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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung unter Verwendung eines
Mikroorganismus mit Nitrilhydratase-Aktivität.
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Technischer Hintergrund
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Kürzlich wurde
ein Verfahren zur Synthetisierung einer Verbindung unter Verwendung
eines Bio-Katalysators zur Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen
verwendet, da es Vorteile, wie beispielsweise milde Reaktionsbedingungen,
vereinfachte Reaktionsverfahren und eine hohe Reinheit der Reaktionsprodukte
aufgrund geringer Mengen an Nebenprodukten gibt.
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Seit
der Entdeckung von Nitrilhydratase, einem Enzym, das eine Nitrilverbindung
in eine Amidverbindung umwandelt, ist die Verwendung eines Biokatalysators
zur Herstellung von Amidverbindungen aktiv untersucht worden (
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 11-123098 ,
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7-265091 ,
JP Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 56-38118 und
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 11-89575 ).
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Gegenwärtig wird
ein Mikroorganismus, der Nitrilhydratase-Aktivität besitzt, zur Herstellung
von Acrylamid, Nicotinamid oder ähnlicher
auf industriellem Niveau für
ein verbessertes Reaktionsverfahren unter Gesichtspunkten der Durchführbarkeit,
der Sicherheit, der wirtschaftlichen Effizienz und anderer Faktoren
verwendet.
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Bis
heute sind eine beträchtliche
Anzahl Mikroorganismen gefunden worden, die Nitrilhydratase-Aktivitäten aufweisen.
Beispiele hierfür
schließen Mikroorganismen
ein, die zu den Genera Nocardia, Corynebacterium, Bacillus, Pseudomonas,
Micrococcus, Rhodococcus, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces,
Rhizobium, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter,
Achromobacter, Agrobacterium und Pseudonocardia gehören.
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Hierunter
exprimieren die Genera Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus und Pseudonocardia eine
Nitrilhydratase mit sehr hohem Niveau an Aktivität und Stabilität. Daher
werden diese auf industriellem Niveau oder ähnlichen Niveaus verwendet.
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Des
Weiteren ist bei der Kultivierung dieser Mikroorganismen bekannt,
dass eine mikrobielle Zelle mit hoher aktiver Nitrilhydratase durch
ein Verfahren gewonnen wird, bei dem Nitrile oder Amide (
JP Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 61-43996 und
61-43999 ) zugegeben werden,
ein Verfahren, bei dem Aminosäure
hinzugegeben wird (
JP Patentveröffentlichung
(Kokoku) Nr. 61-43997 und
61-43998 ), ein
Verfahren, bei dem eine Art von Metallionen hinzugegeben wird (
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 61-162193 ,
JP Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 6-55148 und
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 8-187092 ),
oder ähnliche.
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Im
Gegensatz dazu hat ein Biokatalysator im Hinblick auf die Wärme eine
geringe Stabilität,
und daher müssen
die Reaktionen bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden.
Das führt
zu einer verminderten Reaktionsgeschwindigkeit pro Katalysator. Wenn
eine Verbindung hergestellt wird, indem ein Biokatalysator auf industriellem
Niveau hergestellt wird, sollte die Katalysatorkonzentration im
Reaktionsgefäß daher
erhöht
werden.
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Ein
derzeit bekanntes industrielles Verfahren zur Herstellung einer
Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung unter Verwendung eines
Biokatalysators wird gleichermaßen
durch die Immobilisierung mikrobieller Zellen durchgeführt, um
sie partikelförmig
zu machen, die Katalysatorkonzentration im Reaktionsgefäß zu erhöhen, und
die Abtrennung des Katalysators zu erleichtern (siehe Kagaku to
Kogyo (Chemistry and Chemical Industry) Vol. 43, Nr. 7, S. 1098–1101 (1990),
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 54-143593 und
54-144889 ). Ebenfalls
wird ein Verfahren zur Immobilisierung der Zelle untersucht (siehe
JP Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 57-39792 und
62-294083 ). Wenn die effiziente
Produktion einer Amidverbindung auf industriellem Niveau beabsichtigt
wurde, wurde die Immobilisierung von Zellen in einer höheren Konzentration
als wichtig angesehen (siehe
JP
Patentveröffentlichung
(Kokai) Nr. 7-203964 ).
