CN111819191A - 利拉鲁肽、索马鲁肽和glp-1的化学酶促合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于合成包含序列His‑X‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Y‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Z‑Gly‑Arg‑Gly的肽的方法，所述方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一肽片段包含序列His‑X‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑(硫)酯，和(b)具有包含第二肽片段的N‑末端未保护的胺的肽亲核试剂，所述第二肽片段包含序列H‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Y‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Z‑Gly‑Arg‑Gly；其中X是Ala或α‑氨基‑异丁酸(Aib)残基，Y是Lys，所述Lys具有游离侧链ε‑氨基基团，或所述Lys的侧链ε‑氨基基团被保护基团保护，或所述Lys的侧链ε‑氨基基团被氨基酸或另一种官能团官能化，Z是Arg或Lys。

Description

利拉鲁肽、索马鲁肽和GLP-1的化学酶促合成
本发明涉及一种方法，其中在连接酶的存在下以酶促方式进行肽片段偶联以合成包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly的肽。
包含氨基酸序列H-His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly-OH的几种肽是本领域所熟知的促胰岛素肽。这些肽包括GLP-1、利拉鲁肽(Liraglutide)和索马鲁肽(Semaglutide)。
人GLP-1(胰高血糖素样肽-1)具有式H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH。
利拉鲁肽是在上述序列的位置20中的赖氨酸的ε-氨基基团上被Glu间隔的棕榈酸取代的Arg20-GLP-1类似物。因此，利拉鲁肽具有式H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH(也参见图1，所有手性氨基酸残基都是L-氨基酸残基)。在Lys(Pal-γ-Glu)中，Lys残基的ε-氨基-基团与γ-Glu羧基侧链链接，并且Glu被N-棕榈酰化。
索马鲁肽具有式H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。本文的AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基是N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基(也参见图2，所有手性氨基酸残基都是L-氨基酸残基)。
这些肽可以例如在II型糖尿病的治疗中使用。此外，例如，利拉鲁肽可以作为在成人患者中用于慢性体重管理的减少的热量饮食和增加的体力活动的注射用辅助剂在肥胖症的治疗中使用。
本领域已知合成肽(包括寡肽，像GLP-1、利拉鲁肽和索马鲁肽)的方法。在WO2007147816和WO 2016/046753中描述了合成促胰岛素肽(例如GLP-1和其类似物)的方法。在WO 2016/046753的“发明背景”中，给出了合适的制备方法(特别是重组方法)的详细描述，在固体支持物上的顺序合成，利拉鲁肽的固相合成，包括将含有氨基酸残基(1-10)的肽序列与含有氨基酸残基(11-31)的序列偶联，或利拉鲁肽的固相合成，包括制备含有氨基酸残基(1-4)、(15-16)和(17-31)的肽序列，在与含有氨基酸序列(1-4)的肽偶联之前，将含有氨基酸残基(15-16)的肽与(17-31)偶联，并且顺序添加氨基酸。
根据WO 2016/046753，在包括液相或固相肽合成或其组合的方法中制备GLP-1肽，其中该方法包括最终的偶联步骤，其中将至少两个片段在末端Gly残基处偶联，并且其中至少一个片段是通过偶联至少两个亚片段制备的。利拉鲁肽特别是通过偶联His-Ala-Glu-Gly和Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OX)-Glu-Ph e-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH获得的。在此序列中，X表示H或Gluα-羧酸基团的保护基团。
如从WO 2016/046753的“发明背景”得出，仍然需要发现新的用于合成GLP-1蛋白质(例如利拉鲁肽或索马鲁肽)的方法，以提供更好、更有效和/或更便宜的方法，或提供可以更易于纯化的产物以获得具有改善的产率和纯度的产物。特别地，这表示需要提供特别是在工业规模上制备GLP-1和类似物(例如利拉鲁肽或索马鲁肽)的方法，该方法不应要求以高产率而使用有毒或其他不良试剂，并且可以易于纯化以获得高纯度的产物。
在WO 2007147816和WO 2016/046753中均未建议GLP-1或其类似物(像利拉鲁肽或索马鲁肽)的酶促合成，其均集中于化学合成。
然而，如以上引用的现有技术中所讨论的，肽的完全化学合成具有缺点。此外，由于副反应，长于15个氨基酸的肽通常很难在固相上合成。结果是，纯化是麻烦的。因此，长于10个氨基酸的肽通常是通过以下方式合成的：侧链保护的寡肽片段的固相合成的组合，这些寡肽片段随后在溶液中经历化学缩合，例如以10+10缩合以生成20个氨基酸的肽。化学侧链保护的寡肽片段缩合的主要缺点是，在激活该酰基供体的C末端氨基酸残基后，会发生外消旋作用。相反，酶催化的肽偶联完全没有外消旋作用，并且与化学肽合成相比具有若干其他优点，例如在侧链官能团上不存在副反应。对于工业应用而言，基于动力学方法(即，使用酰基供体C末端酯)的酶促肽合成概念最具有吸引力(参见例如N.Sewald和H-D.Jakubke,“Peptides:Chemistry and Biology[肽：化学和生物学]”，第一次重印版Wiley-VCHVerlag GmbH,Weinheim[魏因海姆]2002)。
水溶液中酶促偶联的问题是水的存在趋向于促进水解而不是偶联。已经公开了关于寡肽片段在水溶液中的酶促缩合的一些报道(Kumaran等人Protein Science[蛋白质科学],2000,9,734；
Figure BDA0002672128430000031
等人Bioorg.Med.Chem[生物有机与药物化学快报].1998,6,891；Homandberg等人Biochemistry[生物化学],1981,21,3387；Komoriya等人Int.J.Pep.Prot.Res.[国际肽与蛋白质研究杂志]1980,16,433)。
Wells等人发现(US 5,403,737)，通过改变枯草杆菌蛋白酶BPN’(来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(SEQ ID NO:2))的活性位点，可以显著改善水溶液中寡肽的酶促缩合。当引入两个突变即S221C和P225A时，获得了一种枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，称为subtiligase，与野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，其合成/水解比率(S/H比率)增加了500倍。在进一步的实验中，Wells等人向subtiligase添加了另外五个突变，以使该酶更稳定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1994,91,12544)。称为stabiligase的新突变体显现对十二烷基硫酸钠(sodium dodecasulphate)和盐酸胍具有适度更多的抵抗力，但水解仍是主要的副反应。
在WO 2016/056913中，针对在水性环境中酶如subtiligase或stabiligase用于(寡核苷酸)肽合成时所遇到的不希望的高水解活性，通过提供包含特定突变的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物提供了一种解决方案。这些变体或同源物特别适合于通过偶联第一肽片段和第二肽片段来催化肽的合成，其中第一片段是肽C末端酯或硫酯，并且第二片段是具有N末端未保护的胺的肽亲核试剂。
发明人认为从WO 2007147816或WO 2016/046753中提到的肽片段开始，将酶促片段缩合应用于GLP-1、利拉鲁肽和索马鲁肽的合成。尤其是，发明人认为通过酶促片段缩合将具有氨基酸残基1-10的10-mer肽与包含利拉鲁肽、索马鲁肽或GLP-1的氨基酸残基11-31的21-mer肽偶联，其中10-mer为(硫)酯并且21-mer为亲核试剂。对于具有氨基酸残基1-10的肽C末端(硫)酯与含有氨基酸残基11-31的肽亲核试剂的偶联，发现在P1’和P2’处都存在丝氨酸对于肽亲核试剂是不利的。其他可能的缺乏有效偶联的原因可能是肽C末端(硫)酯的P4(苏氨酸)处存在非疏水氨基酸。此外，发明人试图将具有氨基酸残基1-4的肽C末端(硫)酯与含有氨基酸残基5-31的肽亲核试剂偶联，却没有成功。发明人得出结论，特别是肽C末端(硫)酯的P4处存在组氨酸和/或P1处存在甘氨酸不利于有效偶联。如本申请的实施例1和2所示，发现可能在连接酶的存在下，也在水性反应介质中，通过酶促偶联来制备这些肽，但是对于基于科学考虑所设计的几种方法，产率出乎意料的低，例如认为连接酶(像枯草杆菌蛋白酶变体或其同源物)有利于C末端肽(硫)酯的偶联，所述C末端肽(硫)酯在肽C末端酯或硫酯的P4位置(从C末端起第四个氨基酸)处具有疏水氨基酸残基的C末端肽(硫)酯。尤其是，进行了这样的方法，其中通过酶促偶联13-mer C末端酯His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-OCam-Leu-OH和18-mer肽亲核试剂H-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，在枯草杆菌蛋白酶BPN’变体的存在下，制备具有利拉鲁肽的氨基酸序列的肽(‘H-利拉鲁肽-1-31-OH’)。尽管预期在C末端酯的P4位置处存在疏水性氨基酸残基(Val)使这些片段成为特别好的片段，从而以高产率制备利拉鲁肽氨基酸序列，但是以非常低的产率获得此肽(参见实施例1)。如实施例2所示，尽管预期在P4位置上存在疏水性Phe残基使这些片段成为用于酶促缩合反应的特别好的片段，但从相应的9-mer C末端酯和22-mer肽亲核试剂通过酶促制备H-利拉鲁肽-1-31-OH的产率甚至更低。
本发明的目的是提供新的酶促合成GLP-1或其类似物(特别是利拉鲁肽或索马鲁肽)的方法。通常，对于这些肽的可替代的酶促肽合成方法存在需求，特别是为了拓宽用于制备它们的工具的范围。特别地，目的是提供这样的克服上面提到的或在以上引用的现有技术中讨论的一个或多个问题的方法，更特别是提供改善的总产率或改善的选择性。
从以下的描述中可以得出本发明的主题的一个或多个其他目的。
现在已经令人惊讶地发现，通过一种方法可以满足这些目的中的一个或多个，其中GLP-1或其类似物以包含酶促合成肽的方法通过片段缩合来制备，其中将所述肽的两个特定片段在连接酶(特别是枯草杆菌蛋白酶变体或同源物)的存在下偶联。
因此，本发明涉及用于合成肽的方法，所述肽包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly，其中
-X是Ala或α-氨基-异丁酸残基(Aib)；
-Y是Lys，其中Lys具有游离侧链ε-氨基基团(即非衍生的赖氨酸残基)，或其中侧链ε-氨基基团被保护基团保护，或其被氨基酸或另一种官能团官能化；
-Z是Arg或Lys；
所述方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一肽片段包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)具有包含第二肽片段的N末端未保护的胺的肽亲核试剂，所述第二肽片段包含以下序列：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly；
其酶促偶联通过连接酶进行催化。
特别令人惊讶的是，当也在水性反应介质中进行时，根据本发明的方法允许以高产率合成目的肽(连接产物)。毕竟，在C末端(硫)酯片段的P4位置处的Ser是极性的，从科学的角度预期，这对于酶促偶联反应是不利的。
尽管在特定的实施方案中，可以使用保护基团或溶解度增强基团，但是这不需要肽片段上的任何侧链保护基团，并且不需要向所述片段的一个或两个提供官能团以增加溶解度(例如，在肽主链酰胺官能团上的2-羟基-4-甲氧基苄基酰胺基或在不参与偶联反应的各个片段的末端的极性氨基酸的肽标签)就可以完成。不需要溶解度增强基团的高S/H比率是令人惊讶的，因为肽亲核试剂的溶解度低。
在根据本发明的方法中，肽亲核试剂的Y可以是具有游离侧链ε-氨基基团(即非衍生的赖氨酸残基)的Lys。然而，本发明也允许肽亲核试剂(其中Y是侧链ε-氨基基团包含官能团的Lys)的偶联，特别是其中Y是Lysγ-Glu、Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu)、Lys(Pal-γ-Glu-OH)或Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基-OH)。特别令人惊讶的是，尽管存在此类在空间上需求很高的基团，但是使用此类肽亲核试剂实现有效的酶促偶联也是可能的。在这方面，进一步令人惊讶的是，在水性反应介质中也实现了高的合成与水解比率(S/H-比率)，同时肽亲核试剂具有高疏水性，所述疏水性通过在Lys的侧链ε-氨基基团处存在疏水基团(例如脂肪酸尾)而增强。通常，发明人发现S/H比率与亲核试剂的浓度直接相关，并且因此与亲核试剂在水溶液中的溶解度直接相关。由于存在疏水性官能团使所得分子的溶解度非常低，因此，令人惊讶的是，当将如本发明所定义的(硫)酯与肽亲核试剂(即包含11-mer肽(硫)酯和20-mer肽亲核试剂)偶联时，S/H比率仍然非常高。参考其中试图通过偶联不同的(硫)酯和肽亲核试剂(在Y位置处具有或不具有侧链官能团)来获得相同的连接产物，例如相应的9-mer(硫)酯和22-mer肽亲核试剂的方法不成功。
特别是已经发现，枯草杆菌蛋白酶BPN’变体可能与肽亲核试剂(其中Y是侧链ε-氨基基团已被氨基酸或另一种官能团官能化的Lys)偶联，如本文中其他地方进一步详细描述的。以下还将进一步详细描述其中使用肽亲核试剂(其中Y是侧链ε-氨基基团被官能化的Lys)进行偶联的方法的优选实施方案。
出于本发明的目的，“合成/水解比率”(S/H比率)是指酶促合成的(寡)肽产物的量除以其中酯或硫酯基团已经被水解的(寡)肽C末端酯或硫酯的量。对于确定S/H比率的更多细节，参考WO 2016/056913。
除非另有说明，否则术语“或”在本文中定义为“和/或”，或者其根据上下文意指“要么…要么…”。
除非另有说明，否则本文所用的术语“一个/一种”(a或an)被定义为“至少一个/至少一种”，或者根据上下文其仅指单数。
当以单数形式指代名词(例如化合物、添加剂等)时，应是指包括复数形式，除非根据上下文其应仅指单数形式。
术语“pH”在本文中用于表观pH，即用标准的校准pH电极测量的pH。
