CN106085998A - 一种用于制备ε‑聚赖氨酸的微生物球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于制备ε‑聚赖氨酸的微生物球的制备方法，属于ε‑聚赖氨酸制备技术领域。本发明利用蚕茧为原料进行处理，将自制培养基作为填充物，对处理蚕茧壳进行填充，制得微生物球基体，浸泡于由无菌水淋洗培养菌种的培养基表面得到的淋洗液中，之后再移入海藻酸钠浸泡，进行包裹，再使用竹膜进行表面包裹，从而得到ε‑聚赖氨酸的微生物球的制备方法。实例证明，本发明操作简单，反应条件温和，仪器取材容易，显著提高了ε‑聚赖氨酸的发酵产量和生产强度，最终使得制得的ε‑聚赖氨酸收率和纯度均达到了90％以上，可用于工业化生产。

Description

一种用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球的制备方法

技术领域

本发明公开了一种用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球的制备方法，属于ε-聚赖氨酸制备技术领域。

背景技术

食品的腐败变质会引起巨大的经济损失，如何防止腐败是食品科学工作者最为关注的一个问题.。目前，常用的防腐措施是添加食品防腐剂，食品防腐剂分为化学防腐剂、天然防腐剂和复合型防腐剂，其中使用最为广泛的是化学防腐剂.目前。除矿泉水、纯净水以外，几乎所有保质期超过一个月以上的饮料(包括儿童饮用的各种饮料)，蜜饯、酱菜等食品，包括药品、保健食品口服液的保鲜，均需加入抗菌防腐剂。常规的抗菌防腐剂主要是化学合成的，如苯甲酸钠、山梨酸钾等，毒理学安全评价早已证明，长期使用苯甲酸钠会对人的肝脏产生危害，并可致癌；山梨酸钾也对人体有一定的副作用，随着人们对健康的重视，天然防腐剂和复合型防腐剂的应用会越来越广泛.。因此，研发天然、无副作用的抗菌防腐剂代替化学抗菌防腐剂已成为必然的趋势。

ε-聚赖氨酸是一种新型的天然防霉防腐剂，它不但对人体健康无害，有的还具有一定的营养价值，是今后开发的方向。ε-聚赖氨酸是L-赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接而成的均聚氨基酸，故称为ε-聚赖氨酸。ε-聚赖氨酸具有广谱抗菌性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果，是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物类饲料防腐剂。

ε-聚赖氨酸生物防腐剂是一种天然的微生物代谢产物，是需要经分离提取精制而获得的发酵产品。但是，提取工艺繁琐、收率低、含量低、纯度低、费用高一直是限制ε-聚赖氨酸工业化的重要因素，但目前葡萄糖和甘油都是ε-PL产生菌最适碳源。以葡萄糖为唯一碳源时，ε-PL产生菌的发酵速度快，但ε-PL产量低，葡萄糖转化率低。以甘油为唯一碳源时，转化率高，ε-PL产量高，但发酵速度慢。然而，我们研究发现简单的将葡萄糖和甘油混合共同作为碳源用于ε-PL发酵却并不能有效提高ε-PL发酵水平。

发明内容

本发明主要解决的技术问题：针对目前传统方法制备ε-聚赖氨酸的过程中，提取工艺繁琐，且在发酵的过程中，利用简单的葡萄糖和甘油混合，用于发酵不能有效提高ε-聚赖氨酸发酵水平，导致制得的ε-聚赖氨酸收率、纯度均较低的现状，提供了一种利用蚕茧为原料进行处理，将自制培养基作为填充物，对处理蚕茧壳进行填充，制得微生物球基体，浸泡于由无菌水淋洗培养菌种的培养基表面得到的淋洗液中，之后再移入海藻酸钠浸泡，进行包裹，再使用竹膜进行表面包裹，从而得到ε-聚赖氨酸的微生物球的制备方法。该方法操作简单，反应条件温和，仪器取材容易，显著提高了ε-聚赖氨酸的发酵产量和生产强度，最终使得制得的ε-聚赖氨酸收率和纯度均达到了90％以上，可用于工业化生产。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