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Jedoch
haben die vorstelligen Erfinder eine mikrobielle Zelle, die eine
starke Nitrilhydratase-Aktivität
aufweist „entrap"-immobilisiert und
sie in der Reaktion verwendet. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass eine
Nitrilverbindung als ein Reaktionssubstrat und/oder eine Amidverbindung
als Reaktionsprodukt Diffusionsdefekte bei „entrap"-immobilisierten
Partikeln verursacht, und die Reaktionsgeschwindigkeit wurde signifikant
vermindert.
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Beispielsweise
war die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von den Reaktionsbedingungen
bei einem Vergleich der anfänglichen
Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen den „entrap"-immobilisierten
Zellen und den nicht immobilisierten Zellen signifikant auf ein
Zehntel oder darunter vermindert. Nicht nur die anfängliche
Reaktionsgeschwindigkeit wird signifikant verringert, sondern auch
die Aktivität
des Enzyms in dem „entrap"-immobilisierten
Katalysator, welcher aufgrund eines Diffusionsdefektes nicht vollständig an
der Reaktion teilnehmen kann, so dass diese während der Reaktion vermindert
wird. Dies vermindert auch die Menge der Amidverbindung, die pro
Menge Zelleinheiten produziert wird.
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Genauer
führt die
verminderte Reaktionsgeschwindigkeit oder die verringerte Menge
der Amidverbindung, die pro Menge Zelleinheiten hergestellt wird,
wie oben erwähnt
wurde, zu nachteiligen Bedingungen. Unter derartigen Bedingungen
dauert es lange, um die Zielverbindung anzuhäufen, wenn eine Amidverbindung
in einer Batch-Reaktion hergestellt wird, und die Größen der
Anlagen müssen
im Falle einer kontinuierlichen Reaktion vergrößert werden.
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Daher
ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Probleme zu lösen, die
beim Verfahren zur Herstellung einer Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung
unter Verwendung eines Biokatalysators auftreten, wie beispielsweise
die verringerte Reaktionsgeschwindigkeit oder die verminderte Menge
der Amidverbindung, die pro Menge Zelleinheit hergestellt wird.
Diese Probleme werden durch die Verwendung einer immobilisierten
mikrobiellen Zelle verursacht, die eine starke Hydrilhydratase-Aktivität aufweist.
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Um
das obige Ziel zu erreichen, haben die vorstelligen Erfinder konzentrierte
Untersuchungen bezüglich
einer besser geeigneteren Form eines Katalysators als des immobilisierten
Katalysators durchgeführt.
Im Ergebnis haben sie herausgefunden, dass eine Amidverbindung effizienter
hergestellt werden könnte,
wenn eine mikrobielle Zelle verwendet wird, die eine hohe Nitrilhydratase-Aktivität von 50
U oder darüber
pro mg trockener Zellen bei 10°C
aufweist, und bei der die mikrobielle Zelle mit einer Nitrilverbindung
in Kontakt gebracht wird, während
diese in einem wässrigen
Medium suspendiert sind, als im Falle, wenn die Zelle immobilisiert
wird. Dies hat zur Vollendung der vorliegenden Erfindung geführt.
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Genauer
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung unter Verwendung
eines mikrobiellen Katalysators, wobei eine mikrobielle Zelle mit Nitrilhydratase-Aktivität von 50
U oder höher pro
mg Trockenzellmasse bei Reaktionstemperaturen von 10°C mit einer
Nitrilverbindung in einem wässrigen
Medium in Kontakt gebracht wird, ohne immobilisiert zu sein.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.