出于本发明的目的，“肽”是指由两个或更多个氨基酸构成的任何链。因此，肽通常是酰胺，至少在概念上由两个或更多个氨基羧酸分子(即氨基酸)构成，通过从一个氨基酸的羰基碳到另一个氨基酸的氮原子形成共价键同时正式失水而构成酰胺。术语“肽”通常适用于由α-氨基酸形成的结构，但肽可以包含其他氨基酸，例如一种或多种β-氨基酸和/或一种或多种γ-氨基酸。
肽的氨基酸序列称为一级结构。在一个实施方案中，肽实质上不含二级结构，并且实质上不含三级结构。
在一个实施方案中，已经合成的肽或在根据本发明的方法中待偶联的肽基本上由氨基酸残基组成。例如，GLP-1由氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，肽基本上由氨基酸单元和保护基团组成。
在另一个实施方案中，已经合成的肽或在根据本发明的方法中待偶联的肽是肽链和另一种残基的缀合物，例如脂肪酸。将这些肽称为脂肽。脂肪酸可以例如用于改变溶解度。合适的脂肪酸的实例是C8-C24饱和脂肪酸和C8-C24不饱和脂肪酸。如果需要，在肽与脂肪酸之间提供极性接头，例如以增加在水性环境中的溶解度。利拉鲁肽和索马鲁肽是肽链和脂肪酸的缀合物这样的肽。索马鲁肽在肽与脂肪酸残基之间包含极性接头。
典型地，肽(该术语包括寡肽、蛋白质和嵌合肽)包括至多约35000个氨基酸单元，特别是3-20000个氨基酸单元，更特别是4-1000或5-500个氨基酸单元。可以将根据本发明的连接酶用于合成除His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly以外的其他肽。此类肽优选地包含500个氨基酸单元或更少，特别是200个或更少，更特别是100个或更少。在特别优选的实施方案中，该合成肽包含至少10个氨基酸单元，更特别是至少15个氨基酸单元、至少25个氨基酸单元或至少40个氨基酸单元。可以在宽的范围内选择来自这种肽的片段；片段的长度可以至少是2，特别是至少是5，更特别是至少是10，其中上限由合成肽的长度来决定。
在本发明的上下文中，“寡肽”是指由2-200个氨基酸单元构成的肽，特别是由5-100个氨基酸单元构成的肽，更特别是由10-50个氨基酸单元构成的肽。
出于本发明的目的，“肽键”是指(i)一个α-氨基酸的α-氨基末端或一个β-氨基酸的β-氨基末端以及(ii)一个其他α-氨基酸的α-羧基末端或一个其他β-氨基酸的β-羧基末端之间的酰胺键。优选地，肽键在一个α-氨基酸的α-氨基末端与另一个α-氨基酸的α-羧基末端之间。
在本发明的上下文中，“氨基酸侧链”是指任何蛋白来源或非蛋白来源的氨基酸侧链。
蛋白来源的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。蛋白来源的氨基酸包括：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)。硒代半胱氨酸(Sec，U)是如下氨基酸，其结构对应于半胱氨酸，条件是硒代半胱氨酸含有硒而不是硫原子。蛋白来源的氨基酸是所述氨基酸的L-立体异构体(甘氨酸除外，其没有立体异构体形式)。
在根据本发明的方法中特别值得关注的非蛋白来源的氨基酸是2-氨基异丁酸(Aib)，其形成部分索马鲁肽的肽链。
术语“(硫)酯”在本文中用作短语“酯或硫酯”的简写。
本文使用术语“N末端保护”指示肽的N末端胺基基团(典型地N末端α-胺基基团)具有保护基团，通常至少基本上使N末端胺基基团免于与另一个肽或同一肽分子的C末端羧基基团偶联。
本文使用术语“C末端保护”指示肽的C末端羧基基团(典型地C末端α-羧基基团)具有保护基团，通常基本上使该羧基基团免于与另一个肽或同一肽分子的N末端胺基基团偶联。
如本文所用，关于蛋白质或多肽(特别是酶，例如连接酶)的术语“突变”(mutated或mutation)意指通过诱变编码这些氨基酸的核酸，野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列中的至少一个氨基酸已经被不同的氨基酸取代、插入、添加、或从该序列中缺失。诱变是本领域中熟知的方法，并且包括例如通过PCR或通过寡核苷酸介导的诱变进行的定点诱变，如Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册],第二版,第1-3卷(1989)中所述。如本文所用，关于基因的术语“突变”(mutated或mutation)意指该基因的核酸序列或其调控序列中的至少一个核苷酸通过诱变已被不同的核苷酸取代、已经被插入、已经被添加、或已经从该序列中缺失，导致功能上发生定性或定量改变的蛋白质序列的转录、或导致该基因的敲除。
在本说明书中，用于表示氨基酸取代的简写使用被取代的氨基酸的单字母氨基酸代码，其后为表示在蛋白质氨基酸序列中何处进行取代的数字。此数字是野生型氨基酸序列的氨基酸位置。因此，对于突变的氨基酸序列，此数字是对应于野生型酶中具有此数字的位置的氨基酸位置。由于在较低位置的一个或多个其他突变(添加、插入、缺失等)，实际位置不需要相同。技术人员将能够使用诸如NEEDLE之类的熟知的比对技术来确定相应的位置。该数字后面是替代其中的野生型氨基酸的氨基酸的单字母代码。例如，S221C表示在对应于位置221的位置处的丝氨酸被半胱氨酸取代。X用于表示除要取代的氨基酸以外的任何其他蛋白来源的氨基酸。例如，S221X表示在对应于位置221的位置上的丝氨酸被任何其他蛋白来源的氨基酸取代。
术语“连接酶”在本文中用于在两个肽的偶联中具有催化活性的酶，该酶通过偶联第一个肽的C末端和另一个肽的N末端来催化肽键的形成。通常，根据本发明的连接酶(方法中使用的)在关于偶联11-merHis-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯和20-mer肽亲核试剂H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly方面具有连接酶活性。
如Schechter和Berger所定义，蛋白酶(包括连接酶)中的活性位点残基由称为亚位点的连续口袋构成。每个亚位点口袋与肽底物序列中的相应残基结合，相应残基在此称为序列位置。根据此定义，底物序列中的氨基酸残基从裂解位点起向外连续编号为.-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-.(易裂键位于P1与P1’位置之间)，而活性位点中的亚位点(口袋)则相应地标记为.-S4-S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-S4'-.(Schechter和Berger,BiochemBiophys Res Commun[生物化学和生物物理学研究通讯].1967年4月20日；27(2):157-62.)。应该注意的是，并不是所有的蛋白酶都具有所有的所述亚位点。例如根据本发明，在枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物中可能不存在S3’和/或S4’口袋。
出于本发明的目的，“S1口袋、S2口袋、S3口袋和S4口袋”是指蛋白酶(特别是连接酶)的与肽酰基供体的氨基酸相互作用的氨基酸。酰基供体肽的C末端氨基酸(第一个氨基酸；P1)与蛋白酶S1口袋中的氨基酸相互作用。酰基供体肽的倒数第二个氨基酸(从C末端起的第二个氨基酸；P2)与蛋白酶的S2口袋中的氨基酸相互作用，第三个氨基酸(P3)与S3口袋相互作用，而第四个氨基酸(P4)与S4口袋相互作用。蛋白酶的S1-S4结合口袋由若干氨基酸定义，这些氨基酸在该蛋白酶的一级结构中可能很远，但在三维空间中很近。出于本发明的目的，S1’和S2’的口袋是指蛋白酶的与肽亲核试剂的N末端氨基酸相互作用的氨基酸。肽亲核试剂的N末端氨基酸与蛋白酶S1’口袋中的氨基酸相互作用。肽亲核试剂的N末端倒数第二个氨基酸与蛋白酶S2’口袋中的氨基酸相互作用。蛋白酶的S1’和S2’结合口袋由若干氨基酸定义，这些氨基酸在该蛋白酶的一级结构中可能很远，但在三维空间中很近。
当参考括号内的酶类别(EC)提及酶时，该酶类别是其中该酶基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB)提供的酶命名法被分类或可以被分类的类别，该命名法可在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/找到。未被(尚未)分类在指定的类别中但可以如此分类的其他合适的酶也被包括在内。
肽或酶的同源物通常具有与肽或酶相同的预期功能，例如能够催化相同的反应，特别是根据本发明方法的酶促偶联。
当展现出一定水平的相似度时，氨基酸或核苷酸序列被认为是同源物。无论两个同源序列是较近相关还是较远相关，用分别为高或低的“同一性百分比”或“相似度百分比”表示。
术语“同源性”、“同源性百分比”、“同一性百分比”或“相似度百分比”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此定义为，为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，对完整序列进行比对。为了优化两个序列之间的比对，可以在比较的两个序列中的任何一个中引入缺口。这种比对是在所比较序列的全长上进行的。可替代地，可以在较短的长度上，例如在约20、约50、约100或更多个核酸或氨基酸上进行比对。同一性百分比是所报告的比对区域中两个序列之间相同匹配的百分比。
序列比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成。技术人员将意识到以下事实：若干种不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison[序列比较概述]，D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编辑),Time warps,string edits and macromolecules:thetheory and practice of sequence comparison[时间扭曲、字符串编辑和大分子：序列比较的理论和实践],第1-44页Addison Wesley)。可以使用Needleman和Wunsch算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，以便比对两个序列。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48,第443-453页)。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本发明的目的，使用了来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件](2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends inGenetics[遗传学趋势],16,(6)第276-277页,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于替代矩阵。可以指定其他矩阵。用于氨基酸序列比对的可选参数是缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.5。技术人员将理解，所有这些不同的参数将产生略有不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：在比对中显示两个序列中相同氨基酸的对应位置的数量除以减去比对中缺口总数后的比对总长度。可以使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得如本文定义的同一性，并在程序的输出中将其标记为“最长同一性”。出于本发明的目的，两个序列之间的同一性(同源性)水平是根据“最长同一性”的定义来计算的，这可以通过使用程序NEEDLE来进行。
多肽序列，特别是酶序列，可以进一步用作“查询序列”，以对序列数据库进行搜索，例如以鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用BLAST程序进行此类搜索。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。BLASTP用于氨基酸序列。BLAST程序使用默认值：
-空位开放罚分：默认值＝11，用于蛋白质
-空位延伸罚分：默认值＝1，用于蛋白质
-期望值：默认值＝10
-字号：默认值＝28，用于megablast/默认值＝3，用于蛋白质
此外，查询的氨基酸序列与检索到的同源序列之间的局部同一性(同源性)程度由BLAST程序确定。然而，仅比较那些给出高于某个阈值的匹配的序列片段。因此，该程序仅为这些匹配段计算同一性。因此，以此方式计算出的同一性称为局部同一性。
术语“同源物”在本文中特别用于如下肽、更特别是酶，其和与同源肽或酶进行比较的肽、特别是酶具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。显然，序列同一性将小于100％。序列同一性的百分比将取决于突变的数量和与同源物进行比较的肽(酶)的长度。在“最长同一性”比对中，不考虑缺失。
出于本发明的目的，“缩合”是指在肽的C末端羧基官能团与亲核试剂(特别是另一种肽)的N末端胺官能团之间形成新的酰胺键。
术语肽的“类似物”特别用于作为所述肽的结构类似物和/或功能类似物的肽。功能类似物具有相同的体内靶标(例如细胞膜上的相同靶受体)；结构类似物在氨基酸序列上具有高度相似度。肽的功能类似物可以具有相对较低的氨基酸序列同一性，例如在整个氨基酸序列上具有约50％或更小的氨基酸序列同一性，但与如下肽具有较高的序列同一性(并且因此具有较高的结构相似度)，在一段氨基酸序列中例如在N末端部分附近或C末端部分附近所述功能类似物是该肽的类似物。结构类似物特别包括与如下肽的氨基酸序列具有至少60％、更特别至少70％、优选至少80％、更优选至少90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的氨基酸序列，这样的肽是该肽的类似物。出于清楚和简明描述的目的，本文将特征描述为相同或分开的实施方案的一部分，但是，应当理解，本发明的范围可以包括具有所描述的全部或一些特征的组合的实施方案。本文中没有特别定义的术语如WO 2016/056913所定义，或者，如果未在其中定义，则根据公知常识使用。
肽C末端酯或硫酯包含第一肽片段，所述第一肽片段包含氨基酸序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，其中X是Ala或α-氨基-异丁酸单元(Aib)。已经用第一肽片段获得了特别好的结果，其中这是第一肽片段的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，将N末端用至少一个氨基酸(Wv，参见下文)(例如Gly或Phe)延伸，并且延伸肽的N末端具有保护基团，典型地是埃德曼(Edman)型保护基团(还参见下文)。如果需要，可以在N末端提供肽标签，例如以改变在反应介质中的溶解度。然而，这通常不需要，尤其是在水性反应介质中不需要。
肽C末端酯或硫酯通常是活化的(硫)酯，即其含有可以参与酶偶联反应的羧基酯或羧基硫酯基团。原则上，可以使用任何(取代或未取代的)烷基或(取代或未取代的)芳基(硫)酯。可以参与酶偶联反应的(硫)酯的典型实例是甲基-、乙基、丙基-、异丙基-、苯基-、苄基(例如对-羧基-苄基-)、2,2,2-三氯乙基-、2,2,2-三氟乙基-、氰基甲基-和羧酰胺甲基-(硫)酯。
