拌した。

ＬＣ−ＭＳ分析を用いて３０分ごとにサンプルを分析することにより、加水分解活性をモニターした。

両方のペプチドについて、アミノ酸２５とアミノ酸２６との間の結合において最高の加水分解活性（断片１〜２５＋２６〜３１をもたらす）が得られ、その後に、アミノ酸５と６との間の結合における加水分解活性（断片１〜５＋６〜３１をもたらす）が続いた。比較例１１において２５−ｍｅｒ＋６−ｍｅｒアプローチの良好性を試験した。

実施例１１：２５−ｍｅｒ＋６−ｍｅｒアプローチ（参照）、５−ｍｅｒ＋２６−ｍｅｒアプローチ（参照）、又は１１−ｍｅｒ＋２０−ｍｅｒアプローチ（本発明に従う）を並行して使用する、リラグルチド前駆体Ｈ−リラグルチド−１〜３１−ＯＨの酵素合成
ＨＰＬＣバイアル中で、３μｍｏｌのエステル（１：Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１−Ｓｅｒ^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２：Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ、又は３：Ｈ−^１Ｈｉｓ−^２Ａｌａ−^３Ｇｌｕ−^４Ｇｌｙ−^５Ｔｈｒ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−ＯＣａｍ−Ｌｅｕ−ＯＨ）と、２μｍｏｌのアミン（１：Ｈ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨ、２：Ｈ−^６Ｐｈｅ−^７Ｔｈｒ−^８Ｓｅｒ−^９Ａｓｐ−^１０Ｖａｌ−^１１Ｓｅｒ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨ、又は３：Ｈ−^１２Ｓｅｒ−^１３Ｔｙｒ−^１４Ｌｅｕ−^１５Ｇｌｕ−^１６Ｇｌｙ−^１７Ｇｌｎ−^１８Ａｌａ−^１９Ａｌａ−^２０Ｌｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ）−^２１Ｇｌｕ−^２２Ｐｈｅ−^２３Ｉｌｅ−^２４Ａｌａ−^２５Ｔｒｐ−^２６Ｌｅｕ−^２７Ｖａｌ−^２８Ａｒｇ−^２９Ｇｌｙ−^３０Ａｒｇ−^３１Ｇｌｙ−ＯＨ）とを９５０μＬの水中に溶解させた。この混合物に、５０μＬの１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ９．０を添加し、３ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．１に調整した。続いて、１０μＬのＴＣＥＰ溶液（水中１００ｍｇ／ｍＬ）及び１００μＬのリガーゼ（配列番号３に従う）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を周囲温度で反応させた。１５分ごとに、１０μＬの反応混合物を取り出し、アセトニトリル／水（２／１、ｖ／ｖ）中５ｖｏｌ％のＭＳＡ ９８０μＬの中でクエンチし、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。

１８０分後に、３つの反応のそれぞれについて、Ｃａｍ−エステル出発材料が消費された。得られた生成物の混合物のサンプルを分析し、生成物及び加水分解ピークを積分した。１のライゲーション生成物は７２面積％であり、２のライゲーション生成物は５３面積％であり、３のライゲーション生成物は９５面積％であった。

配列
配列番号１：サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸−１０７〜２７５をコードする野生型遺伝子
ＥＮＡ｜Ｋ０２４９６｜Ｋ０２４９６．１ Ｂ．サブチリシンＢＰＮ’バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）

配列番号２：野生型サブチリシンＢＰＮ’（成熟）
＞ＳＵＢＴ＿ＢＡＣＡＭサブチリシンＢＰＮ’バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）成熟１〜２７５
＞ｓｐ｜Ｐ００７８２｜１０８−３８２

配列番号３：突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ｎ６２Ａ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｎ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｆ１８９Ｗ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｎ２１８Ｄ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、及びＱ２７１Ｅ、並びにＨｉｓタグを有するサブチリシンＢＰＮ’変異体

配列番号１４：突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、及びＱ２７１Ｅ、並びにＨｉｓタグを有するサブチリシンＢＰＮ’変異体

Claims (17)