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In
der vorliegenden Erfindung kann ein Mikroorganismus verwendet werden,
der eine Nitrilhydratase-Aktivität
hat, die 50 U oder darüber
pro mg Trockenzellmasse bei einer Reaktionstemperatur von 10°C beträgt, welche
durch FERM BP-1478 definiert wird.
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Die
Einheit „U" der Enzymaktivität, die erfindungsgemäß verwendet
wird, bedeutet, dass 1 μmol der
entsprechenden Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung pro Minute
hergestellt wird. Der Begriff „Enzymaktivität", der hier verwendet
wird, bezieht sich auf den Wert der Enzymaktivität, welcher unter Verwendung
einer Nitrilverbindung gemessen wird, die in der Produktion verwendet
wird.
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Die
Enzymaktivität
wird durch das Platzieren von 5 ml 50 mM Phosphatpuffer, welcher
auf einen optimalen pH des Enzyms eingestellt ist (z. B. pH 7) in
einem Teströhrchen
mit einem Durchmesser von 30 mm, das Suspendieren von 2 mg der kultivierten und
gewaschenen Zellen (Trockengewicht) hierin sowie das Schütteln des
Röhrchens
in einem Wasserbad bei 10°C
gemessen. Ungefähr
5 Minuten später wird
ein Phosphatpuffer, der zuvor hergestellt worden ist, und 1 bis
5% Nitrilverbindung enthält,
bei 10°C platziert
und auf den optimalen pH-Wert eingestellt wurde, hinzugegeben. Die
Konzentration der Amidverbindung, die nach einer gewählten Reaktionsdauer
generiert wird, wird unter Verwendung einer Analyseausrüstung gemessen,
wie beispielsweise der Gas- Chromatographie
oder Flüssigkeits-Chromatographie,
wodurch die Enzymaktivität berechnet
wird.
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Die
Reaktionsdauer wird so bestimmt, dass eine Reaktionslösung eine
Nitrilverbindung in einer Konzentration zurückhält, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit
nicht verringert wird, und die Konzentration der Amidverbindung,
welche erzeugt wird, hoch genug ist, um am Ende der Reaktion akkurat gemessen
zu werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist effizient, wenn eine mikrobielle Zelle
mit einer Enzymaktivität
von 50 U oder höhe
pro mg Trockenzellmasse bei 10°C
verwendet wird. Sie ist effizienter unter Verwendung einer mikrobiellen
Zelle mit einer Enzymaktivität
von 80 U oder darüber,
und noch effizienter bei einer Aktivität von 100 U oder darüber.
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Die
Nitrilverbindung wird durch die Einwirkung der Nitrilhydratase in
eine entsprechende Amidverbindung umgewandelt. Beispiele hierfür schließen ein:
aliphatische gesättigte
Nitrile, die beispielsweise dargestellt werden durch Acetonitril,
Propionitril, Succinonitril und Adiponitril; aliphatische ungesättigte Nitrile,
die beispielhaft dargestellt werden durch Acrylonitril und Methacrylonitril;
aromatische Nitrile, die beispielhaft dargestellt werden durch Benzonitril
und Phthalodinitril; und heterozyklische Nitrile, die beispielhaft
dargestellt werden durch 3-Cyanopyridin und 2-Cyanopyridin. Aufgrund
der chemischen und physikalischen Eigenschaften einer Nitrilverbindung
sind die Substratspezifität
eines Nitrilhydrataseenzyms und vom industriellen Standpunkt aus gesehen,
sind Acrylonitril und Cyanopyridin als Zielverbindungen der vorliegenden
Erfindung bevorzugt.