用由式肽-(C＝O)-O-CX1X2-C(＝O)N-R1R2表示的羧酰胺甲基型酯(Cam酯)已经获得了特别好的结果。在本文中，每个X1和X2独立地表示氢原子或烷基。当X1和X2均为氢原子时(肽-(C＝O)-O-CH2-C(＝O)N-R1R2)，已经获得了良好的结果。在本文中R1表示氢原子或烷基，并且R2表示氢原子或烷基或者具有C末端羧酰胺或羧酸官能团的氨基酸或肽残基，该氨基酸或肽残基任选地在氨基酸的侧链官能团上或在氨基酸的一个或多个侧链官能团上受到保护。在本文中，每个烷基可以独立地表示(取代或未取代的)C1-C7烷基，优选(取代或未取代的)线性C1-C6烷基，更优选(取代或未取代的)线性C1-C3烷基，并且最优选甲基。特别地，在本发明的方法中已经获得了良好的结果，其中R1和R2二者均表示氢原子，或者其中R1表示氢原子，并且R2表示具有C末端羧酰胺或羧酸官能团的氨基酸或肽残基，该氨基酸或肽残基任选地在氨基酸的侧链官能团上或在氨基酸的一个或多个侧链官能团上受到保护。
特别有利的是使用Cam-AA1-AA2-酯，其中AA1是第一氨基酸残基并且AA2是第二氨基酸残基。本文中AA1是疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸单元。AA2是碱性氨基酸残基，例如精氨酸或赖氨酸单元。特别优选的是Cam-Phe-Arg和Cam-Phe-Lys。AA1和AA2典型地具有游离侧链官能团，即没有保护基团或另一个残基。
使用羧基取代的苄基酯，特别是使用对羧基取代的苄基酯(其由式肽-(C＝O)-O-CH2-C6H4-CO2E表示)，也获得了特别好的结果，其中E表示氢原子、带正电荷的盐离子(例如铵离子)、或者具有C末端羧酰胺或羧酸官能团的氨基酸或肽残基，该氨基酸或肽残基任选地在氨基酸的侧链官能团上或在氨基酸的一个或多个侧链官能团上受到保护。使用由式肽-(C＝O)-O-CH2-C6H4-CO2E表示的对羧基取代的苄基酯也已经获得了良好的结果，其中E的定义如上，并且其中苯环(上式中的C6H4)中的一个或多个氢原子被取代基例如羟基、烷氧基、芳氧基或卤素取代。
肽C末端(硫)酯可以是N末端未保护的或N末端保护的。
合适的N末端保护基是可用于肽合成的那些N保护基团。此类基团是本领域技术人员已知的。合适的N保护基团的实例包括氨基甲酸酯或酰基型保护基团，例如“Cbz”(苄氧基羰基)、“Boc”(叔丁氧基羰基)、“For”(甲酰基)、“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)、“PhAc”(苯乙酰基)和“Ac”(乙酰基)。可以分别使用肽脱甲酰基酶、PenG酰基转移酶或酰基转移酶引入For、PhAc和Ac基团并对这些基团进行酶促裂解。
发明人进一步认识到，在通过片段缩合用于酶促合成肽的方法中，取代的硫代氨基甲酰基基团(例如苯基硫代氨基甲酰基(PTC)基团)对于C末端(硫)酯的N末端α-胺官能团是有用的保护基团。例如从埃德曼降解法中熟知这样使用的此类基团。可以用于埃德曼型氨基酸测序的保护剂在本文中也被称为埃德曼型保护剂，并且同样地，与肽的胺基(特别是N末端胺)偶联的试剂在本文中也被称为埃德曼型保护基团。发明人发现，当在酶促偶联反应之后获得的肽需要在位置Y处提供官能团以获得利拉鲁肽或索马鲁肽时(例如当将Pal与Lys-γ-Glu(Y)偶联时或将17-羧基十七烷酸与Lys-AEEA-AEEA-γ-Glu(Y)偶联时)，埃德曼型保护剂(通过连接另外的氨基酸(例如甘氨酸)附接到N末端α-氨基官能团)形成有效的保护基团。通过使所述胺官能团与相应的异硫氰酸酯在(弱)碱性条件下反应，可以将取代的硫代氨基甲酰基基团提供至N末端α-氨基官能团。因此，可以使用苯基异硫氰酸酯(PITC)引入苯基硫代氨基甲酰基(PTC)基团，并且可以使用甲基异硫氰酸酯(MITC)引入甲基硫代氨基甲酰基(MTC)基团。在酸性条件下，此类取代的硫代氨基甲酰基基团与它们所附接的呈噻唑啉酮衍生物形式的α-氨基酸一起从肽上裂解。
已经发现提供这种新的N末端保护的方式在水性反应系统中的溶解度方面优于例如Fmoc。已经发现，当使用固相合成时，在相容性方面优于例如Boc。埃德曼型保护基团(例如取代的硫代氨基甲酰基部分)在中性或碱性pH下作为保护基团可以特别好地运行，并且在酸性pH下可以容易地将其除去。因此，通常将这种基团用于在中性或碱性pH下的偶联反应中，使用在此pH下具有良好S/H比率的连接酶，诸如枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或同系物，如本文其他地方更详细地描述的。
当使用埃德曼型保护部分时，适合的保护/去保护条件包括本领域中通常已知的用于在埃德曼型降解方法中使用此部分的条件。已经发现，取代的硫代氨基甲酰基基团在水性反应介质中，与有助于良好的溶解度相组合也特别有效。取代的硫代氨基甲酰基基团可以是芳香族或脂肪族的。优选地，取代的硫代氨基甲酰基基团是芳基取代的硫代氨基甲酰基基团或烷基取代的硫代氨基甲酰基基团。特别优选的芳基取代的硫代氨基甲酰基基团是C6-C12-芳基取代的硫代氨基甲酰基基团，更特别是苯基硫代氨基甲酰基(PTC)。特别优选的烷基取代的硫代氨基甲酰基基团是C1-C6-烷基取代的硫代氨基甲酰基基团，更特别是甲基硫代氨基甲酰基(MTC)。用于引入取代的硫代氨基甲酰基基团的优选的异硫氰酸酯的另外的实例是在H.Matsunaga,T.Santa,K.Hagiwara,H.Homma,K.Imai,S.Uzu,K.Nakashima,S.Akiyama,Anal.Chem.[分析化学]1995,67,4276中提到的那些，例如FITC、BAMPITC、DNTC、DNSAPITC、丹磺胺基-PITC、3-POPIC、4-POPIC、CIPIC和7-[(N,N-二甲基氨基)磺酰基]-2,1,3-苯并噁二唑-4-基异硫氰酸酯(DBD-NCS)，参见第4276页的左右两栏桥接段落，通过引用并入。又另一个优选的实例是7-氨基磺酰基-4-(2,1,3-苯并噁二唑基)-异硫氰酸酯(ABD-NCS)。
作为取代的硫代氨基甲酰基部分的替代方案，另一种适合于通过埃德曼型降解方法对肽中的氨基酸进行测序的部分也可以类似的方式用作保护基团，即通过用所述部分经由连接的氨基酸标记肽C末端酯的N末端，并且在与肽亲核体酶促偶联后，将所述部分与来自偶联产物其余部分的连接的氨基酸残基一起裂解。因此，可以经由连接氨基酸残基标记在肽的N末端并与连接的氨基酸残基一起裂解掉的适合的保护性部分在本文中也称为“埃德曼型保护基团”。
此外，可能经由一个以上的氨基酸(即通过肽链)将埃德曼型保护基团连接至肽C末端(硫)酯。然后可以与肽测序方法中进行的相似的方式，通过用该部分标记并且裂解掉该部分加上氨基酸的多个循环，以去除连接的氨基酸。不需要使用另外的连接氨基酸，但是如果需要可以使用它们，例如以改变肽C末端(硫)酯在所选反应介质中的溶解度。
因此，在一个特定优选的实施方案中，根据本发明的方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)由式P-Wv-His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫酯，和(b)肽亲核试剂。本文中P表示埃德曼型保护基团，优选苯基硫代氨基甲酰基(PTC)或甲基硫代氨基甲酰基(MTC)部分。本文中，v是至少为1的整数，通常为1-10，优选为1-4，更优选为1、2或3，最优选为1，并且v表示氨基酸残基W的数目。每个W可以是相同或不同的。通常每个W选自蛋白来源的氨基酸，尽管原则上可以使用另一种氨基酸，但是只要可以在埃德曼型裂解条件下将其裂解为P-W即可。
将此N末端受保护的肽C末端(硫)酯与亲核试剂(b)偶联，由此形成N末端受保护的肽P-Wv-His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly。此后，此肽经受裂解反应，其中形成肽Wv-1-His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly(其肽可以在C末端被延长)。
如果v-1>0，将基团P偶联到肽的W的N末端α-氨基官能团，然后通过裂解去除P-W。然后重复偶联和裂解循环直到获得肽1His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly。
基于对所述肽已知的埃德曼型方法，典型地在温和的碱性条件下(例如约pH 8)，以本身已知的方式完成P至肽的N末端的标记。基于对所述P已知的埃德曼型方法，典型地在酸性条件下(通常在约4或更低的pH下，特别是在约3或更低的范围内，例如0-2)，以本身已知的方式完成将P-W从肽的N末端的裂解。例如，可以使用三氟乙酸(TFA)。
肽(硫)酯的N末端保护在以下方法中特别有用：其中Y包含带有游离α-氨基官能团的Lys(γ-Glu-OH)部分，所述游离α-氨基官能团需要与棕榈酸偶联，或者如果Y包含带有游离α-氨基官能团的Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OH)部分，所述游离α-氨基官能团需要与17-羧基-十七烷酸偶联。
特别是，用不具有受保护的侧链官能团的肽C末端(硫)酯已经获得了良好的结果。然而，在一个实施方案中，一个或多个侧链官能团(例如所有侧链官能团)具有保护基团。合适的保护基团是本领域技术人员已知的。羧酸基团可以例如被环己基、苄基或烯丙基保护。
可以使用固相合成以高产率和纯度且不发生外消旋的情况下合成肽C末端(硫)酯的活化的C末端(硫)酯基团。使用羧酰胺甲基型的(硫)酯(其中R1表示氢原子，并且R2表示具有C末端羧酸官能团的氨基酸或肽残基，该氨基酸或肽残基任选地在氨基酸的侧链官能团上或在氨基酸的一个或多个侧链官能团上受到保护)的另一个优点是这些羧酰胺甲基型的(硫)酯的活化的C末端酯或硫酯基团可以使用便宜的和工业上可获得的2-氯三苯甲基氯树脂合成。
肽C末端(硫)酯的活化的C末端(硫)酯基团也可以通过溶液相合成或通过发酵(即使用微生物)来合成。如本领域通常已知的，发酵方法包括在需氧或厌氧条件下产生化合物，即肽。使用发酵获得肽(硫)酯的可靠方法是通过所谓的内含肽表达(参见例如E.K.Lee,Journal of Chemical Technology and Biotechnology[化学技术与生物技术杂志],2010,9,11-18)。不同的内含肽表达体系试剂盒是可商购的(例如IMPACTTM试剂盒)。用于发酵生产肽(硫)酯的其他方法是本领域已知的。
具有N末端未保护的胺的肽亲核试剂包含以下氨基酸序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly(“第二肽片段”)。已经用肽亲核试剂获得了特别好的结果，其中这是肽亲核试剂的氨基酸序列。本发明特别重要的优势是，在水性体系中酶促偶联也运作良好，而不需要用肽标签或另一种衍生物延伸C末端以增强肽亲核试剂的溶解度或反应性。
在一个实施方案中，肽亲核试剂是C末端保护的。在另一个实施方案中，其没有C末端保护。
特别是，已经用不具有受保护的侧链官能团的肽亲核试剂获得了良好的结果。
在一个实施方案中，肽亲核试剂的一个或多个侧链官能团(特别是一个或多个羟基、羧基或胺基基团)具有保护基团。合适的保护基团是本领域技术人员已知的。羧酸基团可以例如被环己基、苄基或烯丙基保护；胺官能团可以例如被烯丙氧基羰基或三氟乙酰基保护。
可以使用本领域已知的方法来合成肽亲核试剂，这些方法为例如固相合成、溶液相合成或通过发酵。
如上所述，Y是Lys，其中Lys的侧链ε-氨基基团可以被保护基团保护。然而，通常不需要令人满意的偶联产率和速率来保护侧链ε-氨基基团，特别是如果将枯草杆菌蛋白酶或其同源物用作连接酶时，也不需要。特别地，当在位置Y处的Lys的ε-氨基基团没有保护基团时，如本文所述的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或同源物也适合于偶联两个片段。
因此，通常肽亲核试剂的Y是具有游离ε-氨基侧链或具有官能化的ε-氨基侧链的赖氨酸残基。通过酶促偶联获得的产物可以是目的肽(如果有的话，任选地在去除保护基团后)，例如如果GLP-1是要合成的目标肽，或者如果肽亲核试剂的Y已经包含所需的官能化以获得索马鲁肽的利拉鲁肽。可替代地，随后通过酶促偶联获得的产物可以经受进一步的反应以使其官能化，特别是用氨基酸或另一种官能团，更特别是选自由Pal-γ-Glu-OH和AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH组成的组的官能团，其中Pal是棕榈酰基，并且AEEA-AEEA是2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。官能化Y的游离氨基酸侧链以产生利拉鲁肽或索马鲁肽以提供适合于合成利拉鲁肽或索马鲁肽的肽亲核试剂的方式可以基于本领域通常已知的方法，或者可以基于本文实施例或基于在本文引用的参考文献中所引用的文献中描述的技术。特别地，可以基于US 6,451,974B1使用官能化方案。
在一个特别优选的实施方案中，在根据本发明的方法中合成的肽是利拉鲁肽。
本发明的优势在于其允许以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一片段包含序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和(b)包含第二肽片段的肽亲核试剂，所述第二片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(Pal-γ-Glu-OH)。因此，可以偶联相应的11-mer肽的C末端(硫)酯和20-mer N末端的亲核试剂来进行酶促偶联，从而获得利拉鲁肽。尽管可以给肽(硫)酯的N末端α-氨基官能团提供保护基团(例如由P-Wv代表的基团)，如在描述埃德曼型保护基团时在本文其他地方所定义的，但是特别好的结果已经尤其是通过这样的方法(其中具有Y＝Lys(Pal-γ-Glu-OH)的肽亲核试剂与由式His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫代酯偶联，对肽(硫)酯的N末端没有任何保护并且也不需要任何其他保护基团)实现了。
在另一个优选的实施方案中，利拉鲁肽通过以下方法制备：将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一片段包含序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和(b)包含第二肽片段的肽亲核试剂，所述第二片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly；并且然后向所述Lys(γ-Glu-OH)残基提供棕榈酰基基团(Pal)，从而获得利拉鲁肽。在该实施方案中，肽C末端酯或硫酯的N末端α-氨基官能团通常在酶促偶联期间被保护，优选用埃德曼型保护基团。
在另一个特别优选的实施方案中，通过以下方法制备利拉鲁肽，该方法包括：将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一片段包含序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和(b)包含第二肽片段的肽亲核试剂，所述第二片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是具有游离ε-氨基侧链的赖氨酸残基；并且然后向所述ε-氨基侧链提供Pal-γ-Glu-OH，从而获得利拉鲁肽。在该实施方案中，已经在肽(硫)酯的N末端α-氨基官能团处不使用任何保护基团的情况下获得了特别好的结果。
在一个替代性实施方案中，根据本发明的方法包括合成索马鲁肽。