（1）使用水将蚕茧壳表面洗净，再按固液比1:3，将其与质量分数为1.2％碳酸氢钠溶液放入低压锅中，设定压力为70～80kPa，温度为95～100℃，蒸煮50～70min后自然冷却至室温，过滤收集蚕茧壳浸泡于质量分数为15％的氨水溶液中，再置于15～20℃下静置2～4h；

（2）上述静置后过滤，将过滤后的蚕茧壳与蒸馏水按固体比1:3混合均匀，并置于超声振荡器中，在23～26KHz下振荡50～60min，过滤并将滤渣放入风干机中风干，得处理蚕茧壳；

（3）按重量份数计，取60～70份蛋白胨、40～50份酵母浸膏、20～25份玉米胚芽粕、1～3份制霉素、0.3～0.6份磷酸二氢钾、0.4～0.5份磷酸氢二钾、0.6～0.8份水杨酸及6～8份琼脂搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基，将所得的培养基填充至上述处理蚕茧壳中，得微生物球基体，备用；

（4）按接种量10～15％，将乳酸链球菌接种至上述培养基，并将培养基移至恒温摇床中，设定温度为28～32℃，使用紫外线进行照射，培养10～15h，再将培养基移至微波反应器中，室温下培养4～6h，随后取出，使用无菌水淋洗培养基表面至其表面无菌丝，收集淋洗液；

（5）将步骤（3）备用的微生物球基体浸泡于上述淋洗液，蚕茧壳开口朝上，使淋洗液淹没微生物球基体，静置4～6h，将微生物球基体取出浸泡于质量分数为1.2％的海藻酸钠溶液中，静置3～5min，将微生物球基体取出室温下风干，使用竹膜将其表面包裹，即可得用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球。

本发明的应用方法是：将本发明制得的ε-聚赖氨酸的微生物球放入发酵罐中，在温度35～55℃，相对湿度38～42％下密封发酵5～7天，待发酵完毕，取出，经检测，经此发酵制得的ε-聚赖氨酸收率和纯度均达到了90％以上，比传统发酵法收率提高了1～2倍，可用于工业化生产。

本发明的有益效果是：

（1）本发明操作简单，反应条件温和，仪器取材容易，发酵条件容易掌握，从而显著提高了ε-聚赖氨酸的发酵产量和生产强度；

（2）本发明使得制得的ε-聚赖氨酸能力强，收率和纯度均达到了90％以上，可用于工业化生产。

具体实施方式

首先使用水将蚕茧壳表面洗净，再按固液比1:3，将其与质量分数为1.2％碳酸氢钠溶液放入低压锅中，设定压力为70～80kPa，温度为95～100℃，蒸煮50～70min后自然冷却至室温，过滤收集蚕茧壳浸泡于质量分数为15％的氨水溶液中，再置于15～20℃下静置2～4h；上述静置后过滤，将过滤后的蚕茧壳与蒸馏水按固体比1:3混合均匀，并置于超声振荡器中，在23～26KHz下振荡50～60min，过滤并将滤渣放入风干机中风干，得处理蚕茧壳；随后按重量份数计，取60～70份蛋白胨、40～50份酵母浸膏、20～25份玉米胚芽粕、1～3份制霉素、0.3～0.6份磷酸二氢钾、0.4～0.5份磷酸氢二钾、0.6～0.8份水杨酸及6～8份琼脂搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基，将所得的培养基填充至上述处理蚕茧壳中，得微生物球基体，备用；接下来按接种量10～15％，将乳酸链球菌接种至上述培养基，并将培养基移至恒温摇床中，设定温度为28～32℃，使用紫外线进行照射，培养10～15h，再将培养基移至微波反应器中，室温下培养4～6h，随后取出，使用无菌水淋洗培养基表面至其表面无菌丝，收集淋洗液；最后将上述备用的微生物球基体浸泡于上述淋洗液，蚕茧壳开口朝上，使淋洗液淹没微生物球基体，静置4～6h，将微生物球基体取出浸泡于质量分数为1.2％的海藻酸钠溶液中，静置3～5min，将微生物球基体取出室温下风干，使用竹膜将其表面包裹，即可得用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球。