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Erfindungsgemäß ist ein
mikrobieller Katalysator, der durch FERM BP-1478 definiert wird,
ohne „entrap"-immobilisiert zu
sein, so, dass die Membran der mikrobiellen Zelle mit der Reaktionslösung in
direktem Kontakt ist. Ein Beispiel hierfür ist eine Form eines Katalysators,
der in einem „entrap"-Immobilisierungsverfahren behandelt
wird, bei dem die Zelle nicht von hoch-molekulargewichtigen Substanzen, wie
Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Carrageenan, Agar, Gelatine oder
Alginsäure
eingefangen ist. Genauer gesagt ist der „Katalysator ohne „entrap"-immobilisiert zu
sein" gemäß der vorliegenden
Erfindung eine mikrobielle Zelle, die durch FERM BP-1478 definiert
wird, welche kultiviert wurde, und gegebenenfalls gewaschen oder
anderen Behandlungsformen unterworfen wurde, eine mikrobielle Zelle,
die chemisch mit einer Substanz behandelt worden ist, welche eine
polyfunktionale Gruppe hat, beispielsweise Glutaraldehyd, oder eine
mikrobielle Zelle, die chemisch an eine Oberfläche eines Glaskügelchens,
Harzes, Kieselsäuregels
oder ähnlicher
gebunden wurde.
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Die
Verwendung einer Zelle als Katalysator, die chemisch mit Glutaraldehyd
behandelt wurde, ist insbesondere unter dem Standpunkt der Verbesserung
der Stabilität
der Katalysator-Enzymaktivität vorzuziehen.
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Der
Arbeitsschritt, der eine mikrobielle Zelle mit einer Nitrilverbindung
in einem wässrigen
Medium in Kontakt bringt, bezieht sich darauf, eine mikrobielle
Zelle mit Nitrilhydratase-Aktivität mit einer Nitrilverbindung
in Wasser oder in einem wässrigen
Medium in Kontakt zu bringen, das beispielsweise durch Lösen eines
Stabilisators für
die Innenstärke, pH-Puffer-Kapazität, oder
Nitrilhydratase-Aktivität im Wasser
hergestellt wurde. Diese kann in einem Batch-Verfahren oder kontinuierlichen
System durchgeführt
werden. Die Form der Reaktion wird in Abhängigkeit von Eigenschaften
des Reaktionssubstrates, der Reaktionslösung, der Zielverbindung und ähnlicher
oder dem Ausmaß der
Produktion und des Reaktionsapparats, der entworfen wurde, welcher hierauf
beruht, ausgewählt.
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Vorzugsweise
werden die Reaktionsbedingungen, wie beispielsweise die Reaktionstemperatur und
der pH-Wert so kontrolliert, dass sie optimal dafür sind,
dass eine Amidverbindung in geringerem Ausmaß oder in geringerer Zeit hergestellt
werden kann.
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Die
Konzentration der Amidverbindung, die in dem oben erwähnten Verfahren
angehäuft
wird, beträgt
vom industriellen Standpunkt aus gesehen vorzugsweise 20% oder mehr,
mehr bevorzugt 50% oder mehr.
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Diese
Beschreibung schließt
alles oder einen Teil des Inhalts ein, der in der Beschreibung der
Japanischen Patentanmeldung Nr.
2000-387537 offenbart ist, welche ein Prioritätsdokument
der vorliegenden Anmeldung ist.
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Beste Arten der Durchführung der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail unter Bezugnahme
auf die folgenden Beispiele beschrieben, obwohl sie nicht hierauf
beschränkt
ist. In den folgenden Beispielen bedeutet „%" Masse-Prozent, sofern es nicht anders
angegeben wurde.
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[Beispiel 1] (Herstellung von Acrylamid
unter Verwendung einer mikrobiellen Zelle in einem wässrigen
Medium)
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(1) Zellkultur
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(i) Bedingungen der Präkultur:
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(Zusammensetzung des Mediums)
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- 2% Fructose, 5% Polypepton (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.),
0,3% Hefeextrakt (Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,1% KH2PO4, 0,1% K2HPO4, 0,1% MgSO4·7H2O, pH 7
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(Kulturverfahren)
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Medium
(100 ml) wurde in konische Kolben von 500 ml aufgeteilt, und der
Kolben wurde mit Baumwollstoff verschlossen, und er wurde dann in
einem Autoklav bei 121°C
für 20
Minuten sterilisiert. Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478)
wurde inokuliert und für
48 Stunden bei 30°C
einer Schüttelkultur
unterworfen.