在一个有利的实施方案中，合成索马鲁肽包括将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一片段包含序列His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和(b)包含第二肽片段的肽亲核试剂，所述第二片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)。从而可以直接获得索马鲁肽。尽管可以给肽(硫)酯的N末端α-氨基官能团提供保护基团(例如由P-Wv代表的基团)，如在描述埃德曼型保护基团时在本文其他地方所定义的，但是特别好的结果已经尤其是通过这样的方法(其中具有Y＝Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH的肽亲核试剂与由式His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫代酯偶联，对肽(硫)酯的N末端α-氨基官能团没有任何保护并且也不需要任何其他保护基团)实现了。
在另一个实施方案中，合成索马鲁肽的方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一片段包含序列His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和(b)包含第二肽片段的肽亲核试剂，所述第二片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OH)，并且然后向Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OH)部分提供17-羧基十七烷酰基基团。因此，可以在酶促偶联后通过进一步官能化而获得索马鲁肽。在此实施方案中，肽C末端酯或硫酯的N末端α-氨基官能团通常在酶促偶联期间被保护，优选用埃德曼型保护基团。
在另一个实施方案中，通过以下方法获得索马鲁肽，该方法包括：将以下(a)和(b)酶促偶联：(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一片段包含序列His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和(b)包含第二肽片段的肽亲核试剂，所述第二片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是具有游离ε-氨基侧链的赖氨酸残基，并且然后向所述ε氨基侧链提供AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH基团，从而获得索马鲁肽。因此，可以在酶促偶联后通过官能化而获得索马鲁肽。在此实施方案中，已经在肽(硫)酯的N末端α-氨基官能团(或任何侧链官能团)处不使用任何保护基团的情况下获得了特别好的结果。
在又另一个可替代性实施方案中，合成的肽是GLP-1。
用于催化肽C末端(硫)酯与肽亲核试剂的偶联的连接酶可以是以下任何连接酶，该连接酶通过催化肽C末端(硫)酯与肽亲核试剂的N末端之间的肽键的形成而在偶联两个肽中均具有催化活性，其中在反应介质中使用的用于偶联与水解偶联产物的S/H比率大于1。通常，连接酶可分类为丝氨酸蛋白酶，其通常可归类于EC 3.4.21中。通常，它具有催化三联体，顺序为Asp、His和Ser。
特别地，在根据本发明的方法中使用的连接酶是分离的酶。因此，如果这种分离的酶已在生物体中产生，则从已经表达了它的生物体(通常是重组生物体)中分离，否则分别从其中已经合成了它的反应介质中分离。
特别地，本发明的酶被认为是出于本发明的目的分离的，其处于粗制形式或通过任何合适的技术被基本上纯化，这样的技术为例如Smith和Johnson,Gene[基因]67:31-40(1988)中披露的单步纯化方法。
特别地，连接酶可以是丝氨酸内切蛋白酶。在所使用的反应介质中，特别是在包含水的反应介质中，更特别是在水性介质中，连接酶通常具有大于1，优选2或更大，特别是5或更大的S/H比率。该商的上限值并不严格；实际上，该商可以是例如100或更小，特别是20或更小。至少与枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，在根据本发明的方法中使用的连接酶通常具有改善的“合成与水解比率”(S/H比率)。
至少在实施例中描述的条件下，本发明的连接酶(在方法中使用的)的S/H比率除以枯草杆菌蛋白酶BPN’的S/H比率通常大于100，优选250或更大，更优选500或更大，特别是1000或更大。该商的上限值并不严格；该商可能接近无穷大。
特别地，已经用枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物取得了非常好的结果。
特别是当在包含水作为主要溶剂(例如占总液体的50-100wt.％)的反应介质中进行酶促偶联时，已经发现根据WO 2016/056913的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物特别合适。该出版物的内容通过引用并入，特别是关于枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或同源物的细节，如其权利要求书所呈现的。
因此，与由SEQ ID NO:2或其同源物序列表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，通常用于偶联反应的连接酶是包含以下突变的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物：
-对应于位置75-83的氨基酸的缺失；
-在对应于S221的氨基酸位置处的突变，该突变是S221C或S221硒代半胱氨酸；
-优选在对应于P225的氨基酸位置处的突变；
-其中这些氨基酸位置是根据由SEQ ID NO:2表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’的序列定义的。
用于在本发明的方法中使用的另外的优选的连接酶可以包含一种或多种另外的突变，特别是如本文其他地方或在WO 2016/056913中鉴定的一种或多种另外的突变，将该文献通过引用并入本文。
在对应于连接酶(特别是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物)的S221的氨基酸位置处的突变优选是S221C。
在对应于P225的氨基酸位置处的突变通常对于酶促偶联的S/H比率是有利的。该突变通常选自由以下组成的组：P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H、P225Q，优选选自由以下组成的组：P225N、P225D、P225S、P225C和P225G，更优选P225N或P225D，最优选P225N。
为了获得良好的酶稳定性，连接酶(特别是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物)优选地包含一个或多个突变，该一个或多个突变选自以下突变的组：在对应于SEQ ID NO:2的Q2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、S188、Q206、N212、N218、T254和Q271的氨基酸位置处的突变。
优选的在对应于Q2位置处的突变对应于Q2K。
优选的在对应于S3位置处的突变对应于S3C。
优选的在对应于P5位置处的突变对应于P5S。
优选的在对应于S9位置处的突变对应于S9A。
优选的在对应于I31位置处的突变对应于I31L。
优选的在对应于K43位置处的突变对应于K43N。
优选的在对应于M50位置处的突变对应于M50F。
优选的在对应于A73位置处的突变对应于A73L。
优选的在对应于S188位置处的突变对应于S188P。
优选的在对应于Q206位置处的突变对应于Q206C。
优选的在对应于N212位置处的突变对应于N212G。
优选的在对应于T254位置处的突变对应于T254A。
优选的在对应于Q271位置处的突变对应于Q271E。
在一个特别优选的实施方案中，连接酶(特别是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物)包含至少六个，优选至少八个，更优选至少10个，特别是12个、13个或14个所述突变，所述突变选自以下突变的组：在对应于Q2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、S188、Q206、N212、T254和Q271的位置处的突变。这对于在包含水作为主要或唯一溶剂的反应介质中的酶稳定性是特别优选的。与枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，连接酶可以具有另外的突变，特别是如本文所引用的参考文献中描述的一种或多种另外的突变，条件是所属连接酶在制备根据本发明的肽时具有酶促片段缩合活性(偶联活性)。
枯草杆菌蛋白酶BPN’的替代物是其他枯草杆菌蛋白酶，特别是与枯草杆菌蛋白酶BPN’具有至少50％同源性的枯草杆菌蛋白酶；该枯草杆菌蛋白酶BPN’为模板酶，根据本发明的酶、特别是本发明的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体的同源物可以通过诱变从该模板酶得到。
可以通过使用枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID 2)作为查询对数据库进行BLASTing而从UNIPROT序列数据库(http://www.uniprot.org/)中检索适当的枯草杆菌蛋白酶序列，如在2014年8月11日可获得的。然而，序列检索不仅限于UNIPROT，也不限于日期。本领域技术人员知道如何通过测序查询替代序列库或收集其他同源序列(参见例如Zooming in onmetagenomics:molecular microdiversity of Subtilisin Carlsberg in soil[放大宏基因组学：土壤中枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的分子微观多样性].Gabor E,Niehaus F,Aehle W,Eck J.J Mol Biol[分子生物学杂志].2012年4月20日；418(1-2):16-20)。
特别地，本发明还涉及变体，其具有对应于L75的氨基酸(直到)的至少所述缺失，并且包含枯草杆菌蛋白酶BPN’的G83、在枯草杆菌蛋白酶BPN’中对应于位置221的位置处的半胱氨酸或硒代半胱氨酸，以及本发明权利要求1中所述另外的突变中的至少一个。
枯草杆菌蛋白酶BPN’的序列在SEQ ID NO:2(成熟的形式)中给出。SEQ ID NO:1中给出了编码枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸-107至275的基因。枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或同源物可以是基于根据WO 2016/056913的酶，条件是其具有上述突变。
在一个有利的实施方案中，连接酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，其具有对应于位置75-83的氨基酸的缺失，突变S221C和在对应于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’(成熟)的M222、Y217、P225、F189、N218、E156、G166和N62的氨基酸位置处的一个或多个另外的突变，优选至少3个另外的突变，特别是5-8个另外的突变。
在这些突变中，具有对应于以下的突变已经取得了特别好的结果：M222P、Y217H、P225N、F189W、N218D、E156N、G166E、N62A。SEQ ID NO:3示出了根据本发明的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体(使用的)具有Ca2+结合环的缺失、S221C、并且具有所述另外的突变。对于促进纯化需包括His标签，而对于连接酶活性则不需要。进一步优选的酶可以包含一种或多种另外的突变，特别是如本文其他地方或在WO2016/056913中鉴定的一种或多种另外的突变，将该文献通过引用并入本文。
在本发明的方法中，酶促反应典型地在包含水的流体中进行。优选地，反应在缓冲流体中进行。基于全部液体，水的含量通常为10-100vol％、优选20vol.％或更多，优选40vol.％或更多，特别是50vol.％或更多，更特别是60vol.％或更多。特别地，已经在包含70-100vol％的水，更特别地90-100vol％、95-100vol％或98-100vol％的水的反应介质中获得了良好的结果。术语“水性”用于至少基本上由水组成的介质。
原则上，任何缓冲液都是合适的。良好的缓冲液是本领域技术人员已知的。参见例如David Sheehan,Physical Biochemistry[物理生物化学],第二版Wiley-VCH VerlagGmbH,Weinheim[魏因海姆]2009；http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-calculator.html。例如，已经用古德氏(Good's)缓冲液(例如N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(tricine))取得了特别好的结果。缓冲液的浓度可以在较宽的限度内选择，例如在10-1000mM的范围内，特别是在25-500mM的范围内，更特别是在50-250mM的范围内。已经发现相对低摩尔浓度的缓冲液对于偶联其中Y为Lys(Pal-γ-Glu-OH)等的肽亲核体是有利的。
在根据本发明的方法中用于偶联反应的缓冲液的pH可以为至少5，特别是至少6，优选至少7。期望的pH通常小于11，特别是小于10，甚至更优选小于9。通常，酶促偶联的最佳pH在7-9之间。
由于高的S/H比率，在缩合反应中通常不需要大量过量的肽C末端酯或硫酯或者肽亲核试剂以达到高产量。通常，它们以约化学计量比率或以过量的肽C末端酯接触，特别是以(a)肽C末端酯或硫代酸酯与(b)肽亲核试剂的摩尔比率在1:1至5:1的范围内接触。尽管以化学计量比率取得了令人满意的结果，但是已经发现过量的肽C末端(硫)酯对于反应速率是有利的。因此，优选地，(a)肽C末端酯或硫酯与(b)肽亲核试剂的摩尔比率在1.05:1.0至4:1的范围内，更优选在1.1:1.0至3:1的范围内，甚至更优选在1.2:1.0至2.5:1.0的范围内，特别是在1.2:1.0至2.0:1.0的范围内。
在本发明的方法中，向其中进行反应的流体中加入添加剂以改进肽片段的溶解度或改进反应产量可能是有利的。此类添加剂可以是盐或有机分子，例如盐酸胍、脲、十二碳硫酸钠或吐温(Tween)。然而，在完全水性反应介质中，在没有这种添加剂的情况下也已经取得了良好的结果，例如在一个实施方案中，其中Y为Lys(Pal-γ-Glu-OH)Lys(Pal-γ-Glu-OH)等。
反应可以在完全水性的液体中或在水与水混溶性助溶剂的混合物中进行，该水混溶性助溶剂为例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-吡咯烷酮(NMP)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、醚(例如四氢呋喃(THF)、2-甲基-四氢呋喃(Me-THF)或1,2-二甲氧基乙烷)或(卤代)醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、2,2,2-三氟乙醇(TFE)、1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇)、或这些有机溶剂的混合物。取决于枯草杆菌蛋白酶BPN’变体的稳定性和肽底物的溶解度，助溶剂的量优选低于70vol％，更优选低于60vol％，甚至更优选低于50vol％，并且最优选低于40vol％。