1. （ａ）配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含む第１のペプチド断片を含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含む第２のペプチド断片を含むＮ末端非保護アミンを有するペプチド求核剤と
   を酵素的にカップリングさせることを含む、配列Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むペプチドを合成するための方法であって、
   − Ｘが、Ａｌａ又はα−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）残基であり、
   − ＹがＬｙｓであり、前記Ｌｙｓが遊離側鎖ε−アミノ基を有するか、或いは前記Ｌｙｓの側鎖ε−アミノ基が保護基によって保護されているか、或いは前記Ｌｙｓの側鎖ε−アミノ基がアミノ酸又は別の官能基、特に、γ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ及びＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ［式中、Ｐａｌはパルミトイルであり、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡは−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチル−２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルである］からなる群から選択される官能基によって官能化されており、
   − ＺがＡｒｇ又はＬｙｓであり、
   前記酵素カップリングがリガーゼによって触媒される、方法。
2. 前記合成されるペプチドがリラグルチドである、請求項１に記載の方法。
3. （ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＬｙｓ（Ｐａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）を含むペプチド求核剤と
   の、リガーゼにより触媒される酵素カップリングを含む、請求項２に記載の方法。
4. （ａ）式Ｐ−Ｗ_ｖ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステル（式中、Ｐは保護基であり、ｖは少なくとも０、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１の値を有する整数であり、各Ｗは独立して、同じ又は異なるアミノ酸残基を表す）によって表されるペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを含むペプチド求核剤と
   の、リガーゼにより触媒される酵素カップリング、及びその後に前記Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）にパルミトイル基（Ｐａｌ）を提供することを含む、請求項２に記載の方法。
5. （ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、Ｙは，遊離ε−アミノ側鎖を有するリジン残基である）を含むペプチド求核剤と
   の、リガーゼにより触媒される酵素カップリング、及びその後に前記アミノ側鎖にＰａｌ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨを提供することを含む、請求項２に記載の方法。
6. 前記合成されるペプチドがセマグルチドである、請求項１に記載の方法。
7. （ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ）である）を含むペプチド求核剤と
   の、リガーゼにより触媒される酵素カップリングを含む、請求項６に記載の方法。
8. （ａ）式Ｐ−Ｗ_ｖ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステル（式中、Ｐは保護基であり、ｖは少なくとも０、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１の値を有する整数であり、各Ｗは独立して、同じ又は異なるアミノ酸残基を表す）によって表されるペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、ＹはＬｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）を含むペプチド求核剤と
   の、リガーゼにより触媒される酵素カップリング、及びその後に前記Ｌｙｓ（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）に１７−カルボキシヘプタデカノイル基を提供することを含む、請求項６に記載の方法。
9. （ａ）配列Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（チオ）エステルを含むペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、
   （ｂ）配列Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（式中、Ｙは遊離側鎖を有するリジン残基である）を含むペプチド求核剤と
   の、リガーゼにより触媒される酵素カップリング、及びその後に前記Ｌｙｓのε−アミノ側鎖にＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ−γ−Ｇｌｕ−Ｎ−１７−カルボキシヘプタデカノイル−ＯＨ基を提供することを含む、請求項６に記載の方法。
10. 前記合成されるペプチドがＧＬＰ−１である、請求項１に記載の方法。
11. ｖが１である、請求項４又は８に記載の方法。
12. 前記リガーゼがサブチリシンＢＰＮ’変異体又はその相同体であり、これらが、配列番号２で表されるサブチリシンＢＰＮ’又はその相同体配列と比較して、以下の突然変異：
    − ７５〜８３位に対応するアミノ酸の欠失；
    − Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異であって、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである突然変異；
    − 好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置における突然変異；
    を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２で表されるサブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記リガーゼが、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置における突然変異の群から選択される１〜１３個、特に６〜１２個、より具体的には８〜１１個の突然変異を含み、好ましくは、前記突然変異の１つ又は複数、より好ましくは前記突然変異の少なくとも６個、最も好ましくは前記突然変異の少なくとも１２個が、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅに対応する位置の群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルの（チオ）エステルがＣａｍ−ＡＡ１−ＡＡ２−エステルであり、ここで、ＡＡ１が、非保護側鎖官能基を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファン単位を表し、ＡＡ２が、非保護側鎖官能基を有するアルギニン又はリジン単位を表す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記リガーゼが、配列番号３を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体、若しくは配列番号１４を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体、又は少なくとも８０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するこれらの相同体であり、任意選択的にＨｉｓタグを含む、請求項１３に記載の方法。
16. 任意選択的にＨｉｓタグを含み、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ｎ６２Ａ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｎ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｆ１８９Ｗ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｎ２１８Ｄ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、Ｑ２７１Ｅを含む配列番号３を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体，又は少なくとも８０％、若しくは８５％、若しくは９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するその相同体。
17. 任意選択的にＨｉｓタグを含み、突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Δ７５−８３、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｓ２２１Ｃ、Ｍ２２２Ｐ、Ｐ２２５Ｎ、Ｔ２５４Ａ、及びＱ２７１Ｅを含む配列番号１４を有するサブチリシンＢＰＮ’変異体、又は少なくとも８０％、若しくは８５％、若しくは９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有するその相同体。