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(ii) Bedingungen der Hauptkultur:
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(Zusammensetzung des Mediums)
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- Ausgangsmedium: 0,2% Hefeextrakt, 0,1% KH2PO4, 0,1% K2HPO4, 0,1% MgSO4·7H2O, pH 7, 0,002% COCl2·6H2O, 0,025% Ammoniumsulfat, 2% Fructose, 2%
Harnstoff, 0,4% Ethanol, 0,1% Pluronic L61 (Asahi Denka Co., Ltd.),
pH 7 Später
zugefügtes
Medium: 20% Fructose, 5% Ethanol, 6% Ammoniumsulfat, pH 6,5
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(Kulturverfahren)
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Das
Ausgangsmedium (2 Liter) wurde in einem 3-Liter-Mini-Bottich-Fermenter
gegeben und in einem Autoklav bei 121°C für 20 Minuten sterilisiert. Separat
wurden Fructose, Ethanol und Harnstoff aseptisch durch ein 0,45
Mikrometer Filterpapier (Advantec Toyo Kaisha, Ltd.) filtriert und
zum Medium gegeben.
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Die
Kultur wurde unter Druck-Bedingungen innerhalb des Gefäßes von
0,098 MPa, einer Rührrate
von 600 UpM, einer Luftzufuhrrate von 1 vvm, und einem pH-Wert von
7 sowie einer Temperatur von 30°C
durchgeführt.
Die Kultur wurde beendet, sobald die maximale Enzymaktivität erreicht
wurde. Danach wurde das Kulturprodukt mit einem 50 mM Phosphatpuffer (pH
7,7) gewaschen, und eine Zellsuspension (Gewicht der Trockenzellen:
15%) wurde gewonnen.
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(2) Messung der Nitrilhydratase-Aktivität
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50
mM Phosphatpuffer (4,98 ml, pH 7,7) und 20 μl der Zellsuspension wurden
in ein Teströhrchen gegeben
und gemischt, das einen Durchmesser von 30 mm hat, und das Röhrchen wurde
in einem Tank bei 10°C
für 5 Minuten
geschüttelt.
50 mM Phosphatpuffer (5 ml, pH 7,7), welcher 5,0% Acrylonitril enthält, welcher
zuvor auf 10°C
eingestellt wurde, wurde zugegeben, und das Produkt wurde für 10 Minuten reagieren
gelassen, die Zellen wurden durch Filtrieren abgetrennt und das
erzeugte Acrylamid wurde mittels Gaschromatographie (GC-14B, Shimadzu Corporation)
quantifiziert. Die Analyse wurde unter Verwendung einer 1 m Glassäule, die
mit Parabox PS (einem Säulenfüllmittel,
Waters) gefüllt
war, bei einer Säulentemperatur
von 230°C
durchgeführt
und die FID-Detektion wurde bei 250°C durchgeführt. Das Ergebnis zeigte, dass
1,2% des Acrylamids erzeugt wurden. Wenn „1 U" als die Menge an Aktivität definiert
wird, die daraus hervorgeht, wenn 1 μmol Acrylonitril in Acrylamid
bei einer Reaktionstemperatur von 10°C innerhalb einer Reaktionsdauer
von 1 Minute umgewandelt wird, betrug die Aktivität der Zelle
zur Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid 56 U pro mg Trockenzellmasse
bei 10°C.
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(3) Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid
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50
mM Tris-(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol)hydrochloridpuffer (664 g,
pH 7,7) wurde in einem abtrennbaren umhüllten 1-Liter-Kolben platziert.
Die Suspension der Zellen, die oben gewonnen wurde, wurde hinzugegben,
um sie auf das Gewicht an Trockenzellmasse von 90 mg zu bringen.
Acrylonitril wurde kontinuierlich bei einer Rührrate von 180 UpM bei 18°C zugegeben,
um die Acrylonitril-Konzentration
bei 2% zu halten.