原则上，酶片段缩合期间的温度并不严格，只要选择所使用的连接酶显示足够的活性和稳定性的温度即可。这种温度可以常规地确定。通常，温度可以是至少-10℃，特别是至少0℃或至少10℃。通常，温度可以为70℃或更低，特别是60℃或更低或者50℃或更低。本领域技术人员基于公知常识和本文披露的信息，鉴定通过常规实验，可以容易地用于特定酶片段缩合的特定连接酶的最佳温度条件。通常，温度有利地在20℃-50℃的范围内。
本发明进一步涉及使用埃德曼型试剂以在合成肽的方法中提供保护基团，该方法包括通过片段缩合进行肽的酶促偶联。因此，本发明还涉及用于合成肽的方法，该方法包括将(a)由式P-Wv-AAn-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫代酯和由式AAm表示的肽亲核试剂酶促偶联，其偶联是通过连接酶，优选枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或同源物催化的，例如本文其他地方所描述的。
本文中P表示如上所定义的埃德曼型保护基，优选硫代氨基甲酰基基团。基于对所述肽已知的埃德曼型方法，典型地在温和的碱性条件下(例如约pH 8)，以本身已知的方式完成将P偶联至肽的N末端。本文中，v是至少为1的整数，通常优选为1-10，优选为1-5，更优选为1、2或3，最优选为1，并且v表示氨基酸残基W的数目，其中每个W可以是相同或不同的，并且优选是如上所定义的。每个AA代表氨基酸残基，n是代表肽C末端酯或硫酯的氨基酸残基的数目的整数，并且m是代表肽亲核试剂的氨基酸残基的数目的整数。典型地，n和v的总和至少为4，以允许被连接酶识别。优选地，n是在3-200的范围内，特别是在3-50的范围内，更特别是在3-25的范围内。在一个特定实施方案中，n至少为4、至少为6、至少为8、至少为10、至少为15或至少为20。优选地，m是在3-200的范围内，特别是在5-50的范围内，更特别是在8-30的范围内。在一个特定实施方案中，m至少为4、至少为10、至少为15或至少为20。
使偶联产物(P-Wv-AAn-AAm)经受裂解反应，其中形成肽Wv-1-AAn-AAm。典型地，裂解在酸性条件下完成。如果v-1>0，然后基团P与W在肽Wv-1-AAn-AAm的N末端位置处偶联，以在P-W裂解后形成P-Wv-1-AAn-AAm。然后这样重复直到获得由式AAn-AAm表示的肽。
因此，本发明涉及用于合成肽的方法，该肽包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly，其中
-X是Ala或α-氨基-异丁酸(Aib)残基；
-Y是Lys，其中Lys具有游离侧链ε-氨基(即非衍生的赖氨酸残基)，或者其Lys侧链ε-氨基被保护基团保护，或者其Lys侧链ε-氨基基团被氨基酸或另一种官能团官能化；
-Z是Arg或Lys；
该方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：
(c)包含以下序列的第一肽C末端酯或硫酯片段：His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(d)具有N末端未保护的胺的第二肽亲核试剂片段，该N末端未保护的胺包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly；
其酶促偶联通过连接酶进行催化，其中所述连接酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，或其具有至少80％、或85％、或90％、优选95％序列同一性的同源物。连接酶优选地是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，其具有对应于位置75-83的氨基酸的缺失，突变S221C和在对应于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’(成熟)的M222、Y217、P225、F189、N218、E156、G166和N62的氨基酸位置处的一个或多个另外的突变，优选至少3个另外的突变，特别是5-8个另外的突变，其中最优选一种突变是在P225处。
在一个特别有利的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的连接酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，或其与SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、优选95％序列同一性的同源物，该连接酶包含突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、Δ75-83、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217H、S221C、M222P、P225N、T254A和Q271E，任选地包含His标签。
在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的连接酶是具有SEQ IDNO:3的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，或其具有至少80％、或85％、或90％、优选95％序列同一性的同源物，该连接酶包含突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、N62A、A73L、Δ75-83、E156N、G166E、G169A、S188P、F189W、Q206C、N212G、Y217H、N218D、S221C、M222P、P225N、T254A、Q271E，任选地包含His标签。
SEQ ID NO:14示出了根据本发明的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体(使用的)具有Ca2+结合环的缺失、S221C，以及另外的突变。对于促进纯化包括His标签，而对于连接酶活性则不需要。
所描述的所有连接酶也是本发明的实施方案，优选那些由SED ID NO:14和SEQ IDNO:3指定的连接酶及其具有至少80％、或85％、或90％、优选95％序列同一性的同源物。
在一个优选的实施方案中，该方法的特征还在于Y是侧链ε-氨基基团被官能团官能化的Lys，所述官能团选自由以下组成的组：γ-Glu-OH、Pal-γ-Glu-OH、AEEA-AEEA-γ-Glu-OH和AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH，其中Pal是棕榈酰基并且AEEA-AEEA是-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述Y是Lys(γ-Glu-OH)、Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OH)、Lys(Pal-γ-Glu-OH)或Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基-OH)。
其中术语“肽片段”或“片段”是指具有部分氨基酸序列的肽，参考具有所定义的序列的较长肽。
现在将通过以下实施例说明本发明，但不限于此。
实施例
连接酶的生成
诱变、克隆和表达
SEQ ID NO:1示出了编码枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸-107至275的野生型基因。本文中存在编码氨基酸-107至-1的密码子。这些氨基酸包含的信号序列、前序列(pre-sequence)和前体序列(pro-sequence)在完全成熟后被裂解掉。SEQ ID NO:2示出了成熟的野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’(即不含氨基酸-107至-1)。用于实施例的连接酶如SEQ ID NO:3所示。与成熟的野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’相比，此连接酶具有突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、N62A、A73L、Δ75-83、E156N、G166E、G169A、S188P、F189W、Q206C、N212G、Y217H、N218D、S221C、M222P、P225N、T254A和Q271E。此外，为了促进氨基酸275后的快速和有效纯化，附接了C末端His-标签，如SEQ ID NO:3所示。根据枯草杆菌蛋白酶BPN’编号方案对相应的氨基酸序列进行编号。因此，为了维持枯草杆菌蛋白酶BPN’编号以用于使用的连接酶，编号从74跃升至83。
用于以下合成实施例的编码连接酶的基因是从GenScript获得的。使用基于MluI和BamHI位点的载体，将基因克隆(通过GenScript)到pUB-110大肠杆菌——一种枯草芽孢杆菌穿梭载体(pBES)。在穿梭载体中，基因的表达处于aprE启动子的控制之下。该载体含有芽孢杆菌复制的pUB ori和卡那霉素抗性标志物。该载体还含有在大肠杆菌中维持的复制的ColE1 ori和氨苄西林抗性标志物。使所得质粒pBES-连接酶HIS在大肠杆菌TOP10中繁殖，并转化入枯草芽孢杆菌GX4935(trpC2 metB10 lys-3ΔnprEΔaprE)。
连接酶的生成和纯化
将含有带有感兴趣枯草杆菌蛋白酶变体基因的质粒的枯草芽孢杆菌的单个微生物菌落接种到具有卡那霉素(10μg/mL)的5mL LB中，置于37℃振荡培养箱。向补充有抗生素(卡那霉素10μg/mL)和氨基酸(100mg/L Trp、100mg/L Met和100mg/L Lys)的30mL极品肉汤(Terrific Broth)中添加0.6mL过夜培养物。使细胞在振荡培养箱(200rpm)中在37℃下生长48h。通过离心(15min，4,000rpm，4℃)收获细胞。倒出培养基(30mL)，并以两个离心步骤(15min，4000rpm，4℃)在Sartorius Vivaspin 15R单元(15mL，10kDa MW截留值)上浓缩。然后在三次洗涤/浓缩步骤(14mL缓冲液A，10min，4,000rpm，4℃)中将浓缩的培养基(0.5mL)交换成缓冲液A(25mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，pH 7.5，0.5M NaCl)。为了进行His标签纯化，将Talon树脂(2.5mL，Clonetech公司)添加到塑料柱管柱中。将树脂用20mL MilliQ水洗涤，并用20mL缓冲液A平衡。将粗酶加载到柱上，并用5mL缓冲液A洗涤。将酶用15mL缓冲液B(25mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，pH 7.5，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱。将洗脱物通过离心(15min，4000rpm，4℃)在Sartorius Vivaspin15R(15mL，10kDa MW截留值)上浓缩，并在三次洗涤/浓缩步骤中(15mL缓冲液，10min，4,000rpm，4℃)将缓冲液交换为25mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，pH7.5。
通过SDS-PAGE分析蛋白质的纯度，并如WO 2016056913(A1)中所描述的来确定酶浓度。纯度大于90％。将所获得的含有约2mg/mL所获得的酶的水溶液(25mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，pH 7.5)按原样用于寡肽片段缩合。
酶促片段缩合实施例
材料与方法
除非另有说明，否则化学品是从商业来源获得的，并且无需进一步纯化即可使用。在所有酶促片段缩合中，使用SEQ ID:3的连接酶。在安捷伦1260无限液相色谱仪上，使用反相柱(飞诺美公司，C18，5μm粒度，250×4.6mm)在40℃下进行分析型HPLC。使用UV-VIS 204线性光谱仪在220nm处进行UV检测。梯度程序为：0-25min线性梯度从5％上升到98％的洗脱剂B，并且从25.1min-30min 5％洗脱剂B(洗脱剂A：0.5mL/L甲磺酸(MSA)的水溶液，洗脱剂B：0.5mL/L MSA的乙腈溶液)。流速从0-25.1min为1mL/min，从25.2min-29.8min为2mL/min，然后回到1mL/min，直到在30min停止。进样量为10μL。在瓦里安(Varian)PrepStar系统上，使用固定相柱(Phenomenex，C18，10μm粒度，250×50mm)进行制备型HPLC。在安捷伦1200系列液相色谱仪上，使用反相柱(飞诺美公司，C18，5μm粒度，150×4.6mm)在40℃下进行LC-MS。UV检测和梯度程序同分析型HPLC所述。使用安捷伦6130四极杆LC/MS系统测定分子量。
方案1：Fmoc-乙醇酸的合成
将叔丁基2-羟基-乙酸盐(2.5g)溶解于吡啶(15ml)和二氯甲烷(DCM，30ml)的混合物中。然后在0℃下在无水DCM(15ml)中逐滴添加Fmoc-氯化物(5g)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。将溶剂在真空下去除并将残余物重新溶解于DCM(40ml)中，用1M碳酸氢钠溶液(20mL)洗涤两次，盐水溶液(20ml)洗涤两次，经无水硫酸镁干燥并浓缩。将获得的Fmoc-乙醇酸叔丁酯(4g)溶解于三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)和水(95/2.5/2.5,v/v/v,15mL)中，并搅拌120min。将溶剂在真空下去除并将粘性的残余物重新溶解于5％碳酸氢钠溶液(150ml)中，用二乙醚(75ml)洗涤3次。然后在0℃下将水溶液与乙酸乙酯(45mL)混合并用40％磷酸酸化至pH＝2。收集有机层并用无水硫酸镁干燥。在真空下去除溶剂，得到最终产物Fmoc-乙醇酸(Fmoc-GA)。
方案2：寡肽-OCam-Leu-OH酯的合成
用DCM(2x 2min，10mL)和N,N′-二甲基甲酰胺(DMF，2x 2min，10mL)洗涤1克预负载的Fmoc-Leu-Wang树脂(负载为0.81mmol/克)，并使用哌啶/DMF(1/5v/v，2x 8min，10mL)去除Fmoc的保护。用DMF(6x 2min，10mL)洗涤后，使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，4当量)、OxymaPure(4当量)和二异丙基乙胺(DIPEA，8当量)在DMF(45min，10mL)中将Fmoc-GA(4当量)与树脂偶联。用DMF(2x 2min，10mL)洗涤后，使用哌啶/DMF(1/5,v/v，2x 8min，10mL)将树脂去除Fmoc的保护。使用4当量Fmoc-Xxx-OH、4当量N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)和0.1当量4-二甲基氨基吡啶(DMAP)在DMF(2x 60min，10mL)中，通过偶联第一Fmoc-受保护的氨基酸来形成Cam-Leu-OH酯。此处和本申请的其他部分中，‘Xxx’代表一种氨基酸(如在以下实施例的序列中所指示的，是可变的)。对于索马鲁肽原料，使用可商购的Fmoc-Aib-OH结构单元。