实例1

首先使用水将蚕茧壳表面洗净，再按固液比1:3，将其与质量分数为1.2％碳酸氢钠溶液放入低压锅中，设定压力为70kPa，温度为95℃，蒸煮50min后自然冷却至室温，过滤收集蚕茧壳浸泡于质量分数为15％的氨水溶液中，再置于15℃下静置2h；上述静置后过滤，将过滤后的蚕茧壳与蒸馏水按固体比1:3混合均匀，并置于超声振荡器中，在23KHz下振荡50min，过滤并将滤渣放入风干机中风干，得处理蚕茧壳；随后按重量份数计，取60份蛋白胨、40份酵母浸膏、20份玉米胚芽粕、1份制霉素、0.3份磷酸二氢钾、0.4份磷酸氢二钾、0.6份水杨酸及6份琼脂搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基，将所得的培养基填充至上述处理蚕茧壳中，得微生物球基体，备用；接下来按接种量10％，将乳酸链球菌接种至上述培养基，并将培养基移至恒温摇床中，设定温度为28℃，使用紫外线进行照射，培养10h，再将培养基移至微波反应器中，室温下培养4h，随后取出，使用无菌水淋洗培养基表面至其表面无菌丝，收集淋洗液；最后将上述备用的微生物球基体浸泡于上述淋洗液，蚕茧壳开口朝上，使淋洗液淹没微生物球基体，静置4h，将微生物球基体取出浸泡于质量分数为1.2％的海藻酸钠溶液中，静置3min，将微生物球基体取出室温下风干，使用竹膜将其表面包裹，即可得用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球。

本实例操作简便，使用时，将本发明制得的ε-聚赖氨酸的微生物球放入发酵罐中，在温度35℃，相对湿度38％下密封发酵5天，待发酵完毕，取出，经检测，经此发酵制得的ε-聚赖氨酸收率和纯度均达到了90％，比传统发酵法收率提高了1倍，可用于工业化生产。

实例2

首先使用水将蚕茧壳表面洗净，再按固液比1:3，将其与质量分数为1.2％碳酸氢钠溶液放入低压锅中，设定压力为75kPa，温度为98℃，蒸煮60min后自然冷却至室温，过滤收集蚕茧壳浸泡于质量分数为15％的氨水溶液中，再置于18℃下静置3h；上述静置后过滤，将过滤后的蚕茧壳与蒸馏水按固体比1:3混合均匀，并置于超声振荡器中，在25KHz下振荡55min，过滤并将滤渣放入风干机中风干，得处理蚕茧壳；随后按重量份数计，取65份蛋白胨、45份酵母浸膏、23份玉米胚芽粕、2份制霉素、0.5份磷酸二氢钾、0.45份磷酸氢二钾、0.7份水杨酸及7份琼脂搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基，将所得的培养基填充至上述处理蚕茧壳中，得微生物球基体，备用；接下来按接种量13％，将乳酸链球菌接种至上述培养基，并将培养基移至恒温摇床中，设定温度为30℃，使用紫外线进行照射，培养13h，再将培养基移至微波反应器中，室温下培养5h，随后取出，使用无菌水淋洗培养基表面至其表面无菌丝，收集淋洗液；最后将上述备用的微生物球基体浸泡于上述淋洗液，蚕茧壳开口朝上，使淋洗液淹没微生物球基体，静置5h，将微生物球基体取出浸泡于质量分数为1.2％的海藻酸钠溶液中，静置4min，将微生物球基体取出室温下风干，使用竹膜将其表面包裹，即可得用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球。