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Im
Ergebnis erreichte die Konzentration des Acrylamids, die 25 Stunden
nach der Initiierung der Acrylonitrilzugabe hergestellt worden war,
das Zielniveau von 45%.
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[Vergleichsbeispiel 1] (Herstellung von
Acrylamid unter Verwendung einer „entrap"-immobilisierten microbiellen Zelle)
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(1) Immobilisierung von Zellen
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Die
Suspension der Zellen, die in Beispiel 1 gewonnen wurde mit einer
Aktivität
von 56 U im Hinblick auf die Umwandlung von Acrylonitril und Acrylamid,
wurde zu einer äquivalenten
Menge einer wässrigen
Lösung
gut durchmischten 3% Natriumalginats (Kanto Kagaku) gegeben und
gut durchmischt. Dieses Gemisch wurde durch ein Silikonröhrchen mit
einem inneren Durchmesser von 2 mm tröpfchenweise zu einer wässrigen
Lösung
aus 1 M Calciumchlorid gegeben. Auf diese Weise wurden Partikel
aus immobilisierten Zellen mit Partikelgrößen von ungefähr 3 mm
gewonnen. Die Partikel der immobilisierten Zellen wurden mit einer
50 mM Tris-Hydrochloridpuffer (eingestellt
auf pH 7,7) gewaschen, um immobilisierte Zellen zu erhalten.
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(2) Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid
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50
mM Tris-Hydrochloridpuffer (664 g, pH 7,7) wurden in einer getrennten
1-l-Flasche mit Verschluss platziert. Die immobilisierten Zellen,
die oben gewonnen wurden, wurden hinzugegeben, um das Gewicht der
Trockenzellmasse auf 90 mg zu bringen. Acrylonitril wurde kontinuierlich
zugegeben, um die Acrylonitrilkonzentration bei einer Rührrate von
180 UpM bei 18°C
bei 2% zu halten.
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Im
Ergebnis erreichte die Acrylamidkonzentration nicht das Zielniveau
von 45%, selbst 50 Stunden nach dem Beginn der Acrylonitrilzugabe.
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[Beispiel 2] (Herstellung von Acrylamid
unter Verwendung einer mikrobiellen Zellen in einem wässrigen Medium)
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(1) Zellkultur
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Pseudomonas
chlororaphis B23 (FERM BP-187) Zellen wurden in der Weise kultiviert,
wie im Beispiel der
JP Patentveröffentlichung
(Kokai) Nr. 2-177883 beschrieben. Die Aktivität dieser
Zellen zur Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid wurde in gleicher
Weise wie in Beispiel 1 bei pH 7,7 gemessen. Im Ergebnis betrug
die Aktivität
90 U pro mg Trockenzellmasse bei 10°C.
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(2) Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid
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50
mM Phosphatpuffer (850 ml, pH 7,7) und 0,4 g Zellen (auf Trockengewichtsbasis)
wurden in ein getrenntes verschließbares Gefäß gegeben (Innenvolumen 1 Liter).
Die Reaktion wurde unter kontinuierlicher Zugabe von Acrylonitril
unter Rühren
bei 3°C
durchgeführt,
um die Acrylonitrilkonzentration bei 2% zu halten.
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Die
Acrylamidkonzentration erreichte das Zielniveau von 20% drei Stunden
später.
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[Vergleichsbeispiel 2] (Produktion von
Acrylamid unter Verwendung der „entrap"-immobilisierten mikrobiellen Zelle)
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(1) „Entrap"-Immobilisierung
von Zellen
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Eine
wässrige
Lösung
eines Monomergemischs wurde hergestellt, um 30%, 1% und 4% an Acrylamid,
Methylenbisacrylamid bzw. 2-Dimethylaminopropylmethacrylamid zu
enthalten.