在用DMF(6x 2min，10mL)洗涤后，遵循标准SPPS方案以延长肽段(Weng C.Chan和Peter White,牛津大学出版社(OUP Oxford),2000)。使用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，v/v/v，15mL)的混合物进行从树脂的裂解和侧链脱保护，持续120min。使用甲基叔丁基醚(MTBE)/正庚烷(1/1，v/v，50mL)沉淀该粗肽。通过离心收集所沉淀的肽，并用MTBE/正庚烷(1/1，v/v，50mL)洗涤两次，然后从乙腈/水(1/1，v/v，50mL)中冻干。将粗产物通过制备型HPLC纯化，然后冻干纯的级分。
如上所述，但然后在预负载的Fmoc-Arg(Pbf)-Rink树脂(负载为0.62mmol/克)上，制备了一些可替代的肽Cam-酯，即H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Phe-Arg-NH2、H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-Arg-NH2和H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Trp-Arg-NH2。
方案3：寡肽C末端酸亲核试剂的合成
用DCM(2x 2min，10mL)和DMF(2x 2min，10mL)洗涤1克预负载的Fmoc-Gly-Wang树脂(负载为0.30mmol/克)，并使用哌啶/DMF(1/5v/v，2x 8min，10mL)去除Fmoc的保护。遵循标准SPPS方案延长肽段(Weng C.Chan和Peter White,牛津大学出版社(OUP Oxford),2000)。使用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，v/v/v，15mL)的混合物进行从树脂的裂解和侧链脱保护，持续120min。使用MTBE/正庚烷(1/1，v/v，50mL)沉淀该粗肽。通过离心收集所沉淀的肽，并用MTBE/正庚烷(1/1，v/v，50mL)洗涤两次，然后从乙腈/水(1/1，v/v，50mL)中冻干。将粗产物通过制备型HPLC纯化，然后冻干纯的级分。
方案4：H-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH的PTC保护
将100mg的H-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH溶解于10mL吡啶/水(1/1，v/v)中。向此混合物添加25mg的苯基异硫氰酸酯，并将溶液在环境温度下搅拌14小时。将粗反应混合物用50mL水稀释并用50mL二氯甲烷(DCM)洗涤三次。将水层通过制备型HPLC纯化然后冻干纯的级分，从而给出受PTC-Gly保护的肽
方案5：含有肽的γ-Glu或Pal-γ-Glu的合成
使用可商购的Fmoc-Lys(Boc-γ-Glu-OtBu)-OH或Fmoc-Lys(Pal-γ-Glu-OtBu)-OH结构单元，遵循通用方案3。
方案6：索马鲁肽片段H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH的合成
使用可商购的Fmoc-20Lys(Mtt)-OH和Boc-12Ser(tBu)-OH结构单元，遵循通用方案3。在Boc-12-31-Wang片段的SPPS后，使用10mL的TIS/TFA/DCM(1/1/48，v/v/v，3x 15min)将Mtt保护基团去除。将标准SPPS程序用于偶联Fmoc-AEEA-OH(两次)、Fmoc-Glu-OtBu和17-羧基十七烷酰基-OtBu。使用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，v/v/v，15mL)的混合物进行从树脂的裂解和侧链脱保护，持续120min。使用MTBE/正庚烷(1/1，v/v，50mL)将粗肽沉淀。通过离心将所沉淀的肽收集，并用MTBE/正庚烷(1/1，v/v，50mL)洗涤两次，然后从乙腈/水(1/1，v/v，50mL)中冻干。将粗产物通过制备型HPLC纯化，然后冻干纯的级分。
实施例1(参照)：
使用13-mer+18-mer方法酶促合成利拉鲁肽前体H-利拉鲁肽-1-31-OH。
在HPLC小瓶中，将6mg的H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-OCam-Leu-OH和9mg的H-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于800μL 2M水性氯化胍中。向此混合物中添加50μL 1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH 9.0)并使用4M NaOH溶液将pH调整至8.3。随后，添加10μL的TCEP(三(2-羧乙基)膦)溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
90分钟后，所有Cam-酯起始材料已经被消耗，将产物和水解峰整合。连接产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是14面积％并且水解的Cam-酯H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-OH是86面积％。
可以通过制备型HPLC来获得产物H-利拉鲁肽-1-31-OH，然后冻干纯的级分。
实施例2(参照)：
使用9-mer+22-mer方法酶促合成利拉鲁肽前体H-利拉鲁肽-1-31-OH。
在HPLC小瓶中，将6mg的H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-OCam-Leu-OH和10mg的H-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于800μL2M水性氯化胍中。向此混合物中添加50μL 1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH9.0)并使用4M NaOH溶液将pH调整至8.3。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物在980μL5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
300分钟后，所有Cam-酯起始材料被消耗，并将产物和水解峰整合。连接产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是8面积％并且水解的Cam-酯H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-OH是92面积％。
可以通过制备型HPLC来获得产物H-利拉鲁肽-1-31-OH，然后冻干纯的级分。
实施例3：使用11-mer+20-mer方法酶促合成H-利拉鲁肽-1-31-OH。
在HPLC小瓶中，将6mg的H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH和10mg的H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于800μL 2M水性氯化胍中。向此混合物中添加50μL 1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH 9.0)并使用4M NaOH溶液将pH调整至8.3。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
180分钟后，所有Cam-酯起始材料已经被消耗，将产物和水解峰整合。连接产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是96面积％并且水解的Cam-酯H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-OH是4面积％。
可以通过制备型HPLC来获得产物H-利拉鲁肽-1-31-OH，然后冻干纯的级分。
因此表明，根据本发明的方法出乎意料地以远高于同等的方法(其中C末端(硫)酯和肽亲核试剂的偶联位点是朝向H-利拉鲁肽-1-31-OH的C末端或N末端的两个酰胺键)中的产率，提供了所需的偶联产物(即H-利拉鲁肽-1-31-OH，具有利拉鲁肽的氨基酸序列在20Lys处无衍生的肽)。
实施例4：使用11-mer+20-mer方法酶促合成PTC-Gly-利拉鲁肽-1-31-[20Lys(γ- Glu)]-OH
在HPLC小瓶中，将6mg的PTC-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH和10mg的H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于800μL 2M水性氯化胍中。
向此混合物中添加50μL 1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH 9.0)并使用4M NaOH溶液将pH调整至8.3。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
180分钟后，所有Cam-酯起始材料已经被消耗，将产物和水解峰整合。连接产物PTC-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是93面积％并且水解的Cam-酯PTC-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OH是7面积％。
可以通过制备型HPLC获得产物PTC-Gly-利拉鲁肽-1-31-[20Lys(γ-Glu)]-OH，然后冻干纯的级分。
实施例5：使用来自实施例4的PTC-Gly-利拉鲁肽-1-31-[20Lys(γ-Glu)]-OH前体 合成H-利拉鲁肽-1-31-[20Lys(Pal-γ-Glu)]-OH。
将2mg的PTC-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于500μL水和500μL吡啶中。向此溶液中添加2mg的棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Pal-OSu)，并将混合物在环境温度下反应5小时，然后在真空中蒸发溶剂。将粗产物PTC-Gly-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于水中的5vol％三氟乙酸用于PTC-Gly基团的裂解(去保护)。
完成后(15min)，获得产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH并通过制备型HPLC纯化，然后冻干纯的级分。
实施例6：使用11-mer+20-mer方法酶促合成H-利拉鲁肽-1-31-[20Lys(Pal-γ- Glu)]-OH(Pal＝棕榈酰基)。
在HPLC小瓶中，将6mg的H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH和10mg的H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于950μL水中。向此混合物中添加50μL 1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH9.0)并使用3M NaOH溶液将pH调整至8.1。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
180分钟后，所有Cam-酯起始材料已经被消耗，将产物和水解峰整合。连接产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是95面积％并且水解的Cam-酯H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OH是5面积％。
本实施例示出了本发明允许以单一酶促偶联步骤以高产率直接合成利拉鲁肽。
如上所述，除了使用一些可替代的肽Cam-酯，即(1)H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Phe-Arg-NH2、(2)H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-Arg-NH2和(3)H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Trp-Arg-NH2，进行相同的连接反应。一般而言，反应进行的比H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH(180min)酯更快，从而导致80分钟后(1)完全转化，100分钟后(2)完全转化，85分钟后(3)完全转化。
实施例7：从实施例3的酶促合成的前体H-利拉鲁肽-1-31-OH合成H-利拉鲁肽-1- 31-[20Lys(Pal-γ-Glu)]-OH。
使用在US 6451974B1中描述的方案，将前体H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH与Pal-γ-Glu部分偶联，以获得产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH。
实施例8：使用11-mer+20-mer方法合成H-索马鲁肽-1-31-[20Lys(AEEA-AEEA-γ- Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)]-OH。
在HPLC小瓶中，将6mg的H-1His-2Aib-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH和10mg的H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于950μL水中。向此混合物中添加50μL1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH 9.0)并使用3M NaOH溶液将pH调整至8.1。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
180分钟后，所有Cam-酯起始材料已经被消耗，将产物和水解峰整合。连接产物H-1His-2Aib-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是96面积％并且水解的Cam-酯H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OH是4面积％。
本实施例示出了本发明允许以单一酶促偶联步骤以高产率直接合成索马鲁肽。
实施例9：使用11-mer+20-mer方法用酶变体SEQIDNO:14酶促合成H-利拉鲁肽-1- 31-OH。
在HPLC小瓶中，将10mg的H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH和10mg的H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH溶解于500μL50mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH 9.0)中。使用3M NaOH溶液将pH调节至8.3。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