本实例操作简便，使用时，将本发明制得的ε-聚赖氨酸的微生物球放入发酵罐中，在温度45℃，相对湿度40％下密封发酵6天，待发酵完毕，取出，经检测，经此发酵制得的ε-聚赖氨酸收率和纯度均达到了92％，比传统发酵法收率提高了1.5倍，可用于工业化生产。

实例3

首先使用水将蚕茧壳表面洗净，再按固液比1:3，将其与质量分数为1.2％碳酸氢钠溶液放入低压锅中，设定压力为80kPa，温度为100℃，蒸煮70min后自然冷却至室温，过滤收集蚕茧壳浸泡于质量分数为15％的氨水溶液中，再置于20℃下静置4h；上述静置后过滤，将过滤后的蚕茧壳与蒸馏水按固体比1:3混合均匀，并置于超声振荡器中，在26KHz下振荡60min，过滤并将滤渣放入风干机中风干，得处理蚕茧壳；随后按重量份数计，取70份蛋白胨、50份酵母浸膏、25份玉米胚芽粕、3份制霉素、0.6份磷酸二氢钾、0.5份磷酸氢二钾、0.8份水杨酸及8份琼脂搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基，将所得的培养基填充至上述处理蚕茧壳中，得微生物球基体，备用；接下来按接种量15％，将乳酸链球菌接种至上述培养基，并将培养基移至恒温摇床中，设定温度为32℃，使用紫外线进行照射，培养15h，再将培养基移至微波反应器中，室温下培养6h，随后取出，使用无菌水淋洗培养基表面至其表面无菌丝，收集淋洗液；最后将上述备用的微生物球基体浸泡于上述淋洗液，蚕茧壳开口朝上，使淋洗液淹没微生物球基体，静置6h，将微生物球基体取出浸泡于质量分数为1.2％的海藻酸钠溶液中，静置5min，将微生物球基体取出室温下风干，使用竹膜将其表面包裹，即可得用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球。

本实例操作简便，使用时，将本发明制得的ε-聚赖氨酸的微生物球放入发酵罐中，在温度55℃，相对湿度42％下密封发酵7天，待发酵完毕，取出，经检测，经此发酵制得的ε-聚赖氨酸收率和纯度均达到了95％，比传统发酵法收率提高了2倍，可用于工业化生产。

Claims (1)

1.一种用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：

（1）使用水将蚕茧壳表面洗净，再按固液比1:3，将其与质量分数为1.2％碳酸氢钠溶液放入低压锅中，设定压力为70～80kPa，温度为95～100℃，蒸煮50～70min后自然冷却至室温，过滤收集蚕茧壳浸泡于质量分数为15％的氨水溶液中，再置于15～20℃下静置2～4h；

（2）上述静置后过滤，将过滤后的蚕茧壳与蒸馏水按固体比1:3混合均匀，并置于超声振荡器中，在23～26KHz下振荡50～60min，过滤并将滤渣放入风干机中风干，得处理蚕茧壳；

（3）按重量份数计，取60～70份蛋白胨、40～50份酵母浸膏、20～25份玉米胚芽粕、1～3份制霉素、0.3～0.6份磷酸二氢钾、0.4～0.5份磷酸氢二钾、0.6～0.8份水杨酸及6～8份琼脂搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基，将所得的培养基填充至上述处理蚕茧壳中，得微生物球基体，备用；

（4）按接种量10～15％，将乳酸链球菌接种至上述培养基，并将培养基移至恒温摇床中，设定温度为28～32℃，使用紫外线进行照射，培养10～15h，再将培养基移至微波反应器中，室温下培养4～6h，随后取出，使用无菌水淋洗培养基表面至其表面无菌丝，收集淋洗液；

（5）将步骤（3）备用的微生物球基体浸泡于上述淋洗液，蚕茧壳开口朝上，使淋洗液淹没微生物球基体，静置4～6h，将微生物球基体取出浸泡于质量分数为1.2％的海藻酸钠溶液中，静置3～5min，将微生物球基体取出室温下风干，使用竹膜将其表面包裹，即可得用于制备ε-聚赖氨酸的微生物球。