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Anschließend wurde
die Suspension der Zellen mit Aktivität von 90 U im Hinblick auf
die Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid, welche in Beispiel 2
gewonnen wurde, eine wässrige
Monomerlösung, eine
wässrige
Lösung
aus 10% N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin und eine wässrige Lösung von 10%
Ammoniumpersulfat einer Leitungsmischung in einem Mischverhältnis von
50:20:1:1 unterworfen. Die Abflüsse
wurden nacheinander auf eine Scheibe mit einer Größe von 300 × 300 × 30 mm
gegeben und dann hierauf polymerisiert.
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Die
hergestellte Zell-immobilisierte Gelschicht wurde in kleine Stücke von
ungefähr
0,5 mm2 unter Verwendung eines Messers zerschnitten,
um Partikel aus Acrylamidpolymer „entrap"-immoblisierten Zellen zu gewinnen.
Die Partikel der immobilisierten Zellen wurden für die Herstellung durch Eintauchen
in eine wässrige
Lösung
aus 0,1% Natriumacrylat gewaschen (eingestellt auf pH 7 mit Hilfe
von Natriumhydroxid).
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(2) Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid
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Acrylonitril
wurde unter Verwendung des Verfahrens und des Apparats, wie in Beispiel
2 beschrieben, umgewandelt.
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Die
Acrylamidkonzentration erreichte das Zielniveau von 20% acht Stunden
später
nicht.
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[Vergleichsbeispiel 3] (Herstellung von
Acrylamid unter Verwendung einer mikrobiellen Zelle mit niedriger Nitrilhydratase-Aktivität)
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(1) Kultur der Zelle und Herstellung des
Katalysators
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In
gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde die Rhodococcus rhodochrous
J1 (FERM BP-1478) Zelle kultiviert. Wenn die Aktivität der Zelle
zur Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid, welche auf Grundlage
des Verfahrens zur Messung der Aktivität, das in Beispiel 1 beschrieben
worden ist, gemessen wurde, 20 U pro mg Trockenzellmasse bei 10°C erreichte, wurde
die Kultur gestoppt. Danach wurde das Kulturprodukt mit 50 mM Phosphatpuffer
(pH 7,7) gewaschen, und eine Zellsuspension (Trockengewicht der Zellen:
15%) wurde gewonnen.
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(2) Umwandlung von Acrylonitril in Acrylamid
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In Übereinstimmung
mit dem Verfahren, das in Vergleichsbeispiel 2 beschrieben wurde,
wurde zuerst eine Suspension aus Acrylamidpolymer „entrap"-immobilisierten
Zellen hergestellt.
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Anschließend wurde
die zuvor erwähnte Suspension
der immobilisierten Zelle oder Suspension der nicht immobilisierten
Zelle als ein Mikroorganismus in einer Menge von 225 mg bezogen
auf das Gewicht der Trockenzelle verwendet, wodurch Acrylonitril
in Acrylamid umgewandelt wurde. Im Ergebnis erreichte die Acrylamidkonzentration
ungefähr
100 Stunden später
das Zielniveau von 45% unter Verwendung einer Suspension von entweder
den immobilisierten oder nicht immobilisierten Zellen.
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Genauer
gesagt gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen immobilisierten
Zellen und nicht immobilisierten Zellen, wenn die Zelle eine Aktivität von 20
U aufwies.
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Industrielle Anwendbarkeit
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine mikrobielle Zelle, die durch FERM BP-1478 mit 50 U oder
mehr pro mg Trockenzellmasse bei einer Reaktionstemperatur von 10°C, welche
eine starke Nitrilhydratase-Aktivität aufweist, in der Reaktion
verwendet, ohne „entrap"-immobilisiert zu
sein. Auf diese Weise kann eine Amidverbindung wirksam aus einer Nitrilverbindung
ohne die Probleme der verringerten Reaktionsgeschwindigkeit oder
der geringeren hergestellten Menge pro Menge der Zelleinheit, welche
durch die „Entrap"-Immobilisierung verursacht werden, hergestellt
werden. Demgemäß kann eine Amidverbindung
innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne im Fall einer Batch-Reaktion
und mit einer sehr kleinen Anlage im Fall einer kontinuierlichen
Reaktion hergestellt werden.