240分钟后，所有Cam-酯起始材料，并将产物和水解峰整合。连接产物H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH是92面积％并且水解的Cam-酯H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OH是8面积％。
可以通过制备型HPLC来获得产物H-利拉鲁肽-1-31-OH，然后冻干纯的级分。
实施例10：使用衍生自具有SEQIDNO:3的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体(C221S突变的) 的丝氨酸内切蛋白酶鉴定适合于酶促合成利拉鲁肽的片段
将1mg的利拉鲁肽1-31(在位置20中的赖氨酸处含或不含Pal-γ-Glu)溶解于1mL的N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(50mM，pH＝8.0)中。向此混合物种添加1μL的内切蛋白酶溶液(1mg/mL)并将反应混合物在室温下搅拌。
通过用LC-MS分析每30分钟分析一次样品来监测水解活性。
对于这两种肽，在氨基酸25与氨基酸26(产生片段1-25+26-31)之间的键处观察到最高的水解活性，然后在氨基酸5和氨基酸6(产生片段1-5+6-31)之间的键处观察到水解活性。在比较实施例11中测试了25-mer+6-mer方法的优点。
实施例11：并行使用25-mer+6-mer方法(参考)、5-mer+26-mer方法(参考)、或11- mer+20-mer方法(根据本发明)酶促合成利拉鲁肽前体H-利拉鲁肽-1-31-OH。
在HPLC小瓶中，将3μmol酯(1:H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-OCam-Leu-OH、2：H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-OCam-Leu-OH或3：H-1His-2Ala-3Glu-4Gly-5Thr-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser-OCam-Leu-OH)以及2μmol胺(1：H-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH、2：H-6Phe-7Thr-8Ser-9Asp-10Val-11Ser12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH或3：H-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys(Pal-γ-Glu)-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-27Val-28Arg-29Gly-30Arg-31Gly-OH)溶解于950μL水中。向此混合物中添加50μL 1M N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸缓冲液(pH 9.0)并使用3M NaOH溶液将pH调整至8.1。随后，添加10μL的TCEP溶液(在水中100mg/mL)和100μL的连接酶(根据SEQ ID NO:3)溶液(10mg/mL)。将混合物在环境温度下反应。每15分钟，将10μL反应混合物取出并在980μL 5vol％MSA中在乙腈/水(2/1，v/v)中淬灭并用LC-MS分析。
180分钟后，用于三个反应的每一个反应的Cam-酯起始材料已经被消耗。分析得到的产物混合物的样品，并将产物和水解峰整合。对于1的连接产物是72面积％，对于2的是53面积％，对于3的是95面积％。
序列
SEQ ID NO 1：编码枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸-107至275的野生型基因
ENA|K02496|K02496.1 B.枯草杆菌蛋白酶BPN'解淀粉芽孢杆菌
Figure BDA0002672128430000381
SEQ ID NO 2：野生型枯草杆菌蛋白酶BPN’(成熟)
>SUBT_BACAM枯草杆菌蛋白酶BPN'解淀粉芽孢杆菌成熟1至275
>sp|P00782|108-382
Figure BDA0002672128430000391
SEQ ID NO 3：具有突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、N62A、A73L、Δ75-83、E156N、G166E、G169A、S188P、F189W、Q206C、N212G、Y217H、N218D、S221C、M222P、P225N、T254A，以及Q271E和His标签的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体
Figure BDA0002672128430000392
SEQ ID NO 14：具有突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、Δ75-83、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217H、S221C、M222P、P225N、T254A，以及Q271E和His标签的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体
Figure BDA0002672128430000393
序列表
<110> 恩细贝普有限公司
<120> 利拉鲁肽、索马鲁肽和GLP-1的化学酶促合成
<130> FK19044-02-PAT-WO
<150> EP 18161084.1
<151> 2018-03-09
<160> 14
<170> PatentIn3.5版
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (322)..(1149)
<400> 1
gtgagaggca aaaaagtatg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60
gcgttcggca gcacatcctc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga aaagaaatat 120
attgtcgggt ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagaagaa agatgtcatt 180
tctgaaaaag gcgggaaagt gcaaaagcaa ttcaaatatg tagacgcagc ttcagctaca 240
ttaaacgaaa aagctgtaaa agaattgaaa aaagacccga gcgtcgctta cgttgaagaa 300
gatcacgtag cacatgcgta c gcg cag tcc gtg cct tac ggc gta tca caa 351
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln
1 5 10
att aaa gcc cct gct ctg cac tct caa ggc tac act gga tca aat gtt 399
Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val
15 20 25
aaa gta gcg gtt atc gac agc ggt atc gat tct tct cat cct gat tta 447
Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu
30 35 40
aag gta gca ggc gga gcc agc atg gtt cct tct gaa aca aat cct ttc 495
Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe
45 50 55
caa gac aac aac tct cac gga act cac gtt gcc ggc aca gtt gcg gct 543
Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala
60 65 70
ctt aat aac tca atc ggt gta tta ggc gtt gcg cca agc gca tca ctt 591
Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu
75 80 85 90
tac gct gta aaa gtt ctc ggt gct gac ggt tcc ggc caa tac agc tgg 639
Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp
95 100 105
atc att aac gga atc gag tgg gcg atc gca aac aat atg gac gtt att 687
Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile
110 115 120
aac atg agc ctc ggc gga cct tct ggt tct gct gct tta aaa gcg gca 735
Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala
125 130 135
gtt gat aaa gcc gtt gca tcc ggc gtc gta gtc gtt gcg gca gcc ggt 783
Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly
140 145 150
aac gaa ggc act tcc ggc agc tca agc aca gtg ggc tac cct ggt aaa 831
Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys
155 160 165 170
tac cct tct gtc att gca gta ggc gct gtt gac agc agc aac caa aga 879
Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg
175 180 185
gca tct ttc tca agc gta gga cct gag ctt gat gtc atg gca cct ggc 927
Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly
190 195 200
gta tct atc caa agc acg ctt cct gga aac aaa tac ggg gcg tac aac 975
Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn
205 210 215
ggt acg tca atg gca tct ccg cac gtt gcc gga gcg gct gct ttg att 1023
Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile
220 225 230
ctt tct aag cac ccg aac tgg aca aac act caa gtc cgc agc agt tta 1071
Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu
235 240 245 250
gaa aac acc act aca aaa ctt ggt gat tct ttc tac tat gga aaa ggg 1119
Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly
255 260 265
ctg atc aac gta cag gcg gca gct cag taa 1149
Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln
270 275
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌
<400> 2
Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala
260 265 270
Ala Ala Gln
275
<210> 3
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变枯草杆菌蛋白酶B
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (267)..(272)
<223> His标签
<400> 3
Ala Lys Cys Val Ser Tyr Gly Val Ala Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Ala Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala Val Ala Pro Ser Ala Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser
85 90 95
Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val
100 105 110
Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala
115 120 125
Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala
130 135 140
Gly Asn Asn Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Glu Tyr Pro Ala
145 150 155 160
Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln
165 170 175
Arg Ala Pro Trp Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro
180 185 190
Gly Val Ser Ile Cys Ser Thr Leu Pro Gly Gly Lys Tyr Gly Ala His
195 200 205
Asp Gly Thr Cys Pro Ala Ser Asn His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
210 215 220
Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser
225 230 235 240
Leu Glu Asn Thr Ala Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys
245 250 255
Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln His His His His His His
260 265 270
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有肽片段
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 也可以是α-氨基-异丁酸单元
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (20)..(20)
<223> Lys具有游离的侧链ε-氨基或被保护基团保护的侧链ε-氨基或被氨基酸或另一官能团官能化的侧链ε-氨基
<220>
<221> 变体
<222> (28)..(28)
<223> 也可以是K
<400> 4
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (20)..(20)
<223> Lys是Lys(Pal-γ-Glu)-
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (20)..(20)
<223> Lys是Lys(Pal-γ-Glu)
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 7
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (2)..(2)
<223> bAib
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (20)..(20)
<223> Lys是Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-17-羧基十七烷酰基)
<400> 7
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于产生利拉鲁肽的偶联试剂
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (20)..(20)
<223> Lys是Lys(Pal-Glu-OX)，其中X是H或保护基团
<400> 8
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于偶联的13-mer C末端酯
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (14)..(14)
<223> 是OCam-Leu
<400> 9
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18-mer偶联肽
<400> 10
Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly
1 5 10 15
Arg Gly
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11-mer偶联肽
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 也可以是α-氨基-异丁酸单元
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (11)..(11)
<223> 硫酯
<400> 11
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20-mer偶联肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (9)..(9)
<223> Lys具有游离的侧链ε-氨基或被保护基团保护的侧链ε-氨基或被氨基酸或另一官能团官能化的侧链ε-氨基
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (17)..(17)
<223> 也可以是Lys
<400> 12
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Arg Gly Arg Gly
20
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20-mer偶联肽
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (9)..(9)
<223> Lys(Pal-γ-Glu-OH)
<220>
<221> 经修饰的残基
<222> (9)..(9)
<223> Lys(Pal-γ-Glu-OH)或Lys(γ-Glu-OH)
<400> 13
Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Arg Gly Arg Gly
20
<210> 14
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变枯草杆菌蛋白酶B
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (267)..(272)
<223> His标签
<400> 14
Ala Lys Cys Val Ser Tyr Gly Val Ala Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Leu Ala Val Ala Pro Ser Ala Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser
85 90 95
Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val
100 105 110
Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala
115 120 125
Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala
130 135 140
Gly Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Ser Tyr Pro Ala
145 150 155 160
Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln
165 170 175
Arg Ala Pro Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro
180 185 190
Gly Val Ser Ile Cys Ser Thr Leu Pro Gly Gly Lys Tyr Gly Ala His
195 200 205
Ser Gly Thr Cys Pro Ala Ser Asn His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
210 215 220
Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser
225 230 235 240
Leu Glu Asn Thr Ala Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys
245 250 255
Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln His His His His His His
260 265 270

Claims (17)

1.一种用于合成肽的方法，所述肽包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly，所述方法包括将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含第一肽片段的肽C末端酯或硫酯，所述第一肽片段包含序列His-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯；以及
(b)具有包含第二肽片段的N末端未保护的胺的肽亲核试剂，所述第二肽片段包含序列H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Z-Gly-Arg-Gly
其中
-X是Ala或α-氨基-异丁酸(Aib)残基；
-Y是Lys，所述Lys具有游离侧链ε-氨基基团或所述Lys的侧链ε-氨基基团被保护基团保护或所述Lys的侧链ε-氨基基团被氨基酸或另一种官能团官能化，特别是选自由以下组成的组的官能团官能化：γ-Glu-OH、Pal-γ-Glu-OH、AEEA-AEEA-γ-Glu-OH和AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH，
其中Pal是棕榈酰基并且AEEA-AEEA是-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基；
-Z是Arg或Lys；
所述酶促偶联通过连接酶进行催化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中合成的所述肽是利拉鲁肽。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(Pal-γ-Glu-OH)。
4.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)由式P-Wv-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫酯，
其中P是保护基团，v是具有至少为0的值的整数，优选为1-5，更优选为1-3，最优选为1，并且每个W独立地表示相同的或不同的氨基酸残基，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly；并且然后
提供所述具有棕榈酰基基团(Pal)的Lys(γ-Glu-OH)。
5.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是具有游离ε-氨基侧链的赖氨酸残基；并且然后提供所述具有Pal-γ-Glu-OH的氨基侧链。
6.根据权利要求1所述的方法，其中合成的所述肽是索马鲁肽。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH)。
8.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)由式P-Wv-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯表示的肽C末端酯或硫酯，
其中P是保护基团，v是具有至少为0的值的整数，优选为1-5，更优选为1-3，最优选为1，并且每个W独立地表示相同的或不同的氨基酸残基，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OH)；并且然后提供具有17-羧基十七烷酰基基团的Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OH)。
9.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括通过连接酶催化将以下(a)和(b)酶促偶联：
(a)包含以下序列的肽C末端酯或硫酯：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-(硫)酯，和
(b)包含以下序列的肽亲核试剂：H-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Y-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，其中Y是具有游离侧链的赖氨酸残基；并且然后提供具有AEEA-AEEA-γ-Glu-N-17-羧基十七烷酰基-OH基团的Lys的ε-氨基侧链。
10.根据权利要求1所述的方法，其中合成的所述肽是GLP-1。
11.根据权利要求4或8所述的方法，其中v是1。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接酶是枯草杆菌蛋白酶BPN’变体或其同源物，其与由SEQ ID NO:2或其同源序列表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’相比包含以下突变：
-对应于位置75-83的氨基酸的缺失；
-在对应于S221的氨基酸位置处的突变，所述突变是S221C或S221硒代半胱氨酸；
-优选在对应于P225的氨基酸位置处的突变；
其中这些氨基酸位置是根据由SEQ ID NO:2表示的枯草杆菌蛋白酶BPN’的序列定义的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述连接酶包含1-13个突变，特别是6-12个突变，更特别是8-11个突变，所述突变选自：在对应于SEQ ID NO:2的Q2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、S188、Q206、N212、T254和Q271的氨基酸位置处的突变，其中优选地所述突变中的一个或多个、更优选地所述突变中的至少六个、最优选地所述突变中的至少十二个选自：对应于Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、S188P、Q206C、N212G、T254A和Q271E的位置。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽C末端酯或硫酯的(硫)酯是Cam-AA1-AA2-酯，其中AA1表示具有未保护的侧链官能团的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸单元，并且AA2表示具有未保护的侧链官能团的精氨酸或赖氨酸单元。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述连接酶是具有SEQ ID NO:3的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，或具有SEQ ID NO:14的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，或其具有至少80％、优选95％序列同一性的同源物，所述连接酶任选地包含His标签。
16.一种具有SEQ ID NO:3的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，其包含突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、N62A、A73L、Δ75-83、E156N、G166E、G169A、S188P、F189W、Q206C、N212G、Y217H、N218D、S221C、M222P、P225N、T254A、Q271E，或其具有至少80％、或85％、或90％、优选95％序列同一性的同源物，任选地包含His标签。
17.一种具有SEQ ID NO:14的枯草杆菌蛋白酶BPN’变体，其包含突变Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、Δ75-83、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217H、S221C、M222P、P225N、T254A和Q271E，或其具有至少80％、或85％、或90％、优选95％序列同一性的同源物，任选地包含His标签